Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano cacbon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.27 MB, 67 trang )
..
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
NGUYỄN SỸ UẨN
NGUYỄN SỸ UẨN
CHUYÊN NGÀNH
VẬT LIỆU ĐIỆN TỬ
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH CHUỖI ADN SỬ DỤNG ỐNG NANO CÁC BON
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
VẬT LIỆU ĐIỆN TỬ
KHOÁ 2009
Hà Nội – 2011
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian học tập và nghiên cứu dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy
cơ giáo, sự giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp cùng sự nỗ lực cố gắng của bản thân,
luận văn tốt nghiệp cao học của tơi đã được hồn thành.
Đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn TS. Phương
Đình Tâm người đã định hướng, hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Viện đào tạo quốc tế về
khoa học vật liệu (ITIMS ), Viện tiên tiến khoa học và công nghệ (AIST), Viện sau
đại học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt
nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thành viên nhóm cảm biến sinh học - Viện
ITIMS những người nhiệt tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động
viên giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành bản luận văn của mình.
Hà nội, ngày27 tháng 9 năm 2011
Học viên
Nguyễn Sỹ Uẩn
Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------------------
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là: Nguyễn Sỹ Uẩn.
Học viên lớp: VLĐT- HY
Đề tài: Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano các bon nhằm ứng
dụng cho cảm biến sinh học
Tôi xin cam đoan các kết quả tơi trình bày trong luận văn là do tơi nghiên cứu
dưới sự hướng dẫn của tiến sỹ Phương Đình Tâm. Các số liệu kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa được công bố và sử dụng để bảo vệ trong bất cứ luận
văn nào.
Hà nội, ngày 27 tháng9 năm 2011
Người viết
Nguyễn Sỹ Uẩn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
NGUYỄN SỸ UẨN
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH CHUỖI ADN SỬ DỤNG ỐNG NANO
CÁC BON NHẰM ỨNG DỤNG CHO CẢM BIẾN SINH HỌC
Chuyên ngành : Khoa học kỹ thuật vật liệu điện tử
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
VẬT LIỆU ĐIỆN TỬ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
TS. PHƯƠNG ĐÌNH TÂM
Hà Nội – 2011
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC...........................................................................................................
4
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................................7
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................9
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ...............................................................................10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH ADN SỬ DỤNG ỐNG NANO
CÁC BON. ..................................................................................................................13
1.1. Giới thiệu chung về cảm biến sinh học. ...............................................................13
1.2. Tổng quan một số phương pháp cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano các
bon. .............................................................................................................................14
1.2.1. Giới thiệu chung về ống nanno các bon (CNT). ...............................................14
1.2.2. Giới thiệu chung về chuỗi ADN. ......................................................................16
1.2.3. Tổng quan một số phương pháp cố định chuỗi ADN. ......................................19
1.2.3.1. Phương pháp hấp phụ vật lý. .........................................................................19
1.2.3.2. Phương pháp liên kết cộng hoá trị. ................................................................20
1.2.3.3. Phương pháp điện hoá. ..................................................................................21
1.2.3.4. Phương pháp bẫy màng. ................................................................................21
1.2.4. Một số phương pháp cố định ADN sử dụng ống nano các bon .......................22
1.2.4.1. Phương pháp hấp phụ vật lý. .........................................................................22
1.2.4.2. Phương pháp liên kết cộng hoá trị .................................................................23
1.3. Kết luận. ...............................................................................................................27
CHƯƠNG 2. CỐ ĐỊNH ADN LÊN CẢM BIẾN .......................................................29
2.1. Các hoá chất sử dụng cố định ADN. ...................................................................29
2.2. Thông tin về cảm biến. ........................................................................................30
2.3. Cố định ADN sử dụng ống nano các bon lên cảm biến. ......................................30
2.3.1. Sơ đồ cố định. ...................................................................................................31
2.3.2. Các bước thực hiện. ..........................................................................................31
2.3.2.1. Biến tính CNT. ...............................................................................................31
2.3.2.2. Rung siêu âm. ................................................................................................31
2.3.2.3. Phủ ADN-CNT lên bề mặt cảm biến. ............................................................32
4
2.3.3. Các phương pháp nghiên cứu. ..........................................................................32
2.3.3.1. Phương pháp SEM & TEM. ..........................................................................32
2.3.3.2. Phổ tử ngoại UV – Vis. ..................................................................................34
2.3.3.3. Phổ hồng ngoại FTIR . ...................................................................................35
2.3.3.4. Phổ Raman. ....................................................................................................36
2.3.3.5. Xây dựng hệ đo và phương pháp đo xác định sự lai hoá ...............................39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................44
3.1. Cố định ADN lên bề mặt ống nano các bon ........................................................44
3.1.1. Phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN ...........................................44
3.1.1.1. Ảnh quang học ống nano các bon phân tán trong dung dịch ADN, nước. ....44
3.1.1.2. Phổ UV-Vis phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN ....................45
3.1.1.3. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua phân tán ống nano các bon trong dung
dịch ADN. ...................................................................................................................46
3.1.2. Đặc trưng cố định ADN lên ống nano các bon .................................................47
3.1.2.1. Ảnh FE-SEM của bề mặt ống nano các bon . ................................................47
3.1.2.2. Đặc trưng phổ hồng ngoại FTIR của CNT-ADN ..........................................48
3.1.2.3. Đặc trưng phổ Raman ....................................................................................49
3.2. Đặc trưng đáp ứng của cảm biến ADN ................................................................50
3.2.1.Đặc trưng đáp ứng ra của cảm biến ...................................................................50
3.2.1.1. Thời gian đáp ứng của cảm biến. ...................................................................50
3.2.1.2. Đặc trưng tín hiệu ra của cảm biến. ...............................................................51
3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng của q trình cố định ADN đến tín hiệu ra của cảm
biến..............................................................................................................................52
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian cố định DNA. ........................................................52
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ ADN dò ..................................................................53
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ CNT. .......................................................................54
3.2.2.4. Ảnh hưởng của giá trị pH. .............................................................................55
3.2.3. Độ ổn định của cảm biến ..................................................................................56
3.2.3.1. Ảnh hưởng của phủ màng BSA. ....................................................................56
3.2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lai hoá. ....................................................................57
3.2.3.3. Độ lặp lại của cảm biến..................................................................................58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................60
5
CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ .........................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................62
6
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
TT
Tên hình vẽ, đồ thị
1.
Hình 1.1.Cấu tạo chung của cảm biến sinh học ADN
2.
Hình 1.2. Hình ảnh mơ phỏng ống nano các bon đơn vách(A) và đa
Trang
14
vách(B).
15
3.
Hình 1.3. Cấu tạo hố học của phân tử ADN.
18
4.
Hình 1.4. Mơ tả phương pháp cộng hóa trị.
21
5.
Hình 1.6. Phương pháp chung để chức năng hoá ống nano các bon.
24
6.
Hình 1.8. Cố định ADN lên trên ống nano các bon.
25
7.
Hình 1.9. Sơ đồ cố định ADN lên màng đa lớp SWCNT.
26
8.
Hình 2.1. Vi cảm biến có có cấu hình 10 µm X 10µm (bề rộng x khoảng
cách giữa các điện cực)
30
9.
Hình 2.2. Sơ đồ cố định ADN sử dụng ống nano các bon.
31
10.
Hình 2.3. Cố định ADN- CNT lên cảm biến
32
11.
Hình 2.4. Dải làm việc của các kỹ thuật hiển vi điện tử và quang học.
33
12.
Hình 2.5. Sơ đồ nguyên lý cấu tạo máy SEM
34
13.
Hình 2.6. Cơ chế phổ Raman
36
14.
Hình 2.7. So sánh các mức năng lượng của phổ Raman thường,
38
15.
Raman cộng hưởng và huỳnh quang cộng hưởng
38
16.
Hình 2.8. Dạng sóng từ bộ khuếch đại Lock-in
40
17.
Hình 2.9. Hệ đo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830
41
18.
Hình 2.10. Mạch tương đương của hệ đo vi sai
42
19.
Hình 3.1. Ảnh quang học phân tán ống nano các bon sau 2 tháng lưu trữ
trong nước (a), trong dung dịch ADN (b). Công suất siêu âm 125W,
30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
20.
44
Hình 3.2. Phổ UV-vis ống nano các bon phân tán trong dung dịch ADN
(a), mối quan hệ giữa cường độ đỉnh hấp phụ với thời gian phân tán (b).
Công suất siêu âm 125W, 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
21.
46
Hình 3.3. Ảnh TEM của ống nano các bon phân tán trong dung dịch
ADN.
46
7
22.
Hình 3.4. Ảnh FE-SEM của bề mặt ống nano các bon không được cố
định ADN (a), được cố định ADN (b)
23.
Hình 3.5. Phổ FTIR ống nano các bon khơng được cố định AND (a),
được cố định ADN (b), 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
24.
47
48
Hình 3.6. Phổ raman ống nano các bon được cố định DNA và ống nano
các bon không được cố định DNA. 30ml dung dịch ADN, 15mg
SWCNTs, pH7.
25.
49
Hình 3.7. Thời gian đáp ứng của cảm biến, nồng độ ADN dị 10µM,
nhiệt độ 30oC.
26.
50
Hình 3.8. Đặc trưng lai hóa của chuỗi ADN với nồng độ chuỗi ADN dị
10µM, tại nhiệt độ 30oC
27.
51
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian cố định ADN đến tín hiệu ra của cảm
biến.
28.
52
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ ADN dị đối với tín hiệu ra của cảm
biến.
29.
53
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ống nano các bon đến tín hiệu ra
của cảm biến.
54
30.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của giá trị pH đối với tín hiệu ra của cảm biến.
55
31.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của màng BSA đối với tín hiệu ra của cảm biến.
57
32.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lai hố tới tín hiệu ra của cảm biến.
58
33.
(a) tại nồng độ chuỗi ADN đích khác nhau, (b) tại nồng độ ADN đích
34.
9nM
58
Hình 3.15. Tín hiệu ra của cảm biến sau hai lần lai hoá.
59
8
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TT
Ký hiệu
Viết tắt cho
Nghĩa tiếng Việt
1
ADN
Deoxyribonucleic acid
Axít nuclêic
2
APTS
3-Amino propyl triethoxy silane
Chất APTS
3
CNT
Carbon nanotube
Ống nano các bon
4
EDC
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide hydrochloride
Chất EDC
5
FE-SEM
6
FTIR
Field Emision Scanning Electron
Microscop
Fourier Transform Infra Red
Hiển vi điện tử
quét
Phổ hồng ngoại
7
GPTS
Chất GPTS
8
GTD
3-Glycidoxy propyl trimethoxy
silane
glutaraldehyde
9
HATU
O-(7-azabenzotriazol-1-yl)N,N,N’,N’-tetramethyluronium
hexafluorophosphate
Chất HATU
10
HREM
High resolution electron
microscopy
Hiển vi điện tử
phân dải cao.
11
MWCNT Multi-walled carbon nanotube
12
NHS
N-hydroxysulfo-succinimide
13
14
ODA
PCR
4,4’-oxydianiline
Polymerase chai reaction
15
SWCNT
Single-walled carbon nanotube
16
TOAB
tetra-n-octylammonium bromide
17
TEM
Transmission electron microscopy
9
Chất GTD
Ống nano các bon
đa vách
Chất NSH
Chất ODA
Phản ứng chuỗi
polyme
Ống nano các bon
đơn vách
Chất TOAB
Hiển vi điện tử
truyền qua.
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
TT
Tên bảng biểu
Trang
1
Bảng 2.1. Các hoá chất sử dụng trong quá trình cố định
29
chuỗi ADN.
10
MỞ ĐẦU
Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng
cung cấp những thơng tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng, gồm 02 thành
phần chính: Phần tử nhận biết sinh học và bộ chuyển đổi tín hiệu. Phần tử nhận biết
thực chất là các lượng chất sinh học hoặc các thực thể sinh học, hoạt động như một
yếu tố nhận biết, các phần tử sinh học thường được sử dụng là enzim, ADN, ARN,
kháng thể. Bộ chuyển đổi thực hiện nhiệm vụ chuyển đổi các tín hiệu do các phản
ứng sinh hố gây ra thành tín hiệu điện, quang, cơ, nhiệt .
Đối với cảm biến sinh học nói chung thì q trình liên kết phần tử nhận biết
sinh học với bề mặt cảm biến đóng vai trị quan trọng, nó quyết định đến tuổi thọ,
độ nhạy, thời gian làm việc của cảm biến. Các phần tử cảm nhận sinh học có thể
liên kết trực tiếp hoặc gián tiếp lên bề mặt cảm biến.
Với mục tiêu nghiên cứu tìm ra phương pháp phù hợp để cố định ADN lên
bề mặt cảm biến ADN nhằm ứng dụng để phát hiện vi rút gây bệnh tại Việt Nam.
Tác giả đã chọn đề tài: “Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano các
bon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học“ với các nội dung nghiên cứu sau:
-
Nghiên cứu tổng quan các phương pháp cố định ADN lên ống nano các bon
-
Tiến hành cố định AND lên bề mặt ống nano các bon.
-
Đo đạc, phân tích kết quả
-
Đánh giá đưa ra kết quả tối ưu cho việc cố định ADN lên ống nano các bon .
Dựa trên những nội dung nghiên cứu luận văn được chia thành ba chương:
Chương 1: Tổng quan về cố định ADN sử dụng ống nano các bon.
Trong chương này tác giả trình bày cơ bản về cảm biến sinh học, khái quát
cấu tạo tính chất của ống nano các bon và ADN. Tiếp theo tác giả trình bày tổng
quan các phương pháp cố định ADN lên ống nano các bon.
Chương 2: Cố định ADN lên bề mặt cảm biến
Chương này mơ tả q trình thực nghiệm để thực hiện đề tài. Bắt đầu từ việc
lựa chọn vật liệu, hóa chất, tiếp theo mơ tả cách cố định ADN lên ống nano các bon
11
bằng phương pháp hấp phụ vật lý. Quá trình đo đạc các thông số của cảm biến và
thiết lập hệ đo.
Chương 3. Kết quả và thảo luận
Trong chương này, tác giả trình bày tồn bộ kết quả của q trình thực
nghiệm và những thảo luận của tác giả đối với những kết quả đạt được, từ đó đưa ra
kết luận và những ý kiến đề xuất.
12
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH ADN SỬ DỤNG ỐNG
NANO CÁC BON.
1.1.
Giới thiệu chung về cảm biến sinh học.
Trong những năm gần đây, cảm biến sinh học đã và đang là lĩnh vực được sự
quan tâm chú ý của rất nhiều nhà khoa học cũng như các hãng sản xuất thuộc lĩnh
vực điện tử y sinh. Do có nhiều ưu điểm nên cảm biến sinh học được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong lĩnh vực kiểm tra môi trường cảm biến sinh
học được sử dụng để xác định nồng độ thuốc trừ sâu trong nước [39]; ứng dụng
trong ngành y sinh học như xác định nồng độ glucose trong máu [23] nồng độ urê
trong nước tiểu [28]. Đối với ngành công nghệ thực phẩm, loại cảm biến này được
sử dụng để phát hiện sự biến đổi gen trong cây trồng [27].
Hiện nay cảm biến sinh học được chia ra thành nhiều loại khác nhau. Dựa trên
thành phần cảm nhận sinh học có thể chia thành ba loại cơ bản: cảm biến Enzyme,
cảm biến ADN và cảm biến miễn dịch. Nếu dựa trên bộ phận chuyển đổi thì có thể
chia cảm biến sinh học thành những loại như sau: cảm biến điện hoá dựa trên cơ sở
các phép đo dòng, thế, hoặc độ dẫn của dung dịch, cảm biến quang trên cơ sở phép
đo huỳnh quang [11], cảm biến cơ dựa trên sự thay đổi khối lượng ở bề mặt cảm
biến sẽ làm thay đổi tần số trong vi cân tinh thể thạch anh [36].
Cùng với sự phát triển của các loại cảm biến sinh học nói chung, cảm biến
ADN đã có tốc độ phát triển rất mạnh mẽ, có hàng nghìn các bài báo, cơng trình
cơng bố những nghiên cứu mới về loại cảm biến này. Trong đó, đã có một số sản
phẩm được ứng dụng và thương mại hóa [19]. Như chúng ta đã biêt cảm biến ADN
sử dụng chuỗi ADN làm phần cảm nhận sinh học. Q trình nhận biết ADN cần
phân tích dựa trên sự lai hóa của chuỗi ADN dị được gắn trên bề mặt bộ chuyển đổi
và ADN đích (ADN cần phát hiện) dẫn đến sự thay đổi mật độ điện tích trên bề mặt
cảm biến. Sự thay đổi này sau đó được phát hiện bởi cảm biến. Nguyên lý hoạt
động của cảm biến sinh học ADN được chỉ ra trên hình 1.1.
13
Hình 1.1.Cấu tạo chung của cảm biến sinh học ADN
Trong cảm biến ADN việc cố định chuỗi ADN dò lên bề mặt cảm biến là
một trong những yếu tố rất quan trọng, nó quyết định đến độ nhạy, thời gian sống
của cảm biến. Thơng thường người ta có thể cố định trực tiếp hoặc gián tiếp chuỗi
ADN bằng cách sử dụng các phương pháp và hoá chất khác nhau. Phần tiếp theo tác
giả tiến hành nghiên cứu tổng quan một số phương pháp cố định chuỗi ADN sử
dụng ống nano các bon.
1.2. Tổng quan một số phương pháp cố định chuỗi ADN sử dụng ống nano các
bon.
1.2.1. Giới thiệu chung về ống nanno các bon (CNT).
Ống nano các bon (Carbon nanotubes) là một dạng thù hình của cácbon, có
dạng hình trụ tròn. Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1991 bởi Sumio Lijima .
Ống nano các bon có hai loại là ống nano các bon đơn vách và đa vách.(hình 1.2)
Ống các bon nano đơn vách (SWCNT) (hình 1.2a) được tạo ra bằng cách
cuộn một đơn tấm graphite lại thành một ống hình trụ theo hướng của véctơ cuộn
(véctơ chiral), có thể ở hai đầu có hai nửa fullerence như hai “nắp”. Tỷ số giữa
chiều dài và kích thước ngang của ống cỡ khoảng 1000 lần nên có thể xem chúng
như cấu trúc một chiều. Phần đầu ống là các nguyên tử cacbon được sắp xếp tạo
thành các vòng lục giác hoặc ngũ giác. Phần thân của SWCNT có cấu trúc hình trụ,
nó được tạo thành khi một dải lớp mạng graphit có bề rộng xác định cuộn lại theo
một hướng xác định.
14
Hình 1.2. Hình ảnh mơ phỏng ống nano các bon đơn vách(A) và đa
vách(B).[18]
Ống nano cacbon đa vách (MWCNT) (hình 1.2b) có thể xem như một cấu
trúc bao gồm nhiều SWNT đồng trục có đường kính khác nhau bao bọc lấy nhau,
khoảng cách giữa các vách của SWCNT là 0,34-0,36 nm .
- Một số tính chất cơ bản của ống nano các bon.
+ Khả năng phản ứng hoá học: Ống nano cácbon khác với mạng graphit ở
cấu trúc cong bề mặt của nó. Các phản ứng xảy ra thường liên quan đến tính khơng
đối xứng của obitan π gây bởi độ cong tăng lên. Do đó chắc chắn có sự khác biệt
giữa đoạn đầu của ống và đoạn thành ống. Tuy nhiên, thực tế cho thấy CNT vẫn
tương đối trơ về mặt hóa học, do đó để tăng hoạt tính hóa học của CNT
cần tạo ra các khuyết tật trên bề mặt của ống, gắn kết với các phân tử hoạt động
khác. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, CNT có đường kính càng nhỏ thì hoạt động
hóa học càng mạnh, song hiện tượng tụ đám càng nhiều. Đó là ảnh hưởng của hiệu
ứng kích thước và hiệu ứng bề mặt xảy ra với các vật liệu nano. Sự tụ đám này làm
giảm khả năng hoạt động hóa học của các ống CNT. Vì vậy, vấn đề quan trọng là
tách bó CNT thành các ống riêng rẽ bằng các xử lý lý, hóa phù hợp.
+ Tính dẫn điện: Tính dẫn điện của CNT phụ thuộc mạnh vào cấu trúc
của CNT. Tùy thuộc vào chỉ số của véctơ cuộn mà độ dẫn của CNT có thể là bán
dẫn hay kim loại. Cơ học lượng tử chỉ ra độ dẫn của mạng graphene là nằm giữa
bán dẫn và kim loại. Tuy nhiên, khi được cuộn lại thành ống, các liên kết C-C
vuông góc với trục ống được hình thành, dẫn đến cấu trúc điện tử của một số loại
15
ống CNT giống như của các kim loại dẫn điện tốt như Cu, Au. Các cách cuộn khác
nhau của mạng graphene tạo ra ống với khe năng lượng nhỏ hoặc bằng 0. Do đó, độ
dẫn của CNT tương ứng là bán dẫn hoặc kim loại. Trở kháng của ống được xác định
bởi đặc tính cơ lượng tử và được chứng minh là độc lập với chiều dài ống.
Ngoài ra, CNT có trọng lượng riêng thấp nhỏ hơn 6 lần so với thép nhưng lại
bền hơn thép khoảng 100 lần, có tính đàn hồi tốt, có thể chịu được nhiệt độ cao (~
2800oC trong chân không và ~ 700oC trong không khí), độ dẫn nhiệt cao ~ 3000
W/mK. Các ống nano các bon có diện tích bề mặt lớn (250 m2/g), có khả năng phát
xạ điện tử ở điện trường thấp (V/µm) ứng với mật độ dịng phát xạ lớn (µA/cm2).
Do những tính đặc biệt như vậy nên chúng được tập trung nghiên cứu nhằm tạo ra
các linh kiện điện tử, các chip vi xử lý có độ tích hợp cao, các bộ nhớ dung lượng
lớn. Bên cạnh đó chúng cũng được dùng làm nguồn phát xạ điện tử cho màn
hình phẳng, các đầu dò nano như mũi nhọn ở hiển vi quét đầu dò (SPM), các loại
vật liệu nano composite siêu bền, các bộ tích trữ năng lượng cao hay các cảm biến
kích thước bé dùng trong cơng nghệ sinh học.v.v.
1.2.2. Giới thiệu chung về chuỗi ADN.
ADN ( axit deoxyribonucleic) là một phân tử axít nucleic mang thơng tin di
truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các dạng sống bao gồm
cả virus. ADN thường được coi là vật liệu di truyền ở cấp độ phân tử tham gia quyết
định các tính trạng.
- Thành phần của ADN.
Axít nucleic gồm hai loại là deoxyribonucleic (ADN) và ribonucleic (ARN)
[3]. Đơn vị cấu tạo cơ bản của phân tử ADN là các nucltít và Axít
Deoxyribonucleic, một chất cao phân tử (polyme) bao gồm Polynucleotide được
tạo lên do sự nối liền nhiều đơn phân tử nucleotit. Thành phần hoá học của ADN
gồm có gốc axít phốtphoríc (H3PO4), đường 5’ Deoxyriboza (C5H10O4) và các bazơ
nitơ. Bazơ nitơ ở ADN có hai loại: Purine gồm Adenin (A) và Guanin (G);
Pyrimidin gồm Cytosin (C) và Thymin (T). Đường Pentose (5C) Deoxyribose gắn
với bazơ nitơ ở vị trí C1 sẽ tạo lên nuclesit. Nuclesit được gắn thêm nhóm phốt phát
16
vào C5 của đường Pentose hình thành nucleotit [2].Tất cả các lồi vật đều có cấu
trúc ADN. Tính đặc trưng ADN của một lồi biểu hiện ở trình tự sắp xếp các
nucleotide dọc theo chiều dài và số lượng của chúng.
- Cấu trúc và tính chất của ADN
Các bazơ Purine và Pyrimidin có cấu trúc phẳng, mặt phẳng của chúng xếp
vng góc với trục dài của Polynucleotide. Khoảng cách trung tâm của hai mặt
phẳng kề nhau là 3.4 A0, mạch Polynucleotide khơng duỗi thẳng mà xoắn như lị xo
quanh trục giữa, mỗi bước xoắn có độ dài 34 Ao [2].
Năm 1953 J.Watson và F.Crick tổng hợp số liệu phân tích hố học và tán xạ
tia X để khẳng định tính đúng đắn của mơ hình cấu trúc phân tử ADN cịn được gọi
là mơ hình cấu trúc ADN của Watson - Crick hay chuỗi xoắn kép. Theo các tác giả
“Phân tử ADN” là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một
chuỗi nucleotit. Mỗi nucleotit gồm một nhóm phốt phát, đường Deoxyribose và các
bazơ (A, C, G hoặc T). Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ các liên kết hyđrơ hình
thành giữa các bazơ bổ sung nằm trên hai mạch, A liên kết với T và C liên kết với
G. Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’ phốt phát tự do,
đầu kia là 3’ - hydroxit tự do (hướng qui ước là 5’→ 3’). Hướng của hai mạch đơn
trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, người ta gọi chúng là mạch đối song song (hình
1.3). Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi một quan hệ bổ sung. Chính quan hệ này
giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử ADN và đặc biệt là phương cách tự
sao chép để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử mẹ. Nhờ mơ hình này mà Watson,
Crick và Wilkins đã nhận được giải thưởng nobel vào năm 1962. Phân tử ADN bị
biến tính khi nhiệt độ tăng hoặc bị tác động của các tác nhân hoá học (dung dịch
kiềm, urea…). Nhiệt độ làm cho hai mạch đơn của ADN tách nhau ra gọi là nhiệt
độ biến tính Tm [30].
Cơng thức tính Tm ở điều kiện chuẩn:
Tm = 69,3 + 0,41(G +C)
17
(1.1)
Hình 1.3. Cấu tạo hố học của phân tử ADN[20].
Theo công thức (1.1) Tm phụ thuộc vào số lượng cặp G – C. Nếu trong phân
tử ADN có lượng cặp G - C cao thì Tm cao và ngược lại. Khi nhiệt độ giảm dần đến
một mức độ nhất định hai mạch đơn tách rời nhau sẽ được liên kết lại theo nguyên
lý Chargaff tạo nên chuỗi xoắn kép, nghĩa là các ADN có sự hồi tính. Nếu hạ nhiệt
độ đột ngột thì sự hồi tính khơng xẩy ra.
Ngun lý lai hóa ADN dựa vào sự biến tính và hồi tính của ADN. Sau khi
hai mạch đơn của phân tử ADN tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp trở
lại sẽ không xẩy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột, lúc đó phân tử ADN
sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình khơng gian vơ trật
tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được giảm từ từ cộng với điều
kiện thí nghiệm thích hợp hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là sự lai
phân tử [1]. Ví dụ, ADN loại A được biến tính để thành mạch đơn, sau đó trộn lẫn
với ADN loại B cũng được biến tính thành mạch đơn trong một dung dịch chất
lỏng. Dung dịch trên nếu được hạ nhiệt độ một cách từ từ sẽ xẩy ra q trình hồi
tính trong đó sợi A kết với sợi A; sợi B kết với sợi B đồng thời có sợi A kết với sợi
B tạo thành phân tử lai [3].
18
1.2.3. Tổng quan một số phương pháp cố định chuỗi ADN.
Cố định đoạn ADN lên bề mặt cảm biến là chìa khố để cho cảm biến có độ
nhạy cao, thời gian làm việc lâu dài. Do đó, cố định ADN phải thoả mãn được các
điều kiện như: giữ được các đoạn ADN trên bề mặt bộ chuyển đổi, cho phép bề mặt
cảm biến được cố định ADN tiếp xúc được với dung dịch phân tích, cho phép bất
kỳ một sản phẩm nào sinh ra trong quá trình tương tác (lai hố) cũng có thể khuếch
tán ra / vào lớp màng cố định và điều quan trọng nhất là không làm biến tính ADN.
Bởi vì ADN là loại vật liệu sinh học sẽ bị hỏng do những tác động cơ học, nhiệt độ,
độc tố hoá chất, và một số tác nhân khác. Vì vậy, cơng nghệ để cố định ADN
thường được sử dụng là các liên kết hoá học gắn đoạn ADN trực tiếp đến bề mặt
cảm biến hoặc bề mặt của một lớp màng được phủ trên bề mặt cảm biến. Hấp phụ
và liên kết cộng hoá trị là hai loại được sử dụng cho cơng nghệ này. Ngồi ra, người
ta cịn sử dụng cơng nghệ giam giữ vật lý bằng việc tách các đoạn ADN dò trong
dung dịch bằng một lớp màng trên bề mặt cảm biến. Lớp màng này sẽ cho phép các
sản phẩm của quá trình lai hố đi qua nhưng khơng cho các đoạn ADN đi qua.
Giam giữ màng và bẫy ma trận là hai dạng của công nghệ này.
1.2.3.1. Phương pháp hấp phụ vật lý.
Phương pháp hấp phụ cố định ADN là một phương pháp dựa trên nền tảng là
tương tác Van der Wall, liên kết tĩnh điện , liên kết hydro và tương tác kỵ nước của
các chất phản ứng. Trong đó tương tác tĩnh điện là một kiểu tương tác bởi ion-ion
giữa phân tử sinh học và các chất liên kết trung gian, năng lượng phân ly của liên
kết tĩnh điện đặc trưng là 30kcal/mol, bằng khoảng 1/3 năng lượng trung bình của
liên kết cộng hoá trị. Tương tác Van der Wall được mô tả như tương tác lưỡng cựclưỡng cực sinh ra bởi sự thay đổi tức thời trong mật độ electron, liên kết Van der
Wall có năng lượng liên kết là 1kcal/mol. Liên kết hydro được sinh ra bởi sự chia sẻ
một nguyên tử hydro giữa hai phân tử, năng lượng phân ly đặc trưng của liên kết
hydro là 5kcal/mol. Tương tác kỵ nước được tạo ra bởi sự đẩy ra của vi hạt nước
xung quanh của phân tử đông tụ và giải phóng năng lượng. Thực tế tương tác kị
nước là khơng tĩnh điện và được hình thành bởi sự kết tụ của các phân tử.
19
Trong phương pháp này, bề mặt cảm biến đã được phủ một lớp vật liệu trung
gian như polyme dẫn, CNT, được đặt trong dung dịch có chứa ADN ở một thời gian
xác định. Sau đó được rửa với nước khử ion để loại bỏ những chuỗi ADN không
liên kết với bề mặt cảm biến. Các chuỗi ADN được hấp phụ trên bề mặt cảm biến là
do sự tương tác tĩnh điện giữa các điện tích dương của polime dẫn và tổng điện tích
âm của ADN hoặc có thể do sự liên kết của lực Van Der Wall, lực ion. Quá trình
hấp phụ ADN lên bề mặt cảm biến có thể được chia thành 3 giai đoạn. Giai đoạn
khuếch tán ADN từ dung dịch đến bề mặt cảm biến, sau đó là giai đoạn sắp đặt lại
các chuỗi ADN và cuối cùng là sự cân bằng của các phân tử ADN trên bề mặt cảm
biến. Các quá trình này sẽ phụ thuộc vào nồng độ ADN, nồng độ pH của dung dịch.
Ưu điểm của phương pháp này là quá trình gắn chuỗi ADN dễ dàng, các lực liên kết
yếu, do đó không làm biến dạng chuỗi ADN. Bên cạnh những ưu điểm của mình
phương pháp này cịn có một số nhược điểm như: lực liên kết có thể bị ảnh hưởng
bởi độ pH, hấp thụ bị giới hạn đơn lớp trên bề mặt polyme. Vì vậy, lượng phân tử
sinh học được gắn trên bề mặt cảm biến là rất nhỏ [10]. Ngoài ra do lượng vật liệu
sinh học được cố định trên lớp ngoài của polyme dẫn và được ngâm trong dung dịch
đo nên đã làm giảm thời gian sống của điện cực [33].
1.2.3.2. Phương pháp liên kết cộng hoá trị.
Phương pháp liên kết cộng hoá trị cố định ADN là phương pháp cố định có
hiệu quả, thời gian sống và độ bền của cảm biến cao, quá trình cố định không quá
phức tạp. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc cộng hoá trị giữa chất nền được phủ
trên bề mặt cảm biến và phần tử cảm nhận sinh học. Chất nền phải là chất vừa có
khả năng phân tán và liên kết tốt trên bề mặt cảm biến vừa có khả năng tạo liên kết
cộng hoá trị với ADN. Một số chất nền thường được sử dụng là: glutaralđehit, 3Amino propyl triethoxy silane (APTS), mới đây là các ống nano các bon (CNT) và
3- Glycidoxy propyl trimethoxy silane (GPTS). Các nhóm chức năng có thể tạo liên
kết cộng hóa trị là: thiol (SH), carboxylic (COOH), amine (NH2), alđehít (COH) .
Quá trình cố định sử dụng phương pháp liên kết cộng hố trị gồm các bước
[33] (hình 1.4):
20
Cố định ADN dị
Hình 1.4. Mơ tả phương pháp cộng hóa trị[33]
-
Cố định các hợp chất trung gian như: APTS, CNT, GPTS… lên bề mặt cảm
biến đã được hoạt hoá.
-
Cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến đã được phủ các chất trung gian.
1.2.3.3. Phương pháp điện hoá.
Trong những năm gần đây, quá trình cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm
biến được dịch chuyển sang phương pháp bẫy các chuỗi ADN trên lớp polyme tổng
hợp bằng phương pháp điện hóa. Trong phương pháp điện hố, lớp màng polyme và
chuỗi ADN được hình thành dựa vào sự thay đổi dòng điện khi áp đặt một điện thế
trên bề mặt cảm biến.
Phương pháp điện hố có thuận lợi ở chỗ nó là phương pháp cố định một
bước, thời gian cố định nhanh hơn tất cả các phương pháp cố định truyền thống
khác [12], sự phân bố phân tử cố định được điều khiển khơng phụ thuộc vào dạng
hình học và kích thước của điện cực, độ dày màng có thể được điều khiển chính xác
[9,38].
1.2.3.4. Phương pháp bẫy màng.
Bẫy màng là phương pháp giam hãm vật lý chuỗi ADN trên bề mặt cảm
biến. Các chuỗi ADN trong dung dịch sẽ được bẫy trên bề mặt cảm biến bằng một
lớp màng bán thấm. Lớp màng này được chọn lựa sao cho nó có những lỗ xốp có
đường kính đủ lớn cho phép các chất phân tích hoặc sản phẩm của đối tượng phân
tích đi qua. Nhưng nó phải đủ nhỏ để giữ lại chuỗi ADN trên bề mặt màng. Các
21
loại màng siêu lọc trên cơ sở polyme dẫn của polymide hoặc polyether sulfon
thường được sử dụng làm lớp màng bán thấm cho phương pháp này.
1.2.4. Một số phương pháp cố định ADN sử dụng ống nano các bon
1.2.4.1. Phương pháp hấp phụ vật lý.
Hấp phụ là phương pháp đơn giản nhất của công nghệ cố định ADN lên ống
nano các bon. Trong công nghệ này, ống nano các bon được đặt trong dung dịch có
chứa ADN và được rung siêu âm ở một thời gian xác định. Các đoạn ADN được
hấp phụ trên bề mặt ống nano là do sự liên kết của lực Van Der Wall, lực ion, tương
tác của liên kết π-π. Quá trình hấp phụ ADN lên bề mặt ống nano có thể được chia
thành 3 giai đoạn: giai đoạn khuếch tán ADN từ dung dịch đến bề mặt ống nano các
bon, sau đó là giai đoạn sắp đặt lại của các đoạn ADN, và cuối cùng là sự cân bằng
của các phân tử ADN trên bề mặt CNTs. Các quá trình này sẽ phụ thuộc mạnh vào
nồng độ ADN, nồng độ pH của dung dịch. Ưu điểm của phương pháp này là quá
trình gắn các đoạn ADN dễ dàng, các lực liên kết yếu, do đó khơng làm biến dạng
đoạn ADN. Bên cạnh những ưu điểm của mình, phương pháp này cịn có một số
nhược điểm như: đoạn ADN được gắn trên bề mặt bằng các liên kết yếu nên có một
sự thay đổi nhỏ về độ pH, nhiệt độ, nồng độ ion cũng có thể làm biến tính đoạn
ADN. Điều này sẽ làm giảm sự ổn định cũng như thời gian sống của cảm biến.
Cho đến nay, có nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để tiến hành
cố định chuỗi ADN lên trên CNT như nhóm của Dovbeshko và các cộng sự đã sử
dụng phương pháp này để cố định DNA lên ống nano các bon bằng cách cho dung
dịch chứa chuỗi ADN được nung nóng tới 100oC sau đó mới cho SWNT vào. Hỗn
hợp được khuấy đều và cho kết tủa trên đế thạch anh có phủ lớp vàng. Sử dụng phổ
raman và phổ hồng ngoại nhóm nghiên cứu đã làm rõ được sự tương tác giữa ADN
và CNT[13]. Cố định chuỗi DNA lên ống nano các bon sử dụng phương pháp hấp
phụ cũng được nhóm của Zheng tiến hành nghiên cứu. Trong đó, chuỗi ADN được
cố định lên SWNT bằng cách rung siêu âm SWNT trong dung dịch nước có chứa
sợi ADN. Kết quả đã chỉ ra cho thấy sự liên kết giữa các sợi ADN và ống nano các
bon là rất mạnh, dung dịch ADN- SWNT sau khi cố định có tính ổn định cao trong
22
thời gian dài khi lưu trữ tại nhiệt độ phòng [29]. Cũng sử dụng cách thức như trên
nhóm nghiên cứu của Nakashima [31] và nhóm nghiên cứu của Glachenco [15] đã
cố định thành công ADN lên trên SWNT. Bên cạnh đó, Taeger và các cộng sự tiến
hành cố định ADN lên CNT theo các tỷ lệ khác nhau, kết quả cho thấy rằng ở tỷ lệ
DNA:CNT là 1:2 có hiệu quả cao nhất bởi vì ở tỷ lệ này giảm thiểu được số lượng
DNA không liên kết [37]. Gần đây, Liang và cộng sự đã sử dụng sợi ADN được
tổng hợp bằng phương pháp PCR để cố định lên SWNT[25]. Kết quả của q trình
cố định sau đó được sử dụng cho các phản ứng vận chuyển điện tử của
hemoglobin(Hb) trên bề mặt điện cực. Đây là một tiềm năng để ứng dụng vật liệu
này vào trong các cảm biến sinh học điện hoá.
Hu và các đồng nghiệp đã tạo ra màng mỏng ADN-CNT bằng cách tiến hành cố
định ADN lên CNT, tiếp theo lắng đọng phức hợp ADN-CNT lên bề mặt đế thủy
tinh hình thành một màng mỏng ổn định sau đó đã được sử dụng để phát hiện
dopamine sử dụng phương pháp điện hố. Phân tích hình ảnh SEM của điện cực xác
nhận rằng DNA-CNT cũng được phân tán trong màng và có chiều dài trung bình là
600 nm. FT-IR và EDS cũng được sử dụng để xác minh sự hiện diện của DNA quấn
quanh CNT trên bề mặt của đế [21]. Trong một nghiên cứu của nhóm Hwang và
các đồng nghiệp đã sử dụng một phức hợp ADN có chứa cả một sợi đơn và một
phần sợi đôi để cố định lên SWNTs. Phần sợi đơn ADN được ưu tiên liên kết với
các SWNTs, trong khi sợi kép, phần được tự do tiếp xúc vào bên ngoài. Sau đó tiến
hành biến tính phần sợi kép bằng cách nung nóng và tiến hành lai hố với chuỗi
ADN đích, kết quả đã được minh chứng bằng quang phổ Raman. Sử dụng phương
pháp này có thể phát hiện một trình tự ADN cụ thể trong một bộ gen phức tạp [22].
1.2.4.2. Phương pháp liên kết cộng hoá trị
Do ADN tự nó khơng thể liên kết được với bề mặt ống nano các bon. Vì vậy,
để cố định đoạn ADN sử dụng phương pháp liên kết cộng hóa trị, bề mặt ống nano
các bon phải được xử lý trước bằng cách hoạt hóa để tạo ra các nhóm chức như
amin (NH2), thio (SH), axít cacboxylic (COOH), Andehit (CHO). Đây là các nhóm
chức sẽ làm nhiệm vụ liên kết đoạn ADN và bề mặt ống nano. Thuận lợi của
23
phương pháp này là các đoạn ADN có thể gắn kết mạnh hơn rất nhiều so với
phương pháp hấp phụ vật lý, làm tăng thời gian sống của cảm biến. Nhưng nhược
điểm của phương pháp này là phải sử dụng nhiều hợp chất hóa học khác nhau, dẫn
đến sinh ra nhiều phản ứng có thể làm biến tính ADN.
Như đã được đề cập, để thực hiện phương pháp này, đầu tiên cần tạo các
nhóm chức trên ống nano thơng qua q trình biến tính CNT. Trong đó, phương
pháp phổ biến nhất là tạo ra nhóm COOH thơng qua q trình oxy hóa CNT sử
dụng các axít mạnh như H2SO4 hoặc HNO3. Khi đó nhóm COOH sẽ được hình
thành chủ yếu tại các khuyết tật trên bề mặt của ống nano (hình 1.6a). Nhóm chức
năng NH2 được tạo ra bằng cách ô xi hoá CNT trong hỗn hợp axit H2SO4 và HNO3
để hình thành nhóm COOH. Sau đó, xử lý các ống nano này với ethylenediamine để
tạo ra các nhóm NH2 trên CNT. Nhóm chức SH được tạo ra bằng cách tương tự,
CNT sau khi được o xy hoá bằng hỗn hợp axit H2SO4 và HNO3 được phản ứng với
NaOH để tao ra các nguyên tử Na trên bề mặt CNT, tiếp đó Na-CNT được phản
ứng với HSCH2CH2Br và tetra-n-octylammonium bromide (TOAB). Kết quả thu
được nhóm SH trên bề mặt CNT.
Ngồi ra, để chức năng hoá bề mặt của ống nano cacbon người ta thường sử dụng
các hợp chất khác như nitrene cycloaddition (Hình 1.6b), arylation sử dụng muối
diazonium (hình 1.6c) hoặc cycloadditions 1,3-dipolar cycloadditions ( hình 6d).
Sau khi chức năng hoá bề mặt ống nano các bon tiếp theo là quá trình cố
định chuỗi ADN lên bề mặt ống nano các bon.
Hình 1.6. Phương pháp chung để chức năng hố ống nano các bon[41].
24
