Luận văn thạc sĩ sinh học thực phẩm 277261

...

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi, các số liệu, kết quả,
hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chƣa đƣợc ai cơng bố trong bất
cứ cơng trình của tác giả nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2017
TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn

Nghiên cứu sinh

Phùng Thị Thủy

1


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quang Hịa và PGS.TS. Tơ Kim
Anh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà
Nội đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian nghiên cứu để
tơi hồn thiện Luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, đồng nghiệp của tôi trong Viện Công
nghệ Sinh học Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình
nghiên cứu luận án và trong cuộc sống hàng ngày. Xin chân thành cảm ơn
Ths. Nguyễn Thành Trung, Viện Kiểm nghiệm an tồn thực phẩm đã giúp đỡ
tơi khi tôi thực hiện một phần luận án tại Viện. Xin chân thành cảm ơn Ths.
Nguyễn Thành Đông, Trung tâm Y tế dự phịng Hà Nội đã giúp đỡ tơi khi tôi
thực hiện một phần luận án tại Trung tâm.
Xin cảm ơn Sở KHCN HN đã cấp một phần kinh phí cho tơi thực hiện đề tài
này thơng qua đề tài cấp sở mã số 01C-06/04-2013-2
Xin cảm ơn KS. Hà Thị Xun, KS. Nguyễn Thu Hiền Phịng Thí nghiệm

Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học thực phẩm đã giúp đỡ tơi trong
q trình thực hiện nghiên cứu Luận án tại Viện.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng cấp Bộ môn, Hội đồng cấp
cơ sở và các thầy cô phản biện độc lập đã cho tơi những góp ý q báu để
hồn thiện bản luận án này.
Để hồn thiện Luận án này tơi khơng thể khơng nói lời cảm ơn chân thành
nhất đến bạn bè, ngƣời thân, gia đình đã ln động viên và dành thời gian cho
tôi thực hiện nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Phùng Thị Thủy

2


MỤC LỤC
MỤC LỤC………………………………………………………………………………….

3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT……….…………………………………………………….

7

DANH MỤC HÌNH………………………………………………………….......................

10

DANH MỤC BẢNG………………………………………………………………………..

12

MỞ ĐẦU………………………………………………………………………....................

14

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN………………….……………………………………………... 16
1.1. Listeria monocytogenes…………………….…………………………………………………

16

1.1.1. Đặc điểm L. monocytogenes……………………………….………………………………..

16

1.1.2. Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L.
monocytogenes…………………………………………..…………………………………………
20
1.1.3 Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L.
monocytogenes…………………………………………………………………………..………….
24
1.1.4. Quy định kiểm soát L. monocytogenes…………………………………………………..

26

1.2. Dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes……………………………..……………….

26

1.2.1. Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L. monocytogenes……………..……….

26

1.2.2. Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (clones complex) L. monocytogenes………..

26

1.2.3. Đặc điểm dịch tễ các kiểu huyết thanh L. monocytogenes……………………….…

27

1.2.4. Các phƣơng pháp phân loại sử dụng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử…….

28

1.2.4.1. Phƣơng pháp điện di xung trƣờng (PFGE)……………………………………..

28

1.2.4.2. Phƣơng pháp ribotyping……………………………………………….…………

29

1.2.4.3. Phƣơng pháp đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên
(RAPD)…………………………………………………..………………………………..
29
1.2.4.4. Phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn DNA (AFLP)…………….………….

30

1.2.4.5. Phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn sản phẩm PCR (PCRRFLP)……………………………………………………………………………………..
1.2.4.6. Phƣơng pháp khuếch đại các trình tự lặp (REP-PCR)………………………….

30
31

1.2.4.7. Phƣơng pháp phân tích đa hình số lƣợng các vùng lặp của nhiều locus
(MLVA)………………………………………………………………………….……….
31
1.2.5. Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự của nhiều locus (MLST)……..………

31

1.2.5.1. Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus gen độc (MVLST)……..

32

1.2.5.2. Phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự các gen giữ nhà………………………

32

1.2.6. Cơ sở dữ liệu về phƣơng pháp phân loại dựa trên trình tự nhiều locus
(MLST)…………………………………………………………………………………….
35
3


1.3. Một số phƣơng pháp phân tích phát hiện L. monocytogenes…………………….……

35

1.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy…………………………………………………..…………

35

1.3.1.1. Ảnh hƣởng của thành phần mơi trƣờng đến q trình tăng sinh……………..

36

1.3.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình tăng sinh………………………….……

38

1.3.1.3. Ảnh hƣởng của mẫu thực phẩm đến quá trình tăng sinh…………………..….

39

1.3.1.4. Ảnh hƣởng của thành phần vi sinh vật đồng nhiễm trong mẫu………………..

39

1.3.2. Phƣơng pháp miễn dịch………………………………………………………..…..

41

1.3.3. Phƣơng pháp khuếch đại DNA (PCR, real-time PCR)……………………….……

42

1.4. Kỹ thuật nhân gen đẳng điện tạo cấu trúc vòm (LAMP)……………………………

44

1.4.1. Nguyên tắc của kỹ thuật LAMP…………………………….……………………..

44

1.4.2. Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP………………………………………………….

46

1.4.3. Phát hiện sản phẩm LAMP……………………………………………..…………..

47

1.4.4. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả phản ứng LAMP…………….……………

48

1.4.5. Các nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp LAMP để phát hiện L. monocytogenes trên
thế giới……………………………………………………………………………………..
49
1.5. Một số kỹ thuật tách chiết thu nhận nhanh DNA cho các phản ứng khuếch đại
DNA………………………………………………………….…………………………….
51
1.5.1. Các yêu cầu đối với DNA sử dụng cho các kỹ thuật nhân gen…………………..

51

1.5.2. Tách chiết và tinh sạch DNA………………………………………………….…...

52

1.5.3. Kiểm tra hiệu suất thu hồi và chất lƣợng DNA…………………………………...

55

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………

56

2.1. Địa điểm nghiên cứu…………………………………………………………..……..

56

2.2. Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………….………….

56

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………..………………………

57

2.3.1. Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm………………..……………………

57

2.3.2. Phản ứng Real-time PCR…………………………………………..…………………

58

2.3.3. Phản ứng PCR……………………………………………………………………….

58

2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen………………………….…………

59

2.3.5. Phân loại các kiểu trình tự ST…………………………………………….………….

60

2.3.6. So sánh trình tự 7 đoạn gen của các chủng phân lập đƣợc với một số chủng trên
ngân hàng dữ liệu…………………………………………………………………………
60
2.3.7. Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP…………………………………………….…..

60

2.3.8. Lựa chọn mồi LAMP……………………………………………………………....

60

2.3.9. Tối ƣu hóa phản ứng LAMP…………………………………………………….…

60

4

2.3.10. Điện di DNA…………………………………………………………………..…..

61

2.3.11. Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP………………..……..

61

2.3.12. Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP………………………………….………

61

2.3.13. Xây dựng quy trình tăng sinh L. monocytogenes nhanh………………………..…

61

2.3.14. Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA của L. monocytogenes…………..……

63

2.3.15. Xây dựng quy trình phân tích L. monocytogenes trên mẫu thực phẩm………….

64

2.3.16. Kiểm định bộ sinh phẩm………………………………………………………….…

64

2.3.17. Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm………………………………………….…..

65

2.3.18. Phƣơng pháp xử lý thống kê theo phần mềm excel……………………..………..

65

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………….……….

66

3.1. Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ
một số thực phẩm Việt Nam…………………………………………..…………………..
66
3.1.1. Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm…………….………………...

66

3.1.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập………..…

70

3.1.2.1. Giải trình tự các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat, ldh và lhkA của các chủng L.
monocytogenes phân lập……………………………………………………………………. 71
3.1.2.2. Phân tích tính đa hình về trình tự nucleotid của các gen abcZ, bglA, cat, dapE, dat,
ldh và lhkA từ các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc……………………..
71
3.1.2.3. Phân loại các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc………………….………

73

3.1.2.4. So sánh các chủng L. monocytogenes đã phân lập đƣợc với các chủng gây bệnh
dịch trên thế giới…………………………………………………………………………..
78
3.2. Xây dựng quy trình phân tích nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ
thuật LAMP………………………………………………………………………………..
81
3.2.1. Xây dựng phản ứng LAMP……………………………………………….………..

81

3.2.1.1. Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ………………………………………………

82

3.2.1.2. Lựa chọn bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nhất……………………..…

84

3.2.1.3. Tối ƣu phản ứng LAMP…………………………………………………….……

85

3.2.2. Xây dựng quy trình tăng sinh………………………………………………….……

93

3.2.2.1. Ảnh hƣởng của loại môi trƣờng cơ bản đến sự sinh trƣởng L.
monocytogenes………………………………………………………………………………….……

95
3.2.2.2 . Ảnh hƣởng của một số thành phần môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của L.
monocytogenes………………………………………………………………………………….…...
96
3.2.2.3 Ảnh hƣởng của acriflavine và acid nalidixic đến sự sinh trƣởng của một số loài vi
khuẩn khác………………………………………………………………………………….
98
5


3.2.2.4. Thử nghiệm tăng sinh trên mẫu thực phẩm……………………………………….

99

3.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA……………………………………………….

100

3.2.3.1. Khả năng tách chiết DNA L. monocytogenes khi sử dụng Triton X100 kết hợp siêu
âm và gia nhiệt ở 95 oC………………………………………………………………..
100
3.2.3.2. Khả năng tách chiết DNA L. monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp siêu âm
và gia nhiệt ở 95 oC……………………………………………………………………….... 102
3.2.3.3. So sánh các phƣơng pháp tách chiết nghiên cứu đối với canh trƣờng L.
monocytogenes thuần………………………………………………………….……………. 104
3.2.3.4. Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phƣơng pháp đối với mẫu thực phẩm
tăng sinh……………………………………………………………................................
105
3.2.3.5. Ảnh hƣởng của lƣợng mẫu lấy tách chiết DNA cho phản ứng LAMP………..…

107

3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP trên các nền mẫu khác nhau…………………….….

108

3.2.4. Đề xuất quy trình phân tích…………………………………………………………

110

3.2.5. Xác định độ nhạy của tồn bộ quy trình………………………………………….…

111

3.2.6. Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L.
monocytogenes……………………………………………………………………………………..
112
3.2.6.1. Thiết kế bộ sinh phẩm……………………………………………………………..

112

3.2.6.2. Sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………..….

114

3.2.7. Kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO………………………………….…….

116

3.2.8. Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO…………………..………..

118

CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN………………………………………………………………

122

KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………….…………...

123

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN……………..…….

124

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………….

125

PHỤ LỤC…………………………………………………………………………….……..

142

6


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
AFLP

ALOA

UVM

Tên đầy đủ tiếng anh

Tên tiếng Việt

Amplified Fragment Length
Polymorphism
Chromogenic
Listeria
Agar
according to Ottaviani and Agosti

Đa hình chiều dài các đoạn DNA

University
of
Enrichment Broths

Vermont

Mơi trƣờng chọn lọc Listeria có
chỉ thị màu đƣợc phát triển bởi
Ottaviani và Agosti
Môi trƣờng tăng sinh UVM
Môi trƣờng tăng sinh BLEB

BLEB

Buffered
Broth

Listeria

Enrichment

HF

Half Fraser Broth

Môi trƣờng Half Fraser

aw

Water activity

Hoạt độ nƣớc

bp

Base pair

Cặp bazơ

CAMP

Christie, Atkins, Munch-Petersen

Phản ứng CAMP

CDC
CFU

Center for Disease Control and
Prevention
Colony forming unit

Trung tâm phòng chống và kiểm
sốt dịch bệnh
Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

dNTP

Deoxynucleotide

Deoxynucleotide

EDTA

Ethylen Diamine
Acid
Ethidium Bromide

EtBr
ISO
USDA-FSIS

FDA
AOAC

Tetraacetic

International Organization for
Standardization
United States Department of
Agriculture-Food
Safety
Inspection Service
U.S.
Food
and
Drug
Administration
Association of Official Analytical
Chemists

Axit Ethylen Diamine Tetraacetic
Ethidium Bromide
Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn
hóa
Bộ Nơng nghiệp và dịch vụ kiểm
sốt an tồn thực phẩm Mỹ
Cục quản lý dƣợc phẩm và thực

phẩm Mỹ
Hiệp hội các nhà hố phân tích
chính thống

7


kDa

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LAMP

MLST

Loop-Mediated
Isothermal
Amplification
Multi-virulence-locus sequence
typing
Multi-locus sequence typing

PBS

Phosphate Buffered Saline

Khuếch đại đẳng nhiệt tạo cấu
trúc vịm

Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus gen gây độc
Phân loại dựa trên trình tự nhiều
locus
Đệm muối phosphate

PCPLC
PCR

Phosphatidylcholine
phospholipase C
Polymerase Chain Reaction

Phosphatidylcholine
phospholipase C
Phản ứng tổng hợp chuỗi ADN

PEG

Polyethylene glycol

Polyethylene glycol

PFGE

Pulsed-field gel electrophoresis

Kỹ thuật điện di xung trƣờng

RAPD

TAE

Randomly amplified polymorphic
DNA
Tris - Acetate - EDTA

Đa hình dựa trên khuếch đại ngẫu
nhiên các đoạn DNA
Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

Tris - EDTA

PA

Positive agreement

Tƣơng đồng về mẫu dƣơng tính

NA

Negative agreement

Tƣơng đồng về mẫu âm tính

ND

Negative deviation

Sai khác về mẫu âm tính

PD

Positive deviation

Sai khác về mẫu dƣơng tính

AC

Relative accuracy

Độ chính xác tƣơng đối

SP

Relative specificity

Độ đặc hiệu tƣơng đối

SE

Relative sensitivity

Độ nhạy tƣơng đối

PCR-RFLP
rep-PCR

PCR-restriction fragment length
polymorphism
Repetitive element PCR

Đa hình chiều dài các đoạn cắt
giới hạn sản phẩm PCR
Khuếch đại các trình tự lặp

MOX

Modified Oxford Agar

Môi trƣờng Oxford Agar cải biến

MLVA

Multiple-locus variable number
of tandem repeat analysis
Pulsed-field gel electrophoresis

Phân tích tính đa hình số lƣợng
các vùng lặp của nhiều locus
Điện di xung trƣờng

MVLST

PFGE
MLEE

Multilocus
electrophoresis typing

CC

Clones complex

enzyme Phân loại theo phổ điện di nhiều
enzyme
Dòng phức hợp

8


EC

Epidemic clones

Dòng phức hợp gây bệnh

DI

Simpson's Diversity Index

Chỉ số phân loại Simpson

VNTRs

Variable
repeats

ST

Sequence type

Kiểu trình tự

TSBYE

Tryptic Soy Broth Yeast Extract

Mơi trƣờng dịch chiết nấm men
và trypton từ đậu tƣơng

numbers

of

tandem Đa hình số lƣợng các vùng lặp

9


DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes ......................................................................... 17
Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người ............................. 20
Hình 1-3. Cấu tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe ............................. 22
Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ . ......................................................................................... 24
Hình 1-5 Tốc độ sinh trưởng của chủng L. monocytogenes 1340 và chủng L.
innocua11288 trong canh trường hỗn hợp và canh trường riêng biệt, mơi trường được

sử dụng là TSBYE .............................................................................................................................. 40
Hình 1-6 Mơ hình phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh L. monocytogenes 42
Hình 1-7 Nguyên tắc kỹ thuật LAMP ........................................................................................... 45
Hình 1-8 Các phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP ......................................................... 47
Hình 1-9 Ảnh hưởng của nồng độ ion Mg2+đến phổ hấp thụ của HNB trong dung dịch
phản ứng LAMP ................................................................................................................................. 48
Hình 3-1 Kết quả ph n lập L. monocytogenes sử dụng mơi trường APID L.mono. .... 66
Hình 3-2 Kết quả khẳng định bằng PC các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định ph n
lập được trên môi trường APID L.mono ................................................................................... 67
Hình 3-3 Mối liên hệ về mặt di truyền của L. monocytogenes đã ph n lập được từ thực
phẩm........................................................................................................................................................ 79
Hình 3-4 Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa trên khả năng khuếch đại DNA của L.
monocytogenes ..................................................................................................................................... 84
Hình 3-5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của
phản ứng LAMP. ................................................................................................................................. 87
Hình 3-6 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP .... 89
Hình 3-7 ộ bao tr m của phản ứng LAMP v i các chủng L. monocytogenes ............... 89
Hình 3-8 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn
thường nhiễm tạp trong thực phẩm................................................................................................ 90

10


Hình 3-9 Ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP đối v i DNA tinh khiết của L.
monocytogenes ..................................................................................................................................... 91
Hình 3-10 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HNB ................................. 91
Hình 3-11 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này v i
các phương pháp LAMP phát hiện L. monocytogenes đã được cơng bố............................ 93
Hình 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự sinh trưởng của L.
monocytogenes trong mơi trường BLEB (canh trường thuần) .............................................. 96

Hình 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ pyruvat đến đến sự sinh trưởng của L.
monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) .............................................. 97
Hình 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavine và axít nalidixic đến sự sinh trưởng của
L. monocytogenes trong môi trường BLEB (canh trường thuần) ......................................... 98
Hình 3-15 So sánh hiệu quả tách chiết DNA L. monocytogenes (canh trường thuần) của
các quy trình sử dụng NaOH, Triton X100 và sinh phẩm GeneJET Genomic DNA
Purification Kit ..................................................................................................................................104
Hình 3-16 So sánh hiệu quả tách chiết DNA của L. monocytogenes từ canh trường tăng
sinh mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X100, sinh phẩm
GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thơng thường ...........105
Hình 3-17 So sánh hiệu quả tách chiết DNA L. monocytogenes từ canh trường tăng sinh
mẫu xúc xích khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm glycine-tris pH 8,3 và Triton X
100 .........................................................................................................................................................106
Hình 3-18 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến khả
năng khuếch đại đoạn gen inlJ của phản ứng LAMP.............................................................107
Hình 3-21 Kết quả thử nghiệm quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes dựa trên kỹ
thuật LAMP .........................................................................................................................................112
Hình 3-22 Hình ảnh bộ sinh phẩm LAMP-L MONO .............................................................113
Hình 3-23 Sơ đồ qui trình sản xuất bộ sinh phẩm LAMP-L MONO phát hiện nhanh L.
monocytogenes trong thực phẩm ..................................................................................................115

11


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1 ặc tính sinh hóa của một số loài thuộc chi Listeria ........................................... 18
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của
Listeria ................................................................................................................................................... 18
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến
2015......................................................................................................................................................... 25

Bảng 1-4 Ảnh hưởng của một số chất nhiễm tạp đến phản ứng LAMP và PC ............. 53
Bảng 1-5 Các chất ức chế phản ứng PC thường gặp trong một số loại thực phẩm và
biện pháp loại bỏ ................................................................................................................................. 54
Bảng 2-1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PC khẳng định L.
monocytogenes ..................................................................................................................................... 58
Bảng 2-2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PC khuếch đại các đoạn gen
giữ nhà.................................................................................................................................................... 59
Bảng 3-1 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại
Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015................................................................. 68
Bảng 3-2 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes theo loại thực phẩm tại Việt
Nam trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015 ......................................................................... 69
Bảng 3-3. Tính đa hình về trình tự nucleotide của các gen các gen abcZ, bglA, cat,
dapE, dat, ldh và lhkA từ các chủng L. monocytogenes đã ph n lập được ....................... 72
Bảng 3-4 Tổng hợp các kiểu trình tự (ST), dịng phức hợp (CC) và dòng giống (lineage)
của 48 chủng L. monocytogenes ph n lập được từ thực phẩm.............................................. 73
Bảng 3-5 Ph n loại các chủng L. monocytogenes đã ph n lập được theo kiểu trình tự 76
Bảng 3-6 Kết quả so sánh trình tự gen inlJ của chủng L. monocytogenes EGD-e v i các
trình tự gen của L. monocytogenes ................................................................................................ 82
Bảng 3-7. Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ ..................... 83
Bảng 3-8 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP v i các trình tự gen inlJ
trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................................................. 86
Bảng 3-9 Trình tự mồi LAMP sau suy biến ................................................................................. 86
12


Bảng 3-10 Ảnh hưởng của loại môi trường cơ bản đến sự tăng sinh của L.
monocytogenes trong canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm ............................................... 95
Bảng 3-11 Ảnh hưởng của hai loại môi trường cơ bản BLEB và HF đến sự sự tăng sinh
của L. monocytogenes trong canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm .................................. 96
Bảng 3-12 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trưởng của một số lồi vi

sinh vật chỉ thị trong mơi trường BLEB (canh trường thuần) ............................................... 99
Bảng 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ acriflavine và axít nalidixic đến sự tăng sinh của L.
monocytogenes trong mơi trường BLEB có bổ sung cao nấm men, pyruvate .................100
Bảng 3-14 Ảnh hưởng của nồng độ Triton X100 đến khả năng tách chiết DNA L.
monocytogenes...................................................................................................................................101
Bảng 3-15 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 ............................................................101
Bảng 3-16 Ảnh hưởng của thời gian siêu m đến khả năng tách chiết DNA L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X100 . ..........................................................102
Bảng 3-17 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến khả năng tách chiết DNA L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.......................................................................102
Bảng 3-18 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khả năng tách chiết DNA L.
monocytogenes...................................................................................................................................103
Bảng 3-19 Ảnh hưởng của thời gian siêu m đến khả năng tách chiết DNA L.
monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH.......................................................................104
Bảng 3-20 Ảnh hưởng của thể tích mẫu canh trường tăng sinh được sử dụng đến khả
năng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và real-time PCR .....................107
Bảng 3-21 ộ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP ..........111
Bảng 3-22 Kết quả kiểm định bộ sinh phẩm LAMP-L MONO phát hiện L.
monocytogenes ...................................................................................................................................116
Bảng 3-23 Kết quả ứng dụng bộ sinh phẩm LAMP-L MONO phát hiện L.
monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Trung t m Y tế dự phòng Hà Nội...........118

13


MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt
với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra đƣợc gọi chung là
listeriosis. Đối tƣợng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thƣờng là những ngƣời có hệ thống

miễn dịch bị suy yếu nhƣ trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, ngƣời lớn tuổi. Nếu không đƣợc
điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não,
sảy thai và tử vong.
Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi
nhƣ đất, nƣớc, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân ngƣời hoặc phân động vật.
Vi khuẩn này thể sống và tăng trƣởng chậm ở các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, hàm
lƣợng khí oxy, pH và hoạt độ nƣớc. Đặc biệt lồi vi khuẩn này có khả năng sinh trƣởng ở
nhiệt độ lạnh (0-10oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes
trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm đƣợc bảo quản lạnh trong thời gian dài.
Nhiều loại thực phẩm đƣợc bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm
nữa càng ngày ngƣời ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm khơng có chất bảo quản
hoặc khơng bị gia nhiệt để giữ đƣợc nguyên vẹn hƣơng vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu.
Những sản phẩm nhƣ vậy thƣờng đƣợc bảo quản lạnh trƣớc khi sử dụng. Vì vậy, các sản
phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ
ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên khắp thế giới đã
đƣợc thông báo.
Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ các
vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây
bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu nhƣ
khơng có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chƣa có cơng bố nào về
dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả
năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam
vẫn là một ẩn số.
Phƣơng pháp ISO 11290-1:1996 phát hiện L. monocytogenes là phƣơng pháp nuôi cấy.
Một số các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ PCR, real-time PCR hoặc các phƣơng pháp
miễn dịch (ELISA) cũng đã đƣợc tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời
của một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật
gây bệnh đã đƣợc đơn giản hóa thêm một bƣớc. LAMP là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt
đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả. Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản
ứng LAMP không cần điện di là một trong các ƣu điểm nổi trội của phƣơng pháp này, giúp

đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích. Kỹ thuật này đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng
để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới.
14


Ở Việt Nam, phƣơng pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát hiện L. monocytogenes là
phƣơng pháp ni cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc khẳng định bằng các phản ứng
sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phƣơng pháp PCR và que thử sắc ký miễn dịch
nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích cịn dài hoặc yêu cầu cao về
trang thiết bị hóa chất nên chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản
xuất.
Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tơi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế
tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ
học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị
trường Việt Nam”.
Luận án này tập trung vào hai mục tiêu chính sau:



Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes
phân lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.
Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong
các loại thực phẩm ăn liền dựa trên kỹ thuật LAMP.

Trong nghiên cứu này đối tƣợng nghiên cứu là L. monocytogenes. Phạm vi nghiên cứu tập
trung phát triển phƣơng pháp phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes trong thực phẩm
dựa trên kỹ thuật LAMP. Qui trình phân tích cần tối ƣu sao cho đơn giản, chính xác, tiện
lợi và nhanh nhất, góp phần kiểm sốt chất lƣợng an tồn vệ sinh thực phẩm. Bên cạnh đó
việc nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm cũng
giúp chúng ta thấy đƣợc hiện trạng mức độ nguy hiểm của các dịng L. monocytogenes

hiện đang nhiễm trên một số nhóm thực phẩm tại Việt Nam. Từ đó có thể giúp các nhà
quản lý, sản xuất, phân phối và tiêu dùng có các biện pháp thích hợp nhằm nâng cao chất
lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đối tƣợng vi khuẩn nguy hiểm này.
Tính mới của luận án



Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L.
monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam
Là cơng trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển kỹ thuật
LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân
tích

15


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Listeria monocytogenes
Vi khuẩn L. monocytogenes đƣợc Murray mô tả lần đầu tiên vào năm 1926 sau khi phân
lập từ những con thỏ non bị chết đột ngột. Khi đó Murray gọi vi khuẩn này là Bacterium
monocytogenes. Sau đó Harvey Pirie đã đổi tên chi thành Listeria vào năm 1940 [104].
Đến năm 1936, L. monocytogenes đƣợc công nhận là một nguyên nhân gây nhiễm trùng ở
trẻ em và viêm màng não ở ngƣời lớn [104]. Mãi đến những năm 1980, một loạt các vụ
bùng phát dịch bệnh gây ra bởi L. monocytogenes xảy ra, khi đó vi khuẩn này mới đƣợc
xác định là một nguyên nhân gây bệnh listeriosis từ thực phẩm [104]. Từ đó, các trƣờng
hợp bệnh dịch do L. monocytogenes đã đƣợc thông báo thƣờng xuyên và L. monocytogenes
hiện đƣợc công nhận là một vi khuẩn có nguy cơ cao trong ngành cơng nghiệp thực phẩm
[104],[159].
Hiện nay đã phát hiện đƣợc 17 loài (L. monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii, L.
welshimeri, L. marthii, L. innocua, L. grayi, L. fleischmannii, L. floridensis, L. aquatica, L.

newyorkensis, L. cornellensis, L. rocourtiae, L. weihenstephanensis, L. grandensis, L.
riparia, và L. booriae) [132]. Trong 17 lồi này chỉ có L. monocytogenes và L. ivanovii có
khả năng gây bệnh [153]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, L. monocytogenes có khả năng gây
bệnh cho cả ngƣời và động vật trong khi đó L. ivanovii chủ yếu gây bệnh cho động vật và
hiếm khi thấy chúng gây bệnh cho ngƣời [153]. Mƣời bẩy loài Listeria này đƣợc chia làm
2 nhóm, nhóm thứ nhất gồm 6 lồi (đƣợc gọi là Listeria sensu strictu): L. monocytogenes,
L. ivanovii, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, và L. marthii (đƣợc mô tả lần đầu năm
2010). Các lồi này có chung đặc tính là khả năng chịu lạnh và có tiên mao có thể di
chuyển đƣợc. Sáu lồi này có sự khác biệt rất rõ ràng về kiểu gen và kiểu hình, chính vì
vậy các phƣơng pháp phát hiện tiêu chuẩn L. monocytogenes hiện nay đều dựa trên sự khác
biệt kiểu hình của các lồi thuộc nhóm này. Nhóm thứ 2 gồm 11 lồi cịn lại (đƣợc gọi là
Listeria sensu lato). Và có thể đƣợc coi nhƣ một chi riêng biệt so với nhóm 1. Nhóm này
khơng có khả năng di chuyển đƣợc (trừ Listeria grayi), có thể làm giảm nitrat (trừ Listeria
floridensis), và đều âm tính với xét nghiệm Voges-Proskauer (trừ L. grayi). Khơng giống
nhƣ tất cả các lồi Listeria khác, các lồi trong nhóm thứ 2 này đƣợc đề xuất là nhóm
Mesolisteria do khơng thể phát triển dƣới 7°C. Hầu hết các loài vi khuẩn Listeria mới này
mới chỉ đƣợc xác định trong một vài quốc gia [132].
1.1.1. Đặc điểm L. monocytogenes
Đặc điểm hình thái
Listeria monocytogenes là trực khuẩn Gram dƣơng, tế bào có dạng hình que, trong một số
điều kiện nhất định chúng có thể ở dạng hình cầu. Bề mặt tế bào có các lơng roi nên giúp
L. monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong mơi trƣờng [153].

16


Hình 1-1 Hình thái vi khuẩn L. monocytogenes
( />spective)

Đặc tính sinh trưởng

Listeria monocytogenes là vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc, chúng có khả năng sinh trƣởng
trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và thậm chí trong điều kiện chân khơng.
L. monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện nhiệt độ từ - 4 tới 50°C, nhiệt độ tối
ƣu cho sự sinh trƣởng của chúng là 30-37°C. Nhiệt độ dƣới 0°C sẽ gây ức chế sự phát triển
của L. monocytogenes [153]. Listeria monocytogenes có thể phát triển trong khoảng pH từ
4,5 tới 7, sinh trƣởng tốt nhất ở giá trị pH 7. Trong dạ dày, chúng có thể tồn tại một khoảng
thời gian ở điều kiện pH 2,0 - 2,5. Hoạt độ nƣớc (aw) thích hợp cho sự sinh trƣởng của L.
monocytogenes từ 0,97 trở lên. Tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trƣởng trong điều kiện
aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại trong một thời gian dài ở aw rất thấp
[153]. Listeria monocytogenes sinh trƣởng mạnh trong môi trƣờng có nồng độ muối vừa
phải (6,5%), tuy nhiên nó vẫn có khả năng sinh trƣởng trong mơi trƣờng có nồng độ muối
khá cao 10-12%, nhờ có các gen đáp ứng stress nhƣ betL, gbuABC, opuC, opuB, lmo1421
và bsh [104].
Đặc tính sinh hố
Listeria monocytogenes có khả năng lên men nhiều loại đƣờng và khơng sinh khí H2S.
Trong 5 lồi Listeria sensu strictu chỉ có L. monocytogenes và L. seeligeri có phản ứng
CAMP dƣơng tính với Staphylococcus aureus và âm tính với Rhodococcus equi trong khi
đó, L. ivanovii lại cho phản ứng CAMP ngƣợc lại [153]. Listeria monocytogene có thể
phân biệt với L. seeligeri và L. ivanovii trong các thử nghiệm khả năng tạo axit từ các loại
đƣờng L-rhamnose, D-xylose, β-methyl-D-mannoside (Bảng 1-1) [153]. Đây là cơ sở cho
các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định L. monocytogenes trong các phƣơng pháp phân tích
dựa trên kỹ thuật ni cấy nhƣ ISO11296-1:1996 và TCVN 7700-1:2007.

17


Đặc điểm

L. monocytogene

L.ivanovii

L.innocua

L.welshimeri

L.seeligeri

L.grayi

Bảng 1-1 ặc tính sinh hóa của một số loài thuộc chi Listeria [153]

Phản ứng catalase

+

+

+

+

+

+

Phản ứng oxidase

-

-

-

-

-

-

Khả năng đồng hóa urea

-

-

-

-

-

-

Khả năng đồng hóa NO2

-

-

-

-

-

-

Phản ứng β-haemolysis

+

+

-

-

+

-

Phản ứng CAMP (S. aureus)

+

-

-

-

+

-

Phản ứng CAMP (R. equi)

-

+

-

-

-

-

L-rhamnose

+

-

d

d

-

-

D-xylose

-

+

-

+

+

-

β-methyl-D-mannoside

+

-

+

+

-

+

Mannitol

-

-

-

-

-

+

Thủy phân Hippurate

+

+

+

+

+

-

Thủy phân Esculin

+

+

+

+

+

+

Khả năng tạo axit từ:

Ghi chú:
-: 90% số chủng cho phản ứng m tính
+: 90% số chủng cho phản ứng dương tính
d: 11-89% số chủng cho phản ứng dương tính

Đặc tính kháng ngun
Các lồi Listeria có hai loại kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, đó là kháng nguyên tế bào
(somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H. Kháng ngun O có 15 loại (I đến
XV) cịn kháng ngun H có 4 loại (A đến D). Đây là cơ sở để phân loại các kiểu huyết
thanh của các loài Listeria (Bảng 1-2)
Bảng 1-2 Các tổ hợp kháng nguyên bề mặt (O và H) trong các kiểu huyết thanh của Listeria [172]

Kiểu
thanh

1/2a

huyết

Kháng nguyên O

Kháng nguyên H

I, II

A, B
18


1/2b

I, II

A, B, C

1/2c

I, II

B, D

3a

II, IV

A, B

3b

II, IV

A, B, C

3c

II, IV

B, D

4a

(V), VII, IX

A, B, C

4b

V, VI

A, B, C

4c

V, VII

A, B, C

4d

(V), VI, VIII

A, B, C

4e

V, VI, (VIII), (IX)

A, B, C

7

XII, XIII

A, B, C

5

(V), VI, (VIII), X

A, B, C

6a

V, (VI), (VII), (IX), XV

A, B, C

6b

(V), (VI), (VII), IX, X, XI

A, B, C

Đặc điểm lây nhiễm và gây bệnh
Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn gây bệnh nội bào nguy hiểm. Thông qua con
đƣờng ăn uống chúng lây nhiễm vào cơ thể ngƣời [64]. Quá trình xâm nhiễm và gây độc
của L. monocytogenes gồm các bƣớc nhƣ Hình 1-2 dƣới đây: Đi vào cơ thể qua con đƣờng
tiêu thụ thức ăn (bƣớc 1). Tại dạ dày, L. monocytogenes có khả năng kháng lại các enzyme
phân hủy protein của vật chủ, chịu đựng đƣợc môi trƣờng axit của dạ dày (pH 2,0), muối
mật và khi tấn công vào tế bào vật chủ chúng khơng gây triệu chứng viêm [175]. Sau đó
chúng bám vào tế bào chủ và xâm nhập vào tế bào chủ (bƣớc 2), phá huỷ không bào, di
chuyển trong nội bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Để sống sót qua giai
đoạn ban đầu này, L. monocytogenes tham gia nhƣ là một bộ phận của tế bào chủ với sự
giúp đỡ của một nhóm các protein bề mặt đƣợc gọi là các internalin [69]. Đến nay, các nhà
khoa học đã phát hiện đƣợc 8 loại internalin ở L. monocytogenes (A, B, C, E, F, H, I, J),
chúng khác nhau ở cấu tạo và chức năng. Trong đó internalin J (inlJ) là một trong những
protein bề mặt đƣợc xác định liên quan trực tiếp tới tính độc của L. monocytogenes.

19


Hình 1-2 Cơ chế xâm nhiễm của L. monocytogenes vào tế bào người [104]
Trong đó:
1: L. monocytogenes xâm nhập vào cơ thể thông qua thức ăn vào dạ dày
2: L. monocytogenes xâm nhập vào tế bào chủ ở thành ruột

3-8: L. monocytogenes sinh trƣởng trong tế bào chủ và di chuyển đến các tế bào lân cận

Ngƣời bị mắc bệnh listeriosis, ban đầu sẽ có các triệu chứng giống nhƣ bị cúm nhƣ sốt và
đau mỏi cơ đơi khi có hiện tƣợng tiêu chảy. Sau đó, vi khuẩn có thể xâm nhập đến các cơ
quan khác nhƣ vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu, vào não bộ gây viêm màng não,
đến tử cung gây nhiễm trùng cổ tử cung có thể gây sẩy thai hoặc chết lƣu. Những tổn
thƣơng này có thể dẫn đến chết ngƣời. Tỷ lệ chết do bệnh listeriosis trên ngƣời là khoảng
20-40% [104]. Khả năng mắc bệnh tùy thuộc nhiều yếu tố nhƣ bản thân hệ miễn dịch của
ngƣời bệnh, liều nhiễm, chủng vi khuẩn bị nhiễm. Thƣờng những ngƣời có hệ miễn dịch
kém nhƣ trẻ nhỏ, ngƣời già, ngƣời mắc các bệnh suy giảm miễn dịch (lao, HIV, ung thƣ,
cấy ghép nội tạng, ...) và phụ nữ có thai có khả năng mắc bệnh cao hơn các đối tƣợng khác
[104]. Liều nhiễm có khả năng gây bệnh phụ thuộc rất nhiều vào chủng vi khuẩn, có những
chủng độc có khả năng gây bệnh ở liều gây chết trung bình thấp (LD 50 thấp), ngƣợc lại có
chủng ít độc hơn với LD 50 cao hơn [77]. Thử nghiệm liều gây nhiễm qua thực phẩm trên
khỉ cho thấy khi nhiễm 109 tế bào L. monocytogenes, khỉ có dấu hiệu bệnh rõ ràng với triệu
chứng ở gan, dễ bị kích thích, ăn mất ngon và tiêu chảy [77]. Với ngƣời bình thƣờng, khi
sử dụng 50-100 g thực phẩm với mật độ nhiễm ≥ 10 3-10 4 CFU/g là có nguy cơ rõ rệt về
bệnh listeriosis [61].
1.1.2. Vai trị của internalin J (inlJ) trong q trình gây bệnh của L. monocytogenes
Nhƣ đã trình bày ở trên, quá trình gây bệnh của L. monocytogenes là kết quả của sự xâm
nhập và sinh trƣởng của loại vi khuẩn này trong một số loại tế bào động vật có vú bao gồm
các tế bào không phải là thực bào (non-phagocytic cells) và các tế bào bạch huyết. Trong
quá trình lây nhiễm truyền qua thực phẩm, L. monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào biểu
mơ ở ruột sau đó sẽ lây truyền đến gan và lá lách thông qua đƣờng máu và hệ bạch huyết,
rồi từ đây sẽ lan đến não và nhau thai.

20


Khi nghiên cứu chức năng của các gen, protein trong quá trình gây bệnh của L.

monocytogenes, ngƣời ta nhận thấy rằng khả năng bám và xâm nhiễm vào tế bào vật chủ
không phải là thực bào của L. monocytogenes gắn liền với một nhóm protein có tên là
internalin (Inl) [26]. Trong hệ gen của chủng L. monocytogenes EGDe có các khung đọc
mở mã hóa cho 25 loại internalin khác nhau (Hình 1-3). Tồn bộ các thành viên trong gia
đình Inl này đều có cấu trúc chung là:
Có một đoạn peptid dẫn đƣờng ở đầu N,
Có chứa vùng lặp chứa nhiều leucin ở đầu N (leucine-rich repeats: LRR), vùng lặp này có
thể chứa từ 3 đến 28 trình tự lặp bao gồm 22 axít amin. Các vùng lặp này đã đƣợc chứng
minh là tham dự vào sự tƣơng tác của internalin với thụ thể trên tế bào vật chủ [26].
Phổ biến nhất là các internalin nhóm I bao gồm 19 thành viên (Hình 1-3) vốn có một trình
tự dẫn đƣờng ở đầu C giúp các protein này có thể biểu hiện trên vách tế bào của vi khuẩn
Gram dƣơng thông qua liên kết cộng hóa trị với lớp peptidoglycan. Chính nhờ đặc tính này
mà internalin có khả năng tƣơng tác với tế bào vật chủ, tạo điều kiện cho quá trình xâm
nhiễm diễn ra. Trình tự dẫn đƣờng này bao gồm một đoạn trình tự peptid LPXTG sau đó là
một vùng kỵ nƣớc gồm khoảng 20 axít amin và một đi mang điện tích dƣơng. Trình tự
dẫn đƣờng này sẽ đƣợc phân cắt bởi transpeptidase có tên sortase A (SrtA) tại vị trí giữa
axít amin threonin (T) và axít amin glycin (G) của đoạn trình tự peptid LPXTG. Sau đó
nhóm –COOH của threonin sẽ gắn với các tiền chất của lớp thành tế bào [26].
Các internalin nhóm II bao gồm 2 thành viên (Hình 1-3) là inlB và Lmo0549 có chung đặc
điểm là đầu cuối C có khả năng tƣơng tác với vách tế bào của L. monocytogenes nhờ các
liên kết phi cộng hóa trị. Đối với inlB, vùng tƣơng tác với vách tế bào là các đoạn lặp GW
(bao gồm 3 vùng lặp đƣợc bắt đầu bởi một dipeptid có trình tự Glycin (G) – Tryptophan
(W)). Trong khi đó đối với Lmo0549 thì vùng tƣơng tác với vách tế bào đƣợc cho là do
vùng WxL quy định [26].
Nhóm internalin cuối cùng bao gồm các protein có kích thƣớc nhỏ đƣợc tiết ra bên ngồi
mơi trƣờng mà điển hình nhất là inlC [26].

21

Hình 1-3. Cấu tạo của 3 nhóm internalin từ L. monocytogenes EGDe [26]
(I): internalin v i motif LPXTG;
(II): internalin GW hoặc WxL;
(III): internalin được tiết ra môi trường;
Các v ng trình tự tương đồng được đánh dấu c ng màu v i chú thích các v ng ở bên phải; các chữ số trong
các hộp màu chỉ số lượng các trình tự lặp.

Chức năng của các internalin trong quá trình gây bệnh của L. monocytogenes ở ngƣời đƣợc
phát hiện lần đầu tiên là ở inlA. Loại internalin này nhận biết và xâm nhiễm vào tế bào
biểu mô ở ruột thông qua tƣơng tác đặc hiệu với E-cadherin (Ecad) vốn là một protein
xuyên màng tế bào cần thiết cho quá trình kiến tạo vùng tiếp giáp bám dính ở lớp tế bào
biểu mô. Ở tế bào động vật, tùy thuộc vào nồng độ Ca2+, các phân tử Ecad có khả năng
tƣơng tác với nhau thông qua đầu N ngoại bào, trong khi đó vùng nội bào của Ecad sẽ
tham dự vào quá trình hình thành bộ khung tế bào (cytoskeleton) nhờ liên kết với các
catenin để tạo vùng tiếp giáp bám dính giữa các tế bào. Khi inlA tƣơng tác với Ecad sẽ
kích hoạt bộ máy của tế bào nhằm sắp xếp lại bộ khung tế bào. Chính điều này sẽ tạo điều
kiện cho L. monocytogenes có thể xâm nhập vào tế bào biểu mô ở ruột ngƣời [26].
Một trong những internalin khác cũng đã đƣợc chứng minh là liên quan đến quá trình gây
bệnh của L. monocytogenes là inlJ. Về mặt cấu trúc, inlJ là một protein bao gồm 851 axit
amin với điểm đặc thù là vùng LRR có chứa cystein (C) thay vì leucin (L) tại vị trí axit
amin thứ bảy trong hầu hết 15 đơn vị lặp (Hình 1-4). Ngồi ra, khác với inlA, inlJ có bốn
22


vùng lặp MucBP (Mucin-Binding Protein) vốn là các vùng protein có khả năng tƣơng tác
với một số glycoprotein ở niêm mạc ruột (Hình 1-4).Trong nghiên cứu đầu tiên về chức
năng của inlJ, Sabet và các đồng tác giả [161] đã chỉ ra rằng việc bất hoạt gen inlJ (hay gen
lmo2821) làm giảm đáng kể độc lực của L. monocytogenes khi tiêm vào tĩnh mạch chuột
hay khi cho lây nhiễm bằng đƣờng miệng. Nghiên cứu tiếp theo của Sabet và các đồng tác
giả vào năm 2007 [162] đã cho thấy protein inlJ không đƣợc tổng hợp khi nuôi cấy L.

monocytogenes trong canh trƣờng BHI (Brain Heart Infusion) cũng nhƣ khi cho loại vi
khuẩn này sinh trƣởng trong tế bào chất của một số dịng tế bào động vật ni cấy trong
phịng thí nghiệm. Tuy nhiên, inlJ lại biểu hiện trên bề mặt của L. monocytogenes trong
máu và trong gan của chuột thí nghiệm đƣợc gây nhiễm. Mặt khác, khi gen inlJ đƣợc biểu
hiện dƣới sự điều khiển của một đoạn khởi động ngoại lai trong L. monocytogenes và L.
innocua giúp cho các vi khuẩn này có thể bám dính vào các dịng tế bào ngƣời ni cấy in
vitro. Tồn bộ các kết quả này cho thấy inlJ đóng vai trị quan trọng trong q trình bám
dính vào tế bào vật chủ của L. monocytogenes khi lây nhiễm in vivo.
Về mặt phân bố, trình tự gen inlJ có tính bảo thủ cao ở L. monocytogenes trong khi đó lại
khơng tồn tại trong các ở các lồi Listeria khác [26]. Khi phân tích sự có mặt của gen inlJ
trong 248 chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tƣơi sống bằng phản ứng PCR,
99,2% số chủng cho kết quả dƣơng tính với gen inlJ [199]. Hai chủng phân lập âm tính
thuộc kiểu nhóm huyết thanh (serogroups) 1/2a-3a (xác định theo phƣơng pháp PCR) vốn
ít khi gây bệnh trên ngƣời. Trong nghiên cứu này, chỉ có gen hly là cho kết quả dƣơng tính
100% (inlB (98.8%), inlA (99.6%), inlC (98.0%)). Tuy nhiên, gen hly cũng tồn tại trong
các loài Listeria khác nhƣ L. ivanovii và L. seeligeri [144]. Do vậy, các phƣơng pháp phát
hiện dựa trên gen mục tiêu hly có nguy cơ mắc phải hiện tƣợng dƣơng tính giả đặc biệt là
khi mật độ vi khuẩn L. ivanovii và L. seeligeri trong mẫu thực phẩm lớn. Từ đây, có thể
nhận thấy rằng việc lựa chọn gen inlJ nhƣ là gen mục tiêu trong các phƣơng pháp sinh học
phân tử sẽ cho phép loại bỏ đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính giả cũng nhƣ nâng cao đƣợc độ
nhạy của phƣơng pháp do khơng bị bó buộc trong việc lựa chọn các trình tự mồi đặc hiệu
cho L. monocytogenes.

23


Hình 1-4. Trình tự axit amin của inlJ [161].
Đoạn peptid tín hiệu đầu N đƣợc in đậm ở đầu trình tự; tiếp theo là trình tự của 15 đoạn lặp LRR, các axit
amin leucin, isoleucin, và valin đƣợc bôi nền đỏ và cystein đƣợc bôi nền màu xanh dƣơng, các vùng bảo thủ
khác in bằng chữ màu; vùng có cấu trúc tƣơng tự Ig (Ig-like)đƣợc bôi nền màu xám; 4 vùng lặp MucBP với

các trình tự bảo thủ đƣợc in đậm; đoạn trình tự peptid LPXTG ở đầu C đƣợc gạch chân, trình tự kỵ nƣớc
đƣợc in chữ nghiêng.

1.1.3. Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L. monocytogenes
Theo các số liệu thống kê trong giai đoạn từ 1996 đến 2000, hơn 60% các vụ triệu hồi thực
phẩm ở Mỹ có nguyên nhân là do nhiễm L. monocytogenes [104]. Một loạt các thực phẩm
nhiễm L. monocytogenes đã gây ra các vụ bùng phát dịch listeriosis ở Bắc Mỹ và Châu Âu
nhƣ coleslaw, sữa, phomat mềm, pate, xúc xích, tơm, cá, … [104]. Theo số liệu thống kê
của CDC, hàng năm ở Mỹ có khoảng 1.600 ngƣời bị bệnh và 260 ngƣời chết do listeriosis
[166]. Tính theo tỷ lệ thì hàng năm cứ 100.000 ngƣời thì có 0,26 ngƣời mắc listeriosis
hàng năm [51]. Nếu so với giai đoạn 1996-1998 thì tỷ lệ ngƣời mắc bệnh listeriosis năm
2012 đã giảm 42 %. Tuy nhiên nếu so với giai đoạn năm 2006-2008 thì con số này năm
2012 khơng hề giảm [40]. Một số các vụ bùng phát dịch bệnh listeriosis gần đây tại Mỹ
đƣợc thống kê trong Bảng 1-3 dƣới đây.
Ở châu Âu, một loạt các nƣớc đã có thơng báo về dịch bệnh do L. monocytogenes. Năm
2006 có 23 quốc gia thuộc cộng đồng chung châu Âu có thơng báo về các trận dịch
listeriosisvới tổng số 1583 ngƣời mắc bệnh. Trong đó Đức, Pháp, Anh là những quốc gia
chiếm 64 % số ngƣời mắc trên toàn châu Âu [55].

24


Ở Việt Nam, việc thống kê các vụ dịch nói chung và dịch bệnh do thực phẩm nói riêng
cịnchƣa đầy đủ. Hiện nay chủ yếu chỉ các vụ dịch lớn ở các bếp ăn tập thể mới đƣợc thống
kê . Nguyên nhân gây nhiễm độc cũng chƣa đƣợc phân tích cụ thể.
Bảng 1-3 Thống kê một số vụ dịch listeriosis tại Mỹ trong khoảng thời gian từ 2011 đến 2015
( />
Thời gian

Loại thực

phẩm

Số người
mắc

Số người
nhập viện

Số nguời
chết

Nơi xảy ra

2011

Dƣa ruột vàng

147

147

33

28 bang

2012

Phomat Ricotta

22

20

4

14 bang

2013

Phomat

6

6

1

5 bang

2014

Pho mat

8

7

1

2 bang

2014

Pho mat

5

5

1

4 bang

2014

Giá đỗ

5

5

2

2 bang

2014

Táo Caramel

35

34

7

12 bang

2015

Kem

10

10

3

4 bang

Tại Việt Nam, những năm gần đây đã có một số các cơng bố về tình trạng nhiễm L.
monocytogenes trong thực phẩm. Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm
sữa chua, hải sản đông lạnh, thịt tƣơi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến ăn liền, Viện
Pasteur TP. HCM đã phân lập đƣợc 2 chủng L. monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0,93 %. Đến
năm 1999, Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng phân lập đƣợc 2 chủng L. monocytogenes từ
20 mẫu thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10 % [11]. Theo tổng kết của Viện Pasteur TP. HCM, các
mẫu hải sản đơng lạnh có tỷ lệ nhiễm L. monocytogenes 23,9% (23/138 mẫu) [11].
Nghiên cứu phát hiện L. monocytogenes dựa trên kỹ thuật PCR với 141 mẫu thực phẩm,
các tác giả phát hiện thấy 11 mẫu cho kết quả dƣơng tính, chủ yếu là mẫu thịt hun khói
[12]. Sử dụng phƣơng pháp que thử nhanh, phát hiện đƣợc 11/160 mẫu (xúc xích, pate,
sữa, pho mat) nhiễm L. monocytogenes [8]. Nghiên cứu của Cục Quản lý Chất lƣợng Nơng

Lâm sản và Thủy sản cho thấy có 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu đƣợc
lấy tại cửa nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp trong q trình sản xuất và
22/95 mẫu vệ sinh cơng nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán
thành phẩm) bị phát hiện nhiễm L. monocytogenes [2].
[1]

Về bệnh do L. monocytogenes gây ra tại Việt Nam, đã xuất hiện những ca bệnh nhiễm
Listeria có bệnh cảnh lâm sàng phức tạp, khó chẩn đốn và tiên lƣợng. Trần Thị Hồng
Châu khi nuôi cấy vi khuẩn trong dịch não tủy đã phát hiện ba ca nhiễm L. monocytogenes
gây viêm màng não tại Bệnh viện Lâm sàng Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, trong đó
hai bệnh nhận đã tử vong. Bệnh viện Lâm sàng Nhiệt đới Quốc gia năm 2010 cũng phát
25