luận án tiến sĩ phân lập và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa n và tích lũy poly p trong nước thải sản xuất hủ tiếu mỹ tho và ứng dụng xử lý nước thải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ THỊ LOAN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC,
CHUYỂN HĨA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN
XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

VI SINH VẬT HỌC
Mã ngành: 62 42 01 07

Người hướng dẫn khoa học
GS. TS Cao Ngọc Điệp

Cần Thơ - 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ THỊ LOAN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC,
CHUYỂN HĨA N VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN
XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
VI SINH VẬT HỌC

Cần Thơ – 2020

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cám ơn:
- Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,
Trường Đại học Cần Thơ đã cung cấp kiến thức và hướng dẫn cho tơi trong
suốt q trình học tập.
-

GS.TS. Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn, góp ý cũng như là tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài.
- Tiến sĩ Trần Thị Giang, giảng viên cùng nghiên cứu sinh Trần Vũ
Phương và cán bộ phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh vật mơi trường, phịng
thí nghiệm vi sinh vật đất của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh
học, sinh viên Nguyễn Võ Tấn Lực, MSSV: B150445, Lớp: CNSH A2K41;
Đặng Ngọc Bảo, MSSV: B1504422, Lớp: CNSH A2K41 Trường Đại học Cần
Thơ đã tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
-

Gia đình chú Trương Văn Thuận tại ấp Hội Gia, xã Mỹ Phong, thành

phố Mỹ Tho đã cũng cấp nguồn nước thải, địa điểm thực hiện đề tài, tạo điều
kiện giúp đở để đề tài được hoàn thiện tốt nhất.
-

Thạc sĩ Trịnh Thị Thắng phụ trách phịng thí nghiệm, Tiến sĩ Lê Quang

Khơi, Phó Giám đốc Sở Khoa học và Công nghệ sinh tỉnh Tiền Giang đã hỗ

trợ, cung cấp kết quả cho đề tài.
-

Quý Thầy cô, anh, chị công tác tại Trung tâm học liệu đã tạo điều kiện

cho tơi trong q trình tìm kiếm tài liệu đề hồn thành đề tài.
Trân trọng!
Cần Thơ, ngày

tháng

Lê Thị Loan

năm 2020


i

TÓM LƯỢC
Phân lập, tuyển chọn, và nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa
N và tích lũy poly-P và trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng
dụng xử lý nước thải
Hủ tiếu là sản phẩm được sản xuất từ hạt gạo nấu chín ở châu Á; Quá trình
chế biến hủ tiếu đã thải ra một lượng nước thải chứa nhiều độc tố gây ảnh hưởng
đến môi trường sống và sức khỏe con người. Mục tiêu đề tài là phân lập, tuyển chọn
và ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và
dịng vi khuẩn tích lũy poly-Phosphate tốt để xử lý nước thải. Tổng số 42 dòng vi
khuẩn kết tụ sinh học, 59 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và 8 dịng vi khuẩn tích
lũy poly-Phosphate được phân lập từ nước thải của 8 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho,
tỉnh Tiền Giang, Việt Nam. Vi khuẩn kết tụ sinh học chia làm 2 nhóm: kết tụ protein

và polysaccharide; vi khuẩn chuyển hóa nitơ dị dưỡng chia làm 4 nhóm: vi khuẩn
oxi-hóa ammonium (15 dịng), vi khuẩn oxi-hoa nitrite (15 dịng), vi khuẩn oxi-hố
nitrate (18 dịng) và vi khuẩn nitrate và phản-nitrate hóa (11 dịng). Phân tích gene
16S rDNA và giải trình tự cho thấy tất cả chúng có mức độ đồng hình từ 97% đến
99%, tất cả các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học và tích lũy poly-P đều thuộc họ
Bacilaceae trong khi đó chi Bacillus chỉ chiếm 12% ở vi khuẩn chuyển hóa nitơ còn
lại thuộc vi khuẩn Gram âm (Proteobacteria). Tuyển chọn được 2 dòng kết tụ sinh
học Bacillus subtilis PRO.01.C và Bacillus subtilis PO.03.B, dịng chuyển hóa nitơ
Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03C và dịng vi khuẩn tích lũy polyPhosphat Bacillus megaterium poly-P.06.4B để xử lý nước thải hủ tiếu từ 100-mL,
1-L, 10-L, 100-L và 1000-L và kết quả đạt được pH nước thải từ 4,68 lên 6,13, TSS
từ 369 mg/L giảm xuống 17 mg/L, BOD 5 từ 1200 mg/L giảm xuống 23 mg/L, TN
từ 45 giảm xuống 7,57 mg/l, TP từ 7,57 giảm xuống 4,76 mg/đạt tiêu chuẩn B, của
QCVN40:2011/BTNMT sau 4 ngày sục khí 8/24 giờ.
Từ khóa: Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, Vi khuẩn chuyển hóa đạm ,Vi
khuẩn tích lũy lân hòa tan, nước thải hủ tiếu.


ii

ABSTRACT
Isolation, Selection and Identification of bioflocculant-producing
bacteria, heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly-P nurturing
bacteria in wastewater from “hu tieu My Tho” mills, Tien Giang province,
Vietnam and their application for wastewater treatment

Hu tieus are a form of rice product from cooked rice grain in Asia. The
process of hu tieu production discharges an amount of wastewater containing a
multitude of toxins that cause environmental degradation and human health risks.
The aim of the study was to isolate, screen and utilize bioflocculant-producing
bacteria, heterotrophic nitrogen-removal bacteria, poly-phosphate nurturing bacteria

as way of wastewater treatment. A total of 42 bioflocculant-producing bacterial
strains (BPB), 59 heterotrophic nitrogen removal bacterial (HNRB) strains and 8
poly-Phosphate nurturing bacterial strains were isolated from wastewater of 8 hu
tieu mills of My Tho City, Tien Giang province, Mekong Delta, Vietnam.
Bioflocculant-producing bacterial strains were divided into two groups: proteinflocculant and polysaccharide; HNRB strains were classified into four groups of
heterotrophic ammonium-oxidizing bacteria (15 strains), nitrite-oxidizing bacteria
(15 strains), nitrate-oxidizing bacteria (18 strains) and heterotrophic nitrifying and
denitrifying bacteria (11 strains). The virtually complete 16S rRNA gene was PCR
amplified and sequenced. The sequences from the selected BPB, HNR and poly-P
bacterial strains all showed high degrees of similarity to those of the GenBank
references strains (between 97% and 99%). Phylogenetic trees based on the 16S
rDNA sequences displayed high consistency, with nodes supported by high
bootstrap (1000) values. These presumptive HNRB strains were categorized into
two groups that included members of genera belonged to Gram-positive bacteria
phylum and Proteobacteria phylum while BPB and poly-P bacteria strains belonged
to bacilli. Application of two strains BPB Bacillus subtilis PRO.01.C and Bacillus
subtilis PO.03.B, HNR Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03C and poly-P


iii

Bacillus megaterium P.06.4.B to treat wastewater from hu tieu in containers from
100mL, 1L, 10L, 100L and 1000L, the results recorded that pH of wastewater
increased from 4.68 to 6.13, TSS and BOD5 concentration of wastewater reduced
from 369 and 1200 mg/L to 17 and 23 mg/L, respectively. Total nitrogen and total
phosphorous decreased from 45 and 6.3 mg/L to 7.57 and 4.56 mg/L, respectively.
All targets reached B level according to QCVN40/2011 standard/Ministry of
Natural Resource and Environment of Vietnam.
Keywords - Bioflocculant-producing bacteria, Heterotrophic Nitrogen Removal
Bacteria, Poly-Phosphate bacteria, Rice-noodle, wastewater

v

MỤC LỤC
Chương 1 – Giới thiệu ......................................................................................
1.1

Đặt vấn đề ..............................................................................................

1.2

Mục tiêu của nghiên cứu ........................................................................

1.3

Đối tượng nghiên cứu.............................................................................

1.4 Thời gian và địa điểm thu mẫu ....................................................................
1.5

Nội dung nghiên cứu ..............................................................................

1.6

Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án ....................................................

Chương 2 – Tổng quan tài liệu .......................................................................
2.1

Hiện trạng sản xuất hủ tiếu ở thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang .......

2.2

Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho

2.3

Vấn đề về nước thải và chất lượng nước thải của các cơ sở sản xuất

hủ tiếu ...................................................................................................
2.4

Quy trình và biện pháp xử lý nước thải tại các cơ sở sản xuất hủ tiếu

Mỹ Tho ...................................................................................................
2.5

Vi khuẩn kết tụ sinh học..........................................................................

2.5.1

Kết tụ sinh học (Bioflocculant) ...........................................

2.5.2

Kiểm tra khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của vi kh

dung dịch kaolin ...................................................................

2.5.3

Cơ chế và đặc điểm của quá trình kết tụ sinh học (Mechan

Bioflocculation) ...................................................................
2.5.4

Một số nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

2.5.5

Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nu

2.5

Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ (đạm) trong nước thải ..................................

2.6.1

Độc tính của Amoni và các hợp chất Nitơ dạng oxy hóa ...

2.6.2

Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa Nitơ ngồi

trong nước ..........................................................................
2.7
2.7.1

Vi khuẩn tích lũy lân dạng poly (poly-P) ...............................................

Các dạng phospho tồn tại trong tự nhiên ...........................


vi

2.7.2 Loại bỏ phospho bằng hóa chất....................................................................................... 31
2.7.3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học................................................................ 31
2.7.4 Vi khuẩn tích lũy lân dạng poly (poly-P)..................................................................... 31
2.7.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ngồi nước và
trong nước................................................................................................................................ 33
2.7.5.1 Những nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ngồi nước................................... 33
2.7.5.2 Những nghiên cứu vi khuẩn tích lũy poly-P ở Việt Nam................................... 34
2.8 Các nghiên cứu và ứng dụng 3 nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn
chuyển hóa đạmNitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P trong và ngồi nước...................... 35
2.8.1 Giới thiệu................................................................................................................................. 35
2.8.2 Các phương pháp xử lý nước thải trong ngành chế biến thực phẩm.................35
2.8.2.1 Nước thải ngành chế biến thực phẩm........................................................................ 35
2.8.2.2 Tổng quan các phương pháp xử lý nước thải ngành chế biến
thực phẩm............................................................................................................................ 36
2.8.2.3 Xử lý nước thải chế biến thực phẩm bằng phương pháp sinh học
hiếu khí................................................................................................................................. 38
2.9 Các phương pháp xử lý nước thải tiên tiến trong và ngoài nước...........................50
2.9.1 Các biện pháp loại bỏ Nitơ................................................................................................ 51
2.9.1.1 Loại bỏ nitơ bằng biện pháp sinh học: nitrate hóa và phản nitrate hóa .

51

2.9.1.2 Loại bỏ nitơ bằng phương pháp hóa lý..................................................................... 51
2.9.2 Các biện pháp tích lũy Phospho...................................................................................... 51

2.9.2.1 Loại bỏ lân bằng biện pháp sinh học......................................................................... 51
2.9.2.2 Loại bỏ lân bằng phương pháp hóa lý....................................................................... 52
2.9.3 Ứng dụng màng lọc tiên tiến xử lý nước thải............................................................ 52
Chương 3 – Phương tiện và phương pháp nghiên cứu............................................... 55
3.1 Vật liệu thí nghiệm................................................................................................................... 55
3.1.1 Môi trường nuôi cấy............................................................................................................ 55
3.1.1.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein............55
3.1.1.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học


vii

polysaccharide.................................................................................................................... 56
3.1.1.3 Mơi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ.................................................... 56
3.1.1.4 Mơi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P....................................................... 57
3.1.2 Nguyên liệu và vật liệu thí nghiệm................................................................................ 57
3.2 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................................... 57
3.2.1 Thu mẫu.................................................................................................................................... 57
3.2.2 Đếm mật số vi khuẩn........................................................................................................... 58
3.2.3 Phân lập vi khuẩn................................................................................................................. 59
3.2.3.1 Phân lập vi khuẩn.............................................................................................................. 59
3.2.3.2 Trữ mẫu và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn........................................... 60
3.2.4 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn
chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P........................................................................ 61
3.2.4.1 Tuyển chọn.......................................................................................................................... 61
3.2.4.2 Nhận diện............................................................................................................................. 70
3.2.5 Ứng dụng các dòng vi khuẩn tốt trên nước thải hủ tiếu......................................... 75
3.2.5.1 Ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ
tiếu Mỹ Tho......................................................................................................................... 75
3.2.5.2 Ứng dụng các dịng Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và dịng vi khuẩn

Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho............................................................ 76
3.2.5.3 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hố Nitơ và tích
luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1- L 78
3.2.5.4 Khả năng xử lý nước thải của dịng vi khuẩn chuyển hố Nitơ và tích
luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L 79
3.2.5.5 Khả năng xử lý nước thải của dịng vi khuẩn chuyển hố Nitơ và tích
luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L............................................................................ 79
Chương 4 - Kết quả và thảo luận........................................................................................... 81
4.1 Mật số vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn
tích lũy poly-P.................................................................................................................. 81
4.2 Phân lập các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa N và


viii

vi khuẩn tích lũy poly-P ....................................................................
4.2.1

Phân lập các dịng vi khuẩn kết tụ sinh sinh học ...............................

4.2.1.1 i khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi trường protein ............
4.2.1.2 i khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên mơi trường

Polysaccharide ...................................................................................
4.2.2

Phân lập các dịng vi khuẩn chuyển hố Nitơ .....................................

4.2.2.1 Đặc điểm các dịng vi khuẩn phân lập trên mơi trường nitrite...............
4.2.2.2 Đặc điểm các dịng vi khuẩn phân lập trên môi trường nitrate ..............

4.2.2.3 Đặc điểm các dịng vi khuẩn phân lập trên mơi trường ammonium ......
4.2.2.4 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên mơi trường tổng .................
4.2.3

Phân lập các dịng vi khuẩn tích lũy poly-P ........................................

4.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ

và vi khuẩn tích lũy poly-phosphate .................................................
4.3.1

Tuyển chọn các dịng vi khuẩn kết tụ sinh học ..................................

4.3.1.1 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học protein ............................
4.3.1.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học polysaccharide .............
4.3.2

Tuyển chọn các dịng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ ................................

4.3.2.1 Tuyển chọn các dịng vi khuẩn chuyển hóa Nititrite (NO2
4.3.2.2 Tuyển chọn các dịng vi khuẩn chuyển hóa nitrate ( NO 3
4.3.2.3 Tuyển chọn các dịng vi khuẩn chuyển hóa ammonium (NH 4
4.3.2.4 Tuyển chọn các dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ tổng hợp
4.3.3

Tuyển chọn dịng vi khuẩn tích lũy poly-P ..........................................

4.4 Nhận diện vi khuẩn ......................................................................................
4.4.1

Nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học .....................................................

4.4.2

Nhận diện các dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hố N

4.4.3

Nhận diện các dịng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P .................

4.5 Ứng dụng các dịng Vi khuẩn kết tụ sinh học, Vi khuẩn chuyển hóa N và

Vi khuẩn Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho..........................


ix

4.5.1 Ứng dụng các dòng Vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ tiếu
Mỹ Tho.................................................................................................................................. 120
4.5.1.1 Chọn pH thích hợp........................................................................................................... 120
4.5.1.2 Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis PO.03.B

122

4.5.1.3 Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis PRO.01.C

128

4.5.1.4 Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và
polysaccharide ở 100-mL nước thải hủ tiếu Mỹ Tho........................................... 132
4.5.1.5 Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và
polysaccharide ở 1-L nước thải nước thải............................................................... 134
4.5.1.6 Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và
polysaccharide ở 10-L nước thải nước thải............................................................. 135
4.5.2 Ứng dụng các dịng của các dịng vi khuẩn chuyển hố Nitơ và tích luỹ
poly-P ở thể tích 1-L

136

4.5.2.1 Kết quả khảo sát khả năng xử lý nước thải của các dịng vi khuẩn
chuyển hố Nitơ................................................................................................................ 136
+

4.5.2.2 Khả năng xử lý NH4 trong nước thải của các dịng vi khuẩn tích luỹ
Poly-P.................................................................................................................................... 138
4.5.3 Kết quả ứng dụng khả năng xử lý nước thải của dịng vi khuẩn chuyển
hố Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1-L.................................................. 139
4.5.4. Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hố Nitơ và tích
luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L................................................................................ 140
4.5.5. Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hố N và tích luỹ
Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L ...............................................................
4.5.6. Khả năng xử lý nước thải của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi
khuẩn chuyển hố Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1000-L

142
143
.....

Chương 5 – Kết luận và Đề xuất............................................................................................ 149
5.1 Kết luận........................................................................................................................................ 149


x

5.2 Đề xuất......................................................................................................................................... 149
Tài liệu tham khảo........................................................................................................................... 150


xi

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Bản đồ vị trí thành phố Mỹ Tho và xã Mỹ Phong, nơi các làng nghề
sản xuất hủ tiếu............................................................................................................. 4
Hình 2.2 Quy trình sản xuất bánh hủ tiếu ở các cơ sở sản xuất hủ tiếu
Mỹ Tho.............................................................................................................................. 5
Hình 2.3 Sơ đồ phân giải protein ngoại và nội bào vi khuẩn cùng các con
đường biến đổi acid amin nội bào 10
Hình 2.4 Cơng thức cấu tạo kaolin............................................................................................ 13
Hình 2.5 Cơ chế kết tụ sinh học của vi khuẩn sinh ra chất kết tụ.................................. 15
Hình 2.6 Chu trình nitơ.................................................................................................................. 19
Hình 2.7 So sánh sự tổ chức của các gen khử đạm trong các vi khuẩn
P. stutzeri, P. aeruginosa, Paracoccus denitrificans

25

Hình 2.8 Cây phát sinh thể hiện mối quan hệ giữa các loài tham gia sự khử
đạm triệt để .........................................................................................
2-

26

-

Hình 2.9 Phân phối HPO4 và H2PO4 tùy theo pH của mơi trường.......................... 30
Hình 2.10 (A) Mơ tả các đặc điểm sinh hóa chính trong q trình EBPR
(B) Sự chuyển đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí

và hiếu khí

33

Hình 2.11 Các thành phần chính của hệ thống bùn hoạt tính.......................................... 39
Hình 2.12 Các cơng đoạn của quy trình xử lý nước thải bằng bể bùn
hoạt tính

40

Hình 2.13 Sơ đồ quy trình xử lý nước thải bằng bể lọc sinh học nhỏ giọt................43
Hình 2.14 Sơ đồ bể lọc sinh học nhỏ giọt............................................................................... 45
Hình 2.16 Phân phối nước bằng các cánh xoay trịn.......................................................... 48
Hình 2.17 Sơ đồ một hệ thống xử lý nước thải bằng đĩa quay sinh học..................... 49
Hình 2.18 Sơ đồ trao đổi chất của PAO trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí..............53
Hình 2.19 Phân loại màng lọc dựa trên kích thước............................................................. 54
Hình 3.1 (A) Pha loãng mẫu và đếm sống nhỏ giọt


xii

(B) xác định mật số vi khuẩn

59

Hình 3.2 Mẫu đã kiểm rịng được trữ trong ống nghiệm.................................................. 60
Hình 3.3 Đường chuẩn đo lân..................................................................................................... 68
Hình 3.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR............................................................................. 72
Hình 3.5 Chương trình PCR dùng để nhận diện vi khuẩn chuyển hố Nitơ.............73
Hình 3.6 Chương trình PCR dùng để nhận diện vi khuẩn tích luỹ Poly-P................74
Hình 3.7 Sơ đồ đánh giá khả năng kết tụ hay % kết tụ và hàm lượng TSS
của nước thải 76
Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá hiệu quả Vi khuẩn kết tụ sinh học,
chuyển hóa N và vi khuẩn poly-P trên nước thải hủ tiếu Mỹ Tho................80
Hình 4.1 Đặc điểm của một số dạng khuẩn lạc vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học ...............................................................................................

83

Hình 4.2 i khuẩn kết tụ sinh học (PRO.01.C) có dạng que ngắn dưới độ
phóng đại 10.000 lần

85

Hình 4.3 Vi khuẩn kết tụ sinh học (PO.03.B) có dạng que dài dưới độ phóng
đại 9.000 lần 86
Hình 4.4 Dạng khuẩn lạc vi khuẩn kết tụ sinh học............................................................. 87
Hình 4.5 Độ nhớt của khuẩn lạc................................................................................................. 88
Hình 4.6 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn nitrite có màu trắng đục, mơ, bìa
ngun

89

Hình 4.7 Tế bào vi khuẩn nitrite (HNi.01.03.DL) đa số có hình que ngắn,
dưới độ phóng đại 6.000 lần........................................................................................ 90
Hình 4.8 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn nitrate có trịn, đục, bìa ngun..................91
Hình 4.9 Tế bào i khuẩn nitrate (HNa.02.03.C) có hình dạng que ngắn
dưới độ phóng đại 6.000 lần

92

Hình 4.10 huẩn lạc của vi khuẩn ammonium.................................................................... 94
Hình 4.11 Hình dạng vi khuẩn ammonium (HAm.03.05.C) có dạng que ngắn
dưới độ phóng đại 6.000 lần

96


xiii

Hình 4.12 Dạng khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa nitơ........................................................ 97
Hình 4.13 Hình dạng vi khuẩn (COM.04.07.C) tổng hợp 03 loại nitơ dưới độ
phóng đại 7.500 lần.................................................................................................... 98
Hình 4.14 Một số hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập
từ nước thải hủ tiếu..................................................................................................... 99
Hình 4.15 Dạng khuẩn lạc vi khuẩn tích lũy poly-P.......................................................... 100
Hình 4.16 Hình dạng vi khuẩn tích lũy Poly-P (Poly-P.06.4.B) có dạng
que dài

101

Hình 4.17 Tỷ lệ kết tụ của dòng vi khuẩn kết tụ protein trong dung dịch
Kaolin 102
Hình 4.18 Tỷ lệ kết tụ của dịng vi khuẩn kết tụ polysaccharise trong dung
dịch

aolin

103

Hình 4.19 Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn khi thử nghiệm trên môi
trường tối thiểu bổ sung nitrite ở 10 mM (A) và giảm dần ở
30 mM (B)

105

Hình 4.20 Số dòng vi khuẩn khử nitrite giảm dần trên mơi trường bổ sung
-

NO2 với nồng độ tăng dần 105
Hình 4.21 Số dòng vi khuẩn khử nitrite giảm dần trên mơi trường bổ sung
-

NO3 với nồng độ tăng dần 106
Hình 4.22 Khả năng phát triển của vi khuẩn khử ammonium trên mơi trường
+

bổ sung NH4 với nồng độ tăng dần

107

Hình 4.23 hả năng phát triển của vi khuẩn chuyển hóa N trên môi trường
bổ sung 3 loại Nitơ với nồng độ tăng dần 108
Hình 4.24 hả năng tích luỹ poly-P của các dịng vi khuẩn trên mơi trường
phospho

108

Hình 4.25 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng
vi khuẩn kết tụ sinh học trên gel agarose 1,2%. 109
Hình 4.26 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn
kết tụ sinh học

111


xiv

Hình 4.27 Phổ điện di của sản phẩm PCR của các dịng vi khuẩn chuyển hóa
N trên gel agarose 2% ......................................................................
Hình 4.28 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dịng vi khuẩn
chuyển hố Nitơ ...............................................................................
Hình 4.29 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ di truyền giữa các dịng vi khuẩn
tích lũy poly-P ..................................................................................
Hình 4.30 Tỷ lệ kết tụ sinh học trung bình của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh
học protein và polysaccharide xử lý trong 100 mL nước thải hủ
tiếu Mỹ Tho .......................................................................................
Hình 4.31 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến khả năng tổng
hợp chất kết tụ sinh học chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
PO.03.B .............................................................................................
Hình 4.32a Đồ thị mặt đáp ứng của tỷ lệ kết tụ theo khống vơ cơ = 0,75%,

tinh bột = X (0,5% - 1,5%) và urê = Y (0,025% - 0,075%) .............
Hình 4.32b Đồ thị đường mức của tỷ lệ kết tụ theo khống vơ cơ
FeCl2 = 0,75%, tinh bột = X (0,5% - 1,5%) và urê = Y
(0,025% - 0,075%) ..........................................................................
Hình 4.33 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả năng kết tụ
sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PO.03.B .................
Hình 4.34 Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả kết tụ sinh học dịng vi khuẩn
PRO.01.C. .........................................................................................
Hình 4.35 Ảnh hưởng của liều lượng dung dịch vi khuẩn lên khả năng kết tụ
sinh học của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis PRO.01.C ...................
Hình 4.36 Tỷ lệ kết tụ trung bình của tổ hợp các dòng vi khuẩn kết tụ sinh
học xử lý trong 100 mL nước thải hủ tiếu Mỹ Tho .........................
Hình 4.37 Tỷ lệ kết tụ trung bình của 2 dịng vi khuẩn kết tụ sinh học
PO.03.B và PRO.01.C xử lý trong 1 L nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ..
Hình 4.38 Tỷ lệ kết tụ trung bình của tổ hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học
PO.03.B và PRO.01.C xử lý trong 10 lít nước thải hủ tiếu Mỹ


xv

Tho

135

Hình 4.39 Hàm lượng ammonium (mg/L) ở các dịng vi khuẩn chuyển hố N
sau 03 ngày xử lý

136

Hình 4.40 Hàm lượng orthophosphate (mg/L) ở các dịng vi khuẩn chuyển

hóa N sau 03 ngày xử lý

137

Hình 4.41 Hàm lượng ammonium (mg/L) ở các dịng vi khuẩn tích luỹ Poly-P
sau 03 ngày xử lý. 138
Hình 4.42 Hàm lượng orthophosphate (mg/L) ở các dịng vi khuẩn tích luỹ
Poly-P sau 03 ngày xử lý

139

Hình 4.43 Hàm lượng ammonium và orthophosphate (mg/L) nước thải
sau khi xử lý 140
Hình 4.44 Hàm lượng ammonium và orthophosphate (mg/L) nước thải
sau khi xử lý ở qui mơ 10-L

141

Hình 4.45 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển
hố Nitơ và tích luỹ Poly-P trên pH của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho
sau 4 ngày xử lý

143

Hình 4.46 Hiệu quả của các dịng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển
hố Nitơ và tích luỹ Poly-P trên BOD5 và TSS của nước thải hủ
tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý

144

Hình 4.47 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển
hố N và tích luỹ Poly-P trên tổng nito và tổng phospho của nước
thải hủ tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý

145


xvi

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Chỉ tiêu thành phần nước thải của các cơ sở sản xuất bánh hủ tiếu
tại cơ sở sản xuất hủ tiếu tại thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang .......
Bảng 2.2 Giá trị C của các thông số ô nhiễm trong nước thải công nghiệp quy
định bởi QCVN 40:2011/BTNMT .......................................................
Bảng 3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein
Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
polysaccharide .....................................................................................
Bảng 3.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ ..................................
Bảng 3.4 Mơi trường phân lập vi khuẩn tích luỹ poly-P ...................................
Bảng 3.5 Địa điểm 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu ở Thành phố Mỹ Tho, Tiền
Giang được lấy mẫu.............................................................................
Bảng 3.6 Các nguồn carbon, nitrogen và khống vơ cơ được bổ sung trong
mơi trường ni sinh khối chủng vi khuẩn kết tụ sinh học tốt nhất ..

6
36
55
56
56
57

58
63

Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hồn toàn ngẫu nhiên khảo sát ảnh
hưởng của các tỷ lệ carbon, nitrogen và khống vơ cơ đến hiệu quả
kết tụ sinh học ở dòng kết tụ sinh học polysaccharide hat protein
tốt nhất
64
Bảng 3.8 Thành phần môi trường cơ bản bổ sung nitrate, nitrite và
ammonium 66
Bảng 3.9 Thành phần hóa chất xây dựng đường lân chuẩn............................................. 67
Bảng 3.10 Thành phần cho 1 phản ứng PCR (50 μL)........................................................ 71
Bảng 3.11 Thành phần cho 1 phản ứng PCR (50 µL)........................................................ 72
Bảng 3.12 Thành phần cho 1 phản ứng PCR (50 µL)........................................................ 73
Bảng 4.1 pH và mật số 3 nhóm vi khuẩn trong 08 mẫu nước thải hủ tiếu của
08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang
81
Bảng 4.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi
trường protein
84
Bảng 4.3 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học trên môi trường protein. 85
Bảng 4.4 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn sản xuất chất kết tụ
sinh học trên môi trường polysaccharide 86
Bảng 4.5 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học
trên môi trường polysaccharide 87
Bảng 4.6 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn phân lập trên
môi trường nitrite 89
Bảng 4.7 Tổng hợp các đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn phân lập được

xvii

trên môi trường nitrite................................................................................................. 90
Bảng 4.8 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập
trên môi trường nitrate............................................................................................... 91
Bảng 4.9 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập được trên môi trường
nitrate................................................................................................................................ 92
Bảng 4.10 Tổng hợp các đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập trên môi
trường nitrate............................................................................................................. 93
Bảng 4.11 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập
trên môi trường ammonium.................................................................................. 94
Bảng 4.12 Tổng hợp các đặc điểm các dịng vi khuẩn phân lập trên mơi
trường ammonium..................................................................................................... 95
Bảng 4.13 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập được trên môi trường
ammonium................................................................................................................... 96
Bảng 4.14 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập
trên môi trường tổng................................................................................................ 97
Bảng 4.15 Tổng hợp các đặc điểm các dịng vi khuẩn phân lập trên mơi
trường tổng.................................................................................................................... 98
Bảng 4.16 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập được trên môi trường
tổng (T)......................................................................................................................... 99
Bảng 4.17 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập
trên môi trường lân 100
Bảng 4.18 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn phân lập trên mơi trường tích luỹ
poly-P 101
Bảng 4.19 Tổng hợp các đặc điểm vi khuẩn trên mơi trường tích luỹ poly-P..........101
Bảng 4.20 So sánh tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học........................ 104
Bảng 4.21 Kết quả giải trình tự 06 dịng vi khuẩn kết tụ sinh học................................ 110
Bảng 4.22 ết quả giải trình tự 11 dịng vi khuẩn chuyển hố Nitơ............................ 113

Bảng 4.23 ết quả giải trình tự 03 dịng vi khuẩn tích luỹ Poly-P............................... 118
Bảng 4.24 Ảnh hưởng của nguồn (%) carbon, (%) nitrogen và (%) khống
vơ cơ đến tỷ lệ kết tụ (%) của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
PO.03.B
123
Bảng 4.25 Ảnh hưởng của nguồn (%) tinh bột, (%) urê, (%) va FeCl3 (%) đến
tỷ lệ kết tụ (%) của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PO.03.B 125
Bảng 4.26 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khống vơ cơ đến khả
năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của dòng vi khuẩn Bacillus
subtilis PRO.01.C 129
Bảng 4.27 Ảnh hưởng của sự thay đổi tỷ lệ (%) tinh bột, (%) urê, (%) va
Cl (%) đến tỷ lệ kết tụ (%) của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis


xviii

PO.03.B
Bảng 4.28 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học trên

131

lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho.
Bảng 4.29 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tự sinh học trên

133

lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ở 1-L nước thải
Bảng 4.30 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tự sinh học trên

134

lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ở 10-L nước thải
Bảng 4.31 Hiệu quả của vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ
và vi khuẩn tích lũy Poly-P trên pH và lý, hóa tính của nước thải

135

hủ tiếu Mỹ Tho

142


xix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ADP
ATP
PCR
BOD

BOD5
BTNMT
COD
DNA
N
N2
NH4+
NO3OD
P
Poly-P

QCVN
RNA
TN
TP
TSS


xx

L
VK
PAC
BLAST


1

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Gạo là nguồn lương thực chính ở các quốc gia châu Á và loại lương thực này
được chế biến nhiều loại sản phẩm khác nhau trong đó có hủ tiếu. Hủ tiếu được sản
xuất theo quy trình gạo được ngâm trong thời gian 24 giờ, sau đó tháo nước rửa chua,
kế tiếp là xay bột rồi ủ bột trong khoảng thời gian 48 giờ. Bước tiếp theo là luộc bột
và tráng bột trên các vĩ mỏng sau đó phơi khơ và dùng máy cắt thành sợi. Hủ tiếu
thành phẩm có thể trộn với rau củ quả cùng với thịt và nước súp (nước lèo) được nấu
chín từ xương heo là đặc sản nổi tiếng ở Mỹ Tho, Tiền Giang.
Tuy nhiên, hầu hết các cơ sở sản xuất hủ tiếu chưa có hệ thống xử lý nước thải
hay xử lý không đạt tiêu chuẩn. Nhu cầu nước cho sản xuất tại các cơ sở chế biến
nông sản thực phẩm thường rất lớn, nhưng nước thải trong q trình sản xuất thường

khơng được xử lý mà xả thẳng ra môi trường gây ô nhiễm nặng nề cho nguồn nước
sông, rạch. Cụ thể ở Mỹ Tho - Tiền Giang, đa số các cơ sở đều mang tính tự phát, nhỏ
lẻ nên chưa thật sự chú trọng đến việc xử lý nước thải bảo vệ môi trường. Nhiều cơ
sở sau khi sản xuất đã xả trực tiếp nước thải hủ tiếu chưa qua xử lý ra môi trường
khiến nhiều sơng ngịi, kênh rạch gây ơ nhiễm nghiêm trọng đồng thời gây nguy hại
cho sinh vật và người dân sống quanh đó.
Nhận thấy được tiềm năng cũng như hiệu quả của các nhóm vi khuẩn kết tụ sinh
học, vi khuẩn chuyển hóa đạm, vi khuẩn tích lũy poly-P trong việc xử lý nước thải,
đồng thời vấn đề cấp bách hiện tại là phải có biện pháp xử lý nước thải hủ tiếu, để
ngăn chặn việc ảnh hưởng đến môi trường. Quan trọng hơn là bảo vệ danh tiếng của
ẩm thực Việt Nam, danh tiếng 50 năm danh hiệu của hủ tiếu Mỹ Tho và hình ảnh của
Việt Nam. Vì vậy đề tài “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa
nitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý
nước thải” được thực hiện là một nghiên cứu vơ cùng cấp thiết và mang tính ứng
dụng vào thực tiễn rất cao nhằm giải quyết những khó khăn nêu trên.


2

1.2 Mục tiêu của nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng các vi khuẩn khả năng xử lý nước thải từ các
cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho.
1.3 Đối tượng nghiên cứu
Các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N (nitơ) và tích lũy poly-P trong
nước thải hủ tiếu.
1.4 Thời gian và địa điểm thu mẫu
Thời gian: Từ tháng 2 năm 2016 đến tháng 8 năm 2018.
Địa điểm thu mẫu: tại 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu tại xã Mỹ Phong, Thành phố
Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang.
1.5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:
- Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ N và tích

lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu.
- Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh

học, loại bỏ N và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu có các đặc tính tốt bằng
phương pháp sinh học phân tử và công cụ Tin Sinh học kết hợp với một số mơ tả hình
thái tế bào và khuẩn lạc đã có.
- Tuyển chọn một số dòng kết tụ sinh học, loại bỏ N và tích lũy poly-P trong

nước thải hủ tiếu tốt nhất để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải hủ tiếu trong thùng
hay bể chứa có dung tích 100 mL, 1-L, 10-L, 100-L.
1.6 Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án
Kết quả nghiên cứu của đề tài là một bộ sưu tập gồm 109 dòng vi khuẩn kết tụ
sinh học, chuyển hóa N và tích lũy poly-P. Trong đó: 42 dòng vi khuẩn kết tụ sinh
học (23 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ protein và 19 dịng vi khuẩn có khả năng
kết tụ polysaccharide), 59 dịng vi khuẩn chuyển hóa N (15 dịng vi khuẩn chuyển
hóa ammonium, 18 dịng vi khuẩn chuyến hóa nitrate, 15 dịng vi khuẩn chuyển hóa
nitrite và 11 dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonium, nitrite, nitrate), 8
dịng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P.