Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp kháng nguyên bảo vệ pa từ vi khuẩn bacillus anthracis và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh than

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Phạm Kiều Thúy
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP KHÁNG
NGUYÊN BẢO VỆ PA TỪ VI KHUẨN Bacilus anthracis VÀ
ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH THAN

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS Ngơ Đình Bính

Hà Nội 10 - 2008


LÝ LỊCH KHOA HỌC
Họ và tên: Phạm Kiều Thúy
Ngày sinh: 19-9-1982
Nơi sinh: Hà Nội
Địa chỉ: Số 57 ngõ 134 Trương Định, Hai Bà Trưng, Hà Nội
Nguyên quán: Thanh Trì, Hà Nội
Quá trình học tập:
1988-1993: Học sinh cấp 1, Trường Tiểu học Trung Hiền
1993-1997: Học sinh cấp 2, Trường THCS Nguyễn Phong Sắc
1997-2000: Học sinh cấp 3, Trường THPH Thăng Long
2000-2004: Sinh viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội
2004 đến nay: Nghiên cứu viên, Phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
Địa chỉ nơi công tác: 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Tel +84 4 756 2880

Các cơng trình cơng bố:
1. Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Tuấn, Đinh Duy Kháng, Ngơ Đình Bính (2008),
“Biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên bảo vệ PA”, Chuyên san Tạp chí Cơng
nghệ Sinh học,(Đang in).
2. Phạm Kiều Thúy, NguyễnÁnh Nguyệt, Phạm Minh Tuấn, Ngơ Đình Bính
(2008), “Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA từ vi khuẩn Bacillus
anthracis trong E. coli”, Kỷ yếu hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 : Hóa
sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghệ thực phẩm,
NXB KHKT, Hà Nội, 765-767.
3. Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Đặng
Tơn, Nơng Văn Hải, Ngơ Đình Bính (2006), “Tách dịng và đọc trình tự đoạn
gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng vi khuẩn Bacillus anthracis
VCM 1167”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 4: 447-454.
4. Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn
ánh Nguyệt Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Th, Ngơ Đình Bính, (2005),
“Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của Bacillus thuringiensis phân lập


một số tỉnh thuộc vùng Đơng Bắc Bộ”, Tạp chí Di truyền và Ứng dụng, 4: 2934.
5. Ngo Dinh Binh, Nguyen Xuan Canh, Nguyen Anh Nguyet, Nguyen Dinh Tuan,
Pham Kieu Thuy, Nguyen Thanh Hanh, Shin-ichiro Asano, Michio Ohba,
(2007), “Characterization of Bacillus thuringiensis strains in the Vietnamese
Bacillus thuringiensis Collection”, Proceedings of the 6th

Pacific Rim

Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and Its
Environmental Impact. Edited by Jean-Charles Cote, Imre S. Otvos, Jean-Louis
Schwartz. Science Publishing and Creative Service Agriculture and Agri-Food
Canada, 26-130.

6. Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt,
Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Trịnh Thị Thu Hà, Ngơ Đình Bính,
Dương Văn Hợp, (2007), “Nghiên cứu sự phân bố và một số đặc điểm sinh học
của vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại vườn Quốc gia Cát Bà. Báo cáo
khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật”, Hội nghị khoa học Toàn quốc lần
thứ 2, Nxb Nơng nghiệp, 277-283.
7. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Th, Nguyễn Thị
Thanh Hạnh, Ngơ Đình Bính (2006), “Tách dịng và đọc trình tự đoạn gen pag
mã hóa kháng nguyên bảo vệ

từ chủng vi khuẩn Bacillus anthracis

VCM1167”, Kỷ yếu Hội thảo Nghiên cứu Phịng chống Vũ khí Hạt nhân, Sinh
học, Hóa học (NBC), 109-118.
8. Ngơ Đình Bính, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Thanh
Hạnh, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Th (2005), “Tách dịng và đọc trình
tự gen cry1D từ hai chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis TQ3-3 và HT21-1”,
Hội nghị Khoa học tồn quốc về Cơng nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản
hướng 8.2, 194-196.
9. Ngô Đình Bính, Nguyễn Xn Cảnh, Phạm Kiều Th, Nguyễn Thị Ánh
Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh (2005), “Nghiên cứu một số
đặc tính sinh học của vi khuẩn Bacillus cereus phân lập ở Việt Nam”, Kỷ yếu
Hội nghị Khoa học Vệ sinh An toàn Thực phẩm lần thứ 3. Nxb Y học. 120-125.
10. Ngơ Đình Bính, Nguyễn Xn Cảnh, Phạm Kiều Th, Nguyễn Ánh Nguyệt,
Nguyễn Đình Tuấn, Hồng Ngọc Hiển, Lê Thu Hồng, Nguyễn Thái Sơn


(2005), “Phát hiện vi khuẩn Vibrio cholerae gây bệnh tả bằng phương pháp
miễn dịch huỳnh quang và PCR”, Kỷ yếu hội nghị khoa học vệ sinh an toàn
thực phẩm lần thứ 3. Nxb Y học.126-131.

11. Ngơ Đình Bính, Phạm Minh Hương, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Xuân Cảnh,
Phạm Việt Cường, Trần Đình Mấn, Vi Thị Đoan Chính (2004), “Nghiên cứu sử
dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces longisporus 198a để chống bệnh héo xanh
do vi khuẩn Ralstonia solanacearum”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc
2004 nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống định hướng Nông Lâm nghiệp
miền núi, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, 325-318.
12. Ngo DB, Nong H, Pham KT, Nguyen DT, Dinh DK (2006), “Bacillus
anthracis patial pa gene for protective antigen, ACCESSION AM404332”.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
cơng bố trong cơng trình nghiên cứu khác.

Hà Nội ngày 23 tháng 10 năm 2008
Tác giả

Phạm Kiều Thúy


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đình Bính - Trưởng phịng Di Truyền
Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
hướng dẫn tơi trong q trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phịng Di Truyền Vi Sinh Vật đã ln
giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Duy Kháng cùng tập thể phịng Vi sinh
phân tử, PGS.TS Nơng Văn Hải cùng tập thể phịng ADN Ứng dụng, Viện Cơng nghệ
sinh học đã giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thày, cô khoa Công nghệ sinh học, thực
phẩm; trung tâm Đào tạo sau đại học, Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ
tơi trong q trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động
viên tơi trong suốt q trình học tập và cơng tác.
Xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ nhiệt tình và q báu đó!

Hà Nội, ngày 23 tháng 10 năm 2008
Học viên

Phạm Kiều Thúy


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN

3

1.1.

Bệnh than và các dạng bệnh than

3

1.1.1.

Bệnh than thể da

3

1.1.2.

Bệnh than thể tiêu hóa

4

1.1.3.

Bệnh than hô hấp

5

1.1.4.

Bệnh than thể màng não

6

1.2.

Tác nhân gây bệnh than

6

1.2.1.

Đặc điểm của vi khuẩn than (Bacillus anthracis)

6

1.2.2

Sự hình thành bào tử

7

1.2.3.

Sự tương tác giữa bào tử Bacillus anthracis và đại thực bào

8

1.3.

Các độc tố của vi khuẩn Bacillus anthracis

10

1.3.1.

Độc tố than (Anthrax Toxin)

10

1.3.1.1. Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective Antigen)

10

1.3.1.2. Độc tố gây phù thũng (Edema Factor-EF)

10

1.3.1.3. Độc tố gây chết (Lethal Factor-LF)

13

1.3.2.

Độc tố vỏ nhày (Capsule Toxin)

14

1.4.

Sự biểu hiện của các độc tố

15

1.5.

Kháng nguyên bảo vệ PA

18

1.5.1.

Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA

18

1.5.2.

Cấu trúc và đặc tính của kháng nguyên bảo vệ PA

19

1.5.3.

Đặc điểm gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA

22

1.5.4.

Quá trình dịch mã kháng nguyên bảo vệ PA từ gen cấu trúc pagA

23

1.6.

Cơ chế gây bệnh

24

1.6.1.

Cơ chế chung

24

1.6.2.

Các giai đoạn xảy ra trong quá trình xâm nhiễm

25

1.6.2.1. Liên kết thụ thể

25

1.6.2.2. Q trình hoạt hóa PA bởi protease

26

1.6.2.3. Q trình oligomer hóa

27

1.6.2.4. Q trình liên kết EF/LF

27

1.6.2.5. Quá trình thực bào trung gian thụ thể

28

1.6.2.6. Sự hình thành lỗ màng

28

1.6.2.7. Sự vận chuyển qua màng

30

1.7.

Tình hình nghiên cứu biểu hiện và ứng dụng protein tái tổ hợp kháng 31
nguyên bảo vệ PA

1.8.

Hệ thống biểu hiện

33

1.8.1.

Vector biểu hiện

33

1.8.2.

Lựa chọn chủng biểu hiện

36

PHẦN 2-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

38

2.1.

Vật liệu

38

2.1.1.

Sinh phẩm

38

2.1.2.

Hố chất và mơi trường

38

2.1.3.

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

44

2.2.

Phương pháp nghiên cứu

45

2.2.1.

Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn

45

2.2.2.

Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

46

2.2.3.

Phương pháp PCR

47

2.2.4.

Phương pháp gắn đoạn gen pagA vào vector

48

2.2.4.1. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1

48

2.2.4.2. Phương pháp gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS

48

2.2.5.

Phương pháp làm tế bào khả biến E. coli

48

2.2.6.

Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến

49

2.2.7.

Phương pháp cắt bằng enzym giới hạn

49

2.2.8.

Phương pháp thôi gel

51

2.2.9.

Phương pháp điện di trên gel agarose

52

2.2.10.

Phương pháp xác định trình tự acid nucleic

53

2.2.11.

Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

53

2.2.12.

Phương pháp biểu hiện gen

54

2.2.13.

Phương pháp khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho q trình biểu

54

hiện
2.2.14.

Xác định khả năng hồ tan của protein

55

2.2.15.

Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin

55

2.2.16.

Phương pháp định lượng protein

57


2.2.17.

Phương pháp thu nhận kháng thể kháng PA tái tổ hợp và kháng thể kháng

58

bệnh than tự nhiên
2.2.18.

Phương pháp Western Blot

58

2.2.19.

Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng bệnh than

61

2.2.20.

Phương pháp Dot blot phát hiện kháng thể kháng bệnh than

61

CHƯƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

63

3.1.

Tách chiết DNA tổng số

63

3.2

Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR

63

3.3

Tách dòng gen pagA

64

3.3.1.

Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α

64

3.3.2.

Kiểm tra sự tồn tại của gen pagA trong vectơ tái tổ hợp

65

3.3.3.

Đọc trình tự gen pagA

69

3.4.

Biểu hiện gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA

72

3.4.1.

Thiết kế vector biểu hiện mang gen pagA

72

3.4.2.

Gắn đoạn gen pagA vào vector biểu hiện pET-TRX-FUS

73

3.4.3.

Tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA

74

3.4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA vào chủng trung gian E.

74

coli DH5α
3.4.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của pagA trong plasmid tái tổ hợp

75

3.4.3.3. Kiểm tra khung đọc của vector tái tổ hợp pET-TRX-FUS-pagA

77

3.4.3.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-TRX-pagA vào BL21 (DE3)

78

Nghiên cứu biểu hiện gen pagA trong E. coli BL21

79

3.4.4.

3.4.4.1. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện gen pagA

79

3.4.4.2. Xác định khả năng hòa tan và định khu protein

83

3.5.

Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Niken Probond

85

3.6.

Khẳng định sự biểu hiện của protein tái tổ hợp PA bằng phản ứng

85

Western blot
3.7.

Phát hiện kháng thể kháng bệnh than trong huyết thanh bệnh nhân bằng

87

phản ứng Dot blot và ELISA
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

92


1

PHỤ LỤC
M22589

CAGAAGTTAA ACAGGAGAAC CGGTTATTAA ATGAATCAGA ATCAAGTTCC CAGGGGTTAC

VCM1167

.C........ .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

TG........ .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TAGGATACTA TTTTAGTGAT TTGAATTTTC AAGCACCCAT GGTGGTTACC TCTTCTACTA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .........T ..........

M22589

CAGGGGATTT ATCTATTCCT AGTTCTGAGT TAGAAAATAT TCCATCGGAA AACCAATATT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TTCAATCTGC TATTTGGTCA GGATTTATCA AAGTTAAGAA GAGTGATGAA TATACATTTG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CTACTTCCGC TGATAATCAT GTAACAATGT GGGTAGATGA CCAAGAAGTG ATTAATAAAG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CTTCTAATTC TAACAAAATC AGATTAGAAA AAGGAAGATT ATATCAAATA AAAATTCAAT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

60

120

180

240

300

360

Luận văn cao học


2

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

ATCAACGAGA AAATCCTACT GAAAAAGGAT TGGATTTCAA GTTGTACTGG ACCGATTCTC

VCM1167

.......... .G........ .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

AAAATAAAAA AGAAGTGATT TCTAGTGATA ACTTACAATT GCCAGAATTA AAACAAAAAT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CTTCGAACTC AAGAAAAAAG CGAAGTACAA GTGCTGGACC TACGGTTCCA GACCGTGACA

VCM1167

.......... ..A.....G. .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

ATGATGGAAT CCCTGATTCA TTAGAGGTAG AAGGATATAC GGTTGATGTC AAAAATAAAA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

GAACTTTTCT TTCACCATGG ATTTCTAATA TTCATGAAAA GAAAGGATTA ACCAAATATA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

AATCATCTCC TGAAAAATGG AGCACGGCTT CTGATCCGTA CAGTGATTTC GAAAAGGTTA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

420

480

540

600

660

720

Luận văn cao học


3

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CAGGACGGAT TGATAAGAAT GTATCACCAG AGGCAAGACA CCCCCTTGTG GCAGCTTATC

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CGATTGTACA TGTAGATATG GAGAATATTA TTCTCTCAAA AAATGAGGAT CAATCCACAC

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

AGAATACTGA TAGTGAAACG AGAACAATAA GTAAAAATAC TTCTACAAGT AGGACACATA

VCM1167

.......... ....C..... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... ....C..... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... ....C..... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... ....C..... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... ....C..... .......... .......... .......... ..........

M22589

CTAGTGAAGT ACATGGAAAT GCAGAAGTGC ATGCGTCGTT CTTTGATATT GGTGGGAGTG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... .....T....

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TATCTGCAGG ATTTAGTAAT TCGAATTCAA GTACGGTCGC AATTGATCAT TCACTATCTC

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TAGCAGGGGA AAGAACTTGG GCTGAAACAA TGGGTTTAAA TACCGCTGAT ACAGCAAGAT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

780

840

900

960

1020

1080

Luận văn cao học


4

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TAAATGCCAA TATTAGATAT GTAAATACTG GGACGGCTCC AATCTACAAC GTGTTACCAA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CGACTTCGTT AGTGTTAGGA AAAAATCAAA CACTCGCGAC AATTAAAGCT AAGGAAAACC

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

AATTAAGTCA AATACTTGCA CCTAATAATT ATTATCCTTC TAAAAACTTG GCGCCAATCG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CATTAAATGC ACAAGACGAT TTCAGTTCTA CTCCAATTAC AATGAATTAC AATCAATTTC

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TTGAGTTAGA AAAAACGAAA CAATTAAGAT TAGATACGGA TCAAGTATAT GGGAATATAG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CAACATACAA TTTTGAAAAT GGAAGAGTGA GGGTGGATAC AGGCTCGAAC TGGAGTGAAG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

1140

1200

1260

1320

1380

1440

Luận văn cao học


5

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TGTTACCGCA AATTCAAGAA ACAACTGCAC GTATCATTTT TAATGGAAAA GATTTAAATC

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TGGTAGAAAG GCGGATAGCG GCGGTTAATC CTAGTGATCC ATTAGAAACG ACTAAACCGG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

ATATGACATT AAAAGAAGCC CTTAAAATAG CATTTGGATT TAACGAACCG AATGGAAACT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TACAATATCA AGGGAAAGAC ATAACCGAAT TTGATTTTAA TTTCGATCAA CAAACATCTC

VCM1167

.......... .......... .......... ....C..... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

AAAATATCAA GAATCAGTTA GCGGAATTAA ACGCAACTAA CATATATACT GTATTAGATA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... ...T...... .......... ..........

M22589

AAATCAAATT AAATGCAAAA ATGAATATTT TAATAAGAGA TAAACGTTTT CATTATGATA

VCM1167

.......... .......... .......... .G........ .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

1500

1560

1620

1680

1740

1800

Luận văn cao học


6

M22589

GAAATAACAT AGCAGTTGGG GCGGATGAGT CAGTAGTTAA GGAGGCTCAT AGAGAAGTAA

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

TTAATTCGTC AACAGAGGGA TTATTGTTAA ATATTGATAA GGATATAAGA AAAATATTAT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CAGGTTATAT TGTAGAAATT GAAGATACTG AAGGGCTTAA AGAAGTTATA AATGACAGAT

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

ATGATATGTT GAATATTTCT AGTTTACGGC AAGATGGAAA AACATTTATA GATTTTAAAA

VCM1167

.......... .......... .......A.. .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

AATATAATGA TAAATTACCG TTATATATAA GTAATCCCAA TTATAAGGTA AATGTATATG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

M22589

CTGTTACTAA AGAAAACACT ATTATTAATC CTAGTGAGAA TGGGGATACT AGTACCAACG

VCM1167

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

1860

1920

1980

2040

2100

2160

Luận văn cao học


7

M22589

GGATCAAGAA AATTTTAATC TTTTCTAAAA AAGGCTATGA GATAGGATAA

VCM1167

.........G .......... .......... .......... ..........

AY997299

.......... .......... .......... .......... ..........

AY700758

.......... .......... .......... .......... ..........

AF306778

.......... .......... .......... .......... ..........

AF306782

.......... .......... .......... .......... ..........

2210

Hình 3.8. So sánh trình tự gen pagA của chủng B. anthracis VCM1167 với các trình tự
đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

Luận văn cao học


DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bệnh than thể da
Hình 1.2. Manh tràng của bệnh nhân nhiễm than đường tiêu hóa
Hình 1.3. Phổi (1) và trung thất (2) của khỉ nhiễm than đường hơ hấp
Hình 1.4. Não của khỉ nhiễm than thể màng não
Hình 1.5. Tế bào (1) và bào tử (2) B. anthracis
Hình 1.6. Nhân tố gây phù thũng EF
Hình 1.7. Nhân tố gây chết LF
Hình 1.8. Điều khiển các gen độc tố trong vi khuẩn B. anthracis
Hình 1.9. Cấu trúc PA83
Hình 1.10. Cấu trúc vịng heptam (PA63)7 và tiền lỗ màng (prepore)
Hình 1.11. Cơ chế gây bệnh của Bacillus anthracis
Hình 1.12. Vector biểu hiện
Hình 1.13. Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pET-28a(+)
Hình 2.1. Mơ hình phản ứng Western blot
Hình 2.2. Mơ hình phản ứng ELISA

Hình 2.3. Mơ hình phản ứng Dot blot
Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel 0,8% agarose
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR của gen pagA
Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli DH5α trên mơi trường LBA chứa X - gal và ampicillin
Hình 3.4. Điện di DNA plasmid từ các dòng khuẩn lạc xanh và trắng trên gel 0,8 %
agarose
Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt bằng EcoRI trên gel 1,5% agarose
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc trắng dòng
1, 2 bằng enzyme BamHI và XhoI trên gel 1 % agarose
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA với cặp mồi BA1 và BA2 từ
các dịng khuẩn lạc 1,2 trên gel 0,8 % agarose.
Hình 3.8. So sánh trình tự gen pagA của chủng B. anthracis VCM1167 với các trình


tự đã cơng bố trên ngân hàng gen quốc tế
Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS-pagA
Hình 3.10. Điện di sau khi thôi gel trên gel 1 % agarose
Hình 3.11. Khuẩn lạc của E. coli DH5α trên mơi trường LBA
Hình 3.12. Điện di plasmid từ các khuẩn lạc E. coli DH5a trên gel 1 % agarose
Hình 3.13. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp trên gel 1 % agarose
Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR trên gel 1 % agarose
Hình 3.15. Trình tự acid amin của protein kháng nguyên bảo vệ trên lý thuyết
Hình 3.16. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli chủng BL21 trên môi trường LBA
Hình 3.17. Điện di sự biểu hiện protein PA trên gel 12,6 % polyacrylamide
Hình 3.18. Điện di protein tái tổ hợp PA theo nhiệt độ trên gel 12,6 %
polyacrylamide
Hình 3.19. Điện di protein tái tổ hợp PA theo nồng độ IPTG trên gel 12,6 %
polyacrylamide
Hình 3.20. Điện di mẫu protein PA theo thời gian trên gel 12,6 % polyacrylamide
Hình 3.21. Điện di protein tan và không tan trên gel 12,6 % polyacrylamide

Hình 3.22. Điện di protein sau khi tinh sạch trên gel 12,6 % polyacrylamide
Hình 3.23a. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể
kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF
Hình 3.23b. Phản ứng của protein tái tổ hợp PA gắn Thioredoxin với kháng thể
kháng PA trên màng lai PVDF
Hình 3.23c. Phản ứng western blot giữa protein tái tổ hợp PA với kháng thể kháng
PA tự nhiên
Hình 3.24. Phản ứng Dot blot phát hiện kháng thể kháng bệnh than trong huyết
thanh bệnh nhân
Hình 3.25. Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng bệnh than trong huyết thanh
bệnh nhân


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP

Acid Adenozin Tri phosphat

B. anthracis

Bacillus anthracis

bp

base pair

dH2O

deion water

DNA

Acid deoxyribonucleic

dNTP

Deoxy Ribonucleotid Triphosphat

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EdTx

Edema Toxin

EF

Edema Factor

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropyl- β- D- Thiobalacto Piranozide

kDa

Kilo Dalton

KOAC

Kali Acetate

LB

Lauria Betani

LF

Lethal Factor

LFTx

Lethal Toxin

NaOAC

Natri Acetate

OD

Optical density

ORF

Open Reading Frame

PA

Protective antigen

PCR

Polymerase Chains Reaction

PVDF

Polyvinyl idene difluoride

SDS

Sodium dodecylsulphate

TAE

Tris- Acetate EDTA

TE

Tris- EDTA

v/p

vòng/phút

Xgal

5bromo-4chlro-3indolyl-β-D-galactopyranoside


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Sự thay đổi acid amin
Bảng 2. Kết quả đo OD450 của các mẫu nghiên cứu


1

MỞ ĐẦU
Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuẩn cấp tính do vi khuẩn Bacillus
anthracis (B. anthracis) gây ra cho gia súc, đặc biệt là cho các động vật ăn cỏ như
trâu, bị, dê cừu ngựa... Bệnh than có khả năng lây nhiễm sang người thành dịch với
tỷ lệ tử vong cao. Bệnh được biết đến như một thảm hoạ kinh hồng của nhân loại, đã
làm chết nhiều vật ni cũng như làm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Trong các
cuộc chiến tranh và khủng bố, bệnh than đã được sử dụng như một loại vũ khí sinh học
hiệu quả, có thể gây chết người một cách nhanh chóng với số lượng lớn. Do đó, bệnh
than được coi là một loại vũ khí huỷ diệt hàng loạt.
Tác nhân gây bệnh than là vi khuẩn B. anthracis. Đây là một lồi vi khuẩn
hình que, gram dương, sinh bào tử. Bào tử của B. anthracis có khả năng chống chịu
tốt với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh do đó khả năng gây bệnh rất cao. B.
anthracis có khả năng sản sinh ra 3 loại độc tố là nhân tố kháng nguyên bảo vệ PA,
nhân tố gây chết LF, nhân tố gây phù thũng EF. Trong đó, PA là nhân tố quyết định
tính độc của vi khuẩn than. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân
tố gây chết LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù

thũng cho tế bào vật chủ. Ngồi ra, PA cịn có chứa vùng liên kết thụ thể và có khả
năng gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than. Chính vì vai trị quan trọng của PA
nên hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng PA để tạo kít chuẩn đốn bệnh cũng như
các nghiên cứu tạo vaccine phòng chống bệnh than dựa trên cơ sở kháng nguyên
bảo vệ PA.
Để tạo nguyên liệu protein tái tổ hợp sử dụng trong việc tạo kit chẩn đốn
bệnh than và vaccine tái tổ hợp phịng bệnh than trrong tương lai, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài:“Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ
PA của vi khuẩn Bacillus anthracis và ứng dụng trong việc chẩn đốn bệnh
than”.
Mục tiêu của đề tài:
• Tách dịng và biểu hiện gen mã hóa protein kháng nguyên bảo vệ PA
Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

Luận văn thạc sĩ


2

của vi khuẩn B. anthracis trong E . coli,
• Tinh sạch protein tái tổ hợp kháng nguyên bảo vệ PA,
• Nghiên cứu sử dụng protein tái tổ hợp PA trong chẩn đốn bệnh than.
Nhiệm vụ của đề tài:
• Tách dịng và đọc trình tự gen pagA mã hóa kháng ngun bảo vệ PA,
• Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA và tạo chủng E.
coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA,
• Biểu hiện protein PA trong E. coli BL21 và tinh sạch protein PA bằng cột
sắc kí ái lực Probond Nikel Resin,
• Nghiên cứu khả năng phản ứng của protein tái tổ hợp PA với kháng thể đặc
hiệu và kháng thể tự nhiên kháng PA,

• Sử dụng protein PA tái tổ hợp trong phát hiện kháng thể kháng bệnh than.

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

Luận văn thạc sĩ


3

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh than và các dạng bệnh than
Bệnh than thường xuất hiện ở các loài động vật hoang dã cũng như động vật
nuôi, đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ như trâu, bò, cừu, ngựa, dê… do chúng hít
phải hoặc nhiễm phải bào tử than trong đất. Ở người, nguy cơ mắc bệnh than là do
tiếp xúc với động vật ăn cỏ. Các loài khác như bò sát, lưỡng cư cũng bị nhiễm bệnh
than nhưng ở các mức độ khác nhau (55).
Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da, qua
đường tiêu hố và đường hơ hấp. Bệnh có thể biến chứng thành thể than màng não
nếu hít vào bào tử than. Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà người ta chia bệnh than
thành 4 thể than khác nhau: than da, than tiêu hố, than hơ hấp, than màng não (72).
1.1.1. Bệnh than thể da
Đây là hình thức than phổ biến nhất chiếm hơn 95 % và là loại bệnh có khả
năng điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng cơ nguy cơ lây nhiễm cao,
thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã bị nhiễm than,
thường là những người nông dân, bác sĩ thú y, người giết mổ gia súc, người buôn
bán gia súc hay thịt, … Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay bào tử B.
anthracis có thể xâm nhập vào (Hình 1.1).
Triệu chứng của bệnh: Sau 1 - 2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn ngứa như
côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu hoại tử trong vùng tâm. Sau 2- 3 ngày sẽ
xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị trí nhiễm, xung quanh xuất hiện các

mụn nước. Vài ngày sau tại vùng trung tâm vết loét sẽ xuất hiện các nốt đen,
khô và bắt đầu bong vẩy.

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

Luận văn thạc sĩ


4

Trong khoảng 1-2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và các
hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết tăng
lên. Sau đó vùng thương tổn
sẽ chuyển sang dạng tự phát.
Nếu bệnh nặng thêm vết loét
sẽ lan rộng và ăn sâu làm
nhiễm trùng máu dẫn đến
không thể chữa khỏi. Than da
gây tử vong khoảng 20 % các
Hình 1.1. Bệnh than thể da

trường hợp không được điều trị

(80).
1.1.2. Bệnh than thể tiêu hoá
Nguyên nhân của bệnh than tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc đã bị nhiễm
bào tử than mà khơng được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì khả năng
gây bệnh vẫn cao. Người ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch ruột của bệnh nhân
mắc bệnh than. Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn công vào những vị trí thương tổn của màng
nhày ruột và dạ dày. Từ những vị trí

này sẽ xuất hiện những vết loét, lan
rộng và lan vào hệ bạch huyết. Bệnh
than tiêu hố thường ít gặp nhưng lại
có tỉ lệ tử vong khá cao. Bệnh thường
có hai thể lâm sàng (26,72,80) (Hình
1.2):
Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và
rất dễ nhận biết là có thương tổn xuất
huyết hoại tử ở manh tràng và các

Hình 1.2. Manh tràng của bệnh nhân

vùng lân cận. Triệu chứng ban đầu

nhiễm than đường tiêu hóa

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

Luận văn thạc sĩ


5

không đặc biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt. Sau đó là các triệu
chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong. Bệnh nhân có thể viêm
phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu hạch bạch huyết. Sau 2-5
ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong.
Thể họng, miệng: tại vùng thương tổn thấy xuất huyết hoại tử ở vùng vòm
họng, cổ họng cứng, sưng amidan. Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch vùng cổ sưng
to, nhiễm độc máu và đa số đều dẫn đến tử vong. Dạng than này có tỉ lệ tử vong cao

chiếm 50 % mặc dù có được điều trị.
1.1.3. Bệnh than hô hấp
Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than. Sau khi vào cơ thể,
các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế nang,
hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng, làm trung thất
giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt cao. Các
thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi. Khí
quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng như ho khan, co thắt, vùng phổi bị phù.
Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm mạc của ống tiêu hoá và tạo
nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nơn ra máu, tiêu hố ta máu hoặc cả hai
triệu chứng trên. Một số nang lympho của đường tiêu hoá cũng bị phù và xung
huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến chứng sang thể màng não gây xuất huyết. Đa
số bệnh nhân đều tử vong trong khoảng 1 - 2 ngày kể từ khi phát bệnh. Tỉ lệ tử vong
của thể than này rất cao (65,80) (Hình 1.3).

Phạm Kiều Thúy CNSH 06-08

Luận văn thạc sĩ