Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của một số chủng lactococcus phân lập từ sữa

NGUYỄN THỊ ĐÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
0B

---------------------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2006 - 2008
Hà nội
2008

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA
MỘT SỐ CHỦNG LACTOCOCCUS PHÂN LẬP
TỪ SỮA
1B

NGUYỄN THỊ ĐÀ

HÀ NỘI, 2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG
LACTOCOCCUS PHÂN LẬP TỪ SỮA
04.3898

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ ĐÀ

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH BÌNH

HÀ NỘI, 2008


ii

LỜI CÁM ƠN

Tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Lê Thanh Bình
– Phịng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật – Viện Cơng nghệ sinh học,
đã nhiệt tình dạy bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn này.
Tơi cũng xin được cám ơn Th.S Hoa Thị Minh Tú - Phịng Các chất
hoạt tính sinh học từ vi sinh vật – Viện Cơng nghệ sinh học, đã nhiệt tình giúp
đỡ tơi trong q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cám ơn trung tâm đào tạo sau đại học, trường Đại
học Bách khoa Hà Nội; Ban Lãnh Đạo viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam cùng tồn thể các thầy cơ giáo đã dạy dỗ và tạo
điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin được gửi lời cám ơn tới tất cả các anh chị, các bạn đồng nghiệp
Phòng Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học
đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người thân đã ln
ủng hộ và góp ý cho tơi trong suốt thời gian học tập và công tác.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2008

Nguyễn Thị Đà


iii

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa………………………………………………………………. i
Lời cám ơn…………………………………………………………………. ii
Mục lục……………………………………………………………………..

iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt…………………………………….. v
Danh mục các bảng………………………………………………………… vi
Danh mục các hình vẽ, đồ thị………………………………………………. viii
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………... 1
Chương 1 - TỔNG QUAN………………………………………………... 3
1.1 Vi khuẩn lactic………………………………………………………… 3

1.1.1 Giới thiệu chung…………………………………………………….

3

1.1.2 Sự phát sinh loài……………………………………………………. 5
1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic.................................................................... 6
1.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic………………………………………

10

1.2 Bacteriocin…………………………………………………………….. 14
1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về bacteriocin………………………………….. 14
1.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic……………………………………... 15
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP………………………….. 34
2.1 Chủng giống và môi trường………………………………………….. 34
2.1.1 Chủng vi sinh vật…………………………………………………….

34

2.1.2 Môi trường…………………………………………………………… 34
2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………..

35

2.2.1 Xác định hoạt tính bacteriocin……………………………………… 35
2.2.2 Quan sát hình thái tế bào……………………………………………

37

2.2.3 Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa ………………………... 37

iv

2.2.4 Xác định khả năng kháng kháng sinh và nisin…………………….. 39
2.2.5 Phương pháp lên men thu hồi bacteriocin bằng dung môi………...

39

2.2.6 Xác định một số đặc điểm của bacteriocin………………………….

40

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid……………………………………………. 41
2.2.8 Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)…………. 42
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………

45

3.1 Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng………………………….

45

3.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ……………………………… 45
3.1.2 Đặc tính kháng kháng sinh và kháng nisin………………………… 47
3.1.3 Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng và tác động của các yếu tố môi
trường đối với sự sinh tổng hợp bacteriocin các chủng………………….. 54
3.2 Nghiên cứu thu hồi bacteriocin bằng phương pháp kết tủa ethanol

72

3.3 Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm…………………………. 74
3.3.1 Ảnh hưởng của pH lên độ bền của các bacteriocin thu hồi……….

74

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của các bacteriocin thu hồi….. 76
3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp giữa nhiệt độ và pH lên độ bền của các
bacteriocin thu hồi………………………………………………………… 78
3.3.4 Phản ứng với các enzyme phân hủy protein………………………... 80
3.3.5 Phân tích điện di protein trên gel polyacrylamid (SDS-PAGE)……. 81
Chương 4 - KẾT LUẬN …………………….……………………………. 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………... 85


v

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ

APS

Amoni persulfate

AU

Activity unit – đơn vị hoạt tính

bp

Base pair – cặp bazơ

BU

Bacteriocin unit – Đơn vị bacteriocin

cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethilenediaminetetra acetic acid

G-

Vi khuẩn Gram âm

G+

Vi khuẩn Gram dương

GRAS

Generally recognized as safe – được coi là an toàn

IU

International unit – Đơn vị quốc tế

LAB

Lactic acid bacteria – vi khuẩn lactic

MIC

Minimal inhibition concentration – Nồng độ ức chế tối thiểu

MRS

De Man - Rogosa - Shape

SDS

Sodiumdodecylsulfat

STT

Số thứ tự

TE

Tris - EDTA

VSV

Vi sinh vật


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
1

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng

46

2

Bảng 3.2. Tính nhạy kháng sinh của chủng PĐ14, BV20, PĐ2.9

49

3

Bảng 3.3. Số lượng tế bào của các chủng nghiên cứu sống sót

52

trên mơi trường bổ sung nisin ở các nồng độ khác nhau
4

Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

55

các chủng PĐ 14, BV20 và PĐ 2.9
5

Bảng 3.5 Động thái sinh trưởng, sinh tổng hợp bacteriocin của

56

các chủng.
6

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh

60

tổng hợp bacteriocin
7

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng

64

và sinh tổng hợp bacteriocin
8

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NaCl đến khả năng sinh trưởng và sinh

66

tổng hợp bacteriocin của các chủng BV20, 2.9, PĐ14
9

Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

68

các chủng trên mơi trường có các nguồn cacbon khác nhau.
10

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng sacharose lên sự sinh

70

trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của các chủng
11

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh trưởng và sinh tổng

71

hợp bacteriocin của các chủng .
12

Bảng 3.12. Hoạt tính bacteriocin kết tủa ở các nồng độ ethanol

72

khác nhau
13

Bảng 3.13. Kết quả thu hồi sản phẩm bacteriocin bằng phương
pháp kết tủa ethanol.

73


vii

14

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH đến độ bền hoạt tính bacteriocin

75

15

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền bacteriocin của

77

các chủng
16

Bảng 3.16.Ảnh hưởng kết hợp giữa nhiệt độ và pH lên độ bền

79

bacteriocin
17

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của một số enzym lên độ bền bacteriocin.

80


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
1

Hình 1.1. Sơ đồ cây phát sinh của vi khuẩn lactic bao gồm một số vi 6
khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện dựa trên hàm lượng G+C

2

Hình 1.2. Hai con đường chính để lên men glucose

9

3

Hình 1.3. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp lantibiotics

22

4

Hình 1.4. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II

23

5

Hình 2 . Quy trình xác định hoạt tính bacteriocin bằng phương pháp

36

khuếch tán thạch
6

Hình 3.1. Ảnh Nhuộm G dưới kính hiển vi Olimpus CH - 2 độ phóng

45

đại 1000 lần
7

Hình 3.2. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic chụp dưới

45

kính hiển vi điển tử (phóng đại 10.000 lần)
8

Hình 3.3. Kết quả điện di plasmid của các chủng nghiên cứu.

9

Hình 3.4. Đồ thị tỷ lệ phần trăm số tế bào sống sót trên mơi trường bổ 53

51

sung nisin ở các nồng độ khác nhau
10 Hình 3.5. Hoạt tính bacteriocin của tế bào chủng BV20 sống sót trên

54

mơi trường bổ sung nisin ở các nồng độ khác nhau
11 Hình 3.6. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

57

chủng PĐ14 trong thời gian từ 0 - 48h ni cấy.
12 Hình 3.7. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

57

chủng BV20 trong thời gian từ 0 - 48h ni cấy.
13 Hình 3.8. Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của

58

chủng PĐ2.9 trong thời gian từ 0 - 48h ni cấy.
14 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng, 60
phát triển và sinh bacteriocin của các chủng PĐ14
15 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ ni cấy đến khả năng sinh

61


ix

trưởng, phát triển và sinh bacteriocin của các chủng BV20
16 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ ni cấy đến khả năng sinh

61

trưởng, phát triển và sinh bacteriocin của các chủng PĐ2.9
17 Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp

63

bacteriocin của chủng PĐ14
18 Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp

63

bacteriocin của chủng BV20
19 Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp

64

bacteriocin của chủng PĐ2.9
20 Hình 3.15. Hoạt tính bacteriocin của các chủng PĐ14 trên mơi trường 67
có bổ sung nồng độ muối khác nhau
21 Hình 3.16. Ảnh hưởng của PH đến độ bền hoạt tính bacteriocin

75

22 Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền hoạt tính của dịch kết 77
tủa.
23 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền hoạt tính bacteriocin sản 78
phẩm kết tủa của chủng PĐ14
24 Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên độ bền hoạt tính

79

bacteriocin của chủng PĐ14
25 Hình 3.20. Ảnh hưởng của các Enzym phân hủy protein đối với độ bền 81
hoạt tính của các bacteriocin sản phẩm
26 Hình 3.21. Kết quả điện di SDS – PAGE trên gel polyacrylamide

82


1

MỞ ĐẦU
Bảo quản đã đang và sẽ là mối quan tâm hàng đầu của nền công nghiệp
thực phẩm trong tương lai. Sự phát triển nhanh đời sống xã hội loài người đã
làm cho nhu cầu về thực phẩm trở lên lớn hơn bao giờ hết. Trong đó, vấn đề
an tồn vệ sinh trong chế biến và bảo quản thưc phẩm trở thành vấn đề được
quan tâm đặc biệt.
Trước đây các sản phẩm thực phẩm như: thịt, cá… đã được bảo quản
bằng thuốc kháng sinh như penicilline, creomicin…Hoa Kỳ là một trong
những nước đầu tiên sử dụng kháng sinh để bảo quản thực phẩm, sữa. Sử

dụng các chất kháng sinh trong bảo quản là một trong số các nguyên nhân gây
ra tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật. Cũng chính Hoa Kỳ là nước đầu tiên
phát hiện ra tác hại này và đã đưa ra luật cấm sử dụng kháng sinh y tế trong
bảo quản.
Với tác hại nghiêm trọng như vậy, việc tìm ra một chất bảo quản an
tồn để bảo quản thực phẩm đáp ứng nhu cầu cũng như yêu cầu về an toàn
thực phẩm trở thành một vấn đề đáng được quan tâm.
Trước đây, có một số phương pháp bảo quản đã được sử dụng như: bảo
quản lạnh, lạnh đông, ướp muối, sấy, gia nhiệt, lên men, sử dụng hố
chất…Các phương pháp này có khả năng bảo quản thực phẩm trong thời gian
nhất định song nó lại làm mất đi một số đặc tính tự nhiên của sản phẩm. Để
khắc phục điều này thì một số chất diệt khuẩn được dung để tiêu diệt vi sinh
vật trong quá trình chế biến và kéo dài thời gian bảo quản. Các chất diệt
khuẩn có nguồn gốc hố học đã được dùng và nó cho thấy có thể bảo quản
được trong thời gian khá lâu nhưng nó lại thường để lại dư lượng trong các
sản phẩm và tích tụ lại trong cơ thể và gây hại cho người sử dụng.


2

Vì thế, với việc phát hiên ra nisin, một bacteriocin do vi khuẩn lactic
sinh ra đã mở ra một hướng mới trong ngành công nghiệp chế biến - bảo quản
thực phẩm. Kể từ đó đến nay, việc nghiên cứu về nisin, tìm kiếm các
bacteriocin mới và về vi khuẩn lactic thu hút sự quan tâm nghiên cứu đặc biệt
trong lĩnh vực công nghệ sinh học và thực phẩm.
Với ý nghĩa to lớn trong bảo quản thực phẩm của bacteriocin, chúng tôi
tiến hành: Đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng
hợp bacteriocin của một số chủng Latococcus phân lập từ sữa”, với mục
đích đặt ra:
1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố của chủng.

2. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.
3. Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh.
4. Nghiên cứu nhu cầu dinh dưỡng và tác động của một số yếu tố môi trường.
5. Nghiên cứu phương pháp thu hồi sản phẩm.
6. Nghiên cứu tính chất của sản phẩm thu hồi.
Với những mục tiêu nêu trên, đề tài đã thu được một số kết quả về:
1. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng tuyển chọn.
2. Hoạt tính bacteriocin của các chủng được tuyển chọn.
3. Đặc điểm kháng kháng sinh.
4. Động thái sinh tổng hợp bacteriocin.
5. Thu hồi bacteriocin và nghiên cứu được một số tính chất.


3

Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1 Vi khuẩn lactic
1.1.1 Giới thiệu chung
Vi khuẩn lactic có các đặc điểm chung là các vi khuẩn G+, khơng sinh
bào tử, hình que hoặc hình cầu, catalase âm tính, khơng có cytochrome, sinh
axit lactic như một sản phẩm chính của q trình lên men cacbonhydrat. Đây
là nhóm vi khuẩn lên men bắt buộc, chúng sinh trưởng trong mơi trường từ kỵ
khí đến vi hiếu khí. Tuy nhiên, chỉ có duy nhất đặc điểm là chúng thuộc vi
khuẩn G+ thì khơng thay đổi. Catalase và cytochrome có thể được hình thành
ở một số LAB khi ni cấy ở các điều kiện mơi trường nào đó, một số
streptococci (Streptococcus bovis) cần nguồn dinh dưỡng giới hạn, khi lên
men đường thì tạo ra rất ít axit lactic ở dưới điều kiện mơi trường đó [7, 76].
Năm 1780, nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách
được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Nhưng phải mãi đến năm 1857 hiện
tượng làm chua sữa mới đươc Pasteur chứng minh là do một nhóm vi sinh vật

đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic gây ra. Chủng vi khuẩn lactic thuần khiết đầu
tiên được đặt tên là Bacterium lactic được J. Lister phân lập năm 1873. Từ đó
đến nay hàng loạt các vi khuẩn lactic đã được phát hiện và nhưng ứng dụng
của chúng ngày càng được mở rộng ra nhiều lĩnh vực [7, 76].
Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều nơi: trong phân, rác, xác
của động thực vật, trong niêm mạc miệng, niêm mạc ruột của người và gia
súc, gia cầm. đặc biệt là sự có mặt một lượng lớn của vi khuẩn lactic trong các
sản phẩm lên men chua, trong các môi trường giàu dinh dưỡng như trong các
sản phẩm thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, đồ uống…).
Nói chung các vi khuẩn lactic không sinh sắc tố nhưng khi sinh trưởng trên
môi trường có bổ sung máu thì một số lồi lại có khả năng tạo nên các sắc tố


4

hemin tương ứng [7, 77]. Vi khuẩn lactic cũng không chứa catalase và
cytocrom (trừ một vài loài như Enterococcus feacalis được coi là có hoạt tính
pseudocatalase) [77]. Tuy nhiên một vài lồi như Lactococcus lactis,
Leuconostoc mensenteroides lại có thể khả năng tạo thành các cytocrom khi
sinh trưởng trên môi trường chứa máu; ở chúng thậm chí cịn có q trình
phosphoryl hóa, oxi hóa của chuỗi hơ hấp [7].
Vi khuẩn lactic địi hỏi nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khơng một đại
diện nào của chúng có thể phát triển trên mơi trường muối khoáng thuần khiết
chứa glucose và NH4+. Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin: lactoflavin,
tiamin, axit patotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin…và các axit amin trong
quá trình sinh trưởng, phát triển [7, 76]. Vì vậy, mơi trường ni cấy vi khuẩn
lactic thường chứa một lượng lớn các chất cung cấp axit amin và vitamin như:
cao nấm men, peptone, dịch chiết cà chua… Ngoài ra, để tăng cường khả
năng sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic, người ta cịn phải bổ sung các
muối khống Mn2+, Mg2+, Fe3+…, thậm chí bổ sung máu (ở Mỹ, người ta bổ

sung 5% máu cừu vào môi trường thạch để nuôi cấy Streptococcus; ở Anh,
người ta thường dùng 5% máu ngựa để bổ sung vào môi trường thạch…)
Cũng giống như các cơ thể nhân nguyên thủy khác, là một tế bào, vi
khuẩn lactic tiếp xúc trực tiếp với môi trường xung quanh không hề có một cơ
quan chuyên trách bảo vệ nào, do đó q trình sinh trưởng, phát triển của
chúng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện mơi trường bên ngồi. Một biến đổi
dù rất nhỏ của điều kiện nuôi cấy hoặc thành phần mơi trường cũng có ảnh
hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic, thậm chí có thể gây ức
chế hồn tồn q trình sinh trưởng, phát triển. Chủng Lactococcus lactis
subsp lactis NIZO 22186 đạt mức sinh trưởng cực đại trên mơi trường có hàm
lượng glucose ban đầu 20g/l, nhưng chỉ cần giảm hàm lượng glucose ban đầu
này xuống 10g/l thì ngay lập tức sinh trưởng, phát triển của chúng đã giảm


5

1/3 lần so với trước [34]. Tuy nhiên, khả năng thích ứng với các điều kiện
sống khác nhau cũng tùy thuộc vào từng loài, từng chủng. Nồng độ muối 5%
đã đủ để ức chế sinh trưởng, phát triển của hầu hết các vi khuẩn lactic nhưng
đối với các chủng chịu mặn được bổ sung vào thức ăn xanh ủ chua thì nồng
độ muối 5% lại tăng cường khả năng lên men của chúng [25].
1.1.2 Sự phát sinh loài [76]
Mối quan hệ về sự phát sinh loài của các vi khuẩn G dương được thể
hiện thông qua các dữ liệu về oligonucleotid và trình tự rRNA. Vi khuẩn
Gram dương được chia theo tỷ lệ % G + C của DNA cao và thấp. Điểm ranh
giới phân chia là 50%, tuy nhiên nó có thể là 53 – 55% tùy thuộc vào một số
lồi có G+ C thấp trong dãy này như Lb. fermentum và Lb. pontis. Hàm lượng
G + C cao bao gồm một số chi: Bifidobacterium, Arthrobacter, Micrococcus,
Propionibacterium, Microbacterium, Corynebacterium, Actinomyces, and
Streptomyces. Hàm lượng G + C thấp bao gồm tất cả các vi khuẩn lactic, cùng

với các vi khuẩn lên men hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện như Bacillus,
Staphylococcus, Listeria và các vi khuẩn kỵ khí như Clostridium,
Peptococcus, và Ruminococcus.
Mối quan hệ giữa các chi trong LAB và giữa LAB với các chi khác có
cùng hàm lượng G+ C thấp đã được M. D Collin và cộng sự đưa ra khi nghiên
cứu thông qua hai phương pháp là phiên mã ngược và kỹ thuật PCR. Hầu hết
vi khuẩn lactic ngày nay được định nghĩa một phần dựa trên việc đo khoảng
cách phát sinh loài đối với trường hợp của Aerococcus, Carnobacterium,
Enterococcus,

Lactococcus,

Leuconostoc

sensu

stricto,

Oenococcus,

Streptococcus sensu stricto, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella mỗi
loại trong các chi này đều đã được tính tốn chính xác về đơn vị phát sinh
lồi. LAB khơng thực sự phân chia rõ ràng đối với các vi khuẩn Gram dương
có hàm lượng G + C thấp khác.


6

Hình 1.1. Sơ đồ cây phát sinh của vi khuẩn lactic bao gồm một số vi
khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy tiện dựa trên hàm lượng G+C

1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic
Vào năm 1919, Orla-Jensen đã đưa ra một số đặc điểm đặc trưng để
phân loại vi khuẩn lcatic. Nhờ các đặc điểm này mà công việc phân loại vi
khuẩn lactic được rõ ràng hơn rất nhiều và chúng vẫn cịn là một cơng cụ
phân loại hữu ích cho đến ngày nay. Các đặc điểm để phân loại lactic mà
Orla-Jensen đưa ra bao gồm: các đặc điểm hình thái (dạng hình que, cầu hay
dạng tetrad), kiểu lên men đường glucose (lên men đồng hình hay lên men dị
hình), khả năng sinh trưởng ở các ngưỡng nhiệt độ (100C hay 450C) và khả
năng sử dụng một số các loại đường khác nhau. Dựa trên những đặc điểm
phân loại của Orla – Jensen thì LAB được chia thành 4 chi: Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus, và Streptococcus. Nếu phân loại theo định nghĩa
phổ rộng về đặc điểm sinh lý và sinh hố thì nhóm vi khuẩn lactic bao gồm
khoảng 20 chi [76]. Thực tế trong ngành cơng nghiệp thực phẩm thì các chi


7

được coi là nhóm vi khuẩn lactic chính bao gồm:

Aerococcus,

Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, và
Weissella. Chi Bifidobacterium thường được coi như vi khuẩn lactic vì nó có
mang một số đặc điểm của vi khuẩn lactic. Các chi mới như Alloiococcus,
Dilosicoccus, Dilosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella,
Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera bao gồm một số chủng có quan
hệ với LAB cả về đặc điểm sinh lý cũng như hệ thống phát sinh loài [76].
Sự phân loại vi khuẩn lactic thành các chi khác nhau phần lớn dựa trên
sự khác nhau về hình thái, cơ chế lên men đường, khả năng sinh trưởng ở các

điều kiện nhiệt độ khác nhau, dạng sản phẩm axit lactic, khả năng sinh trưởng
ở các nồng độ muối khác nhau và khả năng chịu axit hay kiềm. Đặc điểm hoá
học như thành phần axit béo và thành phần cấu tạo thành tế bào cũng được sử
dụng để phân loại. Hơn nữa, các kỹ thuật phân loại ngày nay dựa trên mối
quan hệ về phylogenetic, phân loại dựa trên việc xác định trình tự rRNA, mối
quan hệ gần gũi ở mức độ lồi hay dưới lồi có thể được xác định dựa trên
các nghiên cứu sự tương đồng DNA-DNA. Để xác định sự phát sinh kiểu gen
của lồi và chi, thì phương pháp nghiên cứu dựa trên trình tự rRNA là phù
hợp hơn cả vì nó có chứa cả các vùng có trình tự bảo thủ và ít bảo thủ.
Dựa vào đặc điểm hình thái thì vi khuẩn lactic được chia thành hai loại
đó là dạng hình que (gồm có Lactobacillus và Carnobacterium) và hình cầu
(tất cả các chi còn lại). Riêng chi Weissella theo định nghĩa thi nó gồm cả hai
dạng là hình que và hình cầu. Trong dạng hình cầu lại có một số chi tồn tại ở
dạng tetrad như Aerococcus, Pediococcus, và Tetragenococcus.
Dựa theo khả năng lên men đường thì vi khuẩn lactic được chia làm hai
nhóm: là nhóm lên men đồng hình (Glycolysis hay là con đường EmbdenMeyerhof-Parnas) và nhóm lên men dị hình (con đường 6 phosphogluconate /


8

phosphoketolase) [7, 8, 76]. Hầu hết các LAB sử dụng quá trình đường phân
theo con đường Embden-Meyerhof-Parnas. Ngoại trừ leuconostoc, oenococci
và weissella và một số dưới nhóm lactobacilli có cơ chế lên men dị hình cịn
tất cả các LAB khác đều lên men đồng hình [76].
Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường
EMP (Embden-Meyerhof-Parnas path way) và cho ta sản phẩm chủ yếu là
axit lactic từ 90 – 98%[5, 88]. Chỉ một phần nhỏ pyruvat được decarboxyl hóa
thành axit axetic, etanol, axetoin và CO2. Mức độ tạo thành các sản phẩm này
phụ thuộc vào sự có mặt của O2. Đại diện của các vi khuẩn lactic lên men
đồng hình như: Lc. lactis, E. faecalis, Str. salivarius, Str. pyogenes, S.

thermophilus, Lb. helveticus, Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. platarum …
Các vi khuẩn lactic dị hình do thiếu hai 2 enzym chủ yếu của con
đường EMP là aldolase và triozophosphat-isomerase nên giai đoạn đầu của
quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đường PP (Pentose phosphat).
Quá trình chuyển hóa triozophosphat thành axit lactic xảy ra giống như trong
lên men đồng hình [7, 76]. Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men lactic dị
hình vẫn là axit lactic (40%), ngồi ra, tùy từng lồi có thể tạo them các sản
phẩm khác như: axit xucinic và rượu etylic khoảng 20%, axit axetic khoảng
10%, các chất khí cịn lại chiếm 20%[7]. Đại diện các vi khuẩn lên men dị
hình như: Ln. mensenteroides, Ln. cremoris và một số vi khuẩn lactic hình
que như Lb. brevis, Lb. fermentum, ….


9

Hình 1.2. Hai con đường chính lên men glucose: (A) lên men lactic đồng
hình (glycolysis hay Embden-Meyerhof-Parnas pathway); (B) con đường lên
men lactic dị hình (6-phosphogluconate/phosphoketolase pathway). Thứ tự
các enzyme được đánh dấu cho phản ứng: 1. Glucokinase; 2. fructose-1,6diphosphate aldolase; 3. Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4.
pyruvate

kinase;

5.

Lactate

dehydrogenase;

6.

glucose-6-phosphate

dehydrogenase; 7. 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8. phosphoketolase; 9.
acetaldehyde dehydrogenase; 10. alcohol dehydrogenase.


10

1.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có lịch sử nghiên cứu lâu dài và nó
được coi là an tồn cho người sử dụng. Vi khuẩn lactic đã được sử dụng trong
công nghiệp từ rất nhiều năm nay bởi chúng có thể lên men đường (bao gồm
cả lactose) và một số nguồn cacbonhydrat khác thành axit lactic. Điều này
không chỉ đem lại vị ngon, làm mềm các sản phẩm lên men hàng ngày giống
như sữa chua, mà còn tạo ra axit lactic làm giảm pH của mơi trường dẫn tới
có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hỏng, gây thối do đó nó
rất có lợi cho sức khỏe và có khả năng ngăn chặn sự phát triển của các vi
khuẩn gây bệnh có trong đường ruột. Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các
axit hữu cơ, enzyme, vitamin, các hợp chất chống oxy hóa, EPS
(exopolysacharide) và các chất kháng khuẩn [71, 76]. Vi khuẩn lactic còn
được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic được dùng cho con người
và gia súc, gia cầm [1, 2, 7, 14, 76]. Dưới đây là một số ứng dụng của vi
khuẩn lactic:
Ứng dụng đầu tiên của vi khuẩn lactic là trong ngành công nghiệp sản
xuất axit lactic, một nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho nhiều ngành công
nghiệp. Axit lactic được sử dụng trong ngành công nghiệp thuộc da (làm mềm
và nở da), trong công nghiệp dệt (làm thuốc nhuộm), trong in ấn, sơn (có vai
trị như dung mơi trong sơn), trong ngành cơng nghiệp chế tạo chất dẻo có
khả năng phân hủy sinh học PLA…. PLA là sản phẩm nhựa phân huỷ sinh

học được chế tạo từ axit lactic đã đem lại cho loài người một nguồn nguyên
liệu mới thân thiện với mơi trường. Ngồi ra, muối lactat với các nguyên tố vi
lượng thường được dùng làm dược phẩm bổ sung cho cơ thể dưới dạng dễ
hấp thụ.
Ứng dụng lớn thứ hai của vi khuẩn lactic là trong công nghiệp chế biến
và bảo quản thực phẩm. Lên men lactic sinh ra các axit hữu cơ (axit lactic,


11

axit axetic,…) do đó làm giảm pH của mơi trường. Ở pH thấp này hầu hết các
VSV gây thối hỏng thực phẩm như: B. subtilis, P. vulgaris, B. mensenterium,
Clostridium hay Acromobacter [12] và các VSV gây bệnh có trong thực phẩm
tự nhiên như: E. coli, Pseudomonas sp, Sarcina sp, Samonella sp…[14, 46,
75, 76] đều bị tiêu diệt. Ngoài khả năng sinh axit hữu cơ làm giảm pH môi
trường, một số chủng vi khuẩn lactic cịn có khả năng sinh ra các chất ức chế
như diaxetyl, hydroperoxyt, axetaldehyt và đặc biệt là bacteriocin.
Diaxetyl ức chế mạnh đối với vi khuẩn G-, nấm mốc, đặc biệt là đối với
M.tuberculosis.
Hydroperoxyt ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn nhạy cảm nhờ khả
năng oxy hóa mạnh kìm hãm sự phát triển của S. aureus, Pseudomonas,
Proteus, Flavobacter, Achromobacter.
Axetaldehyt ức chế sự sinh sản của E. coli
Bacteriocin thực sự là một phát hiện có giá trị trong bảo quản thực
phẩm lên men cũng như không lên men. Bacteriocin của vi khuẩn lactic có
khả năng ức chế chủ yếu các vi khuẩn G+ có quan hệ họ hàng với chủng sinh
bacteriocin đó, một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức
chế vi khuẩn G âm và G dương [76].
Nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế trên cho nên lên men lactic, từ lâu
đã thành một biện pháp bảo quản thực phẩm hữu hiệu trong dân gian: các

hình thức muối dưa, muối cà, nem chua, sữa chua…. Lên men lactic đồng
thời cũng sinh ra các hợp chất vòng thơm, các axit amin tự do… do đó sản
phẩm lên men lactic rất giàu dinh dưỡng và có hương vị thơm ngon đặc trưng.
Có thể kể đến một vài sản phẩm lên men lactic từ sữa như: sữa chua,
phomat,…
Sữa chua là món ăn truyền thống của nhiều dân tộc: sữa ngựa chua của
Mông Cổ được lên men lactic tự nhiên từ sữa tươi hoặc dùng hạt kefir làm


12

giống ban đầu. Hiện nay trong công nghiệp thường dùng các chủng thuần
khiết để lên men như: Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, S.
cremoris, S. diacetylactis…
Phomat cũng là món ăn truyền thống của dân vùng khí hậu lạnh. Q
trình làm chín và tạo hương cho phomat chính là nhờ các vi khuẩn lactic.
Hiện nay có rất nhiêu loại phomat nổi tiếng được sản xuất cơng nghiêp. Tùy
từng loại phomat mà q trình lên men có thể do các tập đồn VSV khác nhau
tham gia, thường bao gồm các vi khuẩn propionic, nấm men, nấm mốc, vi
khuẩn lactic [7].
Ngoài các sản phẩm lên men rau quả tự nhiên như: dưa muối, cà muối,
kim chi…ngày nay lên men lactic được sử dụng để ủ chua thức ăn xanh cho
gia súc, dự trữ một nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc trong suốt mùa
đông lạnh [1, 24, 25]. Vi khuẩn lactic thường được sử dụng để ủ chua thức ăn
xanh là L.plantarum.
Khả năng phân giải protein của vi khuẩn lactic được ứng dụng để chế
biến và bảo quản thịt cá. Trong dân gian, người ta sử dụng lên men lactic để
tạo ra các sản phẩm: nem chua, tôm chua, cá muối chua (Việt Nam), salami
(Ý), xúc xích, jambon, thịt hun khói (các nước châu âu)…
Gần đây, hệ thống enzym phân giải protein ở Lactococcus đã được

nghiên cứu một cách khá đầy đủ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi [2, 47].
Lên men lactic trong bảo quản thịt, cá, và các phế phụ phẩm của chúng
dành cho chăn nuôi [3, 58]. Các sản phẩm thịt, cá lên men lactic có hàm
lượng axit amin tự do cao, mùi vị thơm ngon, lại không bị nhiễm các vi sinh
vật gây thối hỏng thực phẩm, các VSV gây bệnh…nên rất được ưa chuộng.
Bên cạnh khả năng sinh ra các chất ức chế được ứng dụng trong chế
biến, bảo quản thực phẩm, vi khuẩn lactic lên men lactic dị hình cịn được sử
dụng để tạo ra hương vi cho sản phẩm bảo quản. Nhờ khả năng sinh các chất


13

thơm như diaccetyl, axetaldehyt… của các vi khuẩn lên men lactic dị hình
như: L. diacetylactis, các sản phẩm lên men lactic (phomat, sữa chua) có mùi
thơm và hương vị đặc trưng. Lên men lactic dị hình của Leuconostoc oenos
trong rượu vang và các sản phẩm nước hoa quả cũng tạo hương thơm đặc
trưng và vị chua nhẹ cho các sản phẩm này [75, 77].
Gần đây, người ta đã phát hiện ra vai trò to lớn của vi khuẩn lactic đối
với sức khỏe con người cũng như động vật nuôi. Khu hệ vi khuẩn lactic trong
đường ruột người và động vật đóng một vai trị quan trọng, chúng cạnh tranh
với các VSV gây bệnh, giúp tăng cường tiêu hóa và bảo vệ ruột. Những
nghiên cứu gần đây về khu hệ VSV trong đường tiêu hóa của người, gia súc,
gia cầm [24, 46, 54] đều gắn liền với việc tạo ra các chế phẩm sống giúp cân
bằng hệ VSV đường ruột [46], giảm lượng cholesteron trong máu, chữa các
bệnh rối loạn đường ruột, bệnh không dung nạp lactose, bệnh viêm dạ dày cấp
tính và nhiều bệnh đường ruột khác [75] đồng thời tạo ra nhiều thức ăn bổ
sung khoáng, vitamin cho người bệnh, những người ăn kiêng và cả gia súc gia
cầm.
Bên cạnh những mặt có lợi nêu trên, vi khuẩn lactic cũng gây một số
tác hại đối với sức khỏe con người cũng như trong công nghiệp. Trong công

gnhiệp sản xuất rượu vang, bia, nước ngọt, hiện tượng nhiễm một số vi khuẩn
lactic (L.manitoporum) sẽ làm vẩn đục và làm chua sản phẩm; có khi gây hư
hại cả một giai đoạn quá trình lên men rượu [7]. Một số vi khuẩn lactic ký
sinh ở người, gia súc, gia cầm khi phát triển quá mức sẽ gây bệnh. VD:
Enterococcus faecalis gây bệnh tim cấp [75].
Vi khuẩn lactic đem lại lợi nhuận to lớn từ các ứng dụng nhiều mặt của
chúng. Để nâng cao hiệu quả của các ứng dụng đó, trong những năm gần đây,
bên cạnh việc thu thập, tuyển chọn các vi khuẩn lactic cho năng xuất cao,
người ta đã nghiên cứu áp dụng các tành tựu của sinh học phân tử , kỹ thuật di


14

truyền trên các vi khuẩn lactic và đã thu được một số thành cơng nhất định.
Đó là các cơng trình nghiên cứu thiết lập hệ thống biến nạp cho vi khuẩn
lactic với các hệ vectơ tách dòng, vectơ biểu hiện [2, 47].
Việc phát hiện ra bacteriocin của vi khuẩn lactic đã mở ra một hướng
mới trong công nghiệp chế biến và bảo quản các sản phẩm thực phẩm.
Bacteriocin của vi khuẩn lactic thực sự là một phát hiện có giá trị trong bảo
quản thực phẩm lên men cũng như không lên men. Bacteriocin của vi khuẩn
lactic có khả năng ức chế chủ yếu các vi khuẩn G+ có quan hệ họ hàng với
chủng sinh bacteriocin đó.
1.2 Bacteriocin
1.2.1 Lịch sử nghiên cứu về bacteriocin
Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức
chế lẫn nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường
được tìm thấy có mặt trong nước tiểu [79]. Những nghiên cứu tiếp theo của
Florey và cs cũng khám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu
(diphtheria) bằng các vi sinh vật khơng gây bệnh, có tính đối kháng. Năm
1925, Gratia đã phát hiện ra sự ảnh hưởng lẫn nhau của hai chủng E. coli. Đến

năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra nisin, một polypeptide do
chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng Lactococcus lactis.
1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng E.
coli V có khả năng ức chế E. coli và gọi tên là “colicine”. Vào năm 1953,
Jacop và cs đã sử dụng thuật ngữ “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các
chất kháng khuẩn có bản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật. Năm 1982
theo Konisky thì thuật ngữ colicine ngày nay được dùng để chỉ các
bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng thuộc loài E. coli và có quan hệ
gần với họ Enterobacteriaceae. Chính vì thế mà ý nghĩa ban đầu của thuật ngữ
bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: có phổ kháng khuẩn hẹp


15

và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [26]. Sau đó, phát hiện
bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid. Tại đây
cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các
chủng vi khuẩn G+ [26, 79]. Bacteriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn G+
khơng có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng
thấp hơn colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác
dụng rộng hơn và khác nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào
và nó có thể có trình tự đầu được phân chia trong giai đoạn thành thục [26,
52].
Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin - một sản phẩm do vi sinh vật
sinh ra có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã
được nghiên cứu rất nhiều về các đặc tính sinh hố cũng như các đặc điểm về
di truyền ở cấp độ phân tử bởi vai trị của nó trong vấn đề bảo quản.
Bacteriocin có đặc tính giống như một kháng sinh vì nó có khả năng kháng
khuẩn nhưng bacteriocin không phải là kháng sinh. Bacteriocin khác với các
kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tác dụng, tính miễn

dịch của chủng sản, đích tấn cơng,…[28]. Bacteriocin có bản chất protein,
được tồng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp có khả năng ức chế các
vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [30, 32, 79]. Theo Joger và cs năm 2000,
bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân huỷ rất
nhanh bởi enzyme phân huỷ protein trong hệ tiêu hố của người. Vì vậy, để
nghiên cứu bản chất protein của những bacteriocin mới người ta thường thử
khả năng nhạy cảm của chúng với các enzyme phân huỷ protein.
1.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic không chỉ được biết đến như một vi khuẩn tạo hương
trong thực phẩm lên men mà còn tạo ra chất kháng khuẩn – bacteriocin.
Bacteriocin của vi khuẩn lactic được xem như một giải pháp mới hữu hiệu để