Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor hệ thống LED cải tiến môi trường hai lớp đến quá trình nhân giống tạo củ và tích lũy saponin trong sâm ngọc linh panax vietnamensis ha et grushv in vitro
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.73 MB, 132 trang )
ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH
BAN CHẤP HÀNH TP. HỒ CHÍ MINH
----------------------
CƠNG TRÌNH DỰ THI
GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA
LẦN THỨ XX NĂM 2018
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC
ELICITOR, HỆ THỐNG LED CẢI TIẾN, MÔI
TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN Q TRÌNH NHÂN
GIỐNG, TẠO CỦ VÀ TÍCH LŨY SAPONIN
TRONG SÂM NGỌC LINH (PANAX
VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) IN VITRO
LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ SINH – Y SINH
CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số cơng trình: …………………………….
(Phần này do BTC Giải thưởng ghi)
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................................. i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................................. xii
TĨM TẮT .................................................................................................................................. 1
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................... 2
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................................... 2
2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................................................. 3
3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................ 4
4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................................... 6
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn................................................................................. 7
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 9
1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor ........................................................................... 9
1.1.1. Khái niệm vi nhân giống ................................................................................................... 9
1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor .............................................................................................. 10
1.1.2.1. Than hoạt tính ................................................................................................................. 10
1.1.2.2. Saccharose ...................................................................................................................... 11
1.1.2.3. Bạc nitrate ....................................................................................................................... 12
1.1.3. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc ......................................................................................... 12
1.1.4. Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống .......................................................................... 14
1.1.4.1. Vai trò của ánh sáng đối với quá trình quang hợp ở thực vật......................................... 14
1.1.4.2. Vai trị của ánh sáng đối với q trình sinh trưởng và phát triển của thực vật............... 15
1.1.4.3. Vai trò của ánh sáng trong nhân giống in vitro .............................................................. 17
1.1.4.4. Nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy in vitro hiện nay ........................... 18
1.1.5. Đèn LED (Light Emitting Diode) ...................................................................................... 21
1.1.5.1. Giới thiệu đèn LED ........................................................................................................ 21
1.1.5.2. Ưu, nhược điểm của đèn LED ........................................................................................ 22
1.1.5.3. Một số thành tựu trên thế giới và Việt Nam khi sử dụng nguồn sáng LED trong
nuôi cấy in vitro .................................................................................................................. 23
1.1.5.4. Hướng phát triển ứng dụng của đèn LED trong nuôi cấy in vitro ở Việt Nam .............. 26
ii
1.1.6. Ánh sáng đối với thực vật .................................................................................................. 27
1.1.6.1. Vai trò của một số phổ ánh sáng đơn sắc đến đời sống thực vật .................................... 27
1.1.6.2. Vai trò của ánh sáng đến q trình tích lũy các chất hữu cơ đối với thực vật................ 29
1.2. Phương pháp định tính và định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 32
1.2.1. Định tính saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng
phương pháp Sắc ký lớp mỏng ........................................................................................... 32
1.2.2. Định lượng saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................................ 33
1.3. Sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................. 36
1.3.1. Giới thiệu sơ lược về cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............. 36
1.3.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................................. 37
1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển ................................................................................... 38
1.3.4. Đặc điểm phân bố .............................................................................................................. 39
1.3.5. Nhân giống cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)............................. 39
1.3.5.1. Nhân giống từ hạt ........................................................................................................... 39
1.3.5.2. Nhân giống in vitro ......................................................................................................... 41
1.3.6. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 41
1.3.6.1. Thành phần hóa học........................................................................................................ 41
1.3.6.2. Tác dụng dược lý ............................................................................................................ 42
1.3.7. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................................................................... 44
1.3.7.1. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) trên thế giới .......................................................................... 44
1.3.7.2. Nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn nguồn gene cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) ở Việt Nam ........................................................................... 45
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 49
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài .................................................................................. 49
2.1.1. Địa điểm ............................................................................................................................ 49
2.1.2. Thời gian ............................................................................................................................ 49
iii
2.2. Vật liệu ................................................................................................................................. 49
2.2.1. Nguồn mẫu ........................................................................................................................ 49
2.2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy...................................................................................... 49
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................................ 50
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................... 50
2.3.1. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn .......................................................... 52
2.3.2. Thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp ................................................... 53
2.4. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................................... 54
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ...................................... 54
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 54
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate (AgNO3) đến khả năng tăng
trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 55
2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng
tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............ 56
2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏvàng; đỏ-xanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................................ 57
2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của ni cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn
cảm ứng) đến khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) in vitro ................................................................................................................. 58
2.4.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hai lớp (kiểu bổ sung các thành
phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ................................................... 59
2.5. Hình thái giải phẫu Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ....... 59
2.5.1. Hình thái giải phẫu khí khổng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy trong các hệ thống LED cải tiến ..................... 59
2.5.2. Hình thái giải phẫu củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro...... 61
iv
2.6. Xác định hàm lượng chlorophyll trong sản phẩm Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) từ q trình ni cấy in vitro dưới hệ thống LED cải
tiến................................................................................................................................. 62
2.7. Thu nhận hợp chất saponin triterpenoid từ sản phẩm của quá trình ni cấy in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường hai lớp ............... 63
2.7.1. Định tính saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ................................ 63
2.6.2. Định lượng saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
Performance Liquid Chrotomatography – HPLC) ............................................................. 63
2.7. Chỉ tiêu theo dõi ................................................................................................................... 64
2.8. Thống kê và xử lý số liệu ..................................................................................................... 64
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 65
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................... 65
3.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................... 68
3.3. Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ............................................... 71
3.4. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng,
tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................ 74
3.5. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng
trưởng, tạo củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .................... 76
3.6. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến
khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) .............. 80
3.7. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy (môi
trường hai lớp) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và tích lũy saponin của
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ........................................................ 82
3.8. Hình thái Giải phẫu cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ...... 88
3.8.1. Hình thái Giải phẫu khí khổng Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
in vitro sau 12 tuần nuôi cấy trong hệ thống LED cải tiến ................................................. 88
3.8.2. Hình thái Giải phẫu củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) .............................................................................................................................. 90
v
3.9. Xác định hàm lượng chlorophyll trong sản phẩm Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) từ q trình ni cấy in vitro dưới hệ thống LED cải tiến ............ 92
3.10. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng ........................................................................... 93
3.11. Định lượng saponin trong củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in
vitro sau 16 tuần nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ......................... 93
CHƯƠNG 4: KẾT LUẠN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 96
4.1. Kết luận................................................................................................................................. 96
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................................. 97
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AC
Than hoạt tính
BA
Benzyladenine
BAP
6-Benzyl Amino Purin
DNA
Deoxyribonucleic Acid
GA3
Acid gibberellic
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPTLC
Sắc ký lớp mỏng cao áp
IAA
Acid b-Indolyacetic
IBA
Acid b-Indolybutyric
IFR
Cường độ ánh sáng đỏ xa
IR
Cường độ ánh sáng đỏ
KH2PO4
Monopotassium phosphate
KH&CN
Khoa học công nghệ
Kin
Kinetin
LED
Light-Emmitting Diode
MS
Murashige và Skoog, 1962
NAA
Acid a-naphtaleneacetic
NaClO
Sodium hypocloride
SH
Schenk và Hildebrandt, 1972
TDZ
Thidiazuron
TLC
Sắc ký lớp mỏng
UFLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao siêu nhanh
WPM
Woody Plant Medium
2,4-D
2,4-Dichlorophenoxy acetic acid
vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Các bước sóng ánh sáng (nguồn Internet) ............................................................... 14
Hình 1.2. A. Sự hấp thu các bước sóng bởi các loại sắc tố quang hợp và cường độ quang
hợp; B. Sự hấp thu ánh sáng của chlorophyll a và chlorophyll b (nguồn Internet). 16
Hình 1.3. Các hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED. a. Đèn LED với tỷ lệ chiếu sáng 70%
LED đỏ kết hợp 30% LED xanh; b. LED uni-Pack (LP) (Nguyễn Bá Nam,
2012) ........................................................................................................................ 21
Hình 1.4. Hệ thống ni cấy LED truyền điện khơng dây (Wireless power transfer – LED
uni-Pack (WPT - LP)). a. Thiết bị phát; b. Thiết bị thu; c.d. Hoạt động của hệ
thống (Nguyễn Bá Nam, 2012)................................................................................ 26
Hình 1.5. Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng................................................................. 33
Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC................................................ 35
Hình 1.7. Hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC ......................................................... 35
Hình 1.8. Cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (Nhut et al., 2011) ....... 36
Hình 1.9. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) (nguồn Internet).................. 37
Hình 2.1. Mơ hình thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn a. Hệ thống chiếu
sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ thống chiếu
sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ ........................... 53
Hình 2.2. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED đơn sau khi thiết kế và thi công. a. Hệ
thống chiếu sáng đèn LED trắng; b. Hệ thống chiếu sáng đèn LED vàng; c. Hệ
thống chiếu sáng đèn LED xanh dương; d. Hệ thống chiếu sáng đèn LED đỏ ....... 53
Hình 2.3. Mơ hình hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED kết hợp a. 100% LED đỏ (ĐC);
b. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED vàng; c. 50% LED đỏ kết hợp 50% LED
xanh dương; d. 50% LED vàng kết hợp 50% LED xanh dương ............................ 54
Hình 2.4. Hệ thống chiếu sáng cải tiến đèn LED hỗn hợp sau khi thiết kế và thi công. a.
Tỷ lệ chiếu sáng 100% LED đỏ (ĐC); b. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED
vàng; c. Tỷ lệ 50% LED đỏ kết hợp 50% LED xanh dương; d. Tỷ lệ 50% LED
vàng kết hợp 50% LED xanh dương ....................................................................... 54
Hình 3.1 Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. A0,
viii
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 tương ứng với nồng độ than hoạt tính lần lượt là 0;
0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 g/L ........................................................................... 67
Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. B0,
B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7 tương ứng với nồng độ saccharose lần lượt là 30;
40; 50; 60; 70; 80 g/L ............................................................................................ 70
Hình 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy. C0,
C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 tương ứng với nồng độ AgNO3 lần lượt là 0; 0,5;
1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mg/L ............................................................................. 73
Hình 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi
cấy. D0, D1, D2, D3, D4 tương ứng với với nguồn sáng là đèn huỳnh quang;
LED trắng; LED vàng; LED xanh dương; LED đỏ .............................................. 75
Hình 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi
cấy. G0, G1, G2, G3 tương ứng với với các tỷ lệ 100% đỏ; 50% đỏ:50% vàng;
50% đỏ:50% xanh dương và 50% vàng:50% xanh dương .................................... 79
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả năng
tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 3
tuần nuôi cấy. L0, L1, L2 tương ứng với trạng thái nuôi cấy là rắn (agar), lỏng
tĩnh, lỏng lắc .......................................................................................................... 81
Hình 3.7. Ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng
tăng trưởng, tạo củ in vitro của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ............................................................................... 83
Hình 3.8. Ảnh chụp hiển vi soi nổi hình thái cây và củ Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi cấy ................................... 87
Hình 3.9. Cấu tạo củ Sâm Ngọc Linh Ngọc in vitro sau 16 tuần ni cấy............................ 88
Hình 3.10. Ảnh chụp dưới kính hiển vi sơi nổi và ảnh chụp hình thái giải phẫu khí khổng
dưới kính hiển vi quang học của lá Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau. 89
ix
Hình 3.11. Ảnh chụp hình thái giải phẫu dưới kính hiển quang học củ Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy; a) Lát cắt dọc chồi
mọc từ củ; b) Lát cắt ngang củ; c1) Lát cắt ngang mơ củ, c2) Hình thái tế bào
mơ củ, c3) Mô củ với tế bào nhân bắt màu hồng đậm (mũi tên), c4) Hình thái
bó mạch trong lát cắt dọc củ .................................................................................. 91
Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên mơi
trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx
vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ................................................ 92
Hình 3.13. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức ĐC (nuôi cấy trên mơi
trường agar một lớp: khơng than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx
vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ................................................ 94
Hình 3.14. Sắc ký đồ HPLC định lượng Rg1 và Rb1 ở nghiệm thức E8 (nuôi cấy trên môi
trường 2 lớp lỏng-rắn: có than hoạt tính) Sâm Ngọc Linh (Panaxx
vietnamensis Ha et Grushv.) sau 16 tuần nuôi cấy ................................................ 95
x
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Ảnh hưởng của các bước sóng ánh sáng khác nhau lên thực vật (Trần Thị Hồng
Thúy, 2014) ............................................................................................................ 17
Bảng 1.2. Thành phần hoá học chung của Sâm Ngọc Linh .................................................... 43
Bảng 1.3. So sánh thành phần và hàm lượng của saponin trong Sâm Ngọc Linh và các lồi
Sâm nhóm 1 ........................................................................................................... 44
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 55
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 56
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 đến sự tăng trưởng, tạo củ in vitro của cây Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 57
Bảng 2.4. Ảnh hưởng ánh sáng LED đơn đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 58
Bảng 2.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED cải tiến hỗn hợp với tỷ lệ 50:50 (đỏ-vàng; đỏxanh dương, vàng-xanh dương) đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro Sâm
Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ................................................... 59
Bảng 2.6. Khảo sát ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến
khả năng tăng trưởng của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 60
Bảng 2.7. Khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung các thành phần môi trường ni cấy đến
khả năng tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro ........................................................ 61
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của elicitor than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy .. 65
Bảng 3.2. Ảnh hưởng nồng độ elicitor saccharose đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy 68
Bảng 3.3. Ảnh hưởng nồng độ elicitor AgNO3 đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần nuôi cấy ......... 71
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của ánh sáng LED đơn cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần
nuôi cấy ................................................................................................................. 74
xi
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của ánh sáng LED hỗn hợp cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo
củ in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau 12 tuần
nuôi cấy ................................................................................................................. 77
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng lắc (giai đoạn cảm ứng) đến khả
năng tăng trưởng của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
sau 3 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 80
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường hai lớp đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in vitro và
tích lũy saponin của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sau
16 tuần nuôi cấy..................................................................................................... 82
Bảng 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) in vitro sau 12 tuần nuôi cấy trong các điều kiện chiếu sáng khác
nhau ....................................................................................................................... 92
Bảng 3.9. Kết quả phân tích HPLC hàm lượng saponin (ginsenoside Rg1 và Rb1) trong củ
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro sau 16 tuần nuôi
cấy khi khảo sát ảnh hưởng của kiểu bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi
cấy.......................................................................................................................... 94
1
TĨM TẮT
Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành các hướng sau đây:
Đầu tiên là khảo sát ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính, saccharose và bạc
nitrate) đến sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha
et Grushv.). Kết quả cho thấy môi trường SH bổ sung 1 g/L than hoạt tính thích hợp cho
sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Đối với saccharose, bổ sung 30 g/L
thích hợp cho việc tạo cây con hoàn chỉnh, để nhân sinh khối mơ sẹo Sâm Ngọc Linh thì
bổ sung 70 g/L saccharose. Bổ sung 2 g/L AgNO3 thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo củ
in vitro Sâm Ngọc Linh.
Thứ hai là cải tiến hệ thống chiếu sáng LED (sử dụng các bóng LED trịn, dễ sử
dụng, dễ lắp đặt, dễ thay thế, linh hoạt trong thiết kế và thi công, tiết kiệm điện năng, tỏa
nhiệt lượng thấp, tiết kiệm chi phí đầu tư, tăng hiệu quả kinh tế). Kết quả cho thấy khi
nghiên cứu ảnh hưởng của LED đơn đến sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc
Linh. Đối với nguồn sáng LED hỗn hợp thì LED xanh dương và LED đỏ kết hợp tỷ lệ
50:50 thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh.
Thứ ba là tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc – giai đoạn cảm ứng). Kết
quả cho thấy nuôi cấy lỏng lắc giúp mẫu cấy tăng trưởng mạnh, nhân nhanh sinh khối, rất
thích hợp cho giai đoạn nuôi cấy cảm ứng Sâm Ngọc Linh.
Thứ tư là sau giai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy được cấy chuyền sang môi
trường hai lớp (lớp trên và lớp dưới khác nhau về trạng thái vật lý, thành phần các chất
dinh dưỡng) nhằm tìm ra các kiểu bổ sung các thành phần dinh dưỡng thích hợp cho sự
tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh in vitro. Đây là một
hướng nghiên cứu mới rất có ý nghĩa đối với nhân giống Sâm Ngọc Linh, một lồi dược
liệu q hiếm, có giá trị kinh tế cao, là loài Sâm đặc hữu của Việt Nam. Kết quả cho thấy
môi trường hai lớp lỏng-rắn (lỏng-agar): lớp trên lỏng có than hoạt tính và lớp dưới rắn có
than hoạt tính thích hợp nhất cho sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong Sâm
Ngọc Linh in vitro. Sau 16 tuần nuôi cấy, mẫu cấy tăng trưởng mạnh, tạo củ kích thước
lớn, hình thái củ tương tự trong tự nhiên. Kết quả định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng
cho thấy có sự xuất hiện saponin trong Sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. Kết quả định
lượng saponin bằng phương pháp HPLC (ginsengnoside Rg1 và Rb1) cho thấy có sự hiện
diện của 2 loại saponin này với hàm lượng cao.
2
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., thuộc họ
Nhân Sâm (Araliaceae). Chữ Panax xuất phát từ chữ Panacea trong tiếng Hy Lạp, có
nghĩa là thuốc trị bá bệnh, thần dược. Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.) là một loài Sâm đặc hữu của Việt Nam được biết đến từ năm 1973. Tại hội nghị
quốc tế về Sâm, lồi Sâm này được xếp vào nhóm Sâm q trên thế giới cùng với Sâm
Triều Tiên (Panax ginseng), Sâm Mỹ (Panax quinquefolium),… (Phai et al., 2002).
Sâm Ngọc Linh là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn, có tên
trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [25]. Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin,
20 chất khoáng vi lượng và 0,1% tinh dầu. Sâm Ngọc Linh có hàm lượng saponin khung
dammaran cao nhất (khoảng 12 – 15%) và lượng saponin triterpenoidoid nhiều nhất so
với các loài khác của chi Panax trên thế giới (Le Thi Hong Van et al., 2015). Qua nhiều
nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam và trên thế giới đã thấy rằng Sâm Ngọc Linh
khơng chỉ có các tác dụng dược lý đặc trưng của chi Nhân Sâm mà cịn có những tác dụng
dược lý điển hình như chống stress, chống trầm cảm, chống oxy hóa, chống ung thư và
tăng cường hệ miễn dịch (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007). Với những đặc điểm
đó, Sâm Ngọc Linh khơng chỉ là lồi Sâm quý của Việt Nam mà còn là của thế giới.
Việc nhân giống Sâm Ngọc Linh cịn gặp nhiều khó khăn do đây là loài đặc hữu của
Việt Nam, yêu cầu sinh thái rất khắt khe, tăng trưởng rất chậm và chỉ trồng được ở các
khu vực quanh đỉnh núi Ngọc Linh (thuộc địa phận hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam).
Thời gian trồng trọt phải kéo dài từ 6 đến 7 năm mới có thể thu hoạch (do củ cần nhiều
thời gian để tích lũy các hợp chất sinh học quý giá). Các nghiên cứu về loài Sâm này chưa
nhiều, chưa có một quy trình nhân giống hồn chỉnh phổ biến được chuyển giao cơng
nghệ. Đây là lồi dược liệu đắt tiền bậc nhất, nhu cầu thị trường rất cao, khai thác cạn kiệt
và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Đang được Chính phủ quan tâm và chú trọng
đầu tư phát triển. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó chúng tơi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor, hệ thống LED cải tiến, mơi trường hai lớp đến
q trình nhân giống, tạo củ và tích lũy saponin trong Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Cơng nghệ
3
sinh học thực vật nhằm mục đích cải tiến mơi trường, điều kiện nuôi cấy, hệ thống nuôi
cấy, kiểu bổ sung thành phần dinh dưỡng (môi trường hai lớp lỏng-rắn) và hồn thiện quy
trình nhân nhanh lồi Sâm q này góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lồi Sâm đặc
hữu của Việt Nam.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3) ảnh
hưởng đến q trình sinh trưởng và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của các elicitor trên bổ sung
vào môi trường nuôi cấy giúp mẫu cấy tăng trưởng và tích lũy saponin tối ưu.
Sau khi xác định được nồng độ các elicitor (than hoạt tính, saccharose và AgNO3)
thích hợp, tiến hành thiết kế hệ thống chiếu sáng cải tiến sử dụng đèn LED bóng trịn
được sản xuất sẵn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220V để lắp đặt và thi công trong
thiết kế hệ thống LED đơn và LED kết hợp để khảo sát ảnh hưởng của các bước sóng ánh
sáng LED riêng lẻ (đỏ, xanh dương, vàng và trắng) và LED kết hợp (đỏ-vàng; đỏ-xanh
dương, vàng-xanh dương với tỷ lệ kết hợp là 50:50) đến q trình q trình sinh trưởng,
tạo củ và tích lũy saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
Sau khi xác định được nguồn chiếu sáng thích hợp, để đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng
của mẫu cấy, tiến hành nuôi cấy lỏng (lỏng tĩnh và lỏng lắc) nhằm tìm ra điều kiện ni
cấy thích hợp (lỏng lắc-giai đoạn cảm ứng) giúp thúc đẩy mẫu cấy tăng trưởng nhanh. Sau
giai đoạn nuôi cấy cảm ứng các mẫu cấy sẽ được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy
hai lớp nhằm tìm ra kiểu bổ sung các thành phần mơi trường ni cấy thích hợp cho sự
tăng trưởng, tạo củ và tích lũy saponin trong củ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha
et Grushv.). Mục đích nghiên cứu giúp rút ngắn thời gian nhân giống, tăng số lượng và
chất lượng cây giống, giúp hạ giá thành sản phẩm, góp phần bảo tồn và cung cấp nguồn
gene Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) quý giá. Cung cấp cây giống
chất lượng cao với số lượng lớn không giới hạn cho các nhà vườn, doanh nghiệp trồng
làm nguyên liệu dược và thực phẩm chức năng, từ đó có thể cải thiện đời sống nhân dân,
tiến dần đến thương mại hóa sản phẩm Sâm Ngọc Linh, tạo thương hiệu cho sản phẩm
đặc hiệu của Việt Nam.
4
3. Đối tượng nghiên cứu
Sâm Ngọc Linh là một cây dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao của Việt Nam (40
– 100 triệu VNĐ/kg). Từ đầu tháng 10/2017, Ủy Ban Nhân Dân huyện Nam Trà My
(Quảng Nam) đã chính thức mở phiên chợ Sâm Ngọc Linh nhằm góp phần tìm ra giải
pháp duy trì, bảo tồn và phát huy giá trị Sâm Ngọc Linh theo Chương trình phát triển sản
phẩm quốc gia đến năm 2020 do Thủ tướng Chính Phủ phê duyệt. Tại phiên chợ Sâm
Ngọc Linh lần thứ 6 được tổ chức vào đầu tháng 3/2018, Sâm Ngọc Linh có giá bán từ 85
triệu/kg [79]. Từ khi phát hiện năm 1973 đến 1995 thì lồi này đã bị khai thác cạn kiệt và
đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng mất nguồn gene quý hiếm (Trần Công Luận, 2003).
Đến nay, quần thể Sâm Ngọc Linh tự nhiên đang bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới nguy cơ
tận diệt do nhu cầu của thị trường dược liệu ngày càng tăng cao. Ngày 12/9/2015, Phó
Thủ tướng Chính phủ Vũ Đức Đam đã phê duyệt Đề án bảo tồn và phát triển cây Sâm
Ngọc Linh (Sâm Việt Nam) đến năm 2030 trị giá 9.500 tỷ đồng nhằm bảo vệ nguồn gene
quý, kết hợp bảo vệ và phát triển nguồn nguyên liệu Sâm góp phần xóa đói giảm nghèo,
phát triển kinh tế - xã hội (nguồn Internet).
Hoàng Hải Anh và cộng sự (2011) đã báo cáo rằng Sâm Việt Nam ni cấy mơ cũng
có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd,
G-Re, N-R1 và M-R2. Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Nam
nuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Việt Nam thiên nhiên).
Việc nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình ni cấy mơ cây Sâm Ngọc Linh cung cấp
nguồn cây Sâm giống cho trồng trọt và sử dụng để thay thế Sâm thiên nhiên, đã mở ra
một hướng mới trong sản xuất nguyên liệu cây Sâm Ngọc Linh: chủ động được nguồn
nguyên liệu dồi dào trong thời gian ngắn, phục vụ công tác nghiên cứu, sản xuất thuốc và
các sản phẩm thực phẩm chức năng.
Hiện nay, cây Sâm Ngọc Linh là đối tượng đang rất được quan tâm và chú ý nghiên
cứu nhằm xây dựng quy trình nhân giống nhanh, rút ngắn được thời gian sinh trưởng so
với cây Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên mà vẫn đảm bảo được hàm lượng các dược chất
quý giá vốn có như saponin triterpenoid, ginsengnosidee để đảm bảo được nhu cầu tiêu
dùng của thị trường. Trong đó phải kể đến các cơng trình nghiên cứu như Hồng Văn
Cương (2012) đã chứng minh ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự sinh trưởng và khả
5
năng tích lũy saponin thơng qua q trình ni cấy mô sẹo và cây Sâm Ngọc Linh Panax
vietnamensis Ha et Grushv. in vitro.
Nguyễn Thị Liễu và cộng sự (2011) đã tạo được rễ bất định của Sâm Ngọc Linh
trong nuôi cấy in vitro.
Hà Thị Loan (2014) đã sử dụng Agrotobacterium rizogenes chứa gene rol cảm ứng
tạo rễ tóc. Kết quả cho thấy rễ tóc được ni cấy trong mơi trường lỏng lắc sinh trưởng tốt
và có sự hiện diện của 3 hoại chất saponin đặc trưng trong Sâm Ngọc Linh. Ni cấy rễ
tóc với những ưu điểm vượt bậc đã được khẳng định là sinh trưởng mạnh, không hướng
đất, không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh, bền vững về mặt
di truyền và có khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc
bằng cây mẹ giúp giảm được những ảnh hưởng không mong muốn đến sức khỏe người
tiêu dùng và nâng cao tính an tồn của sản phẩm, mở ra giải pháp mới cho sản xuất
saponin ở quy mô công nghiệp.
Mai Trường và cộng sự (2014) đã thành công trong việc tạo và nhân phôi soma Sâm
Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et Grushv. trong môi trường lỏng.
Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong
nghiên cứu quá trình cứu hình thái của cây Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Ha et
Grushv. Trước nhu cầu rất lớn về Sâm Ngọc Linh dùng để làm thuốc, thực phẩm chức
năng của các công ty dược và người dân, một số Trung tâm nuôi cấy mô đã chuyển hướng
nghiên cứu nhân nhanh giống Sâm Ngọc Linh in vitro.
Trong nhân giống in vitro thực vật, ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và
thời gian chiếu sáng đều có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát triển của thực vật. Tổng
lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt q trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên
quang hợp, sự sinh trưởng và năng suất của cây. Nguồn sáng nhân tạo sử dụng phổ biến
trong nhân giống in vitro hiện nay là đèn huỳnh quang. Mặc dù một số đèn huỳnh quang
thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang đều tỏa nhiệt, lại
phải tiêu tốn thêm một phần điện năng để làm giảm nhiệt độ nóng do các đèn này gây ra.
Theo Dương Tấn Nhựt (2002), chi phí điện năng ước tính khoảng 65% dùng cho thắp
sáng trong phịng ni cây và khoảng 25% để làm mát phịng ni. Do đó, sự phát triển
6
nguồn bức xạ hiệu quả hơn được sử dụng trong các phịng ni cấy mơ sẽ mang lại nguồn
lợi đáng kể để giảm chi phí sản xuất trong vi nhân giống.
Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô ở đối tượng cây Sâm
Ngọc Linh chưa nhiều vì đây là lồi Sâm đặc hữu của Việt Nam. Các nghiên cứu trong
nước về lĩnh vực nuôi cấy mô hiện nay chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ảnh hưởng của
các phytohormone trong quá trình phát sinh hình thái hay sinh trưởng và phát triển của
thực vật, cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy, chuyển gene, chủ
yếu là nghiên cứu tạo mô sẹo, phát sinh phơi, ni cấy rễ tóc, thu sinh khối trong
bioreactor, các kết quả đạt được là tiền đề cho các nghiên cứu sâu. Đặc điểm của Sâm
Ngọc Linh là tăng trưởng rất chậm, yêu cầu sinh thái khắt khe, việc nghiên cứu về tạo củ
in vitro vẫn chưa nhiều, chưa có nghiên cứu nào báo cáo về kiểu bổ sung các thành phần
môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp lỏng-rắn) lên sự tăng trưởng, tạo củ và tích lũy
saponin ở cây Sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến quá
trình sinh trưởng của Sâm Ngọc Linh chỉ có một vài báo cáo được công bố, các nghiên
cứu cũng đã cho thấy rằng Sâm Ngọc Linh được ni cấy in vitro có thành phần hóa học
tương tự như Sâm Ngọc Linh tự nhiên tuy nhiên với hàm lượng thấp, thậm chí một số
chất chỉ được phát hiện ở dạng vết, một số chất chưa được phát hiện trong Sâm nuôi cấy
in vitro. Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng các chất cảm ứng-elicitor có tác động tích
cực đến sự tăng trưởng cũng như quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở thực vật.
Tuy nhiên, đối với từng loại thực vật và mục đích ni cấy, việc lựa chọn loại và nồng độ
các elicitor phải được xem xét kỹ lưỡng. Đây là một lồi dược liệu vơ cùng q giá, việc
hồn thiện quy trình nhân giống và gia tăng hàm lượng dược chất quý hiếm là điều mà
nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và được Chính phủ chú trọng phát triển nguồn cây trồng
quốc gia. Trong đó, nghiên cứu tạo củ in vitro, kích thích tăng trưởng, rút ngắn thời gian
nhân giống, tăng sức sống của cây con nhằm tạo được số lượng lớn cây giống khỏe mạnh,
tăng tỷ lệ sống sót khi chuyển ra vườn ươm là điều vơ cùng cấp thiết.
4. Phạm vi nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu chúng tôi sử dụng là Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro, chúng tôi tập trung vào việc cải tiến môi trường nuôi
cấy bằng cách kế thừa môi trường nhân giống Sâm Ngọc Linh tối ưu của Dương Tấn
7
Nhựt và cộng sự (2012), sau đó khảo sát ảnh hưởng của các elicitor (than hoạt tính,
saccharose và AgNO ) bổ sung vào mơi trường nhằm tìm ra mơi trường bổ sung các chất
3
này cho sự tăng trưởng của mẫu cấy tối ưu nhất. Ánh sáng LED là nguồn chiếu sáng đang
ngày càng phổ biến bởi những tính năng ưu việt của nó như tiêu thụ điện năng thấp, chỉ
chứa một số bước sóng ánh sáng nhất định, độ bền cao, tỏa nhiệt ít, do vậy rất tiết kiệm
năng lượng. LED đã được nghiên cứu trên thực vật nuôi cấy in vitro và mang lại hiệu quả
rất tốt cho sự tăng trưởng của thực vật. Tuy nhiên, trên đối tượng Sâm Ngọc Linh thì chỉ
có một số báo cáo về vai trị của LED. Vì vậy, chúng tơi thiết kế hệ thống LED đơn và
LED kết hợp cải tiến sử dụng các bóng LED trịn được sản xuất sẵn dễ lắp đặt, dễ thi
công, tỏa nhiệt thấp, không gây phát sinh chi phí chuyển đổi điện năng từ dịng điện 110v
sang 220v do các bóng đèn LED trịn có thể sử dụng trực tiếp nguồn điện 220v để khảo
sát vai trò của đèn LED trong nhân giống in vitro Sâm Ngọc Linh nhằm tìm ra nguồn
sáng LED phù hợp cho nhân nhanh giống và gia tăng chất lượng cây giống Sâm Ngọc
Linh. Ni cấy lỏng cho thấy có hiệu quả đối với nhiều lồi thực vật vì mẫu cấy tiếp xúc
với mơi trường tồn diện hơn hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn, tăng sinh khối nhanh hơn,
tuy nhiên đối với mỗi lồi các điều kiện ni cấy lỏng, các thông số kỹ thuật là không
giống nhau, Sâm Ngọc Linh là lồi tăng trưởng chậm, khó ni cấy vì vậy giai đoạn ni
cấy lỏng đóng vai trị cảm ứng giúp mẫu cấy tăng trưởng nhanh rút ngắn thời gian nuôi
cấy, gia tăng sinh khối. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên kiểu bổ sung các thành phần
vào môi trường nuôi cấy (môi trường hai lớp) được thiết lập cho nhân giống cây Sâm
Ngọc Linh nhằm tăng cường khả năng tăng trưởng, tạo củ, tích lũy saponin và gia tăng
chất lượng cây giống.
5. Ý nghĩa của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài sẽ giúp hồn thiện quy trình ni cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.) sẽ cung cấp những cơ sở khoa học cho công tác nhân giống
in vitro cây trồng nói chung và cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
nói riêng. Cung cấp cơ sở khoa học cho bảo vệ nguồn gen cây Sâm Ngọc Linh là một
trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay.
8
Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống LED cải tiến đến khả năng tăng trưởng, tạo củ in
vitro của Sâm Ngọc Linh cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của đèn LED
đến nuôi cấy in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Góp phần định hướng cho những nghiên cứu
tiếp theo về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh in vitro.
Đề tài sẽ cung cấp những tài liệu khoa học về Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.), thuộc chi Panax. Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống
in vitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Các kết quả nghiên cứu sẽ
bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu khoa học về loài Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.).
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xây dựng quy trình nhân nhanh Sâm Ngọc Linh thơng qua khảo sát các chất yếu tố
ảnh hưởng đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nhằm nhân
nhanh với số lượng lớn, hạ giá thành cây giống, góp phần bảo tồn nguồn gene cây thuốc
quý.
Nghiên cứu ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng của cây Sâm Ngọc Linh là
cơ sở đánh giá khả năng ứng dụng của đèn LED trong ni cấy in vitro cây trồng nói
chung và Sâm Ngọc Linh nói riêng, hướng tới tìm nguồn ánh sáng thích hợp thay thế đèn
huỳnh quang và các loại đèn đang dùng trong nuôi cấy Sâm Ngọc Linh hiện nay, là cơ sở
giúp hạ giá thành sản phẩm cây Sâm Ngọc Linh giống. Hoặc định hướng cho các nghiên
cứu tiếp theo về ứng dụng của đèn LED đến cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha
et Grushv.)
9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vi nhân giống và các elicitor
1.1.1. Khái niệm vi nhân giống
Vi nhân giống (micropropagation) hay còn gọi là nhân giống in vitro (in vitro
propagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân
giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ,
sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình ni cấy
khác.
Nhân giống in vitro, trong nhiều thập niên vẫn được xem là một trong những kỹ
thuật hữu hiệu nhất dùng để nhân nhanh các giống cây trồng sạch bệnh đã được tuyển
chọn hoặc các nguồn gene thực vật quý hiếm.
1.1.2. Các chất cảm ứng – Elicitor
Hợp chất thứ cấp của thực vật không chỉ giúp thực vật tự vệ, chống chịu lại sâu bệnh
và điều kiện môi trường khắc nghiệt mà cịn hữu ích cho con người khi có khả năng ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực: y dược, hóa học, mỹ phẩm và nơng nghiệp. Saponin
triterpenoid là hợp chất quý hơn cả vàng có trong chi Nhân Sâm nói chung và Sâm Ngọc
Linh nói riêng. Để thu được lượng lớn hợp chất thứ cấp, theo phương pháp truyền thống
đòi hỏi hao tốn rất nhiều sinh khối thực vật. Do đó, khoa học hiện đại đã nghiên cứu ứng
dụng các chất cảm ứng (elicitor) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thu được lượng lớn
hợp chất đích như mong muốn. Elicitor được định nghĩa là một chất cơ bản mà khi đưa
với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì kích thích sự sinh tổng hợp các hợp chất
thứ cấp trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là q trình cảm ứng hoặc tăng cường sinh
tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng của elicitor
(Namdeo, 2007). Đối với lồi có thời gian tăng trưởng kéo dài và khó nhân giống trong tự
nhiên như Sâm Ngọc Linh, việc bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy vừa
giúp nhân nhanh sinh khối, rút ngắn thời gian tăng trưởng và thu được lượng lớn hợp chất
thứ cấp.
Elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ mầm bệnh và các chất được tiết ra từ thực
vật bằng phản ứng của mầm bệnh (elicitor nội sinh). Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor
có thể được phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.
10
Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học, gồm các
muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật lý như sóng siêu âm, áp suất, nhiệt độ,
và pH.
Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các polysacharide
có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các vi sinh vật (chitin hoặc
glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào có chức năng là gắn với
các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênh
ion.
Ngồi ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng 2 loại elicitor là
elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh.
Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngồi tế bào như các
polysaccharide, polyamine và các acid béo.
Elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được hình thành thơng
qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học hay phi sinh học, chẳng
hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside,... (Namdeo, 2009).
1.1.2.1. Than hoạt tính
Trước đây, than hoạt tính (Actived charcoal – AC) thường được sử dụng để phịng
độc, lọc khơng khí và các chất lỏng. Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất
rộng rãi như một chất có tính hấp phụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mơ
nhờ tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thưc vật (Pan et al.,
1998). Vai trị của AC trong ni cấy mơ tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối”
cho môi trường nuôi cấy, hấp phụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vậy
như phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy (Biniak, 1990). Ngồi ra
than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin (Ebert et al., 1990;
Fridborg et al., 1978), làm thay đổi tỷ lệ thành phần các chất có trong mơi trường ni
cấy cũng như pH môi trường (Wann et al., 1997).
Từ khi AC được ứng dụng trong lĩnh vực nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu
tập trung nghiên cứu và đã công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến mơi trường
nuôi cấy (Buter et al., 1993), tăng cường khả năng tái sinh cây (Krajnáková et al., 2009),
phát sinh phôi (Mathews et al., 1993), tăng sinh tế bào trần (Kunitake H. et al., 1995),
11
ngăn cản sự phát triển bất bình thường của cây con, kích thích q trình hình thành và
phát triển chồi (Kee-Kee-oeup et al., 2000), thúc đây hay ức chế sự tăng trưởng và hình
thành rễ (Christopher et al., 2012); ngồi ra AC cịn có khả năng làm giảm hiện tượng
thủy tinh thể ở một số loài thực vật (Debergh et al.1981).
Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sự (2012) đã tiến hành cấy các chồi cây Hồng môn
vào môi trường được phân thành 2 phần, một phần khơng có AC và phần còn lại bổ sung
các nồng độ AC tối ưu đã khảo sát ở hai đối tượng cây Cúc (3 g/L AC) và Hồng môn (2
g/L AC) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trong mơi trường ni cấy (trên, giữa hoặc
dưới). Kết quả cho thấy, hầu hết các rễ phát sinh trong lớp mơi trường có AC (trên 80%
rễ). Ngoài ra, các kết quả cũng cho thấy sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc
vào vị trí lớp AC nhiều hơn ở cây Cúc. Vị trí lớp mơi trường có AC ở dưới là tối ưu cho
sự phát triển của cây và rễ in vitro của cả cây Cúc và cây Hồng môn. Mặt khác, những
cây sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện in vitro cũng sinh trưởng và phát triển tốt
ở điều kiện ex vitro; điều này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu nhân giống vơ tính cây
trồng.
1.1.2.2. Saccharose
Trong ni cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng, nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắt
buộc (Lê Trần Bình và cộng sự, 1997). Đường saccharose khơng chỉ điều hịa áp suất
thẩm thấu của mơi trường mà còn là nguồn cacbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tế
bào. Nhưng khi nồng độ đường quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây.
Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, trong
đó saccharose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2001). Tùy theo mục
đích ni cấy mà hàm lượng đường cho vào mơi trường khác nhau, thông thường là 30 –
40 g/L là tương đối thích hợp cho nhiều loại cây (Vuylsteke, 1989). Các nghiên cứu trên
dưa Cucumis hystrix (Michael et al., 2001), cây dâu tây (Hyung, 1996) và cây hành
(Teruyuki, 1999) đều cho thấy hàm lượng đường 30 g/L là thích hợp cho chồi phát triển
tốt trong nuôi cấy in vitro.
Theo nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương và cộng sự (2005) đã chứng minh rằng cho
thấy sự phát triển của chồi dưa hấu tam bội tốt nhất trong mơi trường MS có chứa 30 g/L
12
saccharose với 0,5 mg/L BA dưới cường độ ánh sáng 1.800 lux. Những chồi này phát
triển rất tốt, cao và nhiều lá sẽ là vật liệu tốt để nhân chồi, ra nhiều rễ và dễ thuần dưỡng.
1.1.2.3. Bạc nitrate
AgNO3 còn được gọi là bạc nitrate. AgNO3 là chất có khả năng điều khiển quá trình
sinh trưởng, phát triển của chồi thơng qua tác động vào q trình trao đổi ethylene
(Biddington, 1992). Chính vì thế, bổ sung AgNO3 vào mơi trường ni cấy có thể ức chế
việc tổng hợp ethylene hoặc chức năng của ethylene bằng cách tác động lên quá trình tổng
hợp hoặc tác động lên tín hiệu trao đổi chất (Pua và Chi, 1993), qua đó ảnh hưởng đến
sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Do vậy, bạc nitrate cũng là một elicitor.
Các ion bạc dưới dạng nitrate (AgNO3) có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến
quá trình phát sinh cơ quan, sinh phơi, ra rễ in vitro, cảm ứng hoa, ra hoa sớm, kiểm soát
hiện tượng rụng lá thông qua việc ức chế hoạt động của ethylene (Sharma, 2008).
Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều
hòa sinh trưởng thực vật và khoáng vi lượng đến sự sinh trưởng và ra hoa in vitro của cây
hoa hồng cho thấy kết quả là bổ sung 30 µM AgNO3 là tốt nhất cho sự sinh trưởng và
hình thành hoa với tỷ lệ ra hoa ở các giống hoa hồng.
Trương Thị Phương Lan và cộng sự (2017) nghiên cứ ảnh hưởng của AgNO3 đến
quá trình tái sinh cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) cho thấy kết quả là bổ sung
1,5 mg/L AgNO3 vừa có thể tạo rễ lẫn phát sinh chồi mới.
1.1.3. Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc
Nuôi cấy lỏng lắc: nuôi cấy lỏng lắc thúc đẩy sự phân chia và tăng trưởng của tế bào
trong môi trường lỏng (Torres, 1989). Là phương pháp ni cấy thực vật bằng mơi trường
lỏng, bình ni cấy được đặt trên máy lắc (shaker), tuỳ vào mục đích ni cấy, đối tượng
ni cấy mà số vịng quay của máy lắc được điều chỉnh khác nhau (từ 90 – 180
vịng/phút).
Các tế bào được tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng do mẫu được ngâm trực tiếp
vào dung dịch mơi trường. Sự thơng khí được thực thực hiện nhờ máy lắc ở tốc độ 100 –
150 vịng/phút. Khí đưa vào phải đảm bảo vơ trùng. Q trình thơng khí cịn ngăn chặn và
làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau.
13
Theo Thomass và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 mL, tốc
độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 − 150 vịng/phút. Thể tích của mơi trường lỏng phải
phù hợp với kích thước bình ni cấy, thường chiếm 20% thể tích bình.
Debergh (1983) và George (1993) đã cho rằng lượng nước trong môi trường thạch rắn
thấp khiến cho sự hấp thụ bởi thực vật thấp hơn so với môi trường lỏng lắc.
Các nuôi cấy quy mơ nhỏ như phịng thí nghiệm và trong những thời gian ngắn, có
thể máy lắc từ ở tốc độ 250 vịng/phút và thời gian ni cấy thường từ 10 – 15 ngày. Sau
đó, các mẫu ni cấy phải được chuyển vào môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng
và phát triển của các tế bào.
Phương pháp nuôi cấy lỏng lắc có ưu thế hơn các phương pháp khác là mẫu cấy
được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển
nhanh. Nhờ việc liên tục được di chuyển trong môi truờng ni cấy nên ít xảy ra hiện
tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo ra được nhiều chồi hơn.
Mục đích của ni cấy lỏng lắc:
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật bằng môi trường lỏng sẽ khắc phục
được một số nhược điểm khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn:
Các mẫu nuôi cấy được ngập và phân bố theo không gian 3 chiều nên tiết kiệm được
không gian, mẫu cấy hấp thụ hết mơi trường dinh dưỡng trong bình ni cấy. Tăng cường
được sự thống khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh.
Khi nuôi cấy ngập và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn
bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau. Giảm chi phí sản xuất thơng
qua việc giảm được lượng agar sử dụng cho môi trường nuôi cấy.
Khó khăn của ni cấy lỏng lắc:
Khó khăn lớn nhất của nuôi cấy lỏng lắc là mẫu mô nuôi cấy bị tổn thương do q
trình lắc. Những khối mơ hay cơ quan tế bào thực vật mới hình thành cịn non yếu, nếu bị
va đập mạnh sẽ làm dập nát khối mơ non. Từ đó khả năng nhân nhanh tế bào bị giảm sút.
Q trình nhân nhanh khối mơ hay tế bào sử dụng môi trường lỏng thay cho môi
trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Môi trường nuôi cấy
lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy
tinh thể (hyperhydricity hay vitrification).
