PHÂN TÍCH KIỂU GENE CHỐNG CHỊU NHIỆT ATP1A1 VÀ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG LÊN SẢN LƯỢNG SỮA TRÊN BÒ SỮA TẠI TRẠI TRÌNH DIỄN VÀ THỰC NGHIỆM CHĂN NUÔI BÒ SỮA CÔNG NGHỆ ISRAEL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NI - THÚ Y
--------

TIỂU LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN TÍCH KIỂU GENE CHỐNG CHỊU NHIỆT ATP1A1 VÀ
MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG LÊN SẢN LƯỢNG SỮA
TRÊN BÒ SỮA TẠI TRẠI TRÌNH DIỄN VÀ THỰC NGHIỆM
CHĂN NI BỊ SỮA CƠNG NGHỆ ISRAEL

Sinh viên thực thực hiện

: LÙ HỒNG PHẮN

Lớp

: DH15TY

Ngành

: BÁC SĨ THÚ Y

Niên khóa

: 2015 – 2020

Tháng 10/2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NI - THÚ Y
--------

LÙ HỒNG PHẮN

PHÂN TÍCH KIỂU GENE CHỐNG CHỊU NHIỆT ATP1A1 VÀ
MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG LÊN SẢN LƯỢNG SỮA
TRÊN BÒ SỮA TẠI TRẠI TRÌNH DIỄN VÀ THỰC NGHIỆM
CHĂN NI BỊ SỮA CƠNG NGHỆ ISRAEL
(Tiểu luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y)

Giáo viên hướng dẫn
TS. BÙI THỊ TRÀ MI

Tháng 10/2020

2


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên sinh viên thực tập: LÙ HỒNG PHẮN
Lớp: DH15TY
Tên tiểu luận: “PHÂN TÍCH KIỂU GENE CHỐNG CHỊU NHIỆT
ATP1A1 VÀ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG LÊN SẢN LƯỢNG SỮA TRÊN BỊ
SỮA TẠI TRẠI TRÌNH DIỄN VÀ THỰC NGHIỆM CHĂN NI BỊ SỮA
CƠNG NGHỆ CAO ISAREL”
Đã hoàn thành tiểu luận theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các
quy định của khoa Chăn Nuôi – Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
TP. Hồ Chí Minh, ngày ... tháng 10 năm 2020

Giáo viên hướng dẫn

TS. BÙI THỊ TRÀ MI

3


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến
ba mẹ và những người thân trong gia đình, người đã nuôi nấng, dạy dỗ, yêu thương
dõi theo từng ngày và ln dành cho con những tình cảm tốt đẹp nhất.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm TP. Hồ
Chí Minh cùng tồn thể q thầy cô Khoa Chăn nuôi Thú Y Trường Đại Học Nơng
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS. BÙI THỊ TRÀ MI đã tận tình
giúp đỡ em hồn thành tốt bài tiểu luận này và chỉ dạy cho em nhiều điều từ chuyên
môn cho đến những kinh nghiệm trong công việc.
Gửi lời cám ơn chân thành đến tồn thể anh chị trong phịng xét nghiệm
chẩn đoán bệnh thú y Hàn Việt và trung tâm quản lý kiểm định giống cây trồng - vật
nuôi Tp. HCM đã tạo điều kiện và giúp đỡ, chỉ dạy và truyền đạt những kiến thức,
kinh nghiệm quý báu trong suốt q trình hồn thành tiểu luận này.
Gửi lời cám ơn đến Thầy chủ nhiệm và tập thể lớp DH15TY đã động viên
chia sẻ cùng tôi trong suốt thời gian học tập và sinh hoạt tại trường.
Cám ơn anh Phạm Hồng Minh và bạn Nguyễn Thanh Ngân trong nhóm đề
tài đã giúp đỡ và đồng hành sát cánh cùng tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Xin cám ơn !
Sinh viên thực hiện

LÙ HỒNG PHẮN

4


TÓM TẮT
ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1 gene (ATP1A1) một trong
những gene quan trọng được phát hiện có khả năng kiểm sốt stress nhiệt trên bị
sữa. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy gene ATP1A1 có ảnh hưởng đến khả
năng chống chịu nhiệt, tần số hô hấp, năng suất sữa,...Để tiếp tục nghiên cứu về vấn
đề này đề tài: “ Phân tích kiểu gene chống chịu nhiệt ATP1A1 và mức độ ảnh hưởng
lên sản lượng sữa trên bò sữa tại trại trình diễn và thực nghiệm chăn ni bị sữa
cơng nghệ cao Israel ” được tiến hành từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 03 năm
2020 tại Trại trình diễn và thực nghiệm chăn ni bị sữa cơng nghệ cao Israel tại
huyện Bình Chánh và phịng xét nghiệm chẩn đoán bệnh thú y Hàn Việt tại trường
Đại học Nông Lâm Tp. HCM tên bác ghi full đi chị. Mục đích việc ứng dụng kĩ
thuật PCR nhằm xác định sự hiện diện của gene ATP1A1, phân tích mối liên quan
của gene ATP1A1 lên nhiệt độ trực tràng, sản lượng sữa để cung cấp dữ liệu có thể
giúp ích cho cơng tác chọn lọc và cải tạo giống bị sữa được nuôi tại trại.
Các kiểu gene của gene ATP1A1 được tìm thấy trong 97 mẫu máu bị là kiểu
gene CC chiếm 57%, kiểu gene CA chiếm 40% và kiểu gene AA là 3%. Chỉ số nhiệt
độ - ẩm độ (THI) ở mức cao > 79, đặc biệt là vào buổi trưa (82,5). Do một số điều
kiện khách quan nên khi phân tích sự ảnh hưởng của kiểu gene lên nhiệt độ trực
tràng cho thấy kết quả khác biệt khơng có ý nghĩa tuy nhiên cũng cho thấy kiểu
gene CC (38,78) có nhiệt độ trực tràng thấp hơn so với nhiệt độ trực tràng của kiểu
gene CA (38,98) dự đoán kiểu gene AA sẽ có nhiệt độ trực tràng cao hơn so với hai
kiểu gene CC và CA. Tuy khác biệt khơng có ý nghĩa giữa sản lượng sữa của kiểu
gene CC và kiểu gene CA nhưng dựa theo kết quả của (Liu và cs, 2011) có thể dự
đốn kiểu gene CC sẽ cho sản lượng sữa cao hơn so với kiểu gene CA và AA.

5

MỤC LỤC
Trang tựa.................................................................................................................... i
Xác nhận của giáo viên hướng dẫn...........................................................................ii
Lời cảm ơn...............................................................................................................iii
Tóm tắt..................................................................................................................... iv
Mục lục.....................................................................................................................v
Danh sách các chữ viết tắt......................................................................................viii
Danh sách các bảng..................................................................................................ix
Danh sách các hình....................................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề............................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu.............................................................................................2
1.2.1 Mục tiêu...........................................................................................................2
1.2.2 Yêu cầu............................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN.........................................................................................3
2.1 Giới thiệu sơ lược về trang trại............................................................................3
2.1.1 Lịch sử hình thành............................................................................................3
2.1.2 Vị trí địa lí và điều kiện tự nhiên......................................................................3
2.1.3 Quy mơ trang trại..............................................................................................3
2.1.4 Nhân sự............................................................................................................4
2.1.5 Cơ cấu đàn và giống.........................................................................................5
2.1.6 Quy trình phịng bệnh của trại..........................................................................6
2.1.7 Quy trình làm mát của trại................................................................................6
2.1.8 Quy trình vắt sữa..............................................................................................7
2.2 Stress nhiệt và ảnh hưởng của stress nhiệt lên sức sản xuất sữa của bò sữa........7
2.2.1 Stress nhiệt.......................................................................................................7
2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng của stress nhiệt....................8
2.2.3 Ảnh hưởng của stress nhiệt đối với bò sữa.......................................................8
2.2.4 Các biện pháp làm giảm tác động của stress nhiệt lên bò sữa...........................9

2.3 Tổng quan về gene ATP1A1..............................................................................10
2.3.1 Giới thiệu gene ATP1A1.................................................................................10

6


2.3.2 Một số nghiên cứu ảnh hưởng của gene ATP1A1 lên stress nhiệt ở bò...........10
2.4 Kĩ thuật sử dụng trong phân tích gene...............................................................11
2.4.1 Kĩ thuật ly trích DNA.....................................................................................11
2.4.1.1 Nguyên tắc...................................................................................................11
2.4.1.2 Quy trình......................................................................................................11
2.4.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di.....................................................12
2.4.3 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction)..................12
2.4.3.1 Nguyên tắc...................................................................................................12
2.4.3.2 Quy trình nhiệt.............................................................................................13
2.4.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR...................................................................14
2.4.4 Kĩ thuật giải trình tự (DNA sequencing).........................................................15
2.4.4.1 Khái niệm....................................................................................................15
2.4.4.2 Ứng dụng.....................................................................................................16
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................17
3.1 Thời gian và địa điểm........................................................................................17
3.1.1 Thời gian........................................................................................................17
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu.......................................................................................17
3.2 Đối tượng nghiên cứu........................................................................................17
3.3 Nội dung nghiên cứu.........................................................................................17
3.4 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................17
3.4.1 Thiết bị và dụng cụ.........................................................................................17
3.4.2 Hóa chất sử dụng............................................................................................18
3.5 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................18
3.5.1 Tách chiết DNA và khuếch đại gene ATP1A1................................................18

3.5.1.1 Thu thập mẫu...............................................................................................18
3.5.1.2 Ly trích DNA...............................................................................................18
3.5.1.3 Phản ứng PCR.............................................................................................19
3.5.1.4 Điện di sản phẩm PCR.................................................................................21
3.5.2 Giải trình tự và xác định kiểu gen...................................................................21
3.5.2.1 Giải trình tự.................................................................................................21
3.5.2.2 Xác định kiểu gene......................................................................................21
3.5.3 Thu thập số liệu liên quan...............................................................................21
3.5.4 Các chỉ tiêu khảo sát.......................................................................................22
7


3.5.4.1 Tỷ lệ thành cơng của quy trình khuếch đại gen ATP1A1.............................22
3.5.4.2 Tỷ lệ thành cơng khi giải trình tự và tần số xuất hiện các kiểu gen của gen
ATP1A1................................................................................................................... 22
3.5.4.3 Ảnh hưởng của kiểu gene đến khả năng sản xuất sữa..................................23
3.5.4.4 Ảnh hưởng của kiểu gene đối với chỉ số nhiệt độ – độ ẩm THI (Temperature
Humidity Index)......................................................................................................23
3.5.4.5 Nhiệt độ trực tràng.......................................................................................23
3.5.5 Xử lý số liệu...................................................................................................23
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................24
4.1 Tỷ lệ thành cơng của quy trình ly trích và khuếch đại gene ATP1A1.................24
4.2 Kết quả phân tích kiểu gene ATP1A1................................................................26
4.3 Chỉ số nhiệt độ – ẩm độ THI.............................................................................27
4.4 Ảnh hưởng của kiểu gene lên nhiệt độ trực tràng..............................................28
4.5 Ảnh hưởng của kiểu gene lên sản lượng sữa.....................................................29
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................................32
5.1 Kết luận.............................................................................................................32
5.2 Đề nghị..............................................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................33

PHỤ LỤC............................................................................................................... 37

8


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ đầy đủ

Nghĩa tiếng việt

ATSH
DDEF

An tồn sinh học
Dairy Demonstrating and

Trại trình diễn và chăn

Experimental Farm

ni bị sữa cơng nghệ
cao

DNA
EDTA
mRNA
PCR

Deoxyribo nucleic acid
Ethylene Diamin Tetraacetic Acid
Messenger ribonucleic acid
Polymerase Chain Reaction

SNP
SSCP

Single nucleotide polymorphisms
Single Stranded Conformation

TBE

Polymorphism
Tris Borate EDTA

Chất chống đơng máu
RNA thơng tin
Phản ứng khuyếch đại
gene
Đa hình đơn nucleotide

Dung dịch đệm

DANH SÁCH CÁC BẢNG

9


Bảng 2.1 Cơ cấu đàn...................................................................................................5

Bảng 3.1 Trình tự cặp Primer cho phản ứng PCR....................................................19
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR........................................................................20
Bảng 3.3 Quy trình nhiệt PCR..................................................................................20
Bảng 4.1 Tỉ lệ thành cơng của các mẫu qua các lần thực hiện.................................25
Bảng 4.2 Tần số kiểu gen và tần số alen của gene ATP1A1.....................................27
Bảng 4.3 Chỉ số nhiệt độ - ẩm độ, THI.....................................................................27
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ trực tràng lên kiểu gene ATP1A1.......................28
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của kiểu gene lên sản lượng sữa.............................................29

10


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí tổng thể trại DDEF..................................................................4
Hình 2.2 Quy trình phản ứng PCR...........................................................................13
Hình 4.1 Kết quả điện di gene ATP1A1....................................................................25
Hình 4.3 Trình tự kiểu gene CA của gene ATP1A1..................................................26
Hình 4.3 Trình tự kiểu gene CC của gene ATP1A1..................................................26
Hình 4.3 Trình tự kiểu gene AA của gene ATP1A1..................................................27

11


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành chăn ni bị sữa ở Việt Nam đã và đang phát triển mạnh ở nhiều địa
phương. Năm 2017 tổng số đàn bò đạt 290,023 con, tăng 10,3 (có cách giữa số và
đơn vị) %, sản lượng sữa đạt 881,270 tấn tăng hơn 11 % so với năm 2016. Tính đến

tháng 10 năm 2018 tổng số đàn bò sữa đạt 294,382 con, tăng 1,1 % và sản lượng
sữa đạt 936,003 tấn tăng hơn 1,1 % so với năm 2017 (Tổng cục thống kê, 2019).
Theo Tổng cục thống kê Việt Nam, dự kiến đến năm 2020 tổng đàn bò sữa đạt
405,000 con và sản lượng sữa đạt trên 1 triệu tấn. Sữa bò tại Việt Nam đã được xuất
khẩu đến 46 quốc gia và vùng lãnh thổ trong đó thị trường các nước Trung Đơng
chiếm đến 70 % so với các thị trường xuất khẩu còn lại. Theo số liệu của Tổng cục
Hải quan trong 7 tháng đầu năm 2019, kim ngạch xuất khẩu sữa đạt 149,18 triệu
USD tăng 24,09 % so với cùng kì năm 2018.
Bên cạnh những thành tựu đạt được, ngành chăn nuôi bị sữa ở Việt Nam cịn
gặp nhiều khó khăn. Khó khăn lớn nhất là chăn ni bị sữa trong điều kiện khí hậu
nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm vào mùa hè. Khi nhiệt độ môi trường thay đổi cơ thể vật
ni sẽ bắt đầu q trình điều hịa thân nhiệt để duy trì thân nhiệt ổn định.
Đối với bị sữa cái thân nhiệt trung bình là 38,6°C, biến thiên trong khoảng
38°C – 39,3°C (Bengtsson và Whitaker, 1998). Nếu nhiệt độ môi trường tăng cao
làm thân nhiệt của cơ thể tăng cao sẽ dẫn đến hiện tượng stress nhiệt. Stress nhiệt
gây ảnh hưởng đến năng suất sinh sản trên bò sữa: thời gian lên giống và mức độ
động dục giảm; tỉ lệ đậu thai thấp; nguy cơ sẩy thai tăng; phôi phát triển chậm và
kích thước thai nhỏ (Jones và Stalling, 1999; Chase, 2006). Ngồi ra, khi bị sữa bị
stress nhiệt, năng suất sữa sẽ giảm từ 10 % đến > 25 % (Chase, 2006) và có thể
12


giảm 12 % ở chu kỳ cho sữa tiếp theo (Jone và Stalling, 1999), hàm lượng các chất
trong sữa cũng thay đổi.
Các yếu tố khác như: tuổi tác, màu lông, năng suất, di truyền,... khi tương tác
với các yếu tố mơi trường: nhiệt độ, ẩm độ,...gây nên tình trạng stress nhiệt trầm
trọng.
Để giảm stress nhiệt trên bò các biện pháp thường được áp dụng như: cung
cấp nước sạch và mát đầy đủ cho bò, cho ăn các thức ăn dễ tiêu hóa, tăng cường hệ
thống quạt thơng gió,...được áp dụng. Bên cạnh đó, việc áp dụng các kỹ thuật ứng

dụng trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học đã góp phần giúp cho việc tìm hiểu, phân
tích và chọn lọc các gene, kiểu gene có liên quan đến stress nhiệt của thú ni một
cách dễ dàng, nhanh chóng hơn. ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1
gene (ATP1A1) một trong những gene quan trọng được phát hiện có khả năng kiểm
sốt stress nhiệt trên bò sữa (Sonna và cs, 2002). Được sự cho phép của khoa Chăn
nuôi - Thú y, Đại học Nông Lâm Tp.HCM, bộ môn Giống động vật và sự hướng
dẫn của TS. Bùi Thị Trà Mi, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Phân tích kiểu
gene chống chịu nhiệt ATP1A1 và mức độ ảnh hưởng lên sản lượng sữa trên bị
sữa tại trại trình diễn và thực nghiệm chăn ni bị sữa cơng nghệ cao Israel ”
nhằm tìm hiểu về kiểu gene chống chịu nhiệt và cung cấp dữ liệu có thể giúp ích
cho cơng tác chọn lọc và cải tạo giống bị sữa được ni tại trại.
1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Cung cấp dữ liệu về kiểu gene của gene ATP1A1 và mức ảnh hưởng của kiểu
gene lên khả năng sản xuất sữa của bò sữa ni tại trại trình diễn và thực nghiệm
chăn ni bị sữa cơng nghệ cao Israel để làm cơ sở cho việc chọn lọc, nâng cao
phẩm chất con giống đáp ứng cho nhu cầu chăn nuôi hiện nay.
1.2.2 Yêu cầu
Xác định quy trình phát hiện các kiểu gene ATP1A1, đồng thời đánh giá mức
độ ảnh hưởng của từng kiểu gene lên sức sản xuất sữa trên các bò lai F1.

13


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu sơ lược về trang trại
2.1.1 Lịch sử hình thành
Trại trình diễn và thực nghiệm chăn ni bị sữa cơng nghệ cao (DDEF)
thuộc Trung tâm Quản lý và Kiểm định giống cây trồng vật nuôi được khánh thành

vào ngày 27 tháng 8 năm 2013. Đây là dự án hợp tác giữa Cơ quan Hợp tác Phát
triển quốc tế (MASHAV) của Isarel và Sở Nông nghiệp và Phát triển Nơng thơn
TP.HCM.
Trại DDEF hình thành với nhiệm vụ xây dựng mơ hình chăn ni bị sữa đạt
năng suất và chất lượng sữa cao trên nền các con giống địa phương đồng thời
chuyển giao khoa học công nghệ hiện đại cho các hộ chăn ni địa phương.
2.1.2 Vị trí địa lí và điều kiện tự nhiên
Trại DDEF nằm tại số 4A181 đường Thanh niên, ấp 4 xã Phạm Văn Hai,
huyện Bình Chánh, TP.HCM về phía Tây Bắc của huyện Bình Chánh. Mang đặc
điểm khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, mùa mưa từ tháng 5 - tháng 11, mùa khô từ
tháng 12 - tháng 4 năm sau, lượng mưa trung bình năm: 1,979 mm. Nhiệt độ trung
bình 29,5°C, độ ẩm cao nhất trung bình đạt 94,6%.
Địa hình trũng thấp, đầm lầy nhiều kênh rạch thích hợp phát triển nơng
nghiệp.
2.1.3 Quy mô trang trại
Trại DDEF được xây dựng trên tổng diện tích 9,8 hecta trong đó diện tích
chuồng trại là 3,8 hecta và 6 hecta là diện tích đồng cỏ. Chuồng trại được thiết kế
theo mơ hình trang trại của Isarel.

14


Diện tích chuồng trại bao gồm: khu chuồng ni, khu điều trị, khu vắt sữa,
khu chứa thức ăn, khu ủ thức ăn, khu thức ăn và khu xử lí nước.
Diện tích đồng cỏ trồng các loại cỏ VA06, VA tím, Paspalum, Mulato II,...

4

8

3
7

2
5
1
9

10

6

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí tổng thể trại DDEF

Chú thích (mấy cái số in đậm)
1: Cây xanh – thảm cỏ

5: Khu chứa thức ăn

9: Đài nước

2: Khu sữa

6: Khu thức ăn

10: Hố sát trùng

3: Khu điều trị

7: Khu ử thức ăn

4: Khu chuồng ni

8: Khu xử lí nước

2.1.4 Nhân sự
Trại có tổng cộng 21 người và được phân cơng nhiệm vụ rõ ràng. Trong đó:
Trưởng trại (1 người): chịu trách nhiệm quản lý tồn bộ cơng việc của trại. Phó trại
(1 người): hỗ trợ trưởng trại trong công tác quản lý và hoạt động của trại. Tổ thú y

15


(4 người): tham gia công tác theo dõi sức khỏe đàn bị, phịng ngừa, phối giống,
chẩn đốn và điều trị bệnh. Tổ dinh dưỡng (3 người): xây dựng khẩu phần thức ăn
dựa vào phần mềm PC Dairy theo lứa tuổi, tình trạng khai thác sữa và nguồn thức
ăn sẵn có. Tổ thông tin (2 người): nhập các số liệu liên quan đến đàn bị và thơng
báo cho tổ thú y kiểm tra đàn bị khi hệ thống phát tín hiệu bất thường. Công nhân
(10 người): làm việc tại các khu vực khác nhau như: vắt sữa, chăm sóc bê, chăm sóc
cỏ, phối trộn thức ăn,... đầu đoạn mới để first line
2.1.5 Cơ cấu đàn và giống
Đàn bò ở trại thuộc giống bò lai HF (Holstein Friesian) trên nền bò cái giống
địa phương và tinh bò đực giống HF được nhập khẩu từ Israel. Tính đến ngày 28
tháng 2 năm 2020 số lượng đàn bò sữa đã tăng lên đạt 279 con (Bảng 2.1) trên nền
120 con bò mẹ giống địa phương ban đầu. Ở trại DDEF đàn bò sữa được chia thành
8 nhóm chính giúp thuận tiện trong cơng tác quản lí đàn.
Bảng 2.1 Cơ cấu đàn
STT
1
2

3
4
5
6
7
8

Nhóm bê/bị
Bê từ 0-2 tháng
Bê từ 2-4 tháng
Bê từ 4-7 tháng
Bê từ 7-12 tháng
Bò hậu bị (từ 12 tháng đến chờ phối)
Bò hậu bị mang thai (thai dưới 220 ngày)
Bò đang khai thác sữa
Bò cạn sữa
Tổng

Số lượng (con)
7
49
15
17
36
50
92
13
279

2.1.6 Quy trình phịng bệnh của trại

Phịng bệnh bằng vaccine và thuốc trên đàn bò sữa được thực hiện đầy đủ
đặc biệt các bệnh có nguy cơ lây nhiễm trong đàn cao, các bệnh được quy định
trong luật thú y.
Bệnh Tụ huyết trùng: tiêm phòng 1 lần/năm mấy cái này gạch đầu dòng đi
Bệnh Lở mồm long móng: tiêm phịng 2 lần/năm

16


Bệnh do Leptospira: tiêm phòng 1 lần/năm
Bệnh do nội, ngoại kí sinh trùng: tiêm phịng 2 lần/năm
Ngồi ra việc phịng tránh bệnh được thực hiện qua các biện pháp: vệ sinh
sát trùng núm vú và dụng cụ sau mỗi lần vắt sữa, vệ sinh bể nước, chuồng trại và
các dụng cụ thú y trước và sau khi sử dụng.
2.1.7 Quy trình làm mát của trại
Trại DDEF áp dụng 2 phương pháp làm mát:
Làm mát gián tiếp: chuồng trại xây dựng thống mát, trang bị hệ thống các quạt
thơng gió trong chuồng và trồng cây xanh xung quanh chuồng nuôi.
Làm mát trực tiếp: kết hợp hệ thống quạt gió và hệ thống phun sương nhằm gia tăng
khả năng thải nhiệt thông qua bốc hơi nước trên bề mặt da. Một chu kỳ làm mát ở
trại gồm 1 phút phun sương nước và 4 phút quạt mát. Làm mát bằng phương pháp
này giúp thân nhiệt của bò giảm từ 0,9°C – 1,1°C. Trong 24h, bò được làm mát 5
lần tại khu vắt sữa và 5 lần tại khu vực chuồng nuôi.
Khu vực vắt sữa: Bò đang khai thác sữa được chuyển lên làm mát trong vòng 45
phút vào thời điểm trước giờ vắt sữa và thời điểm khác, sau đó bị được chuyển về
chuồng nuôi.
Lần 1: từ 5:15 – 6:00h (trước giờ vắt sữa)
Lần 2: từ 10:00 – 10:45h
Lần 3: từ 13:15 – 14:00h (trước giờ vắt sữa)
Lần 4: từ 17:00 – 17:45h

Lần 5: từ 20:15 – 21:00h (trước giờ vắt sữa)
Khu vực chuồng ni: hệ thống quạt gió và phun sương sẽ được khởi động
làm mát khi đàn bò tập trung đứng ăn trong thời gian 60 – 90 phút.
2.1.8 Quy trình vắt sữa
Bị được vắt sữa bằng hệ thống máy vắt sữa tự động với 16 máy, mỗi máy
được trang bị hệ thống cảm biến nhận biết số hiệu và sản lượng sữa của từng con
thông qua chip được gắn ở chân bò. Bò đang cho sữa được vắt 3 ca/ngày vào các
thời điểm: sáng từ 6h – 7h, chiều từ 14h – 15h và tối từ 21h – 22h. Quy trình vắt sữa

17


gồm các bước sau: mấy mục dưới quánh gạch đầu dịng ln hay dùng bulllets cho
xinh.
Chuẩn bị: Dung dịch nhúng vú đầu Apol Fist, khăn lau bầu vú, dung dịch
nhúng vú lần 2 Anti Mastit và khởi động hệ thống vắt sữa.
Vắt sữa: Sử dụng dung dịch Apol Fist để nhúng vú lần 1 và đợi trong 30
giây, sau đó dùng khăn lau khô 4 núm vú đồng thời vắt bỏ các tia sữa đầu. Chú ý
mỗi khăn dùng để lau khơ chỉ sử dụng cho 1 con bị.
Gắn máy vắt sữa vào 4 núm vú và bắt đầu vắt sữa. Máy vắt sữa sẽ tự động
tách ra khỏi 4 núm vú sau khi vắt sữa xong.
Sau khi vắt sữa: Tiếp tục nhúng vú lần 2 bằng dung dịch Anti Mastit sau khi
vắt sữa xong. Bị về chuồng ni sẽ được cho ăn để hạn chế sự tiếp xúc của bầu vú
với nền chuồng. Tách riêng để kiểm tra những con bị có bất thường về sản lượng
sữa, thành phần của sữa,...
Vệ sinh hệ thống vắt sữa và khu vực vắt sữa chuẩn bị cho ca vắt sau.
2.2 Stress nhiệt và ảnh hưởng của stress nhiệt lên sức sản xuất sữa của bò sữa
2.2.1 Stress nhiệt
Stress nhiệt xảy ra khi nhiệt độ môi trường tăng cao làm thân nhiệt tăng cao.
Q trình điều hịa thân nhiệt được diễn ra bằng cách giãn mạch máu ngoại biên để

tăng sự thải nhiệt qua da, đổ mồ hôi và thở dốc. Mất nước do q trình điều hịa
thân nhiệt có thể làm máu bị cơ đặc gây ảnh hưởng đến sự tuần hồn máu, lượng
máu đến da làm chậm quá trình thải nhiệt (Hồ Thị Kim Hoa, 2016).
Nhiệt độ môi trường cao trong một thời gian dài dẫn đến tình trạng trầm
trọng hơn các rối loạn như: giảm nồng độ K + trong máu, mất các chất điện giải
(Na+, Cl-) do tiết quá nhiều mồ hôi; giảm áp suất CO 2, pH máu thay đổi, không cân
bằng được hệ đệm carbonic acid/bicacbonate dẫn đến tình trạng kiềm huyết do tăng
nhịp thở,...Quá trình điều hịa thân nhiệt khơng cịn hiệu quả, thân nhiệt tăng cao sẽ
làm tổn thương các tế bào, mô đặc biệt là não, gan và thận có thể gây tử vong (Hồ
Thị Kim Hoa, 2016)

18


2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng của stress nhiệt
Ẩm độ tương đối của khơng khí ảnh hưởng quan trọng đến khả năng chịu
nhiệt, ẩm độ khơng khí càng thấp thì khả năng chịu nhiệt trên bò càng cao.Tương
quan giữa trọng lượng cơ thể và tỉ lệ diện tích bề mặt trên trọng lượng (A:W) ảnh
hưởng đến khả năng chịu stress nhiệt, tỉ lệ A:W càng thấp thì tỉ lệ thải nhiệt qua bề
mặt cơ thể càng khó có nguy cơ cao dẫn đến tình trạng stress nhiệt. Tình trạng miễn
dịch giảm (độ tuổi, bệnh mãn tính,...) có khả năng chịu nhiệt kém hơn. Ngồi ra cịn
các yếu tố khác như: giống, kích thước cơ thể, màu lơng, năng suất, thời kì mang
thai, sự thơng thống của chuồng ni, tốc độ gió, chiều dài khoảng thời gian stress
nhiệt,...cũng ảnh hưởng đến mức độ nghiêm trọng của stress nhiệt trên vật nuôi
(Hoff, 2013).
2.2.3 Ảnh hưởng của stress nhiệt đối với bị sữa
Stress nhiệt có thể ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, tình trạng sinh lý,
lượng thức ăn ăn vào dẫn đến giảm sản lượng sữa. Sản lượng sữa giảm 35 % do
lượng thức ăn ăn vào giảm, 65 % do tác động trực tiếp các yếu tố sinh lý liên quan
đến stress nhiệt (Rhoads và cs, 2009). Cứ sau 1°C ở nhiệt độ trên 21-27°C, sản

lượng sữa giảm khoảng 36 % được ghi nhận ở bò sữa (Rhoads và cs, 2009;
Das và cs, 2016). Giảm hấp thu chất dinh dưỡng, thay đổi chức năng dạ cỏ và
mất cân bằng nội tiết là những yếu tố khác góp phần làm giảm sản xuất sữa
trong thời gian stress nhiệt.
Trong thời kì tiết sữa, lượng nhiệt sinh ra trong q trình trao đổi chất có thể
làm giảm sức đề kháng của bị sữa với nhiệt độ mơi trường cao, dẫn đến
thay đổi thành phần sữa và giảm năng suất sữa (Chebe và cs, 2004; Hossein và
cs, 2013). Các thành phần sữa thay đổi: protein sữa, chất béo sữa, chất khơ
khơng béo (SNF) ở bị sữa (Kadzere và cs, 2002). Hơn nữa, stress nhiệt làm
giảm chất béo sữa, protein và axit béo chuỗi ngắn trong khi tăng axit
béo chuỗi dài trong sữa (Kadzere và cs, 2002; Bandaranayaka và cs, 1976).
Stress nhiệt còn gây ảnh hưởng đến năng suất sinh sản của bò cái: thời gian
lên giống và mức độ động dục giảm; tỉ lệ đậu thai thấp; nguy cơ sẩy thai tăng; phôi

19


phát triển chậm và kích thước thai nhỏ (Jones và Stalling, 1999; Chase, 2006). Ảnh
hưởng đến bầu vú, tăng nguy cơ viêm vú (Wohlgemuth và cs, 2016). Ngoài ra,
stress nhiệt còn làm thay đổi một số hormone trong việc kiểm soát việc sản xuất
sữa: prolactin, hormone tuyến giáp, glucocorticoid, hormone tăng trưởng,
hormone vỏ thượng thận, oxytocin, estrogen và progesterone (Akers và
cs,198?; Farooq và cs, 2010).
2.2.4 Các biện pháp làm giảm tác động của stress nhiệt lên bò sữa
Cung cấp đầy đủ nước sạch và mát cho bò sữa đặc trong mùa nóng, bị sau
khi vắt sữa có thể uống được lượng nước nhiều hơn lượng nước uống mỗi ngày nên
cần cho bò uống vào thời điểm này. Khu vực cung cấp nước phải thống, rộng và
thuận tiện cho bị đến uống. Tăng cường quạt làm mát kết hợp hệ thống phun
sương, khu vực xung quanh chuồng ni có thể trồng thêm cây xanh, tránh ánh
sáng mặt trời chiếu trực tiếp vào chuồng.

Thức ăn nên chọn loại dễ tiêu hóa để giảm sự sinh nhiệt trong q trình tiêu
hóa, cho ăn thức ăn ủ chất lượng cao và có thể bổ sung chất béo vào khẩu phần. Bổ
sung các chế phẩm nấm men và vi khuẩn có lợi probiotic vào khẩu phần giúp bị dễ
tiêu hóa và tạo mơi trường vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa. Nên cho ăn ít vào
thời tiết nắng nóng và ăn nhiều vào thời tiết mát mẻ.
2.3 Tổng quan về gene ATP1A1
2.3.1 Giới thiệu gene ATP1A1
Các gene đóng góp vào cơ chế sản xuất nhiệt hoặc mất nhiệt có liên quan đến
khả năng chịu nhiệt, cùng với các q trình sinh hóa và phân tử bảo vệ tế bào chống
lại tổn thương do tích tụ nhiệt quá mức. Nhiều loại gene liên quan đến stress nhiệt
đã được nghiên cứu trong đó có gene ATP1A1. ATP1A1: ATPase Na+/ K+ vận
chuyển tiểu đơn vị alpha 1. Na +/ K+ -ATPase là một loại enzyme màng có chức năng
thiết lập và duy trì sự chênh lệch nồng độ điện hóa của các ion Na + và K+ trên màng
tế bào. Quá trình thẩm thấu qua màng tế bào cần có sự chênh lệch nồng độ điện hóa,
sự chênh lệch nồng độ điện hóa giúp vận chuyển kết hợp Na + và các chất chuyển
hóa, các chất dinh dưỡng và ion.

20


Tầm quan trọng của Na + / K + -ATPase trong chuyển hóa được nhấn mạnh
khi 19 – 28 % tổng sản lượng ATP trong các tế bào động vật có vú được tiêu thụ để
vận chuyển 3 Na + và 2 K + vào trong tế bào (Xu, 2005). Gene ATP1A1 có độ dài
20,9 kb bao gồm 21 exons, hiện diện tất cả các mô chủ yếu ở các tế bào thần kinh
ngoại biên và tế bào hồng cầu (Vague và cs, 1997).
Sự hoạt động của enzyme Na +/ K+ ATPase có liên quan đến khả năng chịu
nhiệt và khả năng di truyền cao ở gia súc (Yang, 2007). Khả năng chịu nhiệt khác
nhau dựa vào các biến thể kiểu gene ATP1A1 trên bò (Liu và cs, 2010). Nhiệt độ
cao và ẩm độ kéo dài, bò sữa cần hoạt động của Na + / K + -ATPase cao và liên tục
(Liu và cs, 2011).

2.3.2 Một số nghiên cứu ảnh hưởng của gene ATP1A1 lên stress nhiệt ở bò
Liu và cs (2010) nghiên cứu đa hình gene ATP1A1 với các đặc điểm chịu
nhiệt ở bị sữa đã cho thấy tính đa hình của gene ATP1A1 có tác động tích cực đến
các đặc điểm stress nhiệt.
Năm 2011, Liu và cs đã tiến hành nghiên cứu một đa hình đơn nucleotide
(SNP: Single nucleotide polymorphisms) mới của gene ATP1A1 liên quan đến khả
năng chịu nhiệt ở bò sữa bằng kĩ thuật PCR-LIS-SSCP. Phương pháp giải trình tự
DNA được sử dụng để phân tích đa hình trong vùng mã hóa của gene ATP1A1 của
bị. Kết quả phân tích mRNA ATP1A1 ở những bị bị stress nhiệt phát hiện có 3 kiểu
gene (ko in nghiên hả) CC, CA, AA. Trong đó, kiểu gene CC được tìm thấy nhiều
nhất (P < 0,01) và nhưng cá thể mang kiểu gen CC chịu nhiệt tốt hơn so với kiểu
gene CA. Mức độ biểu hiện gene ATP1A1 ở nhiệt độ 32,5ºC cao hơn nhiệt độ tối ưu
12,5ºC ở bò sữa cho thấy bò cần hoạt động của Na + / K + -ATPase cao hơn khi nhiệt
độ, độ ẩm cao liên tục kéo dài.
Một nghiên cứu khác của Kashyap và cs (2015) khảo sát mức độ ảnh hưởng
của các kiểu gene ATP1A1 với khả năng chịu nhiệt ở bò Tharparkar và Vrindavani
cho thấy các cá thể mang kiểu gene CC có hệ số chịu nhiệt, chỉ số hơ hấp, nhiệt độ
trực tràng thấp trên cả hai giống bò Tharparkar và Vrindavani. Kiểu gene CC có
nhiệt độ trực tràng thấp và hệ số chịu nhiệt cao hơn kiểu gene CA và AA.

21


2.4 Kĩ thuật sử dụng trong phân tích gene
2.4.1 Kĩ thuật ly trích DNA
2.4.1.1 Nguyên tắc
Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ các thành phần tạp chất, quan trọng
nhất là protein dựa trên nguyên tắc độ hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau
(nucleic acid/protein) trong hai pha khơng hịa tan (phenol, cloroform/nước) với
mục đích thu nhận các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị

phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các nucleic acid cần được tách chiết
trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế sự hoạt động của các enzyme nội bào
(DNase và RNase) (Nguyễn Hữu Trí, 2017).
2.4.1.2 Quy trình
Quy trình cơ bản tách chiết DNA từ máu gồm các bước: phá vỡ màng tế bào
và giải phóng các thành phần trong tế bào, làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào, kết
tủa thu hồi DNA.
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng hỗn hợp dung dịch SDS
(Sodium Dodecyl Sulphate) và proteinase (Proteinase K), giải phóng các thành phần
bên trong tế bào ra môi trường và phân hủy các protein liên kết DNA.
Bước 2: Sử dụng hỗn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp phương
pháp ly tâm để loại bỏ các thành phần không mong muốn trong môi trường chứa
DNA.
Bước 3: Kết tủa acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol. Thu nhận DNA
dạng cô đặc. Thu nhận acid nucleic dạng cô đặc khi cần có thể hịa tan trong dung
dịch theo nồng độ mong muốn.
2.4.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Phương pháp điện di cho phép xác định kích thước các đoạn DNA dựa vào
đặc tính cấu trúc DNA. DNA mang điện tích âm do tính chất gốc phosphate nên
trong điện trường DNA sẽ di chuyển từ điện cực âm sang điện cực dương. Trong khi
di chuyển sẽ xảy ra sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng
làm ngăn cản sự di chuyển của DNA. Lực kháng càng mạnh khi kích thước DNA

22


càng lớn, tốc độ di chuyển chậm và ngược lại. Các DNA cùng kích thước sẽ di
chuyển về cùng vị trí và tạo thành các băng, các băng này được quan sát sau khi
nhuộm ethidium bromide và đặt dưới tia tử ngoại (UV) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 1999).

2.4.3 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction)
2.4.3.1 Nguyên tắc
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: giải mã di truyền, nghiên
cứu sự tiến hóa ở mức dộ sinh học phân tử,.... Kỹ thuật PCR do Kary Mullis phát
minh vào năm 1985 và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold
Spring Harbor vào năm 1986; nhận được giải thưởng Nobel Hóa Sinh Học vào năm
1993.
Kỹ thuật PCR được thực hiện dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh
hóa: tổng hợp nhiều bản sao DNA từ trình tự DNA khn mẫu nhờ enzyme. Một
phản ứng PCR bao gồm các thành phần chính: Enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq
Polymerase), bốn loại deoxyribonucletide (dNTP): Adenine (A), Thymine (T),
Cytosine (C), Guanine (G), DNA khuôn, mồi xuôi (Forward Primer), mồi ngược
(Reverse Primer), MgCl2, dung dịch đệm (Buffer) và H2O (Nuclease – free water).
Các thành phần được trộn đều và đưa vào máy luân nhiệt. Máy ln nhiệt sẽ kiểm
sốt phản ứng thơng qua một chuỗi các nhiệt độ khác nhau và trong những khoảng
thời gian khác nhau. Hoạt động tổng hợp DNA mới từ mạch khn được hoạt hóa
nhờ vào enzyme Taq polymerase, cùng với sự hiện diện của các đoạn mồi chuyên
biệt cho phép tổng hợp nhanh và chính xác từng đoạn DNA mục tiêu.

23


2.4.3.2 Quy trình nhiệt
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm ba bước (Hình 2.2)

Hình 2.2 Quy trình phản ứng PCR ( />Bước 1: Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ được đưa lên cao 95ºC làm các liên kết
hydro trong mạch đôi DNA mất đi, DNA bị biến tính thành các mạch đơn tạo điều
kiện cho các primer ngược và xuôi bắt cặp ở hai đầu mạch đơn DNA.

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55ºC - 65ºC, nhiệt độ
thích hợp để primer bắt cặp bổ sung vào trình tự DNA mạch đơn.
Bước 3: Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72ºC tạo điều kiện để Taq
polymerase gắn các dNTP nguyên liệu vào đầu 3’ của đoạn primer đang bắt cặp bổ
sung trên sợi khuôn và kéo dài chuỗi DNA hướng về đầu 5’ của sợi DNA khuôn
nhằm tổng hợp nên mạch DNA bổ sung.
Qua một chu kỳ luân nhiệt, một đoạn DNA đích đã được nhân bản thành hai
bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một đoạn
DNA đích sẽ được nhân bản thành 230 đến 240 bản sao.

24


2.4.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR
DNA mẫu là các nucleic acid thu được từ mẫu cần phân tích đã tách chiết và
tinh sạch. Sự khuyếch đại thành công một trình tự DNA mẫu phụ thuộc vào số
lượng và chất lượng mẫu. Mẫu khơng có các chất kìm hãm với sự hoạt động của
enzyme Taq polymerase. Các chất này thường là những chất được sử dụng trong
quá trình tinh sạch DNA: muối, guanidine, các protease, dung môi hữu cơ,...Mẫu
DNA phải có một chuỗi DNA nguyên vẹn chứa vùng gen cần được khuyếch đại và
đủ lỗng để khơng kìm hãm tổng hợp DNA (100ng – 200ng) (Bùi Thị Trà Mi,
2005).
Enzyme tổng hợp DNA có khả năng chịu nhiệt cao. Taq polymerase có hoạt
tính cắt từ bên ngồi sợi DNA theo chiều 5’ – 3’ và có tính năng hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA và ion Mg 2+. Nồng độ enzyme tối ưu từ 1
đến 5 đơn vị trên một phản ứng.
Mồi (primer) phải đặc trưng, chuyên biệt và cho hiệu quả cao có các đặc
điểm: các đoạn mồi không được trùng lặp với các trình tự trên gene, có kích thước
từ 18 đến 24 base, các đoạn mồi xuôi và mồi ngược không được bắt cặp với nhau,
nhiệt độ nóng chảy của hai đoạn mồi này không quá chênh lệch. Bốn loại dNTP

thường được sử dụng ở nồng độ 200 µM cho mỗi loại nucleotid, mất cân bằng trong
thành phần các nucleotid sẽ làm tăng lỗi sao chép của Taq polymerase.
Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR trong thực tế không nên vượt quá 40
chu kỳ cho một phản ứng. Phản ứng PCR diễn ra trong hai giai đoạn: giai đoạn đầu
số lượng bản sao sẽ tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với số lượng mẫu ban đầu, giai đoạn
sau sẽ giảm hiệu quả khuyếch đại do sự phân hủy và các thể tích các thành phần
tham gia phản ứng bắt đầu hết, xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các
bản sao bắt đầu kết hợp với nhau.
Thiết bị và dụng cụ: máy luân nhiệt phải tăng giảm nhiệt độ nhanh và chính
xác, các ống eppendorf phải cùng một loại và kích cỡ do đặc tính chịu nhệt cũng
như sự tiếp xúc của các ống eppendorf và bộ phận tạo nhiệt của máy luân nhiệt có
ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại.

25