PHÂN TÍCH kết QUẢ điện DI HEMOGLOBIN (THỰC HÀNH HUYẾT học)

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
ĐIỆN DI HEMOGLOBIN
(Phân tích thành phần Hb)

1


MỤC TIÊU
1.
2.
3.
4.

Nêu nguyên lý kỹ thuật điện di.
Nêu chỉ định làm điện di hemoglobin.
Nêu các bước đọc kết quả điện di.
Phân tích được kết quả điện di hemoglobin.

2


ĐIỆN DI
• Định nghĩa
– Điện di là sự di chuyển của các phân tử tích điện trong
một mơi trường điện.

• Các yếu tố ảnh hưởng
– Tốc độ di chuyển của các phân tử phụ thuộc vào:
•
•
•

•
•
•

điện tích,
kích thước và hình dạng của phân tử,
pH của dung dich đệm,
đặc điểm của môi trường hỗ trợ,
khung thời gian cho phương pháp tiến hành
và nhiệt độ của hệ thống hoạt động.

• Ứng dụng: điện di hemoglobin, điện di protein
huyết thanh.
3


NGUN LÝ
• Phương pháp điện di
– phương pháp lý hóa
– dùng dòng điện một chiều làm di chuyển các
phân tử mang điện.

• Mục đích của phương pháp
– dựa trên sự tích điện của các phân tử, và tốc
độ di chuyển khác nhau để tách các thành
phần mong muốn.
 định tính và định lượng.

4

Thiết bị và thuốc thử
• Nguồn điện
• Bể chứa (mơi trường
đệm, mơi trường hỗ
trợ)
• Thiết bị phát hiện và
định lượng

Electrophoresis tank

Cathode

Paper support
medium

Trong một hệ thống điện di, các phân tử tích điện di chuyển
qua một mơi trường hỗ trợ nhờ các lực được phát ra từ môi
trường điện.
5


Ngun lý phân tách
• Theo điện tích
• Theo kích thước

6


(1) Theo điện tích

• Khi những phân tử
tích điện được đặt
trong mơi trường
điện, chúng di
chuyển về hai phía
cả cực dương và cực
âm theo điện tích
của chúng.

7


(2) Theo kích thước phân tử

8


(1) Normal (2) New born (3) Hb C trait [A-C] (4) Hb SC disease [S-C] (5) Sickle cell
disease [S-S], (6) Sickle cell trait [A – S] (7) New born (8) Normal.
9


• Điện di hemoglobin có thể thực hiện
trên:
– Giấy lọc
– Màng cellulose acetate
– Gel tinh bột
– Gel citrate agar
– Gel agarose

10


Một số kỹ thuật điện di Hemoglobin
Alkaline (Cellulose Acetate) ở pH 8,6
Acid (Citrate agar) ở pH 6,2

11


Các kỹ thuật điện di Hemoglobin
Alkaline (Cellulose Acetate) ở pH 8,6


Điện di Hb với gel cellulose acetate ở pH kiềm: pp sàng lọc đầu tiên
được sử dụng để phát hiện các Hb bất thường.



Những chuỗi globin bất thường sẽ khác nhau về số lượng, kiểu và trật
tự các acid amin: điều này làm cho Hb có đặc tính riêng. Tỷ lệ Hb chiếm
nhiều nhất ở người là HbA.



Tất cả các phân tử Hb tích điện âm và di chuyển về phía cực dương tỷ lệ
với điện tích âm của chúng.



Ở pH kiềm HbC, E, A2 và O di chuyển cùng nhau để hình thành 1 băng
đơn giản, HbS, D và G cũng cùng di chuyển.
12


Các kỹ thuật điện di Hemoglobin

Acid (Citrate agar) ở pH 6,2
 Các phân tử Hb tách ra dựa trên sự khác biệt về

điện tích

và khả năng gắn kết với agar.
 Thường được sử dụng để phân biệt các Hb bất thường

cùng di chuyển với nhau trên gel cellulose. (Vd HbS với
HbD và HbG, HbC với HbE).
 Ở pH acid HbC tách ra trừ E và O; và HbS tách từ D và G.

13


CHỈ ĐỊNH
• Đánh giá những trường hợp thiếu máu tán huyết
khơng giải thích được.
• Thiếu máu HC nhỏ khơng liên quan đến giảm sắt,
bệnh lý mạn tính, hoặc ngộ độc chì.
• Một phết máu ngoại biên với những đặc điểm hồn
cầu bất thường (như HC hình bia, hoặc HC hình liềm,
HC kiềm, đa sắc...)

• Tiền sử gia đình có bệnh lý hemoglobin.
• Kết quả sàng lọc trước sinh dương tính
• Kết quả một số test sàng lọc HC liềm, bệnh HbH,
HbE... dương tính.


BN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

RBC
4.95
5.1
6.68
6.45
5.76
5.58
5.73
4.32
6.65
6.41

4.93

HGB
10.0
9.5
13.5
11.8
10.1
11.0
11.0
10.7
14.4
10.9
9.4

HCT
32.4
32.9
46.3
38.1
34
34.3
36.3
36.2
40.8
39.4
31.5

MCV
65.5

64.5
69.3
59.1
59
61.6
63.4
83.8
61.4
61.5
63.9

MCH
20.2
18.6
20.2
18.3
17.5
19.7
19.2
24.8
21.7
17
19.1

MCHC
30.9
28.9
29.2
31
29.7

32
30.3
29.6
35.3
27.7
29.8

RDW Ferritin
12.9
35
14.4
110
13
67
13.8
89
14.4
210
12.9
40
13.7
190
13.5
105
12
72
13.6
38
13
125

Đột biến gen
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal
Beta - thal


BN

RBC

HGB

HCT

MCV

MCH MCHC

RDW

1

5.23

13.2

39.3

75.1

25.2

33.6

12.8

2

5.05

11.6

34.1

67.5

23

34

12.5

3

5.21

13.7

42.9

82.3

26.3

31.9

10.7

4

4.72

13.2

39.6

83.9

28

33.3

10.2

5

5.35

15.2

44.8

83.7

28.4

33.9

11.2

6

5.14

13.0

41.1

80

25.3

31.5

12


BN

RBC

HGB

HCT MCV MCH MCHC RDW Điện di Hb Đột biến gen

1

5.23

13.2

39.3

75.1

25.2

33.6

12.8

BT

Alpha-thal

2

5.05

11.6

34.1

67.5

23

34

12.5

BT

Alpha-thal

3

5.21

13.7

42.9

82.3

26.3

31.9

10.7

BT

Alpha-thal

4

4.72

13.2

39.6

83.9

28

33.3

10.2

BT

Alpha-thal

5

5.35

15.2

44.8

83.7

28.4

33.9

11.2

BT

Alpha-thal

6

5.14

13.0

41.1

80

25.3

31.5

12

BT

Alpha-thal


Bất lợi của kỹ thuật điện di
• Tốn cơng
• Khơng chính xác trong
– định lượng Hb bất thường với nồng độ thấp
(HbA2)
– phát hiện các Hb bất thường di chuyển nhanh
(HbH, Hb Barts)

• Tính chính xác đối với HbA2 kém hơn so với
HPLC (Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao) và
một số KT khác.
18


CHỈ ĐỊNH

• Đánh giá những trường hợp thiếu máu tán huyết
khơng giải thích được.
• Thiếu máu HC nhỏ khơng liên quan đến giảm sắt,
bệnh lý mạn tính, hoặc ngộ độc chì.
• Một phết máu ngoại biên với những đặc điểm hồn
cầu bất thường (như HC hình bia, hoặc HC hình liềm,
HC kiềm, đa sắc...)
• Tiền sử gia đình có bệnh lý hemoglobin.
• Kết quả sàng lọc trước sinh dương tính
• Kết quả một số test sàng lọc HC liềm, bệnh HbH,
HbE... dương tính.


MỘT SỐ KỸ THUẬT
PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HEMOGLOBIN
• IEF - Isoelectric Focusing: tập trung đẳng điện
• HPLC – High Performance Liquid
Chromatography: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Capillary electrophoresis (CE) - Điện di mao
quản

20


ƯU ĐIỂM CỦA CE
• Hồn tồn tự động hóa
• Thể tích mẫu tối thiểu
• Dễ dàng giải thích: vì đường biểu diễn kết quả không bị
ảnh hưởng bởi các đỉnh ngoại lai
• Định lượng chính xác HbA2, HbF và HbS.

• Tách HbE khỏi tỷ lệ HbA2 để dễ dàng xác định và định
lượng
• Định lượng HbH và Hb Barts rõ ràng, được thấy trong
alpha thalassemia
21


PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

22


Các chuỗi globin bình thường ở thời kỳ sau sinh
Chuỗi alpha

Chuỗi non-alpha

β



23


Bệnh lý thalassemia
Thiếu hụt 1 hay nhiều chuỗi globin
Giảm số lượng chuỗi globin bệnh

Mất cân bằng
chuỗi alpha

và
chuỗi non - alpha
24


Alpha - thalassemia

HbF

Hb Bart’s
α





 
 

Thời kỳ bào thai

α

HbA

HbH
α

β

β

α

Thời kỳ sau sinh



β

β


25