Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen BTK gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể không có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính x

..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------***-------------------

NGÔ MẠNH TIẾN

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN GEN BTK GÂY BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH
BẨM SINH THỂ KHƠNG CĨ GAMMAGLOBULIN MÁU

LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH X

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------------------***-------------------

NGÔ MẠNH TIẾN

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN GEN BTK GÂY BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH
BẨM SINH THỂ KHƠNG CĨ GAMMAGLOBULIN MÁU
LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH X
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. KHUẤT HỮU THANH

HÀ NỘI - 2018


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên tác giả luận văn: Ngô Mạnh Tiến
Đề tài luận văn: “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen
btk gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể khơng có gammaglobulin
máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X”
Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã số SV: CB160059
Tác giả, Ngƣời hƣớng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác
giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 10/10/2018 với
các nội dung sau:
- Trang 1, phần mở đầu, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành
“Bruton tyrosine kinase”.
- Trang 4, mục 1.2.2, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton
tyrosine kinase”.
- Trang 8, mục 1.2.3.3, thay thế “Tế bào mầm tạo máu” thành “tế bào gốc tạo
máu”, thay thế “Tế bào đầu dòng lympho” thành “Tế bào tiền thân lympho”.
- Trang 8, muc 1.2.3.3, thay thế “Tế bào proB” thành “Tế bào hƣớng dòng

B”, thay thế “tế bào PreB” thành “Tế bào tiền B”.
- Trang 10, mục 1.3.1, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton
tyrosine kinase”.
- Trang 11, mục 1.3.2, thay thế “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton
tyrosine kinase”.
- Trang 14, mục 1.4.2.1, thay thế “suy giảm miễn dịch phối hợp trầm trọng”
thành “bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nguy kịch”.

i


- Trang 35, mục 3.3.1, bổ sung “các đột biến đƣợc thể hiện ở phụ lục 3”.
- Trang 37, mục 3.3.1, thay thế “sự sau khác trong quá trình dịch mã tạo
mRNA” thành “làm thay đổi các vị trí báo hiệu cho việc cắt chính xác các đoạn
introng”.
- Trang 40, muc 3.3.1, bổ sung “Các đột biến vùng ghép nối exon/intron

cần phải khẳng định thêm bằng thực nghiệm thông qua phân tích mRNA.”
- Trang 47, mục 3.3.3, bổ sung “Trong số 31 bệnh nhân nghi ngờ mắc
bệnh XLA, 04 bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng...”
Ngày 08 tháng 11 năm 2018
Tác giả luận văn

Giáo viên hƣớng dẫn

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Ngô Mạnh Tiến, học viên lớp Cao học khóa 16B-CNSH, Trƣờng Đại
học Bách Khoa Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tơi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn
của thầy PGS. TS. Khuất Hữu Thanh.
Công trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đƣợc công
bố tại Việt Nam.
Các số liệu và thơng tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác và trung
thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự
đồng ý và cho phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chƣa đƣợc ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2018
Tác giả

Ngô Mạnh Tiến

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin đƣợc cảm ơn chân thành đến ngƣời thầy khoa học,
PGS.TS. Khuất Hữu Thanh - Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và động
viên em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn BS. Ngô Diễm Ngọc, trƣởng khoa Di truyền và
Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ƣơng đã tạo đạo điều kiện cho em hoàn
thành nghiên cứu này.
Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực
phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá
trình học tập và rèn luyện.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu em đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình

đầy động viên khích lệ của tập thể cán bộ nhân viên khoa Di truyền và Sinh học
phân tử, em xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
ln quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bƣớc trên con đƣờng học tập và nghiên cứu.

Ngô Mạnh Tiến

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tên đầy đủ

Nghĩa tiếng việt

Bp

Base pair

Cặp bazơ

BTK

Burton’s tyrosine kinase

c.DNA

Complementary DNA

Cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleric acid

dNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

EtBr

Ethidium bromide

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

MLPA

Multiplex

DNA bổ sung

Ligation-dependent Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa

Probe Amplification

vào phản ứng nối

mRNA

messenger RNA

RNA thông tin

RNA

Ribonucleic acid

NST

Nhiễm sắc thể

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

sIg

Surface Immunoglobulin

Kháng thể bề mặt

SNPs

Single nucleotide

Đa hình nucleotid đơn

polymorphisms
SGMD

Suy giảm miễn dịch

SGMDBS

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh

TVDT

Tƣ vấn di truyền

XLA

X-linked agammaglobulinemia

Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh
thể không gammaglobulin máu liên
kết nhiễm sắc thể giới tính X

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................24
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi phản ứng PCR khuếch đại gen BTK .............................25
Bảng 2.3. Trình tự mồi phản ứng PCR mồi đơn .......................................................27
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR mồi đơn ........................................................27
Bảng 3.1. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen........................35
Bảng 3.3. Danh sách đột biến mới trên gen BTK ......................................................36
Bảng 3.4. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA ......................................42
Bảng 3.5. Kiểu gen của 31 bệnh nhân XLA .............................................................44
Bảng 3.6. Tỷ lệ các đột biến của gen BTK ................................................................46

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Nồng độ kháng thể ở trẻ ...............................................................................5
Hình 1.2: Sự phát triển và biệt hóa của lympho B trong bệnh XLA ..........................9
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc gen BTK.............................................................................10
Hình 1.4. Cấu trúc 3 chiều protein BTK ...................................................................11
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xác định đột biến gen BTK gây bệnh XLA .....................22
Hình 2.2. Sơ đồ nhân đoạn gen BTK .........................................................................24
Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen BTK ngƣời bình thƣờng ......33
Hình 3.2. Kết quả phân tích MLPA trên ngƣời bình thƣờng ....................................34
Hình 3.3. Ảnh đột biến c.1735G>C (p.D579H) trên gen BTK .................................36
Hình 3.4. Ảnh đột biến c.1908+2_11delinsC trên gen BTK .....................................37
Hình 3.5. Ảnh đột biến c.521-1G>A (p.IVS6-1G>A) trên gen BTK ........................38

Hình 3.6. Ảnh đột biến c.1578_1581del (p.C527Wfs*2) trên gen BTK ...................38
Hình 3.7. Ảnh điện di bệnh nhân XLA-26 và XLA-27 gen BTK .............................41
Hình 3.8. Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân XLA-26 và XLA-27 ................42
Hình 3.9. Phân bố các dạng đột biến gen BTK .........................................................45
Hình 3.10. Tỷ lệ phát hiện đột biến các vùng gen BTK ............................................47
Hình 3.11. Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen BTK gây bệnh XLA ở các bệnh nhân
nghiên cứu .................................................................................................................48

v


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .....................................................................v
MỤC LỤC ................................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN ......................................................................................3
1.1. Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh .................................................................3
1.2. Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc
thể giới tính X (XLA)..............................................................................................4
1.2.1. Định nghĩa bệnh XLA ...............................................................................4

1.2.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh XLA ...........................................................4
1.2.3. Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh XLA .....................................................5
1.2.4. Dịch tễ học ................................................................................................9
1.3. Cơ sở di truyền bệnh XLA .............................................................................10
1.3.1. Vị trí và cấu trúc gen BTK ......................................................................10

1.3.2. Cấu trúc và chức năng protein BTK .......................................................10
1.3.3. Đặc điểm di truyền và đột biến gen BTK ................................................11
1.4. Chẩn đoán bệnh XLA.....................................................................................12
1.4.1. Tiêu chuẩn lâm sàng................................................................................13
1.4.2. Xét nghiệm cận lâm sàng ........................................................................13
1.4.3. Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen BTK ...................................15
1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh XLA ...................................................................16
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..........................................................16
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................18
CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.....................................................................................19

vi


2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân và tiêu chuẩn loại trừ ...........................19
2.1.2. Thu thập mẫu...........................................................................................20
2.2. Hoá chất và thiết bị ........................................................................................20
2.2.1. Hóa chất ..................................................................................................20
2.2.2. Trang thiết bị ...........................................................................................21
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................21
2.3.1. Kỹ thuật tách DNA tổng số .....................................................................22
2.3.2. Phƣơng pháp điện di DNA ......................................................................23
2.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger bằng máy ABI 3130 ..........................24
2.3.4. Kỹ thuật Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) ....29
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................33
3.1. Lựa chọn kỹ thuật phát hiện đột biến gen BTK..............................................33
3.1.1. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger ............................................................33

3.1.2. Kỹ thuật MLPA .......................................................................................34

3.1.3. Lựa chọn quy trình phát hiện đột biến gen BTK .....................................34
3.2. Kết quả xác định đột biến gen BTK trên 31 bệnh nhân XLA ........................35
3.3.1. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen ......................35
3.3.2. Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA ....................................41
3.3.3. Đặc điểm đột biến gen BTK của 31 bệnh nhân XLA ..............................43
KẾT LUẬN ...............................................................................................................50
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................52
PHỤ LỤC ..................................................................................................................58

vii


MỞ ĐẦU

Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc
thể giới tính X (X-linked agammaglobulinemia – bệnh XLA): là bệnh di truyền trên
nhiễm sắc thể giới tính X do đột biến trên gen BTK khiến cho cơ thể không sản xuất
đƣợc protein Bruton tyrosine kinase dẫn đến các tế bào lympho B khơng thể biệt
hóa hoặc trƣởng thành. Do vậy, giảm khả năng sản xuất kháng thể, khiến cơ thể
thƣờng xuyên bị các tác nhân gây bệnh tấn công.
Bệnh nhân mắc XLA khi mới sinh thƣờng khỏe mạnh nhƣ những trẻ bình
thƣờng khác bởi trƣớc 6 tháng đầu, trẻ đƣợc bảo vệ bởi kháng thể từ mẹ truyền
sang. Sau đó các nhiễm khuẩn lần lƣợt xuất hiện và tăng dần tần suất cũng nhƣ mức
độ nặng.
Việt Nam là nƣớc nhiệt đới, trẻ nhỏ thƣờng dễ mắc các bệnh liên quan đến
đƣờng hơ hấp, tiêu hóa, tái phát nhiều lần… làm cho bệnh suy giảm miễn dịch bẩm
sinh (SGMDBS) dễ bị trùng lặp trong bối cảnh đa dạng nhiễm trùng ở trẻ em, dễ bị
bỏ sót ở tuyến cơ sở. Sau khi các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA đƣợc khám và
sàng lọc dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và các xét nghiệm ban đầu, sẽ đƣợc chẩn

đốn xác định bằng phân tích gen BTK bằng phƣơng pháp sinh học phân tử để phát
hiện các đột biến gây bệnh. Trƣớc đây, các xét nghiệm bằng phƣơng pháp sinh học
phân tử đƣợc tiến hành tại các trung tâm của nƣớc ngồi, gây nhiều khó khăn về vận
chuyển mẫu, chi phí cao, thời gian chờ đợi kéo dài, đặc biệt rất khó áp dụng cho các
trƣờng hợp có nhu cầu chẩn đốn trƣớc sinh cho các lần sinh con tiếp theo của các
gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh.
Việc xác định chính xác đột biến gây bệnh XLA đóng vai trị quan trọng trong
việc chẩn đoán xác định bệnh và thể bệnh để định hƣớng điều trị hiệu quả. Đây là
tiền đề cho công tác phịng bệnh bằng tƣ vấn di truyền và chẩn đốn trƣớc sinh giúp
làm giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh XLA.
Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Áp dụng
kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen BTK gây bệnh Suy giảm miễn

1


dịch bẩm sinh thể khơng có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính
X”.
Mục tiêu của đề tài:
-

Sử dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen phát hiện các đột biến trên gen
BTK gây bệnh thiếu gammaglobulin trong máu liên kết nhiễm sắc thể X.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh (SGMDBS - Primary Immunodeficiency): là
một nhóm các bệnh lý bất thƣờng liên quan tới tình trạng suy giảm hoặc thiếu hụt
một hoặc nhiều yếu tố trong hệ thống miễn dịch. Hầu hết mắc các bệnh này sẽ kéo
dài suốt cuộc đời, nên việc chẩn đốn chính xác bệnh trƣớc khi áp dụng các biện
pháp điều trị là rất quan trọng.
SGMDBS đƣợc phân loại dựa theo loại tế bào, vị trí tổn thƣơng của hệ miễn
dịch. Những trẻ mắc bệnh suy giảm miễn dịch thƣờng nhạy cảm với nhiều tác nhân
nhiễm trùng khác nhau. Biểu hiện lâm sàng đặc trƣng của nhóm bệnh này là ngƣời
mắc bệnh nhiễm trùng nặng, tái diễn suốt đời với nhiều biến chứng nguy hiểm nhƣ
tử vong, tổn thƣơng các cơ quan, rối loạn phát triển thể chất và ảnh hƣởng đến chất
lƣợng cuộc sống.
Tỉ lệ mắc các bệnh SGMDBS trong quần thể là 1/1200 (theo nghiên cứu của
tổ chức SGMDBS thế giới Jeffrey Modell Center for Primary Immunodeficiencies).
Suy giảm miễn dịch bẩm sinh chia 5 nhóm lớn: SGMD thể dịch, SGMD tế bào,
SGMD kết hợp nguy kịch, SGMD dòng bổ thể, SGMD dòng thực bào.
Nghiên cứu tổng kết trên toàn bộ 6 châu lục năm 2011 cho thấy, trong số
44762 bệnh nhân mắc SGMDBS, có tới 3163 bệnh nhân mắc bệnh suy giảm miễn
dịch kết hợp nguy kịch (7,1%) và 2132 bệnh nhân mắc bệnh SGMD thể X-linked
agammaglobulinemia (4,8%) [35].
Bệnh nhân SGMD bẩm sinh khơng đƣợc chẩn đốn sẽ bị nhiễm khuẩn nặng,
tái diễn thƣờng xuyên, đòi hỏi nhập viện và điều trị tích cực bằng các thuốc kháng
sinh mạnh, kéo dài và ảnh hƣởng nhiều kinh tế và chất lƣợng cuộc sống của bệnh
nhân, gia đình ngƣời bệnh và toàn xã hội. Báo cáo của Hội suy giảm miễn dịch bẩm
sinh Jeffrey cho biết cứ 1 bệnh nhân SGMDBS mà bị bỏ sót chẩn đốn thì chi phí
hết $102.736/năm cho y tế vì cấp cứu, nhập viện nhiều lần. Viện nghiên cứu sức
khỏe Hoa Kỳ ƣớc tính ít nhất có 500.000 trƣờng hợp SGMDBS chƣa đƣợc chẩn
3


đoán và nhƣ vậy thiệt hại về kinh tế do vấn đề bỏ sót chẩn đốn nhóm bệnh này gây

ra là trên $50 tỷ/năm [35].
1.2. Bệnh suy giảm miễn dịch thể khơng gammaglobulin máu liên kết nhiễm
sắc thể giới tính X (XLA)
1.2.1. Định nghĩa bệnh XLA
Bệnh suy giảm miễn dịch thể khơng gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc
thể giới tính X (X-linked agammaglobulinemia –bệnh XLA) là bệnh suy giảm miễn
dịch di truyền do đột biến trong gen mã hóa Bruton tyrosine kinase liên kết nhiễm
sắc thể giới tính X, gây giảm gammaglobulin máu khiến cho cơ thể không sản xuất
đƣợc Bruton tyrosine kinase. Thiếu Bruton tyrosine kinase (BTK), các tế bào
lympho B khơng thể biệt hóa hoặc trƣởng thành đƣợc dẫn đến suy giảm các tế bào
lympho B trƣởng thành. Bệnh nhân XLA giảm khả năng chống chọi với các tác
nhân gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn.
1.2.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh XLA
Thông thƣờng, trẻ sau sinh sẽ đƣợc hƣởng kháng thể IgG từ mẹ sang thai
qua rau thai cho nên khi sinh trẻ có lƣợng kháng thể IgG tƣơng tự kháng thể IgG
của mẹ, kháng thể IgG của mẹ cho sẽ giảm còn 50% trong vòng 2 - 3 tháng sau
sinh. Trẻ cũng tự tổng hợp kháng thể IgG, tốc độ tổng hợp kháng thể IgG của trẻ sẽ
cao hơn tốc độ giảm kháng thể IgG của mẹ vào khoảng 4 - 6 tháng tuổi. Kháng thể
IgG trẻ sẽ tăng nhanh trong 3 năm đầu tiên đạt đến ngƣỡng 60% so với ngƣời lớn,
sau đó sẽ tăng chậm lại và đạt ngƣỡng của ngƣời lớn vào lúc vị thành niên. Do đặc
điểm bệnh XLA có đột biến gen BTK, tế bào B của trẻ bệnh XLA không có khả
năng tăng sinh, biệt hóa để tạo lƣợng gamma globulin bảo vệ cho trẻ, cho nên ở giai
đoạn sau sinh lƣợng kháng thể IgG từ mẹ cho con ở các trẻ này vẫn còn làm hàng
rào tự nhiên đủ để bảo vệ trẻ, chỉ sau 4 - 6 tháng tuổi khi IgG mẹ giảm thì trẻ mới
dễ bị mắc bệnh [39].

4


Hình 1.1 Nồng độ kháng thể ở trẻ

(Nguồn: immunobiology 5th edition (2001)
Các biểu hiện lâm sàng trở nên rõ ràng trong những tháng tiếp theo, khi
kháng thể IgG từ mẹ đƣợc chuyển hóa và tác dụng bảo vệ của chúng khơng cịn
hiện diện nữa. Điểm nổi bật của bệnh là tái phát do vi khuẩn đƣờng hô hấp và / hoặc
nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa, mặc dù một số bệnh nhân có thể khơng có triệu chứng
trong những năm đầu đời. Trong trƣờng hợp hiếm hoi, bệnh nhân đƣợc chẩn đoán
SGMD thể XLA ở tuổi vị thành niên hoặc thậm chí ở tuổi trƣởng thành do thiếu các
triệu chứng cho đến tuổi đó. Phạm vi nhiễm trùng điển hình ở bệnh nhân SGMD thể
XLA bao gồm viêm tai giữa tái phát, viêm xoang, viêm phế quản, viêm phổi và
nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa. Mặc dù tỷ lệ mắc các loại nhiễm trùng khác nhau giữa
các nhóm thuần tập khác nhau cho đến nay đƣợc báo cáo, có vẻ nhƣ loại nhiễm
trùng chính liên quan đến đƣờng hơ hấp trên và dƣới. Sau đó các nhiễm khuẩn lần
lƣợt xuất hiện và tăng dần tần suất cũng nhƣ mức độ nặng.
1.2.3. Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh XLA
1.2.3.1. Nồng độ kháng thể trong máu ngoại vi
Trong huyết thanh, thành phần globulin miễn dịch chiếm khoảng 20% tổng
lƣợng protein. 5 lớp Globulin miễn dịch chính là Globulin miễn dịch G (IgG),
Globulin miễn dịch A (IgA), Globulin miễn dịch M (IgM), Globulin miễn dịch D

5


(IgD), Globulin miễn dịch E (IgE). Trong đó, ba Globulin đầu có vai trị quan trọng
trong đáp ứng miễn dịch.
Lớp IgG là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch thứ phát. IgG
chiếm khoảng 70-75% tổng số globulin miễn dịch của cơ thể ngƣời. Có 4 dƣới lớp
của IgG: IgG1, IgG2, IgG3 và IgG4. Mỗi dƣới lớp của IgG có vai trị khác nhau
trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể. IgG là kháng thể duy nhất có thể qua đƣợc rau
thai, vì thế thai nhi đƣợc hƣởng IgG của mẹ truyền cho.
Lớp IgA chiếm khoảng 15-20% tổng số Globulin miễn dịch có trong huyết

thanh. IgA bao gồm IgA trong huyết thanh và IgA tiết ra ngoài niêm mạc. Có 2
dƣới lớp của IgA: IgA1 và IgA2. Đó là phƣơng tiện bảo vệ tại chỗ của cơ thể, ngăn
cản sự xâm nhập của các kháng nguyên. Chúng có trong nƣớc bọt, nƣớc mắt, và rất
nhiều trong sữa mẹ. Vì vậy trẻ nhận đƣợc rất nhiều IgA nếu đƣợc bú mẹ.
Lớp IgM chiếm khoảng 10% tổng số Globulin miễn dịch có trong huyết thanh.
IgM có khả năng liên kết bổ thể mạnh nhất. Đó là kháng nguyên xuất hiện đầu tiên
khi có kháng nguyên xâm nhập, IgG sẽ xuất hiện muộn hơn và thay thế cho IgM.
Các kháng thể trên có nhiều chức năng sinh học khác nhau trong đáp ứng miễn
dịch: chức năng nhận biết kháng nguyên, tác động trực tiếp lên kháng nguyên và
hạn chế khả năng gây bệnh của kháng nguyên đó. Riêng kháng thể IgG, IgM cịn có
vai trị hoạt hóa bổ thể, tạo thành phức hợp tấn công màng, chọc thủng và dung giải
các kháng nguyên là tế bào, vi khuẩn. Ngoài ra, các kháng thể cịn có khả năng
tƣơng tác với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác nhƣ bạch cầu ái kiềm, tế bào
mast, các đại thực bào và bạch cầu trung tính và các tế bào diệt tự nhiên (Nature
killer) để cùng tham gia tiêu diệt kháng nguyên.
Đối với bệnh nhân SGMD thể XLA, do có sự sụt giảm rõ rệt số lƣợng tế bào
lympho B trƣởng thành trong máu ngoại vi nên khả năng sản xuất kháng thể cũng bị
giảm nặng. Bệnh nhân XLA thƣờng có nồng độ IgG thấp dƣới 2 độ lệch chuẩn so
với trẻ cùng lứa tuổi. Nghiên cứu của Coley năm 2002 trên 82 bệnh nhân XLA tại
52 trung tâm của Hoa Kỳ cho thấy: đa số bệnh nhân có nồng độ IgG rất thấp hoặc
khơng đo đƣợc khi đƣợc chẩn đốn bệnh. Chỉ có 10% bệnh nhân có nồng độ trên

6


200 mg/dL [28]. Các nghiên cứu của Eduardo Lopez trên 54 bệnh nhân XLA ở Tây
Ban Nha và của Toyama trên 93 bệnh nhân ở Nhật Bản cũng cho kết quả tƣơng tự
[13].
Nồng độ IgM và IgA thƣờng dƣới 20 mg/dL. Dấu hiệu giảm IgM là một dấu
hiệu quan trọng do giảm IgG và IgA có thể gặp ở trẻ chậm sản xuất globulin miễn

dịch sinh lý. Trong khi giảm IgM thƣờng gặp trong bệnh cảnh suy giảm miễn dịch
bẩm sinh.
1.2.3.2. Dấu ấn màng tế bào
Trong cơ thể, có rất nhiều tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch: tế bào lympho,
tế bào đơn nhân, tế bào bạch cầu hạt trung tính, bạch cầu ái kiềm, bạch cầu ái toan,
dƣỡng bào…Tuy nhiên, vai trị chính đƣợc cho là của các tế bào lympho. Mỗi tế
bào đều có đặc trƣng riêng về mặt miễn dịch do sự có mặt của các thụ thể trên bề
mặt màng tế bào.
Các tế bào tiền thân dạng lympho từ tổ chức tạo máu đi tới tuyến ức, phân
chia, biệt hóa thành các lympho bào chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch qua trung
gian tế bào: lympho T. Tế bào lympho T bao gồm lympho T hỗ trợ (T helper),
lympho T độc (T cytotoxic), Lympho T gây quá mẫn muộn (TDTH) Lympho T ức
chế (Ts), Lympho T điều hịa ngƣợc (TFR). Trong đó, hai dƣới nhóm lympho quan
trọng là: lympho T hỗ trợ (dấu ấn màng tế bào: CD4+), vai trị quan trọng trong
hoạt hóa và thúc đẩy hoạt động của các lympho T khác thông qua việc tiết ra
Interleukin-2 và lympho T độc (dấu ấn màng tế bào: CD8+), có nhiệm vụ tấn cơng
trực tiếp các tế bào có kháng nguyên lạ trên bề mặt và tham gia đáp ứng miễn dịch
qua trung gian tế bào.
Các tế bào lympho B đƣợc sinh ra ở tủy xƣơng, trƣởng thành ở các nang
lympho trong hạch ngoại vi hoặc tủy trắng của lách. Các dấu ấn màng tế bào thƣờng
có ở lympho B là: CD10+, CD19+, CD20+, CD38+. Khi các lympho B đƣợc mẫn
cảm sẽ biệt hóa thành tƣơng bào sản xuất kháng thể. Vì vậy, lympho B đảm nhiệm
vai trị chính trong đáp ứng miễn dịch thể dịch.

7


Các tế bào diệt tự nhiên - NK là một tiểu quần thể tế bào có khả năng diệt một
số tế bào đích: tế bào u, tế bào vật chủ bị nhiễm virus. Chức năng quan trọng của tế
bào NK là kiểm soát miễn dịch, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus. Dấu ấn

màng tế bào: CD16+, CD56+.
Xét nghiệm tìm các dấu ấn miễn dịch trên màng tế bào vào những năm 1970
đã mở ra một thời kì mới trong nghiên cứu và ứng dụng của chuyên ngành miễn
dịch học. Dựa vào các dấu ấn trên tế bào lympho T (CD3+, CD4+, CD8+), lympho
B (CD19+, CD20+) và các tế bào diệt tự nhiên (CD56+), các tổ chức SGMD tồn
cầu đã phân loại bệnh nhân SGMD thành ba nhóm lớn: SGMD tế bào, SGMD thể
dịch hay SGMD kết hợp.
Với bệnh nhân XLA, tổn thƣơng do quá trình hình thành và biệt hóa của tế
bào lympho B nên khi xác định dấu ấn màng tế bào, chỉ có lympho B (CD19+)
giảm ≤ 2%; các tế bào lympho T, NK đều trong giới hạn bình thƣờng [23].
1.2.3.3. Tế bào Lympho B
Bình thƣờng, các tế bào lympho B trải qua quá trình biệt hoá và trở thành
tƣơng bào, sản xuất kháng thể. Trong tuỷ xƣơng, tế bào gốc tạo máu (hematopoietic
stem cell) phát triển thành tế bào tiền thân lympho (lymphoid precursorursor cell),
sau đó tiếp tục biệt hố thành tế bào hƣớng dịng B (pro-B cell), tiếp tục biệt hố
thành tế bào tiền B (pre-B cell) rồi thành tế bào B non (immature B cell). Tế bào B
non tiếp tục chín thêm ở trong tủy xƣơng hoặc sau khi đã rời tủy xƣơng vào các mơ
lympho ngoại vi tiếp tục biệt hố thành tế bào B trƣởng thành (mature B cell). Sau
đó, các tế bào lympho B trƣởng thành trú ngụ tại vùng vỏ ngoài của hạch ngoại vi,
tủy trắng của lách, tạo ra các nang lympho.

8


Hình 1.2: Sự phát triển và biệt hóa của lympho B trong bệnh XLA
(Nguồn: Nature Reviews Immunoglogy, 2005)
Trong quá trình biệt hoá từ tế bào tiền B tới tế bào B non có sự ảnh hƣởng trực
tiếp của phức hợp Pre-BCR (Pre B-cell receptor signalling – preBCR). Phức hợp
pre-BCR bao gồm hai chuỗi Igμ giống hệt nhau và 2 protein chuỗi nhẹ VpreB và
λ14.1, cùng với các phân tử neo đậu CD79α và CD79β. Có nhiều đột biến gây ra

bất thƣờng phức hợp Pre-BCR.
Trong bệnh XLA, đột biến gen Bruton Tyrosin Kinase (BTK) gây ra bất
thƣờng trong quá trình tổng hợp protein Bruton tyrosine kinase (BTK), một protein
quan trọng giúp hình thành phức hợp Pre-BCR. Do vậy, khi bị đột biến gen BTK,
các tế bào lympho B sẽ bị dừng biệt hoá ở giai đoạn tế bào Pre B trong tủy xƣơng,
dẫn đến sự vắng mặt của các tế bào lympho B trong máu ngoại vi và các mô
lympho ngoại biên. Kết quả là sự sản xuất tất cả các loại kháng thể: IgM, IgA, IgG,
các kháng thể đặc hiệu với các căn nguyên gây bệnh đều bị suy giảm nghiêm trọng.
Đột biến gen BTK là đột biến gen đầu tiên (năm 1993) gây bất thƣờng Pre-BCR
đƣợc tìm thấy, chiếm 85% trong số tất cả các trƣờng hợp khơng có gammaglobulin
máu tiên phát.
1.2.4. Dịch tễ học
Tỷ lệ mắc bệnh tại Đức là 0,09 trên 100.000 dân [20], ở Mỹ là 11,25 trên
100.000 dân [7], ở các nƣớc Đông Âu và Trung Âu là 1 trên 1,399.000 dân [46].
Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi từ 1: 100.000 đến 1: 200.000 tùy theo dân tộc.
9


Tại các nƣớc châu Á, rất ít nghiên cứu đƣa ra tỷ lệ mắc bệnh XLA do chƣa
có nguồn dữ liệu khu vực cũng nhƣ dữ liệu của từng quốc gia.
Tuy nhiên, do đặc điểm của bệnh SGMD thể XLA gây suy giảm miễn dịch
thể dịch nặng nên rất nhiều bệnh nhân bị nhiễm khuẩn nặng và tử vong trƣớc khi
đƣợc chẩn đốn xác định bệnh. Vì vậy, đa số các báo cáo chỉ đƣa ra số bệnh nhân
mắc bệnh không thực sự đầy đủ.
1.3. Cơ sở di truyền bệnh XLA
1.3.1. Vị trí và cấu trúc gen BTK
Năm 1993, lần đầu tiên hai nhóm nghiên cứu độc lập cùng tìm ra gen gây
bệnh XLA và giải thích đƣợc cơ chế bệnh sinh của bệnh, sau này đƣợc đổi tên để
tƣởng nhớ bác sỹ Bruton, ngƣời đã tìm ra căn bệnh [42], [12]. Đột biến ở gen BTK
gây nên giảm mất chức năng của protein Bruton tyrosine kinase khiến cho tế bào

lympho B khơng thể biệt hóa hoặc trƣởng thành và không sản xuất ra kháng thể.
Gen BTK nằm ở cánh dài của nhiễm sắc thể X ở vị trí Xq21.3 - q22. Gen
BTK dài 37,5 kilobase, chứa 19 exon. Kích thƣớc của exon thay đổi từ 55 đến 560
bp, và các intron từ 164 bp đến 9 kb [12].
1.3.2. Cấu trúc và chức năng protein BTK
Gen BTK mã hóa protein Bruton’s Tyrosine Kinase dài 659 acid amin, nặng
77 Kilodaltons, với năm khu vực chức năng: plekstrin homology (PH) domain (acid
amin 1 tới 138), Tec homology (TH) domain (acid amin 139 tới 215), Src homology
3 (SH3) domain (acid amin 216 tới 280), Src homology 2 (SH2) domain (acid amin
281 tới 377) and kinase (SH1) domain (acid amin 375 tới 659) [24], [16].

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc gen BTK
(Nguồn: Akintunde Akinleye ,2013)
10


Hình 1.4. Cấu trúc 3 chiều protein BTK
(Nguồn: Wang và cộng sự, 2015)
Gen BTK mã hóa cho protein Bruton Tyrosine Kinase (BTK), Protein BTK
là đại diện của nhóm gia đình Tec của các protein khơng tham gia vai trị receptor:
tyrosine kinases. Nó tham gia trong tất cả các giai đoạn phát triển của tế bào lympho
B từ tế bào tiền B CD34+CD19+ tới tế bào B trƣởng thành, tới tế bào plasma thì
khơng cịn tác dụng. Protein BTK cũng thể hiện ở tế bào erythroid precusors,
myeloid cells, tế bào mast, tế bào mono, megakaryocytes và tiểu cầu [5].
Protein BTK là một trong những Protein Tyrosine Kinase (PTKs) trong bào
tƣơng. Các enzyme Protein tyrosine kinases (PTKs) xúc tác chuyển hóa phosphate
của ATP. Phosphoryl hóa dƣ lƣợng tyrosine điều chỉnh hoạt tính enzym và tạo ra
các vị trí gắn kết các protein báo hiệu hạ lƣu. Hai nhóm PTK có mặt trong các tế
bào: các PTK receptor xuyên màng và các PTK khơng phải receptor (nonreceptor).
Bởi vì PTK là thành phần quan trọng của con đƣờng tín hiệu tế bào, hoạt động xúc

tác của chúng đƣợc điều chỉnh rất nghiêm ngặt. Trong vài năm qua, các nghiên cứu
cấu trúc có độ phân giải cao của PTK đã cung cấp một cơ sở phân tử để hiểu các cơ
chế mà theo đó các thụ thể PTK và receptor nonreceptor đƣợc điều chỉnh [27].
1.3.3. Đặc điểm di truyền và đột biến gen BTK
Bệnh XLA là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể X, do đó ngƣời mẹ mang
gen bệnh sẽ di truyền gen bệnh cho 50% ngƣời con trai trên 1 nhiễm sắc thể X. Một
số trƣờng hợp hiếm gặp hơn, 15-20%% số bệnh nhân nam mang đột biến mới (de

11


novo), do đó ngƣời mẹ khơng phát hiện có đột biến gây bệnh trên nhiễm sắc thể X
[34].
Phát hiện đột biến trên gen BTK đóng vai trị quan trọng trong tƣ vấn di
truyền. Đặc biệt trong các gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh XLA, việc phát
hiện sớm ngƣời mang gen bệnh là điều kiện cần và đủ cho chẩn đốn trƣớc sinh
giúp phịng bệnh và giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh.
Công bố gần đây nhất của ngân hàng gen - Gene Bank: 900 đột biến (789 đã
đƣợc báo cáo) của gen BTK. Phân bố dạng đột biến của các đột biến này nhƣ sau:
sai nghĩa/vô nghĩa (350 đột biến); splicing (125 đột biến); regulatory (2 đột biến);
mất đoạn nhỏ (156 đột biến); thêm đoạn nhỏ (53 đột biến); small indel (22 đột
biến); mất đoạn lớn (64 đột biến); thêm đoạn lớn/ lặp đoạn lớn (15 đột biến) và
phức tạp (2 đột biến). Khoảng 35% đột biến điểm, dẫn đến sự thay thế axit amin.
Các đột biến thay thế axit amin này đƣợc phát hiện chủ yêu ở vùng kinase, đặc biệt
là ở phần đầu C của vùng kinase. Một số đột biến thay thế axit amin cũng có thể
đƣợc phát hiện ở các vùng PH và SH2, trong khi vùng TH, SH3 ít phát hiện thấy
đột biến [26]
Những đột biến đƣợc tìm thấy trên cả exon và intron suốt chiều dài gen và là
những đột biến đã đƣợc chứng minh là làm giảm số lƣợng hoàn toàn hoặc mất chức
năng của protein Bruton Tyrosine Kinase [23]. Tuy nhiên, mỗi năm, con số các đột

biến đƣợc tìm thấy và công bố đƣợc tăng lên do số lƣợng bệnh nhân đƣợc chẩn
đoán ngày càng lớn và nghiên cứu đƣợc mở rộng ở các quần thể khác nhau trên tồn
thế giới.

1.4. Chẩn đốn bệnh XLA
Các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA đƣợc chẩn đoán dựa vào các tiêu
chuẩn lâm sàng, xét nghiệm cơ bản và chẩn đoán xác định dựa vào phân tích gen
BTK.

12


1.4.1. Tiêu chuẩn lâm sàng
Năm 1999, hội đồng SGMD châu Âu ESID (European Society for Immunodeficiencies) và hội đồng SGMD Mỹ PAGID (Pan-American Group for
Immunodeficiency) đã thống nhất và đƣa ra tiêu chuẩn chẩn đốn cho các nhóm bệnh
SGMD bẩm sinh. Các tiêu chuẩn chẩn đoán này dựa vào lâm sàng, xét nghiệm cơ
bản và xét nghiệm phân tích đột biến gen. Cho tới nay, đây vẫn là bản tiêu chuẩn
đƣợc áp dụng rộng rãi nhất trên toàn thế giới [10], [14].
Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SGMD thể XLA

 Tiêu chuẩn chẩn đốn xác định (definitif): bệnh nhân nam có số lƣợng
tế bào lympho B CD19+ ≤2% và ít nhất một tiêu chuẩn sau:
+

Tìm thấy đột biến trên gen BTK.

+

Khơng có Btk mRNA trong mẫu phân tích mARN của bạch cầu hạt trung
tính và bạch cầu mono theo phƣơng pháp Northern blot analysis.

+

Khơng có protein BTK trong tế bào bạch cầu mono hoặc tiểu cầu.

+

Anh, em trai cùng mẹ của bệnh nhân, cậu và bác trai bên mẹ, hoặc cháu
trai bên mẹ có số lƣợng tế bào lymphoB CD19+ ≤ 2%.

 Tiêu chuẩn chẩn đốn có thể (probable): bệnh nhân nam có số lƣợng
tế bào lymphoB CD19+ ≤ 2% và ít nhất một tiêu chuẩn sau:
+

Xuất hiện các đợt nhiễm vi khuẩn tái diễn trong năm năm đầu đời

+

Nồng độ IgG, IgM, và IgA ≤ - 2 SD với nồng độ ở trẻ bình thƣờng cùng
lứa tuổi.

+

Khơng có kháng thể kháng hồng cầu Anti-A và Anti-B trong máu và/hoặc
đáp ứng kém với vaccine.

1.4.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
1.4.2.1. Công thức máu
Công thức máu cơ bản cần đƣợc thực hiện ở tất cả những bệnh nhân suy
giảm miễn dịch tiên phát. Mặc dù cơ chế bệnh sinh của XLA là giảm số lƣợng tế

13


bào lympho B nên số lƣợng bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, ái kiềm, hồng cầu
và tiểu cầu không bị ảnh hƣởng. Tuy nhiên, công thức máu vẫn có vai trị quan
trọng, giúp xác định mức độ nhiễm trùng và có thể loại trừ một số bệnh suy giảm
miễn dịch bẩm sinh khác nhƣ: bệnh giảm bạch cầu hạt trung tính, bệnh suy giảm
miễn dịch kết hợp nguy kịch.
Một số trƣờng hợp bệnh nhân XLA đã có tiền sử giảm bạch cầu hạt trung
tính, đặc biệt trong đợt nhiễm khuẩn và đƣợc chẩn đoán nhầm với bệnh giảm bạch
cầu hạt bẩm sinh. Vi khuẩn pseudomonas và tụ cầu là hai loại vi khuẩn thƣờng gây
giảm bạch cầu hạt trung tính nặng ở bệnh nhân XLA [11], [21].
1.4.2.2. Phân tích dấu ấn màng tế bào
Bình thƣờng, số lƣợng tế bào lympho B dao động theo tuổi của bệnh nhân
nhƣng trung bình chiếm 5-15% số lƣợng tế bào lympho trong máu ngoại vi [41].
Đối với bệnh nhân XLA, các tế bào lympho B khơng thể biệt hố thành các tế bào
lympho B trƣởng thành nên số lƣợng tế bào lympho B ra máu ngoại vi rất ít hoặc
thậm chí bằng khơng.
Số lƣợng tế bào lympho B có thể xác định bằng xét nghiệm phát hiện dấu ấn
màng tế bào bằng hệ thống phân tích dịng chảy tế bào - Flow Cytometry. Nguyên
lý của kỹ thuật là sử dụng chùm tia laser phát hiện ra các kháng thể gắn huỳnh
quang đƣợc gắn lên các dấu ấn màng tế bào máu. Nhờ đó nhận biết các tế bào mang
các dấu ấn bề mặt (hay còn gọi là kháng nguyên bề mặt), giúp xác định chính xác
loại và số lƣợng từng loại tế bào. Dựa vào nguyên lý này, các nhà miễn dịch học đã
ứng dụng để xác định số lƣợng các dòng tế bào: lympho T (CD3+, CD4+, CD 8+),
lympho B (CD19+, CD20+) và các tế bào diệt tự nhiên (CD56+) và rất nhiều dƣới
nhóm của tế bào khác nhƣ các tế bào dƣới nhóm khác. Việc xác định đƣợc các dấu
ấn miễn dịch trên màng tế bào vào những năm 1970 đã mở ra một thời kì mới giúp
chứng minh đƣợc về bản chất và phân loại các thể của bệnh SGMD bẩm sinh.

Theo tiêu chuẩn chẩn đoán của hiệp hội suy giảm miễn dịch Mỹ và Châu Âu
năm 1999, bệnh nhân XLA có số lƣợng tế bào lympho B dƣới 2 % [10]. Hầu hết
các bệnh nhân XLA, đặc biệt là những bệnh nhân dƣới 10 tuổi, đều có rất ít tế bào

14