Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin viêm não nhật bản bất hoạt sản xuất trên tế bào vero

..

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ....................................................................
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN ..........................................................................................3
Đặc điểm virút viêm não Nhật Bản ............................................................3

1.1.

1.1.1.

Hình thể .................................................................................................3

1.1.2.

Cấu trúc .................................................................................................3

Vắcxin VNNB ...............................................................................................5

1.2.

1.2.1.

Các vắcxin VNNB đƣợc sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn ........5

1.2.1.1.

Vắcxin VNNB bất hoạt từ não chuột .............................................5

1.2.1.2.

Vắcxin VNNB bất hoạt từ tế bào thận chuột Hamster tiên phát ..6

1.2.1.3.

Vắcxin VNNB sống giảm độc lực ...................................................7

1.2.2.

So sánh công nghệ sản xuất vắcxin VNNB trên não chuột và trên tế

bào

.................................................................................................................7

1.2.3.

Tế bào Vero trong ứng dụng sản xuất vắcxin ....................................8

1.3.

Quy trình sản xuất vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên

tế bào Vero (JECEVAX) tại VABIOTECH ........................................................9
1.4.

Căn cứ và cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cở sở trong kiểm định chất lƣợng

vắcxin JECEVAX ................................................................................................11
1.4.1.

Yêu cầu chung .....................................................................................11

1.4.2.

Căn cứ và cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định

vắcxin JECEVAX .............................................................................................12
1.4.2.1.

Kiểm tra thành phần hóa học .......................................................13

1.4.2.2.

Kiểm tra tính an tồn và cơng hiệu ..............................................15

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................18
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................18


2.2.

Vật liệu ........................................................................................................18

2.2.1.

Hóa chất ...............................................................................................18

2.2.2.

Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm ..........................................19

2.2.3.

Trang thiết bị .......................................................................................20

2.2.4.

Dụng cụ ................................................................................................21

2.3.

Phƣơng pháp ..............................................................................................22

2.3.1.

Kiểm tra tính chất vật lý ....................................................................22

2.3.2.

Soi vắcxin .............................................................................................22

2.3.3.

Kiểm tra thể tích đóng lọ vắcxin .......................................................23

2.3.4.

Kiểm tra pH .........................................................................................23

2.3.5.

Kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal .......................................................23

2.3.6.

Kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde .................................................25

2.3.7.

Kiểm tra hàm lƣợng Protein ..............................................................25

2.3.8.

Kiểm tra hàm lƣợng ADN tồn dƣ......................................................26

2.3.9.

Kiểm tra vô khuẩn ..............................................................................28

2.3.10. Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử PFU
...............................................................................................................29
2.3.11. Kiểm tra bất hoạt giai đoạn bán thành phẩm thô ...........................30
2.3.12. Kiểm tra hàm lƣợng kháng nguyên virút VNNB bằng kỹ thuật

ELISA ...............................................................................................................30
2.3.13. Kiểm tra bất hoạt bán thành phẩm tinh chế ....................................33
2.3.14. Kiểm tra chất gây sốt ..........................................................................34
2.3.15. Kiểm tra an toàn chung chuột nhắt và chuột lang ..........................34
2.3.16. Kiểm tra an toàn đặc hiệu ..................................................................34
2.3.17. Kiểm tra công hiệu ..............................................................................35
Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................39
3.1.

Kết quả phân tích các thành phần hóa học trong kiểm định vắcxin

JECEVAX.............................................................................................................39
3.1.1.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết ....................39

3.1.2.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP cuối cùng .......................42


3.1.3.
3.2.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX thành phẩm ...........................43

Kết quả kiểm tra tính an tồn và cơng hiệu trong kiểm định vắcxin

JECEVAX.............................................................................................................49
3.2.1.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP thô ...............................49

3.2.2.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin BTP tinh khiết ........................................51

3.2.3.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP cuối cùng. ...................54

3.2.4.

Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX thành phẩm ........................54

3.3.

So sánh kết quả kiểm định chất lƣợng vắcxin JECEVAX tại

VABIOTECH, NICVB ........................................................................................60
3.4.

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin JECEVAX ...........62

3.4.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học .............................62
Chƣơng 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................68
4.1. Kết luận ........................................................................................................68
4.2. Kiến nghị ......................................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................69

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa
từng được ai cơng bố trong bất cứ cơng trình nào khác.

Học viên

Nguyễn Vũ Thu Hương


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến:
Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Đào tạo Sau Đại học, Viện Công
nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm đã giúp đỡ tạo điều kiện và hồn tất các thủ
tục cho tơi hồn thành và bảo vệ luận văn.
Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, phòng Quản lý chất lượng
đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập, thực tập và hồn
thành luận văn.
Trong q trình học tập và hồn thành luận văn, tơi đã được sự dạy dỗ và giúp
đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp. Cho phép tôi được
bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
GS.TS. Huỳnh Thị Phƣơng Liên, Cố vấn khoa học, Công ty TNHH MTV
Vắcxin và Sinh phẩm số 1, ngườithầy đã hướng dẫn tôi các kỹ thuật kiểm định
vắcxin, truyền đạt kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học, đạo đức của người
làm công tác kiểm định và giúp đỡ tôi trong suốt q trình học tập, cơng tác và hồn
thành luận văn.
PGS. TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh
học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp
đỡ tôi trong suốt q trình học tập và hồn thành luận văn.
TS. Đỗ Tuấn Đạt, Giám đốc Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số
1; TS.Nguyễn Quế Anh, Phó Giám đốc chất lượng Công ty TNHH MTV Vắcxin
và Sinh phẩm và số 1; ThS. Nguyễn Thị Thu Hằng, Phó phịng Quản lý chất
lượng,Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm và số 1 đã tạo mọi điều kiện cho
tôi trong quá trình học tập và hồn thành luận văn.


Các đồng nghiệp của tơi ở Phịng Quản lý chất lượng,Công ty TNHH MTV
Vắcxin và Sinh phẩm và số 1, đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình học tập cũng
như thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường
Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tơi trong q trình học tập.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người ln động viên
và giúp đỡ trong suốt q trình làm luận văn.
Hà Nội, ngày 28 tháng 09 năm 2015
Học viên

Nguyễn Vũ Thu Hương


DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa

Amino acid (axit amin)

ADN

Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic)

ARN

Ribonucleic acid (axit ribonucleic)

BHK21

Baby hamster kidney cells (tế bào có nguồn gốc từ thận chuột
hamster sơ sinh)

BTP

Vắcxin bán thành phẩm

CPE

Cytopathic effect (sự hủy hoại tế bào)

CTTCMR

Chương trình tiêm chủng mở rộng

CV

Challenge virus (virút thử thách)

D

Dalton

DĐVN

Dược điển Việt Nam

E

Envelope (Vùng vỏ)

ELISA

Enzyme-linked immunosorbant assay (Thử nghiệm phấp phụ
miễn dịch liên kết gắn enzym)

GMP

Good manufacturing pratice (thực hành sản xuất tốt)

HGKT

Hiệu giá kháng thể

HLKN

Hàm lượng kháng nguyên

IU

International unit (đơn vị quốc tế)

JEVAX

Vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên não chuột

JECEVAX

Vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero

KN

Kháng nguyên

KT

Kháng thể

MCB

Master cell bank (ngân hàng tế gốc)

MRC5

Medical Research Council cell strain 59 (Tế bào MRC5
lưỡng bội từ người)

ND

Not done (không làm)

SD

Standard deviation (độ lệch chuẩn)


PFU

Plaque forming unit (tạo đám hoại tử)

PRNT

Plaque reduction neutralization test (trung hòa giảm đám hoại
tử)

RK13

Rabbit kidney (tế bào thận thỏ)

TCCT

Tiêu chuẩn chấp thuận

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TCYTTG

Tổ chức y tế thế giới

TP

Vắcxin thành phẩm

VABIOTECH

Vaccine and Biological No1 company (Công ty TNHH MTV
Vắcxin và Sinh phẩm số 1)

Vero

Dịng tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh châu Phi (Verda
Reno)

VNNB

Viêm não Nhật Bản

NICVB

National institute for control of vaccine and biologicals (Viện
Kiểm định Vắcxin và Sinh phẩm y tế)

WCB

Working cell bank (Ngân hàng tế bào sản xuất)


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng AND tồn dƣ vắcxin JECEVAX TP .....48
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra chất gây sốt (từng thỏ) vắcxin JECEVAX BTP tinh
khiết ..........................................................................................................................52
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra chất gây sốt (từng thỏ) vắcxin JECEVAX TP .......58
Bảng 3.4. So sánh kết quả kiểm định chất lƣợng vắcxin JECEVAX tại
VABIOTECH, NICVB và tiêu chuẩn của TCYTTG...........................................60


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1.Mơ hình cấu trúc hạtvirút VNNB [9] ......................................................4
Hình 1.2.Sơ đồ sắp xếp Genom của virút VNNB [9]..............................................4
Hình 1.3. Hình ảnh hạt virút VNNB tinh khiết quan sát dƣới kính hiển vi điện
tử JEM - T8 độ phóng đại 120.000 lần ....................................................................5
Hình 3.1.Kết quả kiểm tra pH vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết .....................39
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra Formaldehyde vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 40
Hình 3.3.Kết quả kiểm tra Thimerosal vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết .......41
Hình 3.4.Kết quả kiểm trahàm lƣợng Protein vắcxin JECEVAX BTP tinh
khiết ..........................................................................................................................42
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra pH vắcxin JECEVAX BTP cuối cùng ....................43
Hình 3.6.Kết quả kiểm tra thể tích đóng ống vắcxin JECEVAX TP .................44
Hình 3.7.Kết quả kiểm tra pH vắcxin JECEVAX TP .........................................45
Hình 3.8.Kết quả kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal vắcxin JECEVAX TP .......46
Hình 3.9.Kết quả kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde vắcxin JECEVAX TP ..47
Hình 3.10.Kết quả kiểm tra hàm lƣợng Protein vắcxin JECEVAX TP ............48
Hình 3.11. Kết quả Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB bằng phƣơng pháp tạo đám
hoại tử PFU vắcxin JECEVAX BTP thô trƣớc bất hoạt .....................................50
Hình 3.12.Kết quả kiểm tra Chất gây sốt trên 3 thỏ của vắcxin JECEVAX BPT
tinh khiết ..................................................................................................................52
Hình 3.13.Kết quả hàm lƣợng kháng nguyên virút VNNB vắcxin JECEVAX
BTP tinh khiết .........................................................................................................53

Hình 3.14.Kết quả kiểm tra An tồn chung trên chuột lang vắcxin JECEVAX
TP ..............................................................................................................................55
Hình 3.15.Kết quả kiểm tra An tồn chung trên chuột nhắt vắcxin JECEVAX
TP ..............................................................................................................................56
Hình 3.16.Kết quả kiểm tra An tồn đặc hiệu vắcxin JECEVAX TP................57
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra chất gây sốt 3 thỏ vắcxin JECEVAX TP ..............58
Hình 3.18. Kết quả kiểm tra Cơng hiệu vắcxin JECEVAX TP ..........................59


MỞ ĐẦU
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh nhiễm virút cấp tính làm tổn
thương hệ thống thần kinh trung ương, có ổ bệnh trong thiên nhiên. Tác nhân gây
nên là virút VNNB (Japanese encephalitis virus), cách truyền bệnh là do muỗi đốt
(vectơ) các động vật mang virút (ổ chứa) điển hình là lợn, chim di cư, rồi sau đó
truyền bệnh cho người là vật chủ cuối cùng. Bệnh lưu hành ở hầu hết các nước châu
Á, Trung Á và Ấn Độ. Năm 1998, bệnh VNNB đã lan đến phía Bắc châu Úc. Như
vậy, cho đến nay gần 3 tỷ người sống trong vùng có lưu hành dịch, hàng năm trên
thế giới có khoảng 50.000 trường hợp mắc với tỉ lệ tử vong 5-30% và 30-50% khỏi
bệnh đã để lại di chứng thần kinh suốt đời, là gánh nặng cho gia đình và xã hội [30].
Bệnh VNNB khơng thể thanh tốn được do chu kỳ truyền bệnh trong thiên nhiên
khơng bao giờ chấm dứt.
Bệnh VNNB chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, điều trị triệu chứng là chủ yếu,
do đó biện pháp hữu hiệu nhất là tiêm vắcxin VNNB để phòng bệnh. Nhật Bản là
nước đầu tiên nghiên cứu, sản xuất vắcxin này. Năm 1954, vắcxin VNNB đã được
sử dụng tại Nhật Bản, sản phẩm là dạng vắcxin thô điều chế từ não chuột gây nên
nhiều phản ứng quá mẫn, nhưng cũng đã cứu được nhiều người mắc phải căn bệnh
này. Sau hơn 30 năm nghiên cứu, năm 1986 Nhật Bản đã có vắcxin bất hoạt, tinh
khiết sản xuất từ não chuột nhờ phát minh công nghệ tinh chế bằng phương pháp
hóa lý của Takaku, vắcxin có khả năng bảo vệ cao và phản ứng phụ thấp. Đầu
những năm 1990, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương đã tiếp thu chuyển giao công

nghệ sản xuất vắcxin VNNB từ viện BIKEN-Nhật Bản và đã sản xuất thành công
vắcxin này. Đến năm 1997, vắcxin VNNB đã được đưa vào Chương trình tiêm
chủng mở rộng để đáp ứng nhu cầu phịng bệnh tích cực cho cộng đồng đặc biệt là
trẻ em. Vắcxin VNNB đã góp phần phịng bệnh hiệu quả, làm giảm tỷ lệ mắc và di
chứng xuống 40-50% [6].
Tuy nhiên, để tiến kịp với công nghệ mới về sản xuất vắcxin trên tế bào
nhằm thay thế vắcxin có nguồn gốc từ não chuột với lý do:

1


- Theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới cần phải dần dần từng bước

thay thế vắcxin có nguồn gốc từ mô thần kinh (não chuột) bằng vắcxin sản xuất
trên tế bào.
- Để chủ động nguồn nguyên liệu đầu vào cho sản xuất, tế bào Vero đã

được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu chứng minh đạt tất cả các tiêu
chuẩn an toàn để sản xuất vắcxin dùng cho người.
- Luật bảo vệ động vật của thế giới hạn chế tối đa giết động vật thí nghiệm.

Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 đã nghiên cứu phát triển
thành cơng quy trình sản xuất vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt sản xuất trên tế
bào Vero. Vì vậy, yêu cầu cấp bách cho việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm
định vắcxin viêm não Nhật Bản sản xuất trên tế bào Vero nhằm quản lý và đảm bảo
chất lượng tốt, về an toàn và công hiệu cho người sử dụng, do vậy chúng tôi thực
hiện đề tài:
“Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin viêm não Nhật Bản
bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero”
Đề tài gồm 2 mục tiêu:

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học trong kiểm định vắcxin

viêm não Nhật Bản, bất hoạt sản xuất trên tế bào Vero.
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về tính an tồn và cơng hiệu trong kiểm định

vắcxin viêm não Nhật Bản, bất hoạt sản xuất trên tế bào Vero.
Nội dung nghiên cứu: Kiểm định vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên tế bào
Vero được sản xuất tại VABIOTECH (JECEVAX) về:
- Thành phần hóa học tính an tồn và cơng hiệu ở các giai đoạn BTP thơ,
BTP tinh khiết, BTP cuối cùng và thành phẩm.
- Tính an tồn và cơng hiệu ở các giai đoạn BTP thơ, BTP tinh khiết, BTP
cuối cùng và thành phẩm.
Đề tài được thực hiện tại bộ phận Kiểm tra chất lượng sản phẩm, phịng
Quản lý chất lượng của Cơng ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm virút viêm não Nhật Bản
1.1.1. Hình thể
Virút VNNB là một Flaviviridae thuộc họ Togaviridae, có vỏ bọc được cấu tạo
bởi glycoprotein, có hình khối cầu đối xứng, kích thước trung bình của virút khoảng
40-50 nm. Virút VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm3 trong đường và 1,22-1,24g/cm3
trong cesium chlorua. Hệ số lắng là 200S. Trọng lượng phân tử là 60-70x106 Dalton
[6].
1.1.2. Cấu trúc
Vật liệu di truyền của virút là ARN sợi đơn, xoắn, có vỏ bọc, trọng lượng phân
tử 4x106 Dalton.

ARN là nơi chứa tồn bộ thơng tin di truyền của hạt virút, chiếm 6% trọng
lượng của virion. Chiều dài ARN xấp xỉ 11 Kb, được cấu tạo bởi 10.976 nucleotid
tương ứng 3.432 axit amin, mã hoá cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7
protein không cấu trúc [6].


Protein cấu trúc bao gồm:
- Protein màng (Membrane Protein: M): Cịn gọi là V1, là một

polypeptid có trọng lượng phân tử 8700 Da, gồm 75 axit amin.
- Protein lõi (Nuleocapsid Protein: C) còn gọi là V2, là một polypeptid

có trọng lượng phân tử 13500 Da, gồm 136 axit amin.
- Protein vỏ (Envelop Protein: E) còn gọi là V3, là glycoprotein có

trọng lượng phân tử 53000 Da gồm 500 axit amin. V3 đóng vai trị quan trọng cho
sự xâm nhiễm của virút VNNB và sự khác nhau về độc lực của virút VNNB trong
tự nhiên. Protein vỏ còn giúp virút nhận ra những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế
bào cảm thụ, kích thích cơ thể sinh kháng thể, dịch thể và đáp ứng miễn dịch trung
gian tế bào. Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu được gắn trên bề mặt protein E.

3


Hình 1.1.Mơ hình cấu trúc hạtvirút VNNB [9]
 Protein khơng cấu trúc NS có 2.638 axit amin, gồm 7 Protein ký hiệu:
NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.

Hình 1.2.Sơ đồ sắp xếp Genom của virút VNNB [9]


Quan sát hạt virion dưới kính hiển vi điện tử thấy:
- Vỏ bọc là một màng lipid kép của protein E và protein M.
- Những hạt gai nhỏ trên bề mặt hạt virút là những glycoprotein mang

hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hồ.

4


- Nucleocapsit có đường kính 25-30 nm, hệ số lắng 120 – 140 S gồm

ARN và Protein.

Hình 1.3. Hình ảnh hạt virút VNNB tinh khiết quan sát dƣới kính hiển vi
điện tử JEM - T8 độ phóng đại 120.000 lần
1.2. Vắcxin VNNB
Hơn 20 năm nay, Việt Nam đã tự sản xuất được vắcxin VNNB và được Bộ Y
tế quyết định đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng Quốc Gia từ năm 1997,
nhờ đó số ca mắc VNNB trước năm 1995 khoảng 70-75% trong số viêm não do
virút đến nay chỉ còn 10-15%.
1.2.1. Các vắcxin VNNB đƣợc sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn
1.2.1.1. Vắcxin VNNB bất hoạt từ não chuột
Loại vắcxin này được sản xuất ở một số nước như Nhật Bản, Thái Lan, Đài
Loan và Việt Nam. Vào những năm 1940 khi mới bắt đầu nghiên cứu sản xuất
vắcxin này ở dạng thơ, chứa tồn bộ protein não chuột và hàm lượng myelin cao
nên tỷ lệ gây viêm não dị ứng cao. Ngày nay, áp dụng các công nghệ tinh chế hiện
đại đã loại trừ hầu như hoàn toàn myelin. Hai chủng virút VNNB dùng để sử dụng
sản xuất vắcxin là Nakayama và Beijing-1. Vắcxin đã được thử nghiệm và sử dụng
rộng rãi ở Thái Lan, Nhật Bản, Việt Nam… nơi có lưu hành nhiều tuýp VNNB khác

nhau đều có đáp ứng kháng thể, mặt khác thử nghiệm nhiễm chéo trên chuột với các
chủng virút VNNB lưu hành ở Châu Á cho thấy chủng Beijing-1 là chủng tạo
HGKT trung hòa cao hơn và diện chéo rộng với tất cả các chủng virút VNNB hoang
5


dại lưu hành ở các vùng khác nhau. Vì lý do này mà một số hãng sản xuất vắcxin
VNNB đã thay chủng Nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắcxin từ não
chuột.
Quy trình tinh chế thành cơng vắcxin VNNB bất hoạt từ não chuột được
công bố bởi các viện nghiên cứu Nhật Bản và đạt được vắcxin tinh khiết hiện nay.
Quy trình vắcxin từ não chuột ở Nhật Bản, Thái Lan và Việt nam theo công nghệ
này: gây nhiễm trên não chuột, thu hoạch não chuột liệt, nghiền đồng nhất, ly tâm,
siêu ly tâm, tủa protamin sulfat, bất hoạt formalin, thử nghiệm bất hoạt và tinh chế
bởi phương pháp cô đặc, siêu ly tâm, tủa amoni sulfat, siêu ly tâm trong sacharose
gradient. Tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản quy định khả năng gây miễn dịch tối
thiểu và hiệu lực ở chuột (so với một vắcxin mẫu chuẩn), tổng hàm lượng protein
tối đa (80 µg/ml) và protein cơ bản myelin (2ng/ml) trong một số quy định khác.
Kháng nguyên VNNB tinh khiết, bất hoạt được pha lỗng với mơi trường TCM199
(là dung dịch giàu acid amin và vitamin, là chất bền vững cho kháng nguyên virút
VNNB). Vắcxin VNNB dạng dung dịch có chất bảo quản là thimerosal. Ở Nhật
Bản, vắcxin được sử dụng chủ yếu dưới dạng dung dịch. Để xuất khẩu, vắcxin được
đơng khơ rồi được hồn ngun bằng nước cất vô trùng.
Ở Việt Nam, nhận chuyển nhượng công nghệ sản xuất vắcxin VNNB của
viện BIKEN thuộc trường đại học Osaka- Nhật Bản từ năm 1989, Viện VSDTTƯ
đã sản xuất thành công vắcxin VNNB bất hoạt, tinh khiết từ não chuột theo phương
pháp hóa lý của Takaku với chủng virút Nakayama, NIH, Nhật Bản.
1.2.1.2. Vắcxin VNNB bất hoạt từ tế bào thận chuột Hamster tiên phát
Vắcxin VNNB bất hoạt điều chế từ tế bào thận chuột tiên phát (PHK) chỉ
được sản xuất ở Trung Quốc. Từ 1986, khi thay thế vắcxin từ phơi gà có khả năng

gây miễn dịch kém hơn. Nghiên cứu sản xuất vắcxin từ nuôi cấy tế bào nhằm tránh
các Myelin của não chuột và các phản ứng dị ứng liên quan đến protein não chuột.
Vắcxin được điều chế từ nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng Hamster tiên
phát. Gây nhiễm virút VNNB trên tế bào PHK, sau đó nước nổi của ni cấy tế bào
này được thu hoạch và được bất hoạt với fomalin 0,5% và chất bền vững là albumin
người, sau đó cơ đặc vắcxin bất hoạt qua siêu lọc tiếp đến là siêu ly tâm. Trong một
6


thử nghiệm thực địa, một liều 1,0ml vắcxin tiêm dưới da đạt tỷ lệ chuyển đổi huyết
thanh tương đương với chủng Beijing-3 (P3), tỷ lệ đáp ứng kháng thể chéo với virút
Nakayama.
1.2.1.3. Vắcxin VNNB sống giảm độc lực
Các chủng virút VNNB giảm độc lực được nghiên cứu bằng cách cấy chuyển
chủng virút hoang dại, nuôi cấy và nhân lên nhiểu lần trên các dịng tế bào khác
nhau như PHK, phơi gà, và tế bào biểu bì phơi chuột. Mất độc tính thần kinh ở
chuột, chuột đất vàng hoặc lợn bước đầu cho thấy khả năng sử dụng an toàn trên
người. Trung Quốc đã nghiên cứu giảm độc lực virút VNNB trong tế bào PHK và
phát triển virút VNNB sống giảm độc lực, vắcxin từ chủng SA14-14-2, an tồn và
có khả năng đáp ứng miễn dịch. Hiệu quả của vắcxin được đánh giá trên thực địa và
được cấp phép lưu hành ở Trung Quốc năm 1988.
Tế bào PHK được giữ tại ngân hàng tế bào gốc (MCB) Viện Sinh học
Chengdu. Tế bào một lớp được gây nhiễm với virút SA14-14-2 trong mơi trường có
chứa 0,25% albumin người, gentamicin và kanamicin. Nồng độ gây nhiễm khoảng
108,2TCID50/ml được gặt vào thời điểm 78 đến 96 giờ, lọc thô, và vắcxin dung dịch
được đông khô. Chất bền vứng là Gelatin và sacharoza. Vắcxin đông khơ được hồn
ngun với PBS vơ trùng (pH 7,4-7,6).
Vắcxin phải đảm bảo tiêu chuẩn khơng có các tác nhân độc hại, không gây độc
thần kinh trên chuột trưởng thành, và ổn định khơng trở lại độc tính thần kinh sau
khi gây nhiễm vào não chuột đang bú.

Chưa theo dõi đầy đủ về mức độ an toàn cũng như đột biến gen của virút viêm
não trong loại vắcxin sống giảm độc lực sản xuất từ chủng SA14-14-2, đây chính là
điều cần quan tâm.
1.2.2. So sánh công nghệ sản xuất vắcxin VNNB trên não chuột và trên tế bào
So sánh vắcxin sản xuất từ não chuột và trên tế bào cho thấy việc nuôi và cung
cấp chuột phải được tổ chức và quản lý tốt. Chuột phải đạt tiêu chuẩn chất lượng để
sản xuất loại trừ 11 loại virút gây bệnh cho chuột. Một não chuột 3-4 tuần tuổi chỉ
được 4-5 liều vắcxin. Vì vậy, muốn sản xuất được nhiều vắcxin thì phải có hệ thống
hậu cần và chăn ni chuột, phải đầu tư nhà xưởng, trang thiết bị và nhân lực phù
7


hợp nên sản lượng hạn chế. Sản xuất vắcxin trên tế bào tổ chức thực hiện dễ dàng
hơn, nguyên liệu đầu là tế bào được nhân lên theo yêu cầu từ ngân hàng tế bào sản
xuất (WCB). Như vậy, chủ động được nguyên liệu đầu vào, nhà xưởng đảm bảo
sạch sẽ hơn để đạt được GMP của TCYTTG.
Sau nhiều năm nghiên cứu, các tác giả Trung Quốc đã tạo được một chủng
VNNB giảm độc lực SA14-14-2, chủng này nhân lên tốt trên tế bào PHK. SA14-142 được dùng để sản xuất vắcxin VNNB sống giảm độc lực cho thấy có khả năng bảo
vệ đến gần 70%. Tuy nhiên về mặt an tồn thì cịn phải được chứng minh đầy đủ.
Vắcxin bất hoạt được nuôi cấy trên tế bào PHK đã sử dụng chủng Beijing-3 và
sản xuất tại Viện sản xuất các sản phẩm sinh học Bắc Kinh, Thượng Hải, Vũ Hán
và Thành Đơ. Loại vắcxin bất hoạt này an tồn nhưng hiệu quả bảo vệ < 70%.
Do tính ưu việt về công nghệ, nhà xưởng… nên đầu thế kỷ 21, nhiều nhà sản
xuất đã nghiên cứu về vắcxin trên tế bào Vero như Biken, Kaketsuken, Nhật Bản,
Viện vắcxin và huyết thanh Bắc Kinh (Trung Quốc), Intercell (Áo). Nghiên cứu thử
nghiệm lâm sàng trên thực địa vắcxin VNNB bất hoạt và bước đầu đánh giá về tỷ lệ
đáp ứng kháng thể > 80%. Các vắcxin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào Vero của
Nhật Bản đã được sử dụng rộng rãi tại Nhật Bản và nhiều nước khác.
1.2.3. Tế bào Vero trong ứng dụng sản xuất vắcxin
Dòng tế bào thường trực Vero được thiết lập từ năm 1962 do hai tác giả

người Nhật Bản là Yasumura và Kawakita, có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi
trưởng thành, tế bào này được giữ dưới dạng tế bào gốc MCB đời P122. Sau đó
dưới sự điều hành của TCYTTG, hệ thống tế bào (WHO seed lot) có mã số CCL81.
Mỹ giữ quyền kinh doanh tế bào Vero CCL81 đời 123 coi như ngân hàng tế bào của
Mỹ, tiếp tục nhân truyền đến đời 131 thì thiết lập ngân hàng tế bào sản xuất (WCB).
Tế bào Vero rất an toàn và giá thành thấp hơn so với tế bào lưỡng bội người
hay tế bào thận khỉ tiên phát. Dòng tế bào Vero đã được nghiên cứu và chứng minh:
an toàn và tinh khiết, không gây u bướu, không biến đổi gen qua nhiều đời cấy
chuyển đến WCB. Các mẫu thử MCB và WCB đều đạt tất cả các yêu cầu: vô trùng,
Mycoplasma âm tính, mẫu kiểm tra trên kính hiển vi điện tử không quan sát thấy
thành phần giống virút, thử nghiệm in vitro khơng chứng minh có nhiễm với virút,
8


khơng phát hiện các mầm bệnh từ bị, khơng phát hiện thấy Porcin Parvovirút,
không phát hiện tạo u đến đời cấy chuyển 169, xác định nguồn gốc từ thận khỉ xanh
Phi châu.
Tại Việt Nam, cơng ty VABIOTECH đã mua dịng tế bào Vero CCL81 của
TCYTTG để thiết lập Hệ thống Ngân hàng tế bào Vero của VABIOTECH (Ngân
hàng tế bào gốc và Ngân hàng tế bào sản xuất) dùng cho sản xuất vắcxin. Vắcxin
VNNB bất hoạt trên tế bào Vero đã được nghiên cứu sản xuất thành công tại
VABIOTECH và đang thực địa thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2.
Tế bào Vero mà VABIOTECH mua về đã được kiểm tra chất lượng đầy đủ
các thử nghiệm an toàn đối với dòng tế bào thường trực. Tuy nhiên, trước khi đưa
vào sản xuất thì tế bào Vero phải được kiểm tra và phải đạt yêu cầu đối với các thử
nghiệm sau: thử nghiệm kiểm tra vô khuẩn kiểm tra Mycoplasma, kiểm tra virút hấp
phụ hồng cầu và kiểm tra virút ngoại lai.
- Kiểm tra vơ khuẩn: Khơng có sự phát triển của nấm và vi khuẩn.
- Kiểm tra virút hấp phụ hồng cầu: Khơng có virút hấp phụ hồng cầu.
- Kiểm tra Mycoplasma: Khơng có sự phát triển của Mycoplasma.

- Kiểm tra virút ngoại lai: Khơng có hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế

bào trên các dòng tế bào khác nhau.
1.3. Quy trình sản xuất vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế
bào Vero (JECEVAX) tại VABIOTECH
Quy trình sản xuất và kiểm định vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất
trên tế bào Vero được tóm tắt theo sơ đồ sau:
Quy trình Sản xuất

Kiểm định

Tế bào Vero kín 1 lớp
Rửa tế bào Vero bằng Hank’s 2 lần
Cấy hỗn dịch virút 104 PFU/ml
Hấp phụ 36,5 ± 0,5oC, 50-60 phút

9


Hút cạn dịch virút
Cho mơi trường duy trì TCM 199

Chuẩn độ hiệu giá virút trước bất hoạt

Gặt nước nổi nhiều lần

Kiểm tra vô khuẩn trước bất hoạt

Bất hoạt formalin 2-8oC, 30 ngày
Kiểm tra bất hoạt

BTP thô đã bất hoạt
Ly tâm loại xác tế bào
Cô đặc qua màng Pellicon casette

Tủa bằng Protamin sulfate
Ly tâm thu nước nổi
Siêu ly tâm trong đệm sucrose

Thẩm tích loại sucrose
Tính chất vật lý
Xác định pH
Hàm lượng Formaldehyde
Hàm lượng Thimerosal
Hàm lượng Protein
Vô khuẩn
Bất hoạt
Chất gây sốt
Hàm lượng kháng ngun virút

Thu hoạch sau thẩm tích

Lọc vơ trùng

Bán thành phẩm tinh khiết

Tính chất vật lý
Xác định pH
Thử nghiệm vơ khuẩn

Pha bán thành phẩm cuối cùng
Đóng lọ:
- 1 ml/lọ

10


Dán nhãn, đóng hộp

Tính chất vật lý
Soi vắcxin
Kiểm tra thể tích đóng ống
pH
Vắcxin thànhphẩm
Hàm lượng Thimerosal
Hàm lượng Formaldehyde
Hàm lượng Protein
Hàm lượng ADN tồn dư
Vơ khuẩn
An tồn chung trên chuột lang
An tồn chung trên chuột nhắt
An tồn đặc hiệu
Chất gây sốt
Cơng hiệu
1.4. Căn cứ và cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cở sở trong kiểm định chất lƣợng
vắcxin JECEVAX
1.4.1. Yêu cầu chung
Trong sản xuất vắcxin, kiểm tra chất lượng vắcxin là rất quan trọng bởi vì
vắcxin là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật sống có cấu trúc phân tử phức tạp,
dễ bị biến tính bởi nhiệt độ, thời gian. Và cùng một lúc nó được dùng cho nhiều

người khỏe mạnh nên nếu vắcxin không đạt yêu cầu về chất lượng sẽ ảnh hưởng
thậm chí để lại hậu quả vô cùng tai hại cho hàng triệu người. Việc kiểm tra đánh giá
chất lượng vắcxin phải được thực hiện trong từng loạt sản phẩm ở từng công đoạn
(từ nguyên liệu đầu đến thành phẩm).
Để đảm bảo chất lượng vắcxin cần nghiêm túc thực hiện và giám sát, kiểm
định nguyên liệu đầu, giám sát quy trình sản xuất trong từng cơng đoạn và tuân theo
thực hành sản xuất tốt (GMP). Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắcxin địi hỏi tính
khách quan và chính xác trung thực của người thực hiện, phải có tay nghề và trình
độ chun mơn. Phải tn thủ chặt chẽ các quy trình, các kỹ thuật phương pháp của
TCYTTG, DĐVN và NICVB quy định, nhằm đảm bảo độ chính xác cao.
Chất lượng của vắcxin thành phẩm được đánh giá ở các khâu: phịng thí
nghiệm, thử nghiệm lâm sàng, thực địa [9].

11


- Đánh giá phịng thí nghiệm: rất quan trọng, bao gồm các thử nghiệm định
lượng các thành phần hoá học và tính an tồn, cơng hiệu. Các thử nghiệm này được
thực hiện theo thường quy thống nhất toàn cầu hoặc trong một quốc gia.
- Đánh giá lâm sàng là yêu cầu bắt buộc đối với một loại vắcxin mới và được
thực hiện với hai nội dung chính là an tồn và đáp ứng miễn dịch.
- Đánh giá thực địa là xác định hiệu quả bảo vệ của vắcxin thể hiện bằng khả
năng bảo vệ trong cộng đồng đã được gây miễn dịch để kháng lại tác nhân gây bệnh.
Trong phạm vi luận án này, chúng tôi đánh giá vắcxin tại phịng thí
nghiệm về thành phần hóa học, tính an tồn và công hiệu của vắcxin viêm não Nhật
Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero được sản xuất tại VABIOTECH
(JECEVAX) ở các giai đoạn: Bán thành phẩm thô, bán thành phẩm tinh khiết, bán
thành phẩm cuối cùng và thành phẩm.
1.4.2. Căn cứ và cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin
JECEVAX

Thành phần hóa học, tính an tồn và cơng hiệu là những yếu tố quyết định
đồng thời về chất lượng của một loạt vắcxin. Nếu loạt vắcxin không đạt một trong
những yếu tố trên thì khơng được phép xuất xưởng. Là sản phẩm dùng cho người
và không phải cho 1 cá thể mà dùng cho hàng loạt người trong cộng đồng, đặc biệt
là trẻ em. Vì vậy phải đảm bảo tuyệt đối an tồn.
Mỗi loại vắcxin đều có u cầu, quy trình sản xuất khác nhau, vì vậy việc xây
dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định về hóa học, tính an tồn và công hiệu là rất
thiết thực và quan trọng để đáp ứng yêu cầu và điều kiện của mỗi loại vắcxin.
Chúng tôi căn cứ theo những tiêu chuẩn sau đây để xây dựng tiêu chuẩn cho
vắcxin JECEVAX:
- Tiêu chuẩn của TCYTTG cho vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên tế bào

(TRS-963, Annex 1) [30].
- Tiêu chuẩn của DĐVN 4 áp dụng cho vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên

não chuột [1].
- Tiêu chuẩn cơ sở của vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên não chuột

(JEVAX®).
12


1.4.2.1. Kiểm tra thành phần hóa học
 Giai đoạn vắcxin BTP tinh khiết
- Kiểm tra tính chất vật lý: trải qua quá trình tinh chế, vắcxin ở giai đoạn tinh

khiết cần phải có màu sắc, trạng thái đặc trưng. Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép
là “Dung dịch trong, có màu vàng nhạt”. DĐVN 4 và TCYTTG không quy định cho
tiêu chuẩn này.
- Kiểm tra pH: cần có pH giống như của máu trong cơ thể người. Tuy nhiên, do

những lý do ổn định của các thành phần kháng nguyên có trong vắcxin, pH có thể
điều chỉnh cho phù hợp. Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “6,8 - 7,4”. DĐVN 4
và TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này.
- Kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde: JECEVAX dùng formaldehyde để bất

hoạt virút, trải qua quá trình tinh chế cũng đã loại bỏ được hầu hết formaldehyde.
Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “≤ 0,01 % w/v”. DĐVN 4 không quy định cho
tiêu chuẩn này. TCYTTG khuyến cáo theo cơ quan quản lý quốc gia.
- Kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal: Thimerosal là hợp chất hữu cơ có chứa thủy

ngân, thường được dùng làm chất bảo quản. Dạng thủy ngân trong thimerosal
không phải là loại gây nên ngộ độc vì đã thủy phân trong nước khơng cịn ở dạng tự
do để phản ứng trong cơ thể người. Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “≤ 0,012
% w/v”. DĐVN 4 không quy định cho tiêu chuẩn này. TCYTTG khuyến cáo theo
cơ quan quản lý quốc gia.
- Kiểm tra hàm lƣợng Protein: Protein trong vắcxin tinh khiết chính là kháng

nguyên đặc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch. Các protein này có nguồn gốc là
vi sinh vật gây bệnh vì thế nó phải làm mất hoặc làm giảm hoạt tính. Tiêu chuẩn của
JEVAX® khơng áp dụng tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này. DĐVN 4 không khuyến cáo
tiêu chuẩn cho tiêu chí này. TCYTTG khơng quy định tiêu chuẩn.
 Giai đoạn vắcxin BTP cuối cùng
-

Kiểm tra tính chất vật lý: nhận biết được màu sắc, trạng thái đặc trưng của

dung dịch. Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “Dung dịch trong, không màu”.
DĐVN 4 và TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này.

13


-

Kiểm tra pH: độ pH trung tính tương đồng với pH trong cơ thể để không thể

xảy ra các phản ứng ngồi ý muốn, đảm bảo vắcxin có độ an tồn cao. Tiêu chuẩn
của JEVAX® cho phép là “6,8 - 7,4”. DĐVN 4 và TCYTTG không quy định cho
tiêu chuẩn này.
 Giai đoạn vắcxin thành phẩm
-

Kiểm tra tính chất vật lý: kiểm tra bằng mắt để nhận biết được màu sắc, trạng

thái đặc trưng của dung dịch. Tiêu chuẩn của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là
“Dung dịch trong, khơng màu”. TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này.
-

Soi vắcxin: mỗi loạt vắcxin phải kiểm tra bằng mắt thường để đàm bảo vắcxin

khơng có dấu hiệu bất thường như dị vật (nếu có) trong dung dịch vắcxin. Tiêu
chuẩn của JEVAX®, DĐVN 4 và TCYTTG đều là “Khơng có dị vật”.
-

Kiểm tra thể tích đóng lọ: để xác định thể tích đóng lọ thực có đủ như thể tích

đóng lọ quy định. Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “Thể tích vắcxin đóng trong
1 lọ khơng được nhỏ hơn thể tích công bố trên nhãn”. DĐVN 4 và TCYTTG không
khuyến cáo cho tiêu chuẩn này.

-

Kiểm tra pH: pH phải trung tính tương đồng với pH trong cơ thể để không thể

xảy ra các phản ứng ngoài ý muốn, đảm bảo vắcxin có độ an tồn cao. Tiêu chuẩn
của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là “6,8 - 7,4”. TCYTTG khuyến cáo theo tiêu
chuẩn của cơ quan quản lý quốc gia.
-

Kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde: Formaldehyde là hóa chất có tác dụng

làm bất hoạt virút và làm bền vững kháng nguyên. Tiêu chuẩn của JEVAX®,
DĐVN 4, TCYTTG cho phép là “≤ 0,01 % w/v”.
-

Kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal: Thimerosal là hợp chất hữu cơ có chứa thủy

ngân, thường được dùng làm chất bảo quản. Dạng thủy ngân trong thimerosal
không phải là loại gây độc vì đã thủy phân trong nước khơng cịn ở dạng tự do để
phản ứng trong cơ thể người. Vắcxin chứa thimerosal là an toàn với người sử dụng
với hàm lượng thấp [9]. Tiêu chuẩn của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là “≤ 0,012
% w/v”. TCYTTG khuyến cáo theo cơ quan quản lý quốc gia.
-

Kiểm tra hàm lƣợng Protein: Protein trong vắcxin tinh khiết chính là kháng

nguyên đặc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch. Các protein có cấu trúc phân tử
14

phức tạp, dễ dàng bị biến tính do nhiệt độ và thời gian vì thế nó cần được kiểm tra
một cách nghiêm túc đối với từng loạt. Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN 4 cho
phép là “≤ 80g/ml” và theo khuyến cáo của TCYTTG là theo tiêu chuẩn của cơ
quan quản lý quốc gia.
-

Kiểm tra hàm lƣợng ADN tồn dƣ: Vắcxin VNNB sản xuất trên tế bào Vero

cần được xác định ADN tồn dư, TCYTTG quy định lượng ADN tồn dư phải < 10
ng/ liều. Trong quá trình tinh chế cần phải loại bỏ AND của tế bào Vero. Tiêu chuẩn
của TCYTTG cho phép là “< 10 ng/ liều”.
1.4.2.2. Kiểm tra tính an tồn và cơng hiệu
 Giai đoạn vắcxin BTP thô
-

Kiểm tra vô khuẩn: Đây là thử nghiệm quan trọng được TCYTTG khuyến cáo

để kiểm soát chất lượng vắcxin nhằm phát hiện tác nhân ngoại lai là các vi sinh vật
sống nhiễm vào sản phẩm. Kiểm tra vô khuẩn phải được thực hiện ở nhiều giai đoạn
trong quá trình sản xuất. Ở giai đoạn BTP thơ tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN 4,
TCYTTG, đều u cầu “Khơng có sự phát triển của nấm và vi khuẩn sau 14 ngày
theo dõi”.
-

Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB: hiệu giá virút VNNB được xác định bằng

phương pháp tạo đám hoại tử PFU. Hiệu giá được sử dụng như 1 chỉ số theo dõi
tính ổn định của quy trình sản xuất. Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “Hiệu giá
virút trong bán thành phẩm thô ≥ 107 PFU/ml”, hiệu giá gây nhiễm là 107 PFU/ml.
TCYTTG và DĐVN 4 khuyến cáo nhà sản xuất thiết lập tiêu chuẩn này.

-

Kiểm tra bất hoạt: Ở giai đoạn sản xuất vắcxin BTP thô, vắcxin sẽ được bất

hoạt bằng formaldehyde và sau khi bất hoạt phải kiểm tra bất hoạt để xác định virút
VNNB đã được bất hoạt, khơng có khả năng gây bệnh. Kiểm tra bất hoạt được thực
hiện ngay sau khi kết thúc bất hoạt. Tiêu chuẩn của JEVAX® là “100% chuột phải
sống khỏe mạnh, khơng liệt, khơng có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi”.
DĐVN4 và TCYTTG không khuyến cáo cho tiêu chuẩn này.
 Giai đoạn vắcxin BTP tinh khiết
-

Kiểm tra vô khuẩn: Kiểm tra vô khuẩn cũng cần phải được thực hiện ở giai

đoạn này trong q trình sản xuất. Vắcxin phải khơng có tạp khuẩn hoặc nấm phát
15