Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột giấy thân thiện với môi trường

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thị Hƣơng

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY
TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Trần Thị Hƣơng

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY

TRÊN NGUYÊN LIỆU DĂM MẢNH KEO NHẰM ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT BỘT GIẤY THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƢỜNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn : Phan Thị Hồng Thảo

Hà Nội - 2020


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy
nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột
giấy thân thiện với môi trƣờng” là kết quả nghiên cứu của mình khơng có sự
sao chép của ngƣời khác. Đề tài là sản phẩm mà tôi đã nỗ lực nghiên cứu
trong quá trình học tập tại Học viện và làm việc tại phòng Vi sinh vật đất.
Số liệu và kết quả nghiên cứu thực hiện trong luận văn này là hoàn toàn
trung thực và chƣa từng sử dụng và cơng bố ở bất kì cơng trình nào khác. Tất
cả các tài liệu tham khảo sử dụng để viết bài đều có nguồn gốc rõ ràng, dƣới
sự hƣớng dẫn của TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất –
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ.
Tôi xin cam đoan tất cả các điều trên là sự thật, nếu có vấn đề gì tơi xin
chịu hồn tồn trách nhiệm.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Học viên

Trần Thị Hƣơng


Lời cảm ơn
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đối với TS. Phan Thị Hồng Thảo – Trƣởng phòng Vi sinh vật đất, Viện Công
nghê Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học đã hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên
cứu và tận tình giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu làm luận văn tốt
nghiệp.
Em cũng xin cám ơn các thầy, cô trong Ngành Sinh học, Học viện
Khoa học và Công nghệ đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng
thời gian đào tạo tại đây.
Em cũng xin gửi lời cám ơn tới tồn thể cán bộ phịng Vi sinh vật Đất,
Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã tạo điều kiện thuận lợi về phƣơng tiện, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình
thực tập.
Em xin cảm ơn kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học
để phân hủy nhựa cây trong dăm mảnh gỗ keo, bạch đàn làm nguyên liệu sản
xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng tại Việt Nam: Mã số: 05/HĐĐT.05.18/CNSHCB của TS. Phan Thị Hồng Thảo.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Học viên

Trần Thị Hƣơng


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS
Adt
CMC

DNA
DNSA
pNBP
RBBR
Tris-HCl
U
VSV

: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
: Tấn khô gió
: Carboxymethyl Cellulose
: Deoxyribonucleic acid
: 3,5-dinitrosalicylic acid
: p -nitrophenyl butyrate
: Remazol Brilliant Blue R
: Tris hydrochloride
: Unit
: Vi sinh vật


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập ở nhiệt độ 37oC và 45oC
trong các mẫu .................................................................................................. 31
Bảng 3. 2. Khả năng phân hủy stigmassterol, sinh tổng hợp cellulase và lipase
của vi khuẩn, xạ khuẩn phân lập ..................................................................... 36
Bảng 3.3. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng
vi khuẩn phân lập ở 37oC ................................................................................ 41
Bảng 3. 4. Hoạt tính enzym sterol esterase, laccase và cellulase của các chủng
vi khuẩn phân lập ở 45oC ................................................................................ 42
Bảng 3. 5. Khả năng phân hủy nhựa của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn tuyển

chọn ................................................................................................................. 45
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng
CVSVC1-1 ...................................................................................................... 48
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng phát triển của
CVSVC1-1 ...................................................................................................... 48
Bảng 3.8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng CVSVC1-1 với các lồi
vi khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự gen16S rDNA ............................... 50
Bảng 3. 9. Khả năng sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng
CVSVC1-1 trên một số môi trƣờng khảo sát .................................................. 51
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến sinh trƣởng và hoạt tính enzyme
sterol esterase, laccase và cellulase của chủng CVSVC1-1............................ 55
Bảng 3. 11. Khả năng sinh sterol esterase, laccase và cellulase của chủng
CVSVC1-1 trên dăm mảnh gỗ ở các tỷ lệ giống khác nhau ........................... 58
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng giảm nhựa trên nguyên
liệu dăm mảnh gỗ keo ..................................................................................... 59
Bảng 3.13. Hiệu suất nấu bột ở một số mẫu có lƣợng nhựa giảm tốt ............. 60
Bảng 3. 14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng giảm nhựa của chủng
CVSVC1-1 ...................................................................................................... 60
Bảng 3. 15. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa của chủng
CVSCV1-1 ...................................................................................................... 61


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose........................................................... 28
Hình 3. 1. Hình ảnh vi sinh vật phát triển trên mơi trƣờng phân lập .............. 31
Hình 3.2. Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn trên mơi
trƣờng phân lập lỏng ....................................................................................... 33
Hình 3.3. Khả năng sinh enzym lipase ngoại bào của một số chủng phân lập34
Hình 3.4. Khả năng sinh cellulase ngoại bào của một số chủng phân lập ...... 34
Hình 3.5. Dăm mảnh gỗ keo đƣợc ngâm ngập trong dịch lên men của các

chủng tuyển chọn ............................................................................................ 44
Hình 3.6. Quá trình chiết nhựa ........................................................................ 45
Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào vi khuẩn CVSVC1-1 dƣới kính
hiển vi quang học (100x) (B) và kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại (50000X)
(C) và (10000X) (D)........................................................................................ 46
Hình 3.8. Khả năng sinh bảo tử của chủng vi khuẩn CVSVC1-1 .................. 47
Hình 3.9. Khả năng phân hủy một số cơ chất của vi khuẩn CVSVC1-1........ 49
Hình 3.10. Điện di đồ DNA tổng số (A), sản phẩm PCR (B) trên gel agarose
1,0 % và cây phát sinh chủng lồi của vi khuẩn CVSVC1-1 ......................... 50
Hình 3.11. Khả năng sinh trƣởng của chủng CVSVC1-1 trên các mơi trƣờng
khảo sát ............................................................................................................ 51
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh trƣởng
của chủng CVSVC1-1 trên môi trƣờng MPA bổ sung 0,5g/L ....................... 53
Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ni cấy đến hoạt tính enzyme sterol
esterase và laccase của chủng CVSVC1-1...................................................... 53
Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của pH ni cấy đến hoạt tính enzyme sterol esterase
và laccase của chủng CVSVC1-1 ................................................................... 54
Hình 3.15. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1 ở
các tỷ lệ giống bổ sung khác nhau .................................................................. 57
Hình 3.16. Nguyên liệu dăm mảnh gỗ keo đƣợc xử lý với chủng CVSVC1-1
sau rửa và sấy .................................................................................................. 57
Hình 3.17. Mật độ vi sinh trên mẫu có và không bổ sung chủng CVSVC1-1 ở
nồng độ 105...................................................................................................... 57


MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU .............................................................................. 6
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................ 7
MỤC LỤC ......................................................................................................... 8

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1.

PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY ........................................... 3

1.2. NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY ............................................................. 5
1.2.1. Nhựa cây ................................................................................................. 5
1.2.2. Tác động của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy ......................... 7
1.3. VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY ................................................ 9
1.3.1. Nấm phân hủy nhựa cây .......................................................................... 9
1.3.2. Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa cây. ............................................... 12
1.3.3. Hệ enzym phân hủy nhựa cây. .............................................................. 14
1.3.2.1. Esterase .............................................................................................. 14
1.3.2.2. Lipase ................................................................................................. 15
1.3.2.3. Laccase ............................................................................................... 16
1.3.4. Cơ chế phân hủy lignin và các chất chiết trong gỗ ............................... 17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................ 22
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 22
2.1.2. Thiết bị .................................................................................................. 22
2.1.3. Hóa chất................................................................................................. 22
2.1.4. Mơi trƣờng ............................................................................................ 23
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 23
2.2.1. Chuẩn bị chất chiết nhựa cây ................................................................ 23
2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa................................. 23


2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật đƣợc
tuyển trọn. ............................................................................................. 24

2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzym.......................... 25
2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym ................................................ 26
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa cây bằng chiết trong aceton .. 29
2.2.7. Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate ........................................................ 29
2.2.8. Phƣơng pháp xác định chỉ số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin)....... 30
2.2.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê. .......................................................... 30
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31
3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY. ........................................................ 31
3.1.1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân
hủy nhựa cây ......................................................................................... 31
3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp sterol esterase, laccase và cellulase của các
chủng tuyển chọn .................................................................................. 40
3.1.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa
cây 43
3.2. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI
CHỦNG CVSVC1-1 ............................................................................... 46
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng vi
khuẩn CVSVC1-1 ................................................................................. 46
3.2.2. Định danh chủng vi sinh vật tuyển chọn bằng phƣơng pháp phân tích
trình tự vùng gen 16S rRNA ................................................................. 49
3.3. NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
STEROL ESTERASE CỦA CHỦNG CVSVC1-1 ................................ 51
3.3.1. Lựa chọn mơi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp một
số enzym của chủng CVSVC1-1 .......................................................... 51
3.3.2. Ảnh hƣởng cả các yếu tố nhiệt độ, pH và tốc độ lắc đến khả năng sinh
trƣởng và sinh tổng hợp enzym của chủng CVSVC1-1 ....................... 52
3.4. NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN BỔ SUNG VI SINH VẬT TUYỂN
CHỌN VÀO DĂM MẢNH GỖ KEO. ................................................... 56
3.4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh trƣởng và loại nhựa............ 56

3.4.3. Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng giảm nhựa cây trong dăm mảnh gỗ
......................................................................................................... 61
4.1. Kết luận ................................................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 63


1
MỞ ĐẦU
Sản xuất giấy đƣợc xem nhƣ là một ngành công nghiệp trọng điểm của
nhiều quốc gia trên thế giới. Các sản phẩm từ giấy không chỉ đƣợc sử dụng
trong ngành giáo dục, báo chí, in ấn, hội họa… mà còn đƣợc sử dụng trong
nhu cầu tiêu dùng hàng ngày khác của con ngƣời nhƣ khăn giấy, giấy vệ sinh,
thùng chứa… Ngày nay, các sản phẩm từ giấy còn đƣợc khuyến khích trong
việc sử dụng làm bao bì, giấy gói, dụng cụ dùng một lần v.v. nhằm hạn chế
rác thải nhựa.
Hiện nay, công nghệ sản xuất giấy đã đƣợc cải tiến nhiều kể cả về trang
thiết bị máy móc cũng nhƣ quy trình sản xuất để có thể đáp ứng nhu cầu thị
hiếu của khách hàng. Tuy nhiên, ngành giấy vẫn gặp nhiều vấn đề liên quan
tới tiêu thụ năng lƣợng, nƣớc và ô nhiễm môi trƣờng do phải sử dụng một
lƣợng lớn hóa chất trong sản xuất. Một trong những khó khăn lớn mà ngành
giấy hiện nay đang gặp phải là những ảnh hƣởng của nhựa cây đến quá trình
sản xuất và chất lƣợng của giấy. Mặc dù hàm lƣợng của nhựa cây chỉ chiếm
2-8%, nhƣng với thành phần và đặc điểm cấu tạo các chất nhựa trong gỗ có
thể gây ra những vấn đề nghiêm trọng, ảnh hƣởng đến hiệu quả của q trình
cơng nghệ và chất lƣợng sản phẩm. Nhựa cây đóng cặn làm giảm chất lƣợng
của bột giấy và có thể gây ngừng q trình nghiền bột, giảm hiệu quả sản xuất
và tăng chi phí để loại bỏ hay kiểm soát nhựa cây. Thành phần nhựa trong gỗ
keo bao gồm: sáp, axit béo, các alkanol, các chất chiết hydroxy, rƣợu béo, các

trygliceride, diglyceride, sterol, steryl ester, phospholipid và một số thành
phần khác. Các thành phần axit béo khơng xà phịng hóa đƣợc (ví dụ các
alkanol, sterol, este và steryl) và các axit béo chuỗi dài bão hịa và khơng bão
hịa rất khó xử lý trong q trình sản xuất giấy vì chúng khơng đƣợc loại bỏ
trong quá trình nấu, tẩy trắng và rửa bột. Để hạn chế vấn đề nhựa cây, có thể
sử dụng các phƣơng pháp truyền thống, hóa học và sinh học.
Trong những năm gần đây, ứng dụng công nghệ sinh học trong việc sản
xuất bột giấy đƣợc xem nhƣ là một công nghệ sản xuất sạch với mục đích
tăng sản lƣợng và chất lƣợng giấy, thân thiện với môi trƣờng. Phƣơng pháp
này đã thu hút nhiều sự quan tâm, chú ý không chỉ của các nhà nghiên cứu mà


2
còn cả các cấp quản lý và các nhà sản xuất giấy. Trong phƣơng pháp này, các
chủng vi sinh vật có khả năng tiết ra hệ enzym phân hủy nhựa cây đƣợc sử
dụng trong giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa cây
trong nguyên liệu giúp giảm hóa chất sử dụng, bảo vệ mơi trƣờng và tăng q
trình chạy máy. Trong tự nhiên, các lồi nấm mốc, nấm dát gỗ, nấm đảm, vi
khuẩn, xạ khuẩn đều là các đối tƣợng đã và đang đƣợc quan tâm trong nghiên
cứu giảm nhựa nhờ hệ enzym phong phú nhƣ esterase, laccase, lipase v.v.
Nấm đảm và nấm dát gỗ trƣớc nay đƣợc xem là hai đối tƣợng đƣợc quan tâm
nhiều nhất, tuy nhiên sức phát triển và khả năng chịu các điều kiện khắc
nghiệt của môi trƣờng là một nhƣợc điểm của chúng. Xuất phát từ thực tế đó,
nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh
vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong
sản xuất bột giấy thân thiện với môi trƣờng”, nhằm giảm ảnh hƣởng của nhựa
cây đến quá trình sản xuất bột giấy.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT BỘT GIẤY

Hiện nay có 2 phƣơng pháp chính để sản xuất bột giấy là phƣơng pháp
truyền thống (cơ học) và phƣơng pháp hóa học.
Sản xuất bột giấy bằng phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp đƣợc
áp dụng tại nhiều nhà máy lớn và nhỏ. Trong phƣơng pháp này, nguyên liệu
dăm mảnh đƣợc thu mua và lƣu kho trong thời gian dài. Trong quá trình bảo
quản, dăm mảnh đƣợc tiến hành phun nƣớc giảm hàm lƣợng nhựa. Ƣu điểm
của phƣơng pháp truyền thống là tận dụng nguồn vi sinh vật và các tác nhân
bên ngoài để phân hủy một số thành phần nhựa trong ngun liệu giúp giảm
chi phí trong q trình sản xuất. Tuy nhiên, nó lại khơng kiểm sốt đƣợc các
lồi vi sinh vật gây hại, do đó, rất dễ gây thất thoát Cellulose, giảm hiệu xuất
thu hồi và ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy. Việc áp dụng phƣơng pháp
truyền thống vào sản xuất bột giấy cũng chỉ giảm tối 20% hàm hƣợng nhựa,
chủ yếu là các hợp chất dễ phân hủy, các thành phần khó phân hủy nhƣ sterol,
sterol este, axit nhựa,… vẫn đƣợc giữ lại trong nguyên liệu gây ra các vấn đề
trong sản xuất bột giấy. Hiệu suất thu hồi bột đạt từ 85 – 98%, chi phí thấp.
Bột giấy sản xuất theo phƣơng pháp này thƣờng có khả năng thấm hút mực in
tốt nên thƣờng đƣợc sử dụng trong một số sản phẩm nhƣ: giấy in báo, giấy in
tạp chí cao cấp (SC), giấy in tạp chí có tráng nhẹ (LWC), giấy dán tƣờng, giấy
làm bao bì (FBB), giấy in giấy viết thơng thƣờng... Tuy nhiên, chất lƣợng bột
giấy thƣơng phẩm khi sản xuất bột giấy lại có nhiều điểm hạn chế nhƣ: giấy
thƣờng bị đục, không bền, dễ bị thủng…
Sản xuất giấy bằng phƣơng pháp hóa học là sử dụng hóa chất để biến đổi
nguyên liệu ban đầu thành bột giấy (bột hóa học). Các dăm mảnh gỗ đƣợc xử
lý hóa học bằng cách nấu. Sau khi nấu 12 đến 15 tiếng xơ sợi sẽ đƣợc tách ra
khỏi các thành phần cứng và thu đƣợc sợi cellulose. Bột giấy đƣợc sản xuất

theo phƣơng pháp hóa học đã cải thiện đáng kể về chất lƣợng thành phẩm.
Phƣơng pháp hoá học đã loại bỏ triệt để lignin nên bột giấy hóa học có chất
lƣợng tốt hơn so với bột giấy cơ học. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này cũng có
những mặt hạn chế nhất định đặc biệt là hiệu suất thu hồi bột không cao, chỉ


4
đạt 40 - 50%. Bên cạnh đó việc sử dụng một lƣợng lớn hóa chất gây ảnh
hƣởng đến mơi trƣờng xung quanh, tốn kém chi phí trong q trình xử lý.
Bột Sulfat (bột Kraft): Dịch nấu gỗ gồm (NaOH + Na2S) (có thể bổ sung
xúc tác và các chất trợ nấu), pH từ 13 trở lên, nhiệt độ từ 155-170oC, thời gian
2 - 4 giờ. Nhƣợc điểm lớn nhất của phƣơng pháp này là sinh ra hợp chất lƣu
huỳnh có mùi thối, gây tác động lớn đến môi trƣờng xung quanh. Nấu kiềm,
đặc biệt là nấu sunfat, là phƣơng pháp phổ biến nhất hiện nay, sản xuất ra
phần lớn lƣợng bột giấy hằng năm. Hiện nấu sunfat (Kraft) là phƣơng pháp
đƣợc áp dụng ở quy mô lớn tại nhà máy Giấy Bãi Bằng của Tổng Công ty
Giấy VN và tại Cơng ty cổ phần giấy An Hịa, hai nhà máy có thị phần bột
giấy nấu từ ngun liệu thơ lớn nhất Việt Nam. Nguyên liệu chính dùng
trong sản xuất chủ yếu là gỗ keo và bạch đàn. Tuy nhiên lƣợng gỗ keo chiếm
trên 70%. Tại tổng Công ty Cổ phần giấy An Hịa, quy mơ sản xuất bột giấy
Kraft, nấu liên tục, tƣơng đối lớn 130.000 tấn/năm, bột giấy đƣợc tẩy trắng
theo quy trình tẩy tiên tiến khơng sử dụng clo nguyên tố. Hiện tại hai nhà máy
này chịu ảnh hƣởng nặng nề của vấn đề nhựa cây, làm giảm năng suất quá
trình sản xuất bột giấy và tăng giá thành sản xuất.
Hiện nay, ngoài hai phƣơng pháp sản xuất bột giấy trên các nhà máy sản
xuất giấy cũng đang hƣớng đến một phƣơng pháp sản xuất sạch hơn, giảm
thiểu những tác động của nhựa cây đến môi trƣờng. Xử lý giấy bằng phƣơng
pháp sinh học không chỉ giúp loại bỏ nhựa trên ngun liệu, chúng cịn làm
giảm lƣợng hóa chất sử sụng trong quá trình xử lý, giảm năng lƣợng tiêu thụ
và chi phí sản xuất. Phƣơng pháp sinh học thƣờng đƣợc áp dụng trong giai

đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm giảm hàm lƣợng nhựa, trong giảm năng
lƣợng nghiền hoặc tẩy trắng bột giấy,… Trên thế giới, một số chế phẩn phân
hủy nhựa cây đã đƣợc sử dụng trong xử lý gỗ mềm nhƣ Cartapip 97 đƣợc tạo
thành từ các chủng bạch tạng của Ophiostoma piliferum. Sử dụng chế phẩm
Cartapip có thể loại đƣợc đến 90% hàm lƣợng các triglycerides, cao hơn so
với phƣơng pháp lƣu giữ gỗ, tuy nhiên, hiệu quả loại các axit nhựa, sterol este
và sáp trong 2 tuần tƣơng tự so với bảo quản tự nhiên trong cùng một điều
kiện. Ở Việt Nam, sản xuất bột giấy bằng phƣơng pháp sinh học chƣa đƣợc áp


5
dụng, chúng chỉ là những thử nghiệm của các đề tài, dự án trên các nhà máy,
tuy nhiên, các kết quả thu đƣợc mang lại nhiều triển vọng trong sƣ phát triển
bền vững của ngành Giấy.
1.2. NHỰA CÂY VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GIẤY
1.2.1. Nhựa cây
Nhựa cây chỉ chiếm một lƣợng nhỏ 2 – 8% khối lƣợng gỗ nhƣng chúng
lại cần thiết cho sự sống của cây. Trong cây đang sống, nhựa cây đƣợc tạo ra
để bảo vệ cây khỏi bị vi sinh vật tấn công phá hủy các mô gỗ. Tƣơng tự nhƣ
vậy là vai trò của dịch rỉ (exdudates), đƣợc đùn ra ở những chỗ cây bị tổn
thƣơng bởi tác động bên ngồi. Nhựa cây là nhân tố chính góp phần tạo ra
màu sắc, mùi hƣơng và độ bền của gỗ. Một số chất chiết cịn có hoạt tính sinh
học nên từ lâu nhiều loại gỗ đã đƣợc dùng làm dƣợc liệu hoặc thuốc [1,2].
Trong công nghiệp chế biến đồ dùng từ gỗ, nhựa cây có ảnh hƣởng tới q
trình sấy khơ, khả năng kết dính, tính hút ẩm và âm thanh của gỗ [1]. Trong
ngành sản xuất vật liệu composite từ chất dẻo và gỗ sử dụng trong xây dựng
và công nghiệp ơ tơ, thì gỗ cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần gia cố, tuy
nhiên, hàm lƣợng nhựa trong gỗ cao có thể dẫn tới những tính chất khơng
mong muốn của vật liệu composite [3,4]. Nhựa cây không tan trong nƣớc

nhƣng tan đƣợc trong dầu mỏ và một số dung mơi hữu cơ trung tính, có độ
phân cực thấp. Thành phần hóa học của nhựa cây bao gồm các axit béo tự do,
axit nhựa, sáp, các rƣợu béo, steryl este, các sterol, glyceride, ketone và các
hợp chất chứa oxy khác. Theo Black và Ekman (2000), có thể chia các hợp
chất trong thành phần nhựa cây gồm 4 nhóm chính nhƣ [5]:
-

Các chất béo (triglyxerit) và axit béo;
Steryl este và sterol;
Terpen và terpenoid (các axit nhựa và polyisopren);
Các chất sáp (ester của rƣợu béo và axit béo).

Nhựa cây đƣợc chứa chủ yếu ở trong các kênh dẫn nhựa (resin canals),
trong các túi nhựa (resin pockets), trong các tế bào nhu mơ (parenchyma
cells) hoặc ở một số tế bào chỉ có ở một số loại gỗ cứng nhiệt đới nhƣ các tế


6
bào dầu (oil cells) và các tế bào latex (latex cells). Nhựa trong các kênh dẫn
nhựa thông thƣờng là hỗn hợp vơ định hình của các terpen và terpenoit mạch
vịng đƣợc hình thành từ các đơn vị isopren nhờ sự tiếp xúc của các enzyme
tạo mạch vòng xyclaza. Theo một số tài liệu nghiên cứu, hàm lƣợng và thành
phần hóa học của nhựa cây phụ thuộc vào loài cây, độ tuổi, yếu tố về di
truyền, mùa sinh trƣởng, điều kiện phát triển (ánh sáng, độ ẩm, thành phần
dinh dƣỡng của đất,…), khí hậu vùng miền. Các cây trồng ở vùng có khí hậu
ấm áp có lƣợng axit béo bão hịa cao hơn. Thậm chí giữa các bộ phận khác
nhau của cây cũng có sự khác biệt đáng kể. Nhựa cây thƣờng có nhiều trong
tâm gỗ hơn so với ở dát gỗ, tạo nên một môi trƣờng bảo quản tự nhiên cho
tâm gỗ. Trong các kênh dẫn nhựa và tế bào biểu mơ chứa nhiều chất chiết có
vai trị quan trọng trong quá trình bảo quản gỗ, giúp duy trì các đặc tính của

gỗ. Nhựa ở gỗ mềm có chứa 90% hàm lƣợng các chất xà phịng hố cao là các
axit nhựa và axit béo. Các axit nhựa, axit béo, triglyceride, sterol và các este
của chúng là các nhóm chất béo chính của nhựa gỗ vân sam và thơng. Các
triglyceride chiếm ƣu thế ở phần dát gỗ của cả vân sam và thông trong khi ở
tâm gỗ thông chứa nhiều axit nhựa, gấp khoảng 2 lần so với phần dát gỗ.
Nhựa của gỗ cứng bạch dƣơng và gỗ dƣơng có nhiều các sterol và các chất
béo khơng xà phịng hóa hơn so với gỗ mềm mặc dù vẫn chứa nhiều
triglyceride. Các sterol este và sáp cũng có trong nhựa của gỗ dƣơng, nhựa gỗ
bạch dƣơng có triterpenol và các axit béo bão hịa.
Thành phần nhựa có trong gỗ keo bao gồm: đối với gỗ keo trên 5 tuổi
thành phần nhựa chủ yếu là 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-với hàm lƣợng
lên đến trên 70%, hợp chất này giảm khi độ tuổi tăng. Tuy nhiên, xuất hiện
một số hợp chất mới với hàm lƣợng tƣơng đối nhƣ 1,2-benzenedicarboxylic
acid, bis(2-ethylhexyl) ester (2,5%) ở gỗ keo 6 tuổi và 1,2benzenedicarboxylic acid, diisooctyl ester (5,95%), (2-hydroxyethyl)triphenylphosphonium chloride (8,06%) trên gỗ keo 7 tuổi. Ngồi ra cịn có
các axit béo, axit nhựa (axit n – hexadecanoic, axit octadecanoic) trong thành
phần nhựa cây.


7
1.2.2. Tác động của nhựa cây đến quá trình sản xuất bột giấy
Trong sản xuất bột giấy, nhựa cây là thành phần không mong muốn nên
cần đƣợc loại bỏ một cách triệt để.
Trong quá trình nấu bột giấy sunfat, một phần axit béo, axit nhựa tự do,
triglyxerit, steryl ester phản ứng với xút, đƣợc xà phịng hóa và tan vào trong
dịch nấu. Tuy nhiên, nhựa đã xà phịng hóa vẫn có thể kết hợp với các thành
phần nhựa khơng xà phịng hóa, rất dễ kết tủa tạo ra cặn nhựa trên bề mặt các
bộ phận của thiết bị trong dây chuyền khi điều kiện của quá trình sản xuất (độ
pH và nhiệt độ) thay đổi [6]. Hơn nữa, các hợp chất hữu cơ trong nhựa
thƣờng tƣơng tác với nhau và với các hóa chất trong q trình nấu bột và làm
giấy, tạo ra cặn nhựa (pitch deposit). Cặn nhựa dính vào các lƣới lô rửa làm

giảm hiệu quả rửa bột giấy, gây đóng cặn ở các thiết bị chƣng bốc dịch đen,
nhất là thiết bị chƣng bốc màng rơi, làm giảm năng suất do phải dừng để rửa
thiết bị và tiêu tốn thêm nhiên liệu. Nhựa cây liên kết với lignin trong dịch
đen, kết thành mảng dày trên bề mặt bể, gây khó khăn cho cơng đoạn oxy hóa
dịch đen [7,8]. Mặt khác, các chất chiết nhựa này trong bột sau nấu và rửa
vẫn có thể bám trên xơ sợi, cản trở sự liên kết giữa các xơ sợi và làm giảm độ
bền của giấy trong quá trình xeo vì gây đứt giấy. Trong quá trình tẩy trắng bột
giấy, các chất nhựa này đƣợc tách ra và tích lũy trong nƣớc trắng, nhƣng dễ
kết hợp với các hóa chất khác (nhƣ cacbonat canxi) tạo thành các hạt màu đen
bám lên thành đƣờng ống, bể chứa và bề mặt của các thiết bị và có thể tạo
thành mảng lớn rơi vào dịng bột. Trong q trình sản xuất bột giấy Kraft và
tẩy trắng bằng ClO2 có tới 80% axit béo của gỗ keo vẫn còn lƣu lại trong bột
giấy tẩy trắng, vì vậy có khả năng tạo cặn nhựa rất cao [9]. Cặn nhựa còn lại
trong bột sẽ làm giảm chất lƣợng của giấy sản phẩm nhƣ đốm đen, đứt gẫy
giấy, thủng, mỏng (ở vị trí có nhựa cây) và tạo ra vùng giấy không bám mực
khi in ấn [10]. Ở những nhà máy có mức độ tuần hồn nƣớc sản xuất cao thì
vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng hơn. Nhƣ vậy, nếu không loại bỏ tối đa
đƣợc nhựa cây trong các giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu và nấu bột thì sẽ làm
giảm hiệu quả hoạt động của thiết bị, giảm chất lƣợng giấy và hiệu quả kinh
tế. Bên cạnh đó, trong nƣớc rửa bột, 20-70% độc tính đƣợc xác định là do các


8
axit nhựa từ nguyên liệu gỗ, rất khó bị phân hủy và thƣờng tạo thành các keo
tụ. Các hợp chất này và dẫn xuất của chúng, nhƣ dehydroabietin hay
tetrahydroretene, đƣợc xác định là rất độc hại cho động vật thủy sinh trong
các lƣu vực nhận dòng thải từ nhà máy.
Trong quá trình sản xuất bột giấy, nhựa cây tiếp tục đƣợc giảm thiểu
bằng hóa chất, làm tăng lƣợng hóa chất cần phải xử lý trong nƣớc tuần hoàn
và nƣớc thải. Nƣớc thải từ các nhà máy giấy và bột giấy có chứa nồng độ cao

lignin và các axit nhựa bị tích tụ từ q trình xử lý hóa và cơ học của gỗ, và
lắng đọng lại trong nƣớc, gây ra ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Axit nhựa
(là một chất chiết xuất trong nhựa cây và có thể chiếm 0,2-0,8% tổng trọng
lƣợng của gỗ) trong nƣớc thải từ các nhà máy sản xuất bột giấy hóa học là
nguồn gây độc tính chính (chiếm 70% tổng số các chất gây độc) gây ảnh
hƣởng đến cá và các loài động vật thủy sinh khác [11].
Hiện nay, ngành sản xuất bột giấy và giấy đang chịu áp lực nặng nề do
yêu cầu giảm xả thải các hợp chất hữu cơ (axit béo, axit nhựa v.v.) có độc tính
cao vào mơi trƣờng. Để hạn chế sự tạo cặn nhựa trong dây chuyền sản xuất và
giảm xả thải, cần phải loại bỏ đƣợc các hợp chất này trong nguyên liệu gỗ
trƣớc khi sản xuất bột giấy. Thông thƣờng, nhựa cây trong nguyên liệu đƣợc
loại bớt bằng cách lƣu giữ trên sân bãi từ 15 – 45 ngày trƣớc khi đƣa vào nấu.
Trong quá trình bảo quản, các axit béo và rƣợu béo sẽ bị thủy phân bởi các
yếu tố môi trƣờng, một số steryl este và sterol, các axit nhựa ester của rƣợu
béo và axit béo cũng đƣợc loại bỏ bởi vi sinh vật tạp nhiễm.
Ngoài ra, độ tuổi, mùa khai thác cũng quyết định hàm lƣợng nhựa trên
nguyên liệu. Thời gian bảo quản của nguyên liệu gỗ bạch đàn có tỷ lệ giảm
hàm lƣợng nhựa sau 03 tháng bảo quản cao nhất từ 56,5 % (5 tuổi) đến 72,2%
(6 tuổi), nguyên liệu gỗ keo hàm lƣợng nhựa giảm sau 03 tháng bảo quản từ
55,2% (6 tuổi) và 43% (7 tuổi). Mức giảm hàm lƣợng nhựa trung bình có
trong ngun liệu giảm 10 – 20% sau 30 ngày bảo quản đối với các loại
nguyên liệu, độ tuổi cây và mùa khai thác. Hàm lƣợng nhựa có xu hƣớng tăng
khi độ tuổi của cây nguyên liệu tăng và mùa khai thác là một trong những yếu
tố ảnh hƣởng rất quan trọng đến hàm lƣợng nhựa trong nguyên liệu. Nguyên


9
liệu gỗ keo, bạch đàn khai thác vào mùa xuân có hàm lƣợng nhựa cao hơn so
với mùa hạ, mùa thu và mùa đông. Khai thác vào mùa thu và mùa đông hàm
lƣợng nhựa trong nguyên liệu (bạch đàn, keo) giảm từ 10 – 30% so với

nguyên liệu (bạch đàn, keo) khai thác vào mùa xuân. Hàm lƣợng nhựa trong
nguyên liệu khai thác vào mùa hạ giảm từ 1 – 5% so với nguyên liệu đƣợc
khai thác vào mùa xuân. Các phƣơng pháp giảm nhựa trên chủ yếu là giải
pháp tạm thời vì lƣợng nhựa giảm khá ít, hàm lƣợng nhựa giảm chủ yếu là
các axit béo dễ bị tác động bởi nhiệt độ, độ ẩm, các chất sterol este hầu nhƣ
không bị ảnh hƣởng nhiều. Không những thế, việc giảm nhựa bằng phƣơng
lƣu kho sẽ làm mất kiểm soát đối với sự phát triển và tác động của vi sinh vật
gây thất thoát cellulose ảnh hƣởng đến chất lƣợng bột giấy bị giảm sút
1.3.

VI SINH VẬT PHÂN HỦY NHỰA CÂY

1.3.1. Nấm phân hủy nhựa cây
Nấm mốc
Nấm mốc có khả năng phân hủy các chất chiết trên nhựa nhƣng sự phát
triển trên gỗ kém hơn các loại nấm khác. Chúng phát triển tốt trên gỗ ƣớt
hoặc gỗ lƣu trữ ở độ ẩm cao trong thời gian dài. Đối với gỗ mềm nấm mốc
phát triển chủ yếu trên bề mặt, còn đối với gỗ cứng, mốc có thể xâm nhập vào
mơ mềm hở hoặc tế bào vỡ, rồi phát triển trong khối gỗ. Nấm mốc phát triển
trên gỗ chủ yếu thuộc chi Penicillium, Trichoderma, Rhizopus và Aspergillus.
Tuy nhiên, sự phát triển của nấm mốc trên gỗ làm giảm chất lƣợng nguyên
liệu, do chúng phân hủy đồng thời cellulose.
Nấm dát gỗ
Một nhóm nấm túi nhỏ hay còn gọi là nấm dát gỗ, phát triển và xâm
nhập qua các tế bào nhu mô và kênh dẫn nhựa. Chúng gây ra sự thay đổi màu
sắc trên các mô nhựa do khả năng sinh sắc tố melanin trên sợi nấm [8] nhƣng
chúng lại có khả năng thủy phân môt số thành phần nhựa thành các chất hòa
tan trong nƣớc [12]. Do hầu hết các hợp chất lipophilic đều tích tụ và tập
trung ở các tia gỗ và kênh nhựa, nên nấm dát gỗ là ứng cử viên đầu tiên cho
việc sử lý nhƣa. Với khả năng xâm nhiễm nhanh trên cả nguyên liệu không vô

trùng, chúng có thể hạn chế sự phát triển của vi sinh vật tạp nhiễm và kiểm


10
sốt sinh học cao [8]. Các lồi nấm dát gỗ, đại diện là Ophiostoma,
Ceratocystis, Leptographium và Sphareopsis, sử dụng axit béo, triglycerid,
carbohydrat đơn giản, và các thành phần khác của gỗ [13]. Một số ít lồi nấm
trong nhóm này khơng có khả năng sinh sắc tố melanin, cịn đƣợc gọi là các
chủng nấm bạch tạng, các loài này thƣờng thuộc chi Ophiostoma nhƣ
Ophiostoma valdivianum, O. piliferum, Ophiostoma ainoae… có khả năng
giảm nhựa tốt, không gây biến đổi màu sắc của nguyên liệu và không gây ảnh
hƣởng đến các thành phần chính của gỗ nhƣ cellulose, lignin và phân hủy nhẹ
hemicellulose. Hiện nay, loài O. piliferum đã đƣợc ứng dụng trong sản suất
chế phẩm Cartapip 97, là sản phẩm của công ty Parrac Ltd. (New Zealand)
dùng trong xử lý nguyên liệu gỗ thơng. Chế phẩm Cartapip 97 có khả năng
loại bỏ 60% sterol tự do trên gỗ mềm, tuy nhiên, hiệu quả trong việc loại bỏ
nhựa trên gỗ cứng còn hạn chế [14,15].
Nấm đảm (basidiomycetes)
Nấm đảm lồi lồi nấm lớn có khả năng hình thành quả thể trong điều
kiện tự nhiên. Ở giai đoạn sinh dƣỡng, các loài nấm đảm phát triển thành
dạng sợi bám sát bề mặt hoặc ăn sâu vào trong thân gỗ. Giai đoạn sinh sản,
chúng hình thành các bào tử đảm chứa trong những thân hình dùi gọi là đảm
(quả thể). Các loài nấm mục trắng (white-rot fungi), nấm mục nâu (brown-rot
fungi) và nấm mục mềm (soft-rot fungi) đều thuộc ngành nấm đảm, chúng có
khả năng phát triển nhanh trên gỗ. Một số lồi nấm đảm có khả năng phân
hủy các hợp chất nhựa, lignin.
Nấm mục nâu phân hủy gỗ khá mạnh, chúng ƣu tiên phân hủy
polysaccharide, phân cắt mạch cellulose do đó làm giảm mức độ trùng hợp
của mạch sợi và làm suy giảm hàm lƣợng cellulose đáng kể nên chúng thƣờng
không đƣợng sử dụng trong vẫn đề loại nhựa trên gỗ.

Các loài nấm mục mềm thƣờng ƣu tiên phân hủy carbohydrate trong
thành tế bào gỗ mềm và gỗ cứng. Nấm tấn công từ trên bề mặt gỗ, làm cho
các lớp ngồi có màu đen hoặc đen xám, trơn mềm và bị nứt ngang thớ khi gỗ
khô. Chúng lấy Nitơ cố định từ gỗ hoặc môi trƣờng xung quanh để sinh tổng


11
hợp enzym. Trong tự nhiên, nấm mục mềm phân hủy gỗ kém hơn nấm mục
trắng.
Nấm mục trắng đƣợc biết đến là những tác nhân phân hủy lignin mạnh
trong điều kiện tự nhiên nhờ có hệ enzym oxy hóa mạnh và tính đặc hiệu cơ
chất thấp. Một số loại nấm mục trắng phân hủy lignin và hemicellulose nhƣng
khơng gây thất thốt cellulose. Ngồi ra một số lồi nấm mục trắng cịn có
khả năng phân hủy các chất chiết nhựa trong cả gỗ mềm và gỗ cứng [8]. Theo
một báo cáo về sự phân hủy hợp chất nhựa, nấm mục trắng có khả năng loại
bỏ hoàn toàn triglyceride, chất béo, axit, este sterol và sáp trong gỗ thơng,
thậm chí cả sterol và axit nhựa cũng bị phân hủy mạnh [8]. Nấm mục trắng và
hệ enzym của chúng là chất xúc tác sinh học mạnh hơn có khả năng loại lipid
khó phân hủy. Nhờ có hệ enzym oxi hóa mạnh nhƣ esterase, laccase, lignin
peroxidase, magan peroxidase, lipase,… nấm mục trắng vừa có khả năng
phân hủy đƣợc nhựa cây vừa loại bỏ lignin còn tồn dƣ. Do đó hỗ trợ hiệu quả
cho q trình tẩy trắng bột giấy hồn tồn khơng chlorine (TCF) [16]. Nhựa
cây gây ra sự ức chế khả năng phát triển của nhiều loài nấm trên gỗ. Tuy
nhiên, nhiều loài nấm mục trắng có khả năng chịu độc tố của chất chiết nhƣ
Bjerkandera sp. và Trametes versicolor. Kết quả phân tích gỗ đã ủ với các
chủng Bjerkandera sp. và Trametes versicolor cho thấy lƣợng chất chiết béo
giảm tới 90%, đồng thời độc tố giảm từ 7-17% [8]. Nấm Trametes versicolor
làm giảm 40% axit nhựa, 100% các triglycerides và làm giảm độc tố trong
môi trƣờng nƣớc của gỗ Vân Sam sau 4 tuần ni ủ [17]. Thậm chí, một số
lồi nấm mục trắng có thể loại bỏ hồn tồn các chất chiết chính trong gỗ

bạch đàn. Nấm Phlebia và Ceriporiopsis có thể phân hủy hoàn toàn các sterol
tự do và sterol ester hóa, vốn là những thành phần rất phổ biến trong gỗ bạch
đàn.
Ngoài ra, một số chủng nấm men nhƣ Trichosporon pullulans,
Cryptococcus albidus, Sporobolomyces salmonicolor và Debaryomyces
occidentalis var. occidentalis đã loại đƣợc 60% nhựa cây gỗ thông, chủ yếu là
các axit nhựa, steryl este và triglyceride [8].


12
1.3.2. Vi khuẩn, xạ khuẩn phân hủy nhựa cây.
Trong tự nhiên, bên cạnh các loài nấm phân hủy gỗ và các chất chiết
trong cây, cịn có nhiều lồi vi khuẩn và xạ khuẩn trong đất, trong nƣớc thải
nhà máy giấy và đống ủ compost cũng có khả năng phân hủy nhanh các axit
nhựa. Chúng có tốc độ phát triển nhanh hơn nấm, nhiều lồi có khả năng tạo
bào tử và chịu đƣợc nhiệt độ cao nên dễ dàng sử dụng trong công nghiệp [18].
Vi khuẩn phân hủy nhựa cây.
Vi khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây đã đƣợc chứng minh, mặc dù
số lƣợng cơng bố là ít hơn so với nấm. Một số có khả năng sinh tổng hợp
nhiều loại enzym và sinh trƣởng trên các loại gỗ có chất chiết với nồng độ
axit nhựa cao. Một số vi khuẩn phân lập từ đất, gỗ và các nguồn nƣớc tự
nhiên nhƣ Arthrobacter sp., Alcaligenes eutrophus, Pseudomonas sp., và
Flavobacterium resinovorum đều có khả năng phát triển trên axit
dehydroabietic nhƣ nguồn carbon duy nhất. Một số vi khuẩn Gr (-) cũng có
khả năng phân hủy các axit nhựa khác nhau trong gỗ cũng đã đƣợc công bố
nhƣ chi Sphingomonas Cornamonas, Alcaligenes và Pseudomonas... Hơn
75% axit nhựa đã bị phân hủy trong vòng 8 ngày bởi Sphingomonas sp. và Z.
ramigera. Chi Sphingomonas sp. có thể sử dụng nhiều loại cacbon thƣờng
thấy trong nƣớc thải của nhà máy bột giấy và có thể phát triển trên axit nhựa
nhanh hơn trên glucose. Các loài Pseudomonas đã đƣợc cơng bố là có thể

phát triển trên nguồn carbon duy nhất là axit isopimaric. Ngoài ra, chúng có
thể phát triển trên axit pimaric và dehydroabietic và axit abietic. Trong một số
nghiên cứu về các vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải sản xuất bột giấy kraft, hai
trong số 9 vi khuẩn phân lập có thể phân hủy trên 50% axit dehydroabietic (ở
nồng độ ban đầu là 40 pg mL-l) trong vòng 24 giờ. Các vi khuẩn còn lại có
khả năng phân hủy khoảng 30% axit dehydroabietic trong cùng khoảng thời
gian. Tuy nhiên, các loài vi sinh vật khác nhau thì khả năng phân hủy các
thành phần axit nhựa là khác nhau [11].
Theo Burnes và cộng sự (2000) tiền xử lý gỗ thông không cần khử trùng
với các chủng P. fluorescens NRRL B21432 và Pseudomonas sp. UM-74 đã
làm giảm 40 và 34%, tƣơng ứng chất chiết nhựa trên các loại dăm mảnh tƣơi.


13
Trong đó, các axit nhựa giảm 25% và các axit béo giảm 36%, tƣơng tự khi xử
lý dăm mảnh gỗ với các chủng nấm bạch tạng. Bên cạnh đó, sử dụng các
chủng vi khuẩn làm giảm hàm lƣợng các chất chiết trong gỗ trƣớc khi sản
xuất bột giấy dẫn đến giảm các vấn đề về nhựa trong suốt quá trình sản xuất
giấy và giảm nồng độ các axit nhựa trong dịng thải [19]. Các vi sinh vật này
có tiềm năng ứng dụng cao do có khả năng chịu nhiệt, sinh trƣởng và phát
triển trong mơi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm mà nấm phân hủy gỗ không
sinh trƣởng đƣợc. Bên cạnh đó, sử dụng vi khuẩn có thể mang lại hiệu quả
cao do khả năng phát triển nhanh trên gỗ không cần khử trùng và lấn át đƣợc
sự phát triển của các loài nấm tạp nhiễm.
1.3.1.3. Xạ khuẩn phân hủy nhựa cây.
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, G(+), phân bố rộng rãi trong tƣ
nhiên (đất, nƣớc) tham gia vào quá trình chuyển tự nhiên của nhiều hợp chất
có trong đất. Xạ khuẩn có hệ enzym phân hủy giúp làm giảm các hợp chất
hữu cơ có trong thực vật (axit nhựa, lignin) và chitin. Xạ khuẩn có khả năng
sinh enzym phân hủy nhựa cây nhựa esterase, lipase, một số chủng xạ khuẩn

nhƣ Streptomyces griseus, Streptomyces cyaneus, Streptomyces coelicolor,
Streptomyces ipomoea, Streptomyces sviceus, Streptomyces sp. cịn có khả
năng sinh laccase phân hủy các hợp chất vòng nhân thơm, cắt đứt các liên kết
este có trong thành phần nhựa cây. Cấu trúc của enzym laccase trong xạ
khuẩn có điểm rất khác so với nấm và vi khuẩn. Thay vì cấu trúc 3 miền
enzym laccase trọng xạ khuẩn chỉ có cấu trúc 2 miềm nên đƣợc gọi là laccase
nhỏ [20].
Trong một số nghiên cứu cho thấy, xạ khuẩn có khả năng sinh trƣởng
nhanh và thích nghi tốt với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Khi nhiệt độ
tăng cao xạ khuẩn hình thành nên các thể bào tử để thích nghi tốt hơn với điều
kiện mơi trƣờng. Ngồi ra, chúng cịn có khả năng sinh trƣởng trên mơi
trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm mà một số lồi nấm phân hủy khó có thể phát
triển đây đƣợc xem nhƣ tiềm năng ứng dụng cao do của xạ khuẩn. Bên cạnh
đó, với khả năng phát triển nhanh trên gỗ, và sinh một số hoạt chất kháng


14
khuẩn, kháng nấm, xạ khuẩn có thể át đƣợc sự phát triển của các lồi nấm tạp
nhiễm mà khơng cần khử trùng.
1.3.3. Hệ enzym phân hủy nhựa cây.
1.3.2.1. Esterase
Các esterase sterol (EC 3.1.1.13) là các hydrolases đƣợc tìm thấy trong
vi khuẩn, nhƣ Pseudomonas aeruginosa, nấm men, Candida rugosa và nấm
dát gỗ thuộc chi Ophiostoma, Melanocarpus albomyces, Trichoderma sp.
Chúng có khả năng phân cắt các ester của Sterol và axit béo chuỗi dài. Trong
một số nghiên cứu cho rằng các enzyme esterase sterol từ P. aeruginosa, C.
rugosa, M. albomyces, hoặc O. piceae, cũng có khả năng thuỷ phân các chất
lipase điển hình và carboxylesterase điển hình [21]. Enzyme tiết ra bởi O.
piceae là một chất xúc tác sinh học mạnh mẽ có khả năng thủy phân hỗn hợp
tinh khiết hoặc tự nhiên của este sterol có trong gỗ cứng và mềm, liên quan

đến sự hình thành các chất lắng khơng mong muốn trong quá trình sản xuất
bột giấy sản xuất giấy, nhƣng nó cũng là một chất xúc tác sinh học hiệu quả
trong phản ứng tổng hợp để tạo ra estrogen phytosterol, hợp chất đƣợc công
nhận để làm giảm LDL cholesterol [21].
Sterol esterase có khối lƣợng phân tử 56,5 kDa, điểm đẳng điện là 3,3,
phạm vi pH hoạt động 6 – 8 , pH tối ƣu từ 6,2 – 7, nhiệt độ thích hợp 37 oC
[22]. Khi có cơ chất, sterol esterase sẽ thủy phân cắt các liên kết ester theo
phản ứng
Sterol esterase
este steryl + H2O

sterol + axit béo.

Esterase thủy phân các liên kết ester của ester acyl tan trong nƣớc và
glycerolester đƣợc nhũ hóa với các nhóm acyl chuỗi ngắn (≤C8 [23]. Esterase
thuộc nhóm siêu cấu trúc α /-hydrolase với các chuỗi song song chúng đƣợc
bao quanh bởi các kết nối xoắn ốc. Enzyme này cũng chứa một bộ ba xúc tác
đƣợc tạo thành từ dƣ lƣợng serine, histidine và aspartate / glutamate trong
chuỗi polypeptide; dƣ lƣợng serine của enzym nằm ở trung tâm của chuỗi


15
trình tự pentapeptide có tính bảo tồn gồm Gly-X-Ser-X-Gly, trong đó X có
thể là bất kỳ axit amin nào [24].
Sterol esterase có tính đặc hiệu cơ chất thấp, ngồi việc tham gia phân
cắt este sterol chúng còn tham gia thủy phân chất béo trung tính và pnitrophenyl khác nhau. Tuy nhiên, khả năng thủy phân este sterol là đƣợc coi
là một đặc điểm điển hình của nhóm này [8]. Trong xử lý nhựa cây trong dăm
mảnh, Sterol esterase tham gia vào quá trình phân cắt este các axit nhựa,
Stigmasterol, Steryl este và sterol, các gốc rƣợu béo, axit béo, triglyceride,…
thành các nhóm acyl chuỗi ngắn dễ thủy phân.

Esterase đã đƣợc cơng nhận là chất xúc tác sinh học hữu ích vì sự linh
hoạt của chúng trong nhiều lĩnh vực cơng nghiệp các ứng dụng, bao gồm việc
sử dụng chúng trong chất tẩy rửa hoặc nhƣ chất phụ gia trong ngành công
nghiệp thực phẩm (Harwood 1989, Jaeger và Reetz 1998) [25].
1.3.2.2. Lipase
Lipase (EC 3.1.1.3) thuộc nhóm Enzyme lipolytic (EC 3.1.1.-), phân bố
rộng rãi trong tự nhiên, là một nhóm hydrolase đa dạng xúc tác cho sự phân
tách hoặc hình thành liên kết ester [26]. Lipase đƣợc tìm thấy ở một số loài vi
khuẩn Pseudomonas euruginosa, Staphylococcus hyicus, Bacillus
stearothermophilus, Geobacillus zalihae,… [27].
Khác với esterase tham gia vào phân cắt acyl chuỗi ngắn thì lipase lại
tham gia vào quá trình thủy phân các este acyl khơng tan trong nƣớc và chất
nền nhũ hóa với các nhóm acyl chuỗi dài [24]. Lipase xúc tác quá trình thủy
phân triacylglycerol thành glycerol và axit béo tự do dƣới dạng lipid-nƣớc,
trong đó chất nền lipolytic là trạng thái cân bằng giữa monomeric, micellar và
nhũ hóa [28]. Hai tiêu chí đƣợc sử dụng để nhận biết lipase thực sự là sự xuất
hiện nhũ tƣơng khi thủy phân triglyceride hoặc nó phải tạo vịng kết tủa bề
mặt tại vị trí hoạt động của enzyme. Q trình thủy phân glycerolester có
chiều dài chuỗi acyl <10 nguyên tử carbon với Tributyrylglycerol (Tributyrin)
làm chất nền tiêu chuẩn thƣờng cho thấy sự có mặt của các ester [29]. Mặc dù
vai trò sinh lý của nhiều lipase ở vi sinh vật vẫn chƣa rõ ràng, nhƣng ở vi