Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chuyển cấu trúc promoter gen GmNAC (35s GmNAC004) thông qua vector pZY101Asc

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC
(35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG
ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC
(35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG
ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM
Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm
Mã số
: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN VĂN ĐỒNG

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018
Tác giả luận văn

Lê Thị Mai Hương

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành bản luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Nguyễn Văn Đồng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong q
trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới các thầy cơ giáo phịng Sau Đại học, thầy
cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian
tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Chương trình Khoa học và Công

nghệ độc lập cấp nhà nước trong đề tài mã số 03/2012/HĐ-ĐTĐL.
Cuối cùng tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè lời cảm ơn thân thương nhất những người đã luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm
khóa luận này, cũng như trong cuộc sống.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2018
Học viên

Lê Thị Mai Hương

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….……..
LỜI CẢM ƠN………………………………………………...…………...…...
MỤC LỤC………………………………………………………….………….
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT………………………..…….
DANH MỤC BẢNG.………………………………………………….………
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………..………..
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU………………………………………………..………
1.1. Đặt vấn đề…….………………………………………………………...
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài....................….……………………......
1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài.................................
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………...….....
2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trong và ngồi nước.…………………....
2.1.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương……..........................................
2.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới……………………..…
2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam.………………………..
2.1.4. Tình hình phát triển và ứng dụng cây đậu tương chuyển gen trên
thế giới và tại Việt Nam…..………………………………………...……

2.2. Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương…………………...……………
2.2.1. Chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens…..
2.2.2. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn
ở cây đậu tương………………………………………………………......
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….….

i
ii
iii
v
vi
vii
1
1
3
3
4
4
4
7
9
10
15
15
19

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu…………...…………………………
3.2. Nội dung nghiên cứu.…….……………………………………….……
3.3. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………..…...
3.4. Phương pháp nghiên cứu………..……………………………………...

3.4.1. Phương pháp biến nạp ………………………………………….…

27
27
27
27
30
30

3.4.2. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0……......
3.4.3. Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun Basta………..
3.4.4. Phương pháp thu thập và phân tích số liệu thống kê..…………….

32
35
36

iii


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………….……………
4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương

37

ĐT22……………………………………………………………………….
4.2. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen bằng phun Basta..............…………..
4.3. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen thế hệ T0.….……………...….
4.3.1. Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar......……..………...
4.3.2. Phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc 35S::GmNAC004.

4.4. Kết quả chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử………………………

37
40
42
42

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………..........
5.1. Kết luận………………………………………………….......................
5.2. Đề nghị………………………………………………............................

51

DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………….......

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………..................................

53

PHỤ LỤC…………………………………………………...............................

60

iv

43
45

51
51


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D
ADN
ARN

Dichlorophenoxyacetic acid
Acid deoxyribonucleic

AS
BĐG

Acid ribonucleic
Acetosyringone
Biến đổi gen

CCM
cDNA
CNSH
CTAB
CS
DMSO
DW

Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy
Complementary DNA
Công nghệ Sinh học

Hexadecyltrimethylammonium bromide
Cộng sự
Dimethyl sulfoxide
Dry weight - Trọng lượng khô

EDTA
GM
IBA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt
Indol butyric acid

LB
NBT
OD600

Luria-Bertani
Nitrotetrazolium Blue chloride
Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ kế

PCR
RT PCR
RM
RWC
SDS
SEM
SIM
SSC
TL

TT
TW
v/ p
W
YEP

Polymerase Chain Reaction
Real-time PCR
Rooting medium - Môi trường ra rễ
Relative water content - Hàm lượng nước tương đối
Sodium dodecyl sulfate
Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi
Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi
Saline-sodium citrate
Trọng lượng
Thứ tự
Turgid weight - Trọng lượng trương
vòng/ phút
Weight - Trọng lượng
Yeast extract peptone - Môi trường nuôi khuẩn
v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây đậu tương…………......
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới …………………………....

4
8

Bảng 2.3. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới…...
Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ……………………....…
Bảng 2.5. Một số nghiên cứu về vai trò của các gen GmNAC.................................

8

Bảng 3.1. Thông tin về vector pZY101::35S::GmNAC004…………………..…
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu………………….....
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR………………………………………….
Bảng 4.1. Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển cấu trúc gen

9
23
28
35
35

35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc
và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……………………………………….
Bảng 4.2. Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển cấu trúc

38

gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101…………………………………..
Bảng 4.3. Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí

39

nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22
thông qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101………

Bảng 4.4. Kết quả phun basta các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen

40

35S::GmNAC004………………………………………………………………. 41
Bảng 4.5. Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen
35S::GmNAC004 thế hệ T0…………………………………………………..... 44
Bảng 4.6. Kết quả sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương sau chuyển gen bằng
phun Basta đến thế hệ T3……………………………………………………...... 45
Bảng 4.7. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T1………………………........ 46
Bảng 4.8. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T2………………………........ 46
Bảng 4.9. Kết quả phân tích sự phân ly ở thế hệ T3………………………........ 47

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Hạt đậu tương giống ĐT22………………………….………………
Hình 3.2. Cấu trúc vector pZY101::35S::GmNAC004………………………...
Hình 4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào nốt lá mầm của
giống đậu tương ĐT22 thơng qua vector pZY101-Asc và chủng khuẩn
A.tumefaciens EHA101 ……………………………………………………..…

28
30

Hình 4.2. Kết quả mẫu tạo đa chồi trên mơi trường SIM…………...…………
Hình 4.3. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi trên mơi trường SEM………….
Hình 4.4. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp sử dụng

38
39

cấu trúc gen 35S::GmNAC004 và chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……...

40

Hình 4.5. Kết quả chọn lọc bằng thuốc diệt cỏ Basta cây đậu tương chuyển
cấu trúc gen 35S::GmNAC004…………………………………………..……..
Hình 4.6. Kết quả kiểm tra chất lượng ADN tổng số của các cây đậu tương

41

chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 ………………………………………...
Hình 4.7. Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển cấu trúc gen
35S::GmNAC004…………………………………………………………..…...
Hình 4.8. Kết quả phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây
đậu tương chuyển gen T0………………………………………...…………….
Hình 4.9. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen đồng hợp đến thế hệ T3…………
Hình 4.10. Các dịng đậu tương được chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót
sau phun basta được chăm sóc đến khi ra hoa, kết quả………...........................
Hình 4.11. Phân tích PCR gen bar trên các cây đậu tương chuyển gen T1.......
Hình 4.12. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu
tương chuyển gen thế hệ T1.....………………………………………………...
Hình 4.13. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu
tương chuyển gen thế hệ T2……………………………………………………
Hình 4.14. Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 trên các cây đậu
tương chuyển gen thế hệ T3……………………………………………………

vii

37

42
43
44
48
49
49
50
50
50


CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glicine max (L.) Merr.) thuộc họ Đậu (Fabacea), bộ
Fabales, là cây trồng lấy hạt và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế
giới, do khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các
châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ với sản lượng đậu tương
thu được chiếm 85,4% tổng sản lượng đậu tương trên toàn thế giới, tiếp đến
là Châu Á đạt 12,1% (FAOSTAT, 2016). Tại Việt Nam, đậu tương là cây
thực phẩm có vai trò quan trọng nhưng năng suất cây trồng này còn thấp,
chưa thể đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước. Nguyên nhân gây ảnh
hưởng lớn đến năng suất và sản lượng đậu tương của Việt Nam là do các
bệnh dịch hại, sâu bệnh và chủ yếu là do hạn hán.
Trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khơ hạn,

nhiễm mặn ngày một tăng. Việc nghiên cứu các đáp ứng của cây lương thực,
bao gồm cây đậu tương, trồng trong điều kiện môi trường thiếu nước, mặn,
lạnh… ngày càng trở nên quan trọng (Petit và cộng sự, 1999; Manavalan và
cộng sự, 2009; Tran và Mochida, 2010). Một trong những kỹ thuật luôn mang
lại nhiều kỳ vọng đó là nghiên cứu, phát triển giống đậu tương biến đổi gen dựa
trên việc phân lập các gen có lợi và thiết kế các véc tơ hiệu năng cao để chuyển
các gen mục tiêu vào giống đậu tương xác định.
Các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF và CUC) đã được báo cáo là
tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng đối với các điều kiện bất thuận
như hạn, mặn và lạnh (Tran et al., 2010). Theo nghiên cứu mới nhất của Reem
M. Hussain và cộng sự (2017), đã xác định được 139 gen GmNAC, nghiên

1


cứu cụ thể 28 gen GmNAC chọn lọc kết quả cho thấy biểu hiện gen GmNAC
phụ thuộc vào kiểu gen; 8 trong số 28 gen chọn lọc (GmNAC004,
GmNAC021,

GmNAC065,

GmNAC066,

GmNAC073,

GmNAC082,

GmNAC083 và GmNAC087) đã được phát hiện có mức độ biểu hiện cao ở
các giống đậu tương chịu hạn.
Tại Việt Nam, định hướng nghiên cứu về giống đậu tương Việt Nam

chuyển gen chịu hạn còn khá mới. Cho tới nay, tất cả các cơng trình biến nạp
gen vào đậu tương mới chỉ thành cơng trên giống mơ hình như G. max 'Jack',
Williams. Do có sự khác biệt về nguồn gốc nên hầu hết các giơng mơ hình
khó ra hoa kết quả tại Việt Nam. Giống đậu tương ĐT22 do Trung tâm
Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo được công nhận là giống mới
(Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006) đã được trồng khá
phổ biến ở các vùng Hà Nội, Hà Nam, Thái Bình, Vĩnh phúc, Cao bằng, Sơn
La, Bắc Cạn, Điện Biên… và cho năng suất từ 18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào
mùa vụ và điều kiện thâm canh. ĐT22 thích hợp gieo trồng trong cả 3 vụ
trong năm có khả năng kháng bệnh phấn trắng và chống đổ tốt nhưng khả
năng chịu hạn lại kém. Theo nghiên cứu của phịng Thí nghiệm Trọng điểm
Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã chỉ ra rằng khả
năng tiếp nhận gen cũng như khả năng tái sinh cây sau chuyển gen của giống
ĐT22 cao hơn so với các giống đậu tương hiện có của Việt Nam.
Xuất phát từ tình hình thực tế nêu trên và dựa trên các công bố mới nhất
về chức năng và tiềm năng ứng dụng của hệ thống gen GmNAC, chúng tôi
đã tiến hành thực hiện đề tài đề tài “Nghiên cứu chuyển cấu trúc
Promoter::Gen-GmNAC (35S::GmNAC004) thông qua vector pZY101Asc và chủng vi khu n Agrobacterium tumefaciens EHA101 vào giống
đậu tương ĐT22 Việt Nam”.

2


1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
Mục đích:
Chuyển cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 bằng kỹ
thuật biến nạp gen.
Yêu cầu của đề tài:
- Biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông
qua vector pZY101-Asc và chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101.

- Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây ở thế hệ T0.
- Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử bằng phun thuốc diệt cỏ
Basta.
1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài
Ý nghĩa khoa học:
Đề tài cho thấy một hướng đi mới trong công tác chọn tạo giống cây
trồng bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens khác
xa với các phương pháp chọn giống truyền thống.
Ý nghĩa thực tiễn:
Các giống đậu tương chuyển gen tạo ra từ kết quả của đề tài có thể sử
dụng làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống chống chịu tốt với
điều kiện bất lợi của mơi trường mang thương hiệu Việt Nam.
Tính mới của đề tài:
Đề tài là cơng trình nghiên cứu đầu tiên về khả năng tiếp nhận cấu trúc
gen 35S::GmNAC004 trên cây đậu tương giống ĐT22.

3


CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trong và ngoài nước
2.1.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương
2.1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương
Đậu tương hay cịn gọi là đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine
max (L.) Merr. Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng
nhiễm sắc thể, đậu tương được xếp vào Bộ Fabales, Họ Fabaceae, Phân họ
Leguminosae, Chi Glycine (Ngô Thế Dân, 1999).

Đậu tương là cây họ đậu mùa hè hàng năm, thân thẳng đứng gồm thân
chính và các cành, lá và thân thường có lơng, hoa màu tía hoặc trắng, chùm
hoa sinh ra ở nách lá trên một cây có thể có rất nhiều hoa, nhưng chỉ 2/ 3
hoặc 3/ 4 số hoa đậu quả và quả cũng có lơng tơ. Quả màu vàng rơm nhạt
đến đen, có 3-4 hạt, đơi khi 5 hạt. Hạt đậu tương có các màu sắc khác nhau
tùy thuộc vào giống như màu trắng, vàng nhạt, xanh, nâu và đen, và loại hạt
nhiều màu. Rốn hạt cũng có màu sắc khác nhau như vàng, da bị, nâu và đen,
rễ có nốt sần cố định đạm. Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu
tương được chia làm hai giai đoạn chính là: (1). Giai đoạn phát triển sinh
dưỡng; (2). Giai đoạn sinh sản. Trong từng giai đoạn trải qua các bước khác
nhau được tóm lược như sau:
Bảng 2.1. Các giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây đậu tương
Giai đoạn sinh dưỡng
VE Xuất hiện – lá mầm trồi lên khỏi mặt đất

4


Giai đoạn sinh dưỡng
VC Unrolled unifoliolate leaves – phát triển của lá mầm
V1 Lá kép đầu tiên – một tập hợp lá chét
V2 Lá kép thứ hai – hai tập hợp lá chét
V4 Lá kép thứ bốn – bốn tập hợp lá chét
Lá kép thứ n – Giai đoạn V tiếp tục với sự phát triển của số
V(n) lá chét. Số lá chét cuối cùng phụ thuộc vào giống đậu tương
và các điều kiện môi trường.
Giai đoạn sinh sản
R1 Bắt đầu ra hoa – cây có ít nhất một bơng hoa trên đốt bất kỳ.
R2 Đầy đủ hoa - có một hoa nở tại một trong hai đốt trên cùng
R3

Bắt đầu có quả– các quả dài 5 mm tại một trong 4 đốt trên
cùng

R4 Đầy đủ quả– các quả dài 2 cm tại 1 trong 4 đốt trên cùng
R5

Bắt đầu hạt – hạt dài 3 mm trong các quả ở một trong 4 đốt
trên cùng của thân chính

Hạt hồn chỉnh - quả có chứa một hạt giống màu xanh lá cây
R6 lấp đầy dung lượng quả tại một trong bốn đơt cao nhất trên
thân chính
R7

Bắt đầu chín - một quả bình thường trên thân chính đã đạt đến
màu sắc chín của giống

R8 Quả chín - 95% vỏ quả đã đạt đến màu sắc chín của giống

5


2.1.1.2. Giá trị của cây đậu tương
Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người:
Cây đậu tương đóng vai trị quan trọng trong đời sống con người bởi nó
là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu
các chất khoáng và các vitamin. Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,540 % trong khi đó, hàm lượng protein trong gạo chỉ từ 6,2-12 %, ngơ từ 9,813,2 %, thịt bị 21 %, thịt gà 20 %, cá từ 17-20 % và trứng từ 13-14. Hàm
lượng lipit trung bình từ 15-20 % và thành phần chủ yếu là các axit béo
không no khoảng 60-70 % có hệ số đồng hóa cao và mùi vị thơm như axit

linoleic khoảng 52-65 %, oleic khoảng 25-36 %, linolenolic khoảng 2-3 %
(Trần Văn Điền, 2007). Ở các nước Châu Á (Nhật Bản, Hàn Quốc...), đậu
tương góp phần trong việc sản xuất các thức ăn cổ truyền như đậu phụ,
tương miso, xì dầu shoyu... Ngày nay, sự tiêu thụ các sản phẩm từ đậu tương
có xu hướng tăng lên trên tồn cầu, vì chúng có nhiều lợi ích như làm giảm
lượng cholesterol, phòng chống các bệnh ung thư, đái tháo đường, béo phì
và bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh về đường ruột và thận (Friedman và
Brandon, 2001).
Vai trị của cây đậu tương với ngành cơng nghiệp:
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau: chế
biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt
lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không. Tuy nhiên, đậu tương chủ yếu
được dùng làm nguyên liệu để ép dầu: hiện nay trên thế giới đậu tương là
cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, chiếm 50% tổng lượng
dầu thực vật (Trần Văn Điền, 2007).
Vai trò của cây đậu tương với ngành nông nghiệp:
Trong nông nghiệp, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, với tỉ lệ
1 kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Các bộ phận
6


thân, lá, rễ, quả, hạt của cây đậu tương đều có hàm lượng đạm khá cao cho
nên các sản phẩm phụ như thân, lá tươi và nghiền khô đều là thức ăn tổng
hợp cho gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khơ dầu có thành phần dinh
dưỡng khá cao (N: 6,2 % ; P2O5: 0,7 % ; K2O: 2,4 %) và cũng được dùng sản
xuất thức ăn cho gia súc. Ngồi ra, đậu tương cịn là cây ln canh cải tạo
đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây
trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng
suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho việc bón nitơ. Thân, lá
đậu tương có thể dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng nitơ

trong thân chiếm 0,05 %, trong lá chiếm 0,19 % (Trần Văn Điền, 2007).
2.1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Cây đậu tương có trị kinh tế và khả năng thích nghi rộng trong các điều
kiện môi trường khác nhau nên được xem là một trong những loại cây trồng
chiến lược, được trồng rộng rãi trên tồn thế giới, đứng ở vị trí thứ 4 chỉ sau
cây lúa, cây ngô và cây lúa mì. Đậu tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ
chiếm tỷ lệ 85,4 %, tiếp đến là Châu Á chiếm tỷ lệ 12,1 % (FAOSTAT,
2016). Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nơng nghiệp Liên hiệp
Quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 16,18 triệu ha
trong vòng 4 năm trở lại đây, năm 2012 đạt 105,35 triệu ha, năm 2016 tăng
lên 121,53 triệu ha. Tuy diện tích gieo trồng đậu tương tăng đều qua các năm
nhưng sản lượng đậu tương trên thế giới chỉ có xu hướng tăng nhẹ. Năm
2012 sản lượng đậu tương trên thế giới đạt 241,16 triệu tấn, năm 2013 sản
lượng tăng lên 277,54 triệu tấn, năm 2014 sản lượng tiếp tục tăng lên 306,37
triệu tấn, năm 2015 sản lượng đậu tương có xu hướng tăng đạt 323,20 triệu
tấn, tới năm 2016 sản lượng tăng nhẹ đạt 334,89 triệu tấn cao nhất trong 5
năm gần đây (Bảng 2.2).

7


Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Năm
2012
2013
2014
2015
2016

Diện tích gieo trồng

(triệu ha)
105,35
111,01
117,63
120,79
121,53

Năng suất
(tạ/ ha)
22,89
24,99
26,04
26,76
27,56

Sản lượng
(triệu tấn)
241,16
277,54
306,37
323,20
334,89

(Nguồn FAOSTAT, 2016)
Năng suất đậu tương trên thế giới cũng chỉ dao động nhẹ, năm 2016 đạt
27,56 tạ/ ha cao nhất trong năm năm qua. Bốn quốc gia sản xuất nhiều đậu
tương nhất là Mỹ, Brazil, Argentina và Ấn Độ cũng có những biến động về
sản lượng đậu qua các năm. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng và sản lượng
đậu tương lớn nhất, năm 2016 diện tích đạt 33,48 triệu ha và sản lượng đạt
117,21 triệu tấn (Bảng 2.3).

Bảng 2.3. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới
Năm

2014

2015

2016

Quốc gia
Mỹ
Brazil
Argentina
Ấn Độ
Mỹ
Brazil
Argentina
Ấn Độ
Mỹ
Brazil
Argentina
Ấn Độ

Diện tích gieo trồng
(triệu ha)
33,42
30,27
19,25
11,09
33,12

32,18
19,33
11,67
33,48
33,15
19,50
11,50

Năng suất
(tạ/ ha)
31,98
28,66
27,74
9,36
32,29
30,29
31,76
7,34
35,00
29,05
30,15
12,18

Sản lượng
(triệu tấn)
106,88
86,76
53,39
10,37
106,95

97,46
61,39
8,57
117,21
96,29
58,79
14,01

(Nguồn: FAOSTAT, 2016)

8


Có nhiều ngun nhân gây ra sự khơng ổn định về năng suất và sản
lượng đậu tương, ngoài các yếu tố dịch bệnh, yếu tố kỹ thuật, tình hình biến
đổi khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất đậu
tương trên toàn thế giới.
2.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Tại Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng thứ ba (sau lúa và
ngô). Đậu tương cung cấp protein chủ yếu trong bữa ăn hàng ngày của người
Việt Nam, đồng thời cịn là nguồn thức ăn chính cho sự phát triển ngành
chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp Việt
Nam hoạt động chủ yếu bằng phương pháp canh tác truyền thống nên năng
suất cây trồng thấp và sản xuất còn nhỏ lẻ. Hàng năm, Việt Nam nhập khẩu
một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới. Theo Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2016 Việt Nam đã nhập khẩu 1,56 tấn
đậu tương.
Hiện nay, cây đậu tương đang được trồng tại 25 tỉnh thành trong cả
nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía
Nam, khu vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng bằng sơng

Hồng. Diện tích canh tác đậu tương ngày càng bị thu hẹp, bên cạnh đó sản
lượng đậu tương qua các năm tương đối đồng đều nhưng tổng sản lượng
chung qua các năm biến động và theo chiều hướng giảm (Bảng 2.4).
Bảng 2.4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Năm
2011
2012
2013
2014
2015
2016

Diện tích gieo trồng
(Nghìn ha)
181,1
119,6
117,8
109,4
100,8
94,0

Năng suất
(Tấn/ha)
1,47
1,45
1,43
1,43
1,45
1,57

Sản lượng
(Nghìn tấn)
266,9
173,5
168,3
156,5
146,4
147,5

(Nguồn:Tổng cục thống kê Việt Nam - GSO)
9


Trải dài trên 15 vĩ độ Bắc, Việt Nam có địa hình phức tạp và đa dạng
khí hậu. Khí hậu Việt Nam phân chia thành 2 mùa rõ rệt: mùa mưa khoảng 6
- 8 tháng, từ tháng 5 - 6 đến tháng 9 - 11, mùa khô kéo dài 5 - 6 tháng tiếp
theo. Việt Nam có khoảng 9,6 triệu ha đất canh tác, khoảng 2,5 triệu ha đất
có tưới dành cho cây lúa cịn lại có tới 70% đất canh tác nhờ nguồn nước
mưa tự nhiên. Các nhà khoa học trên thế giới và trong nước khẳng định Việt
Nam là một trong năm nước bị ảnh hưởng nặng nề nhất của biến đổi khí hậu
và mực nước biển dâng. Nhiệt độ tăng và lượng mưa thay đổi sẽ ảnh hưởng
nền nông nghiệp và nguồn nước. Thay đổi chế độ mưa có thể gây lũ nghiêm
trọng vào mùa mưa, và hạn hán vào mùa khô. Trong các thiên tai ở Việt
Nam, khô hạn đã gây nhiều thiệt hại cho sản xuất nông nghiệp làm giảm
năng suất tới 70 - 80%, gây thất thu rất lớn cho sản xuất và thu nhập của
nông dân. Chọn tạo thành công các giống đậu tương 3 vụ có tính thích ứng
rộng năng suất cao là một bước tiến quan trọng của ngành chọn giống ở
nước ta, song trong điều kiện sản xuất nhờ nước mưa, năng suất của các
giống chỉ phát huy được 1/2 tiềm năng, vì vậy rất cần thiết phải phải nghiên
cứu chọn tạo các giống đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật di truyền để vừa

mở rộng diện tích, tăng sản lượng đồng thời giảm thiểu tổn thất cả về số
lượng cũng như chất lượng của đậu tương trước và sau thu hoạch, góp phần
nâng cao chất lượng sản phẩm, giá trị hàng hoá, tăng hiệu quả kinh tế cho
người sản xuất.
2.1.4. Tình hình phát triển và ứng dụng cây đậu tương chuyển gen trên thế
giới và tại Việt Nam
Tính đến năm 2016, đã có 404 sự kiện chuyển gen vào cây trồng đã được
tạo ra, hầu hết các sự kiện chuyển gen tập trung vào đối tượng cây ngô (148 sự
kiện), bông (58 sự kiện), khoai tây (45 sự kiện), cải dầu (38 sự kiện), đậu tương
đứng thứ 5 với 34 sự kiện chuyển gen. Các giống đậu nành chuyển gen chiếm
50% diện tích canh tác cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới. Thống kê tỉ lệ
10


diện tích canh tác đối với từng loại cây trồng, đậu tương đứng thứ nhất với
78%, 64% bông, 26% ngô và 24% hạt cải dầu được trồng trên toàn thế giới là
các giống chuyển gen. Các quốc gia canh tác 90% đậu tương chuyển gen là
Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Canada, Nam Mỹ và Uruguay (ISAAA, 2016). Lợi
ích thu được từ đậu tương chuyển gen trong 20 năm từ 1996 đến năm 2015 là
52,4 tỷ đô la Mỹ và 5,05 tỷ đơ la Mỹ chỉ riêng cho năm 2015.
Các tính trạng chuyển gen vào đậu tương đã được áp dụng và thương mại
hóa chủ yếu là tính trạng kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ. Tổng diện tích
trồng đậu tương chuyển gen trên thế giới năm 2016 đạt 91,4 triệu hecta bao
gồm 68 triệu hecta kháng thuốc trừ cỏ, và 23,4 triệu hecta đậu tương đa tính
trạng. Theo thống kê mới nhất của ISAAA năm 2017, trong 37 sự kiện chuyển
gen vào đậu tương được cơng bố chỉ có 1 sự kiện chuyển gen chịu hạn duy
nhất: IND-ØØ41Ø-5 mang gen Hahb-4 (có nguồn gốc từ cây hoa hướng
dương - Helianthus annuus) đã được thương mại hóa tại Argentina năm
2015.
Sự kiện tồn bộ hệ gen của đậu tương đã được giải trình tự, cùng với nó

là hàng trăm gen điều khiển tính chịu hạn, mặn, lạnh… ở thực vật nói chung
và ở đậu tương nói riêng đã được phát lộ. Và đặc biệt, dịng đậu tương có
khả năng kháng hạn rất cao đã được tạo ra khi chúng được biến nạp gen điều
khiển At DREB2A sẽ là cơ sở và động lực hết sức quan trọng trong việc thúc
đẩy quá trình nghiên cứu và chọn tạo các giống đậu tương biến đổi gen có
khả năng chống chịu lại các điều kiện bất lợi (lạnh, hạn, mặn) hiện nay.
Tại Việt Nam, công tác nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng triển khai
chậm hơn so với thế giới hàng chục năm. Một số công trình chuyển gen ban
đầu chỉ được tiến hành nghiên cứu lẻ tẻ tại một số phịng thí nghiệm:
Từ năm 2006, cây trồng biến đổi gen đã được Nhà nước đầu tư nghiên
cứu với quy mô tập trung hơn sau khi "Chương trình trọng điểm phát triển và
ứng dụng cơng nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông
11


thôn đến năm 2020" được phê duyệt. Các cây trồng được ưu tiên nghiên cứu để
biến đổi gen là lúa, ngô, bông, đậu tương - là những cây lương thực, thực phẩm
quan trọng nhất ở Việt Nam. Hàng năm, nước ta đang phải nhập khẩu nhiều
triệu tấn nên việc tăng sản lượng những cây trồng này là nhu cầu rất cấp bách.
Nhiều phịng thí nghiệm thuộc các viện nghiên cứu chuyên ngành về
CNSH, các trường Đại học như Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền
Nông nghiệp, Viện Sinh học Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Lúa
Đồng bằng Sông Cửu Long, Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp
Nha Hố, Đại học Lâm nghiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên… đã nhanh chóng
triển khai các nghiên cứu chuyển gen ở những loại cây trồng nói trên trong thời
gian qua và đã có báo cáo kết quả ban đầu trong nghiên cứu cây chuyển gen ở
Việt Nam như sau:
- Viện Công nghệ Sinh học đã phân lập được gen EPSPS kháng thuốc
trừ cỏ Glyphosate từ chủng vi khuẩn Agrobacterium CP4, tổng hợp yếu tố
chloroplast transit peptide và thiết kế vector biểu hiện mang cấu trúc 35SCTP-EPSPS-Cmyc-Nos để chuyển vào các dịng ngơ Việt Nam. Chuyển

thành cơng gen mã hóa kháng ngun của vỏ protein của virus đốm vịng
vào cây đu đủ, tạo ra các dòng đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vịng.
- Viện Di truyền Nơng nghiệp đã nghiên cứu chuyển gen kháng sâu
cry1A(c) vào phôi non của các dịng ngơ mơ hình, dịng ngơ chọn lọc bằng
phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Các dịng ngơ chuyển gen kháng sâu thế hệ T0-T4 nhận được đã được sàng
lọc, đánh giá mức độ ổn định và biểu hiện của gen chuyển. Bước đầu đã thu
nhận được một số dịng ngơ chuyển gen ổn định và đang duy trì, đánh giá
trong điều kiện nhà lưới cách ly vật lý. Tại đây, vector biểu hiện mang cấu
trúc promoter FMV và gen kháng thuốc diệt cỏ EPSPS cũng đã được thiết kế
và chuyển vào các giống đậu tương của Việt Nam (DT2008 và ĐT26).
Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống
12


bệnh cúm ở gia cầm cũng được thực hiện với mục đích sử dụng thực vật
chuyển gen để sản xuất vaccine dùng qua đường miệng thay thế cho vaccine
tiêm và giảm giá thành vaccine. Kết quả đã thu được các dòng bèo tấm
Wolffia australiana mang gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro,
bèo L. gibba, L. minor, và S. polyrrhiza mang gen kháng nguyên HA1
của virus H5N1. Một số dòng bèo tấm chuyển gen thu được đã có biểu
hiện protein sau khi cho gà ăn dịch bèo tấm chuyển gen.
- Viện lúa ĐBSCL đã nghiên cứu chuyển nạp gen kháng sâu soycry1Ac
(pPTN791) và vip3A (pPTN-vip3A) vào 2 giống đậu tương nhập nội
(Maverick, Williams 82) và giống đậu tương Việt Nam (MTĐ176, PC19)
thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả đã tạo được các dòng chuyển
gen mang gen kháng sâu soycry1Ac chọn lọc qua các thế hệ từ T0 đến T5
bằng các phân tích Southern blot, RT-PCR và Western blot (dịng T5). Qua
đánh giá tính kháng sâu trong nhà lưới, một số dịng biểu hiện tính kháng sâu
cao đã được xác định, trong đó có các dịng chuyển gen mang gen kháng sâu

soycry1Ac nhưng không mang gen chỉ thị chọn lọc bar.
- Viện Nghiên cứu Bông đã nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1A(c)
vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm hoặc thông qua vi khuẩn A.
tumefacien.
- Viện Nghiên cứu Hệ gen: Gen mã hóa chitinase - có hoạt tính kháng
nấm TcChi1, với các kích thước khác nhau (vùng mang mã có kèm hoặc
không kèm vùng 5’) đã được nghiên cứu tách dịng thành cơng trong vector
pJET1.2 và xác định trình tự hồn chỉnh (vùng mang mã có kích thước 1159
bp). Tạo được vector biểu hiện thực vật pCB301 mang gen mã hóa chitinase
TcChi1 được điều khiển biểu hiện bởi CaMV35S promoter để chuyển vào
một số dòng ca cao (Theobroma cacao L.) có giá trị thương mại đang được
canh tác ở Việt Nam.
Trong lĩnh vực biến nạp gen ở đậu tương, một số nghiên cứu đã được tiến
13


hành thành công ở nhiều trung tâm, viện nghiên cứu như Viện Di truyền
Nông nghiệp, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Viện Công nghệ Sinh
học:
-Viện Công Nghệ Sinh học đã thực hiện các nghiên cứu cấp cơ sở: Nghiên
cứu và hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen ở cây đậu tương (2005 - 2006); Phát
triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục
vụ cho biến nạp gen của Nguyễn Thị Thúy Hường và cộng sự (2009).
- Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu vào đậu tương được triển khai tại
Viện Di truyền Nông nghiệp (Nguyễn Văn Đồng và CS, 2012a; Nguyễn Anh
Vũ và CS, 2013b) và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (Trần Thị Cúc
Hoà và CS, 2013). Các đề tài nghiên cứu này tập trung vào chuyển gen
nguồn gốc Bt bao gồm các gen cry1Ac, cry2Aa, cry4A và vip3A vào giống
đậu tương nhập nội Williams 82, Maverick và giống đậu tương Việt Nam
MTĐ176.

- Các cơng trình nghiên cứu của các tác giả trong nước về tách chiết
phân lập gen, đánh giá khả năng tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương
đã được triển khai và bước đầu thu được một số kết quả (Nguyễn Văn Đồng
và CS, 2012a, 2012b, 2013a, 2013b; Nguyễn Anh Vũ và CS, 2013a, 2013b;
Trần Thị Cúc Hoà, 2013).
Hướng nghiên cứu phân lập, tách chiết các gen điều khiển tính chống
chịu hạn ở lúa, ngơ, đậu tương ... thiết kế các vector phục vụ chuyển gen vào
thực vật đã được tiến hành tại một số phịng thí nghiệm của Viện Di truyền
Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học. Các nghiên cứu đã phân lập được
hàng loạt các gen điều khiển tăng cường tính chịu hạn: OsDREB1A,
OsDREB2A, ZmDREB2A, OsDREB2A-2ACA, OsNAC1, OsNac5, OsNAC6,
OsNac10, OsAREB1A, OsRap2.4A, OsRap2.4B, OsNLI-IF, GmMYB,
GmGLP1,

GmCHS7,

Os06g46270,

Os10g39310.
14

Os04g23910,

Os08g02070

và


Tại viện Lúa ĐBSCL, vector mang gen chịu hạn drebIA (pPTN-rd29ADREBIA) được thiết kế và chuyển nạp vào 2 giống đậu tương nhập nội
(Maverick, Williams 82) và giống đậu tương Việt Nam (MTĐ176, PC19)

bằng phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium. Đã xác định được
các dòng T0 mang gen chịu hạn drebIA và tiếp tục chọn lọc, đánh giá trong
điều kiện nhà lưới.
Các nghiên cứu bước đầu về khả năng chịu nóng, chịu hạn các dịng/
giống đậu tương Việt Nam của các nhóm nghiên cứu của Trần Thị Phương
Liên, Chu Hoàng Mậu đã chỉ ra sự cấp thiết của việc chọn tạo ra các giống đậu
tương chống chịu với các điều kiện bất lợi tại Việt Nam. Tuy vậy, các nghiên
cứu trên chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá sơ bộ khả năng chống chịu hạn và ở
một số lượng nhỏ các giống đậu tương. Do vậy, cần phải tiến hành mở rộng các
nghiên cứu để đánh giá thêm các nguồn gen chống chịu ở đậu tương một cách
toàn diện, đặc biệt ở các giống đậu tương địa phương và các giống có tiềm
năng kinh tế.
2.2. Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương
2.2.1. Chuyển gen vào đậu tương thông qua vi khu n A. tumefaciens
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được
nghiên cứu và ứng dụng vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: chuyển gen
thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng
súng bắn gen, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng vi tiêm,… Nhưng
cùng với phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen thì phương pháp
chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là một trong hai
phương pháp chuyển gen thành công nhất và được ứng dụng nhiều nhất.
Phương pháp này sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens như một vector sinh
học để chuyển một đoạn DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo
được cây biến đổi gen (Hooykaas and Schilperoort, 1992; Zambryski, 1998).

15


Vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vị trí bị tổn
thương. Khi bị tổn thương, mơ thực vật sẽ tiết ra một số hợp chất phenol,

hợp chất này đóng vai trị dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens biểu hiện vùng
gen Vir nằm trên Ti-plasmid (Hooykaas and Beijersbergen, 1994). Kết quả
biểu hiện gen Vir, sợi đơn T-DNA sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen
thực vật. Vấn đề chính của phương pháp chuyển gen này là làm thế nào để
có thể kết hợp giữa tế bào chủ với vector tương ứng.
Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để
lây nhiễm với vi khuẩn (Cleene and Ley, 1976) cho tới khi Pederson và CS
(1983) đã chứng minh đậu tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này.
Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố giống (Parrott et
al., 1989; Delzer et al., 1990). Mặt khác, khả năng thu được các chồi chuyển
gen từ những khối mơ có khả năng tái sinh như phơi vơ tính và nốt lá mầm
ban đầu rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều
nghiên cứu nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trị xúc tác
như acetosyringine để kích thích sự biểu hiện của gen Vir, L-cystein (Parrott
et al., 1989), thiol (Olhoft and Somers, 2001) hoặc sử dụng các chủng vi
khuẩn có khả năng gây độc tính cao (Hansen et al., 1994), xác định các yếu
tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm (Meurer et al.,
1998; Paz et al., 2006), cải tiến nốt lá mầm làm vật liệu biến nạp (Paz et al.,
2006), kết hợp lây nhiễm với tái sinh (Chee et al., 1989). Vấn đề khác khi sử
dụng vi khuẩn A. tumefacines còn phụ thuộc vào chủng khuẩn (Mello-Farias
et al., 2008), số lượng bản sao ADN được tổng hợp trong hệ gen thực vật,
pH môi trường (Santarem et al., 1997), mức độ gây tổn thương của mẫu
(Stachel et al., 1985).
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng phương
pháp nốt lá mầm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens làm trung gian được báo
cáo vào năm 1988. Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng
16