Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển bộ kít phát hiện độc tố ricin dựa trên công nghệ aptamer

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGƠ NGỌC TRUNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN
ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ APTAMER

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGƠ NGỌC TRUNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN
ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CƠNG NGHỆ APTAMER

Chun ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9420101.16
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. PGS. TS Lê Quang Huấn
2. PGS. TS Nguyễn Đình Thắng

HÀ NỘI - 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nghiên cứu nào, các dữ liệu tham khảo được trích dẫn đầy đủ.
Hà Nội, ngày 08 tháng 11 năm 2020
Tác giả luận án

Ngô Ngọc Trung


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn PGS.
TS Lê Quang Huấn, PGS.TS Nguyễn Đình Thắng đã định hướng nghiên cứu và tận
tình hướng dẫn em thực hiện nội dung của luận án.
Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phịng Cơng nghệ tế bào động vật/ Viện
Cơng nghệ Sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ mơn Hóa
sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học/ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà
Nội, Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã quan tâm
giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi và dành thời gian cho em trong quá trình thực hiện
và hoàn thành luận án.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ,
đồng nghiệp tại Viện Hóa học Mơi trường qn sự/ Bộ Tư lệnh Hóa học đã có
những chia sẻ, động viên trong những năm em thực hiện luận án.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên giúp
đỡ trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận án.

Hà Nội, tháng 11 năm 2020
Nghiên cứu sinh

Ngô Ngọc Trung

MỤC LỤC
Trang
Danh mục các chữ viết tắt

i

Danh mục các bảng

iii

Danh mục các hình

v

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

3

1.1. RICIN

3

1.1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu

3

1.1.2. Cấu trúc phân tử và cơ chế tác động của ricin

4

1.1.2.1 Cấu trúc phân tử của ricin

4

1.1.2.2 Cơ chế tác động của ricin

7

1.1.3 Độc tính và ứng dụng của ricin

9

1.1.3.1 Độc tính của ricin

9

1.1.3.2 Ứng dụng trong y học

9

1.1.3.3 Ứng dụng trong quân sự

10

1.1.4 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin

11

1.1.4.1 Các phương pháp tách chiết ricin

11

1.1.4.2 Các phương pháp tinh sạch ricin

11

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về ricin trong và ngồi nước

12

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu ricin trên thế giới

12

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ricin tại Việt Nam

13

1.1.6 Các phương pháp phát hiện ricin

13

1.1.6.1 Phương pháp miễn dịch đánh dấu phóng xạ (RIA)

13

1.1.6.2 Phương pháp sử dụng cảm biến sinh học

14

1.1.6.3 Phương pháp sắc ký miễn dịch

15

1.1.6.4 Phương pháp ELISA

16

1.1.6.5 Phương pháp PCR, RT-PCR và I-PCR

17

1.1.6.6 Một số phương pháp khác

20


1.2 APTAMER VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN RICIN

21

1.2.1 Giới thiệu về aptamer

21

1.2.2 Các quy trình thu nhận aptamer

23

1.2.2.1 Quy trình SELEX

23

1.2.2.2 Quy trình SELEX sử dụng màng lọc nitrocellulose

24

1.2.2.3 Quy trình SELEX sử dụng sắc ký ái lực và hạt từ

24

1.2.3. Các phương pháp xác định ái lực của aptamer với phân tử đích

25

1.2.4 Nghiên cứu về sự tương tác giữa aptamer và ricin

26

1.2.5 Thư viện aptamer sử dụng trong sàng lọc ricin

27

1.2.6 Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước

28

1.2.6.1 Các nghiên cứu của aptamer phát hiện kháng nguyên

28

1.2.6.2 Các nghiên cứu về aptamer phát hiện ricin

29

1.2.7 Thành phần và nguyên lý hoạt động của một số bộ kít phát hiện ricin

30

1.2.7.1 Bộ kít phát hiện ricin theo phương pháp ELISA

30

1.2.7.2 Bộ kít phát hiện ricin theo phương pháp real-time PCR

32

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

34

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

34

2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU VÀ HĨA CHẤT

34

2.2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

34

2.2.2 Các hóa chất chính

35

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

35

2.3.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin

35

2.3.1.1 Tách chiết ricin từ hạt Thầu Dầu

35

2.3.1.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel

36

2.3.2. Các phương pháp xác định ricin

36

2.3.2.1 Xác định hàm lượng protein

36

2.3.2.2 Xác định độ tinh sạch của ricin bằng phương pháp điện di

36

2.3.2.3 Phân tích khối phổ xác định ricin (LC-MS/MS)

36

2.3.2.4 Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin

37


2.3.2.5 Xác định hàm lượng ricin tương đối dựa trên test phát hiện nhanh

38

2.3.2.6 Kiểm tra sự có mặt của ricin bằng phương pháp Western blot

38

2.3.3 Phương pháp SELEX cải tiến sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin

40

2.3.3.1 Chuẩn bị thư viện ssDNA thứ cấp

41

2.3.3.2 Gắn kết aptamer và Q sepharose fast flow

41

2.3.3.3 Rửa, giải hấp và thu sản phẩm

42

2.3.4 Các phương pháp sử dụng để chọn lọc aptamer

43

2.3.4.1 Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR

44

2.3.4.2 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng

45

2.3.4.3 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α

45

2.3.4.4 Chọn dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp

46

2.3.4.5 Phương pháp giải trình tự axit nucleic tự động

47

2.3.4.6 Phương pháp điện di trên gel agarose

47

2.3.4.7 Phương pháp tính giá trị hằng số phân ly K d

47

2.3.4.8 Dự đốn cấu hình khơng gian của aptamer

48

2.3.5 Phương pháp chọn dòng aptamer bằng Enzyme – Limked Aptamer Assay
(ELAA)
2.3.6 Xác định ricin bằng phương pháp Enzyme - Linked Aptamer Assay
(ELAA)

48
49

2.3.7 Xác định ricin bằng phương pháp Real-time PCR

50

2.3.7.1 Xây dựng mối tương quan giữa ricin với aptamer Ar5.9

51

2.3.7.2 Phương pháp real-time PCR để phát hiện aptamer Ar5.9

51

2.3.8 Thẩm định sự phù hợp của phương pháp

51

2.3.8.1 Giới hạn phát hiện (LOD)

52

2.3.8.2 Giới hạn định lượng (LOQ)

52

2.3.8.3 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu

52

2.3.8.4 Xác định độ chính xác, độ khơng đảm bảo đo

53

2.3.8.5 Độ ổn định của phương pháp

56

2.3.9 Phương pháp lấy mẫu nước

57


2.3.10 Phương pháp thống kê trong xử lý kết quả thí nghiệm

57

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

58

3.1. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU

58

3.1.1 Tách chiết protein tổng số từ hạt Thầu Dầu

58

3.1.2 Kết quả tinh sạch ricin

60

3.1.2.1 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion

60

3.1.2.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel

62

3.1.3 Kết quả xác định ricin bằng sắc ký khối phổ LC- MS/MS

66

3.2 NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU RICIN

70

3.2.1 Chuẩn bị thư viện TV40

70

3.2.2 Nhân aptamer sợi đơn (ssADN) từ thư viện TV40 bằng phản ứng PCR
mồi lệch, cặp ApF2/ApR2

73

3.2.3 Sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin

71

3.2.4 Kết quả tách dòng và giải trình tự nucleotide của aptamer

72

3.2.5 Xác định giá trị Kd cho các aptamer đặc hiệu ricin

76

3.2.6 Xác định tính đặc hiệu của aptamer Ar5.9

83

3.3 KẾT QUẢ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN
RICIN
3.3.1 Phát triển phương pháp phát hiện ricin bằng Aptamer Ar5.9 dựa trên
nguyên lý ELAA

86
86

3.3.1.1 Khảo sát các thành phần phản ứng ELAA

86

3.3.1.2 Xây dựng đường chuẩn giữa ricin và aptamer Ar5.9

87

3.3.1.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

89

3.3.1.4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp ELAA

90

3.3.1.5 Xác định khả năng phản ứng chéo trong phương pháp ELAA

93

3.3.1.6 Xác định độ chính xác của phương pháp

94

3.3.1.7 Xác định độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của phương pháp

96

3.3.1.8 Xác định độ ổn định của phương pháp theo thời gian

97

3.3.2 Phát triển phương pháp phát hiện ricin bằng Aptamer Ar5.9 dựa trên kỹ

99


thuật real-time PCR
3.3.2.1 Kết quả kiểm tra phản ứng real-time PCR với aptamer Ar5.9
3.3.2.2 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu tách aptamer Ar5.9 từ phức hợp kháng
thể đơn dòng - ricin - Aptamer Ar5.9

99
100

3.3.2.3 Khảo sát một số thành phần của phản ứng real-time PCR

101

3.3.2.4 Xây dựng đường chuẩn giữa ricin - aptamer Ar5.9

105

3.3.2.5 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

107

3.3.2.6 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp

108

3.3.2.7 Xác định khả năng phản ứng chéo của phương pháp real-time PCR

109

3.3.2.8 Xác định độ chính xác của phương pháp

110

3.3.2.9 Xác định độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của phương pháp

112

3.3.2.10 Xác định độ ổn định của phương pháp theo thời gian

113

3.3.3 Đánh giá, so sánh 02 phương pháp phát hiện ricin

115

3.3.4 Nghiên cứu sản xuất bộ kít phát hiện ricin trong mẫu nước

116

3.3.4.1 Xây dựng quy trình sản xuất kít phát hiện ricin bằng phương pháp realtime PCR kết hợp aptamer Ar5.9

116

3.3.4.2 Đặc tính kỹ thuật của bộ kít

118

3.3.4.3 Quy trình phân tích

119

3.3.4.4 Kết quả thực hành sử dụng trong phát hiện ricin tại hiện trường

120

3.3.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của bộ kít

124

3.3.5.1 Ảnh hưởng của một số kim loại nặng

124

3.3.5.2 Ảnh hưởng của một số loại ion vô cơ

125

3.3.5.3Ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt

126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

128

DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN

129

ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

130


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSA

Bovine serum albumine -Albumin huyết thanh bị

CDC

Centers of Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm sốt và ngăn ngừa bệnh dịch)

NBCW

Nuclear - Biology - Chemistry weapons - Vũ khí Hóa sinh hạt nhân

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Real - time Polymerase Chain Reaction

ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

RIP

Ribosome Inhibiting Protein -Protein ức chế ribosome

RTA

Ricin Toxin chain A - Chuỗi A của độc tố ricin

RTB

Ricin Toxin chain B - Chuỗi B của độc tố ricin

RIA

Radioimmunoassay - Miễn dịch đánh dấu phóng xạ

NATO

North Atlantic Treaty Organization
(Tổ chức Hiệp ước Bắc Đại Tây Dương)

SELEX

Systematic evolution of ligands by exponential enrichment

2-ME

2-Mercaptoethanol

ssADN

Sợi đơn ADN

ELAA

Enzym - Linked Aptamer Assay

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

SD

Độ lệch chuẩn

kDa

Kilo Dalton

LC-MS/MS

Liquid Chromatography Mass Spectrometry
Sắc ký lỏng khối phổ

HPLC

High-performance liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
i

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TE

Tris - EDTA

TEMED

N,N,N’,N’-tetramethylenediamide

SDS– PAGE

Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis

PBS

Phosphat Buffer Saline

OPCW

Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons
(Tổ chức cấm phổ biến vũ khí hóa học)

TPBS

PBS + 0,05% Tween -20

PBSM

PBS + 0,1% methyl cellulose

TBS

Tris Buffer Saline (Đệm TBS)

TTBS

Tween - Tris Buffer Saline (Đệm Tris-Tween)

TMB

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

SB

Sodium Borate buffer (Đệm SB)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

LB

Lysogeny Broth (Môi trường LB)

HRP

Horseradish Peroxidase

AOAC

Association of Official Analytical Chemists
(Hiệp hội các nhà hố học phân tích chính thống)

DEAE

Diethylaminoethanol

ppm

Parts per million - Một phần triệu

ppb

Parts per billion - Một phần tỷ

ii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Thành phần bộ kít phát hiện ricin của tetracore

31

2.1

Thành phần các chất trong phản ứng real-time PCR

51

2.2

Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau

54

2.3

Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau

55

2.4

Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu

55

3.1

Kết quả tách protein từ hạt Thầu Dầu bằng muối (NH4)2SO4

58

3.2

Kết quả xác định ricin trong các dung dịch protein sau tủa muối

59

3.3
3.4

Kết quả xác định ricin trong các phân đoạn chạy sắc ký trao đổi ion
bằng test phát hiện nhanh
Kết quả xác định ricin trong các phân đoạn chạy sắc ký lọc gel bằng
test phát hiện nhanh

60
63

3.5

Các bước tách và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu

65

3.6

Kết quả sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin

74

3.7

Trình tự nucleotide của 03 aptamer Ar4.5, Ar5.4 và Ar5.9

80

3.8

Kết qủa xác định tính đặc hiệu với ricin của các aptamer (OD 450nm)

83

3.9

Kết quả ELAA với ricin và Aptamer Ar5.9

89

3.10

Kết quả ELAA trên 10 mẫu trắng

91

3.11
3.12

Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phát hiện ricin theo phương
pháp ELAA
Kết quả xác định khả năng phản ứng chéo với một số loại lectin
tương tự

92
93

3.13

Độ chụm của phương pháp ELAA trong 03 nồng độ ricin

94

3.14

Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp

96

3.15

Giá trị S2 của các đợt thí nghiệm

98

3.16

Giá trị Ftn tại các thời điểm khác nhau so với thời điểm ban đầu

98

3.17

Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp

102

iii


3.18

Kết quả phát hiện ricin sử dụng aptamer Ar5.9

106

3.19

Kết quả real-time PCR trên 10 mẫu trắng

108

3.20
3.21

Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp real-time
PCR sử dụng aptamer Ar5.9 phát hiện ricin
Kết quả Ct (trung bình) xác định khả năng phản ứng chéo với một
số loại lectin tương tự

109
109

3.22

Độ chụm của phương pháp real-time PCR

110

3.23

Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp

112

3.24

Giá trị S2 của các đợt thí nghiệm

113

3.25

Giá trị Ftn tại các thời điểm khác nhau so với thời điểm ban đầu

114

3.26

Các thông số kỹ thuật của 02 phương pháp phát hiện ricin

115

3.27

Thành phần bộ kít Real-time PCR phát hiện ricin cho 96 mẫu

116

3.28

Kết quả xác định ricin bằng bộ kít real-time PCR với các mẫu nước

117

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
1.1

Tên hình

Trang

Cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L) và hạt Thầu Dầu - một trong
3
những nguồn cung cấp ricin từ tự nhiên

1.2

Cấu hình khơng gian của ricin

5

1.3

Tiền chất preproricin

5

1.4

Cấu trúc ricin với các vị trí hoạt động

6

1.5

Cơ chế sinh tổng hợp ricin trong tế bào

6

1.6

Các con đường vận chuyển ricin trong tế bào

8

1.7

Cơ chế hoạt động gây độc của ricin trong ribosome

8

1.8

Cấu trúc của test phát hiện ricin bằng phương pháp sắc ký miễn dịch

16

1.9

Sơ đồ nguyên lý phát hiện ricin qua real-time PCR đoạn ADN marker

19

1.10

Sơ đồ sàng lọc thu nhận aptamer đặc hiệu phân tử đích

24

1.11

Sơ đồ dự đốn vị trí liên kết giữa ricin – aptamer (A) và ricin – kháng
thể đơn dòng (B)

26

1.12

Sơ đồ thư viện ADN sợi đơn

27

2.1

Quy trình tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt Thầu Dầu

40

2.2

Sơ đồ quy trình sàng lọc Aptamer đặc hiệu ricin bằng cột NANOSEP
5K OMEGA

43

2.3

Sơ đồ quy trình tách dịng và chọn lọc aptamer đặc hiệu ricin

44

2.4

Mơ hình đồ thị xác định giá trị Kd

48

2.5

Sơ đồ nguyên lý phát hiện ricin bằng phương pháp ELAA

49

2.6

Sơ đồ nguyên lý phát hiện ricin bằng phương pháp real-time PCR

50

3.1

Điện di đồ SDS-PAGE (3.1 a) và western blot của quá trình tách chiết
ricin

59

3.2

Sắc đồ rửa giải ricin trên cột sắc ký trao đổi ion

61

3.3

Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch sau khi chạy sắc ký trao đổi ion

61

3.4

Sắc ký đồ tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel

62

v


3.5

Kết quả điện di ricin sau chạy sắc ký lọc gel

64

3.6

Kết quả kiểm tra độ tinh sạch ricin bằng phần mềm ImageJ

65

3.7

Trình tự axit amin nhận được và các đoạn peptide (các đoạn có màu)
khi phân tích LC- MS/MS mẫu ricin tinh sạch.

67

3.8

Kết quả phân tích khối phổ ricin trình tự A,B

67

3.9

Kết quả phân tích khối phổ ricin trình tự C,D

68

3.10

So sánh trình tự thu được với thư viện protein

69

3.11

Trình tự phân tích khối phổ MALDI MS của ricin

69

3.12

Kết quả phản ứng PCR từ thư viện TV40

70

3.13

Kết quả PCR với cặp mồi lệch từ thư viện TV40

71

3.14

Kết quả PCR aptamer sau sàng lọc với ricin

76

3.15

Kết quả biến nạp vào vector pBT (3.16A) pCR2.1 (3.16B) vào tế bào
khả biến E. coli DH5α

77

3.16

Kết quả sàng lọc sơ bộ các dịng có thể mang aptamer đặc hiệu ricin

77

3.17

Kết quả sàng lọc sơ bộ các dịng có thể mang aptamer đặc hiệu ricin

78

3.18

Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang aptamer đặc hiệu ricin

78

3.19

Kết quả xác định khả năng gắn kết của 8 aptamer có ái lực cao nhất
với ricin qua phản ứng ELAA

79

3.20

Cấu trúc không gian của Ar4.5

80

3.21

Cấu trúc không gian của aptamer Ar5.4

81

3.22

Cấu trúc khơng gian của aptamer Ar5.9

81

3.23

Mơ hình aptamer SSRA1 của Elise A. Lamont

83

3.24

Đồ thị xác định giá trị Kd của aptamer Ar4.5

84

3.25

Đồ thị xác định giá trị Kd của aptamer Ar5.4

84

3.26

Đồ thị xác định giá trị Kd của aptamer Ar5.9

85

3.27

Kết quả xác định tính đặc hiệu của aptamer Ar5.9 với ricin bằng Dot blot

86

3.28

Kết quả khảo sát hàm lượng aptamer liên kết với ricin

87

3.29

Kết quả khảo sát các loại đệm liên kết và quá trình tiền xử lý aptamer

88

3.30

Đồ thị xác định các điểm hồi quy tuyến tính giữa OD450 và nồng độ

89

vi


ricin trong phản ứng ELAA
3.31

Đường chuẩn xác định hàm lượng ricin bằng phương pháp ELAA

90

3.32

Kết quả phản ứng Real-time PCR với Aptamer Ar5.9

99

3.33

Kết quả điện di sản phẩm sau khi chạy real-time PCR với Ar5.9

100

3.34

Kết quả phản ứng real-time PCR sử dụng Aptamer Ar5.9 sau khi biến
tính (tách ra khỏi phức hợp Aptamer - ricin) ở các nhiệt độ khác nhau

101

3.35

Kết quả phản ứng realtime PCR ở nhiệt độ 62 oC

102

3.36

Kết quả phản ứng real-time PCR với các nồng độ primer khác nhau

103

3.37

Kết quả chạy phản ứng realtime PCR với master mix IDT

104

3.38

Kết quả chạy phản ứng realtime PCR với master mix Bioneer

105

3.39

Mối tương quan giữa nồng độ ricin - aptamer và giá trị Ct

106

3.40

Phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa Ct và nồng
độ aptamer Ar5.9

107

3.41

Kết quả xác định ricin bằng phương pháp sắc ký miễn dịch

124

3.42

Ảnh hưởng của một số kim loại nặng đến độ chính xác của bộ kít

125

3.43

Ảnh hưởng của một số loại muối vơ cơ đến độ chính xác của kít

126

3.44

Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa đến độ chính xác của kít

126

vii


MỞ ĐẦU
Ricin là một loại protein có đặc tính liên kết đặc hiệu với đường, thuộc nhóm
lectin, có nhiều nhất trong hạt Thầu Dầu (Ricinus communis.L.). Ricin được xem
như một loại tác nhân sinh học điển hình do có độc tính cao với người và động vật.
Trung tâm kiểm sốt và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ xếp ricin vào mức độ nguy

hiểm nhóm B cùng với các loại vi sinh và độc tố khác như phẩy khuẩn tả (Vibrio
cholera), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm
(Escherichia coli O157:H7) và độc tố Botulinum. Bởi vậy, ricin được quan tâm như
một tác nhân sinh học có thể gây nguy hiểm cho người khi được sử dụng trong
khủng bố hoặc chiến tranh sử dụng vũ khí sinh học.
Có nhiều phương pháp phát hiện ricin trong mơi trường, trong tế bào và sinh
vật. Trong khuôn khổ luận án này, tác giả tập trung hướng nghiên cứu phát hiện
ricin trong các mẫu môi trường, phục vụ quân đội để trinh sát phát hiện tác nhân
nguy hiểm này.
Để phát hiện ricin trong mẫu môi trường, người ta hay sử dụng các phương
pháp đặc hiệu để phát hiện nhanh và chính xác có độ nhạy lên đến nanogram như:
sắc ký miễn dịch, ELISA, sử dụng các Aptamer đặc hiệu ricin, tán xạ raman dựa
trên aptamer, Real-time PCR... Các phương pháp miễn dịch và ELISA địi hỏi phải
có ricin chuẩn (là đối chứng dương) và các kháng thể đơn dòng kháng ricin (kháng
thể kháng chuỗi A và kháng chuỗi B của ricin), kháng thể này chỉ có một số ít cơng
ty trên thế giới sở hữu nên chỉ có thể đặt mua với số lượng hạn chế với giá thành
cao. Ricin cũng khơng thể mua được dạng thương mại vì liên quan đến tính gây độc
cực cao cũng như việc tham gia hiệp ước khơng phổ biến vũ khí hủy diệt lớn mà
Việt Nam là một thành viên. Chính vì vậy, việc tách, tinh sạch ricin và tìm ra những
phân tử nhằm thay thế kháng thể đơn dịng có ái lực cao với ricin là một hướng
nghiên cứu cần thiết. Sử dụng aptamer chính là một trong các hướng nghiên cứu thay
thế đáng quan tâm cho vấn đề này.
Aptamer là các sợi đơn oligonucleotide ADN hoặc ARN có cấu trúc đặc biệt
và có khả năng gắn kết đặc hiệu với các phân tử đích khác nhau, ví dụ như các phân
1


tử hữu cơ nhỏ, các dạng protein hay tế bào ung thư. So với kháng thể đơn dịng thì
aptamer có các ưu thế như: ổn định về mặt hóa học trong phạm vi nhiệt độ cao đến
90OC, có thể biến tính thuận nghịch và có thể được phân lập bằng phương pháp in

vitro mà khơng có phản ứng miễn dịch. Hơn nữa, các sợi aptamer được tổng hợp
một cách nhanh chóng thơng qua phản ứng PCR sau một vài chu trình, có thể dễ
dàng sửa đổi và đánh dấu bằng các kỹ thuật đơn giản mà không làm ảnh hưởng đến
khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích. Aptamer hiện nay đang được nghiên
cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực chẩn đốn phát hiện
kháng nguyên, phát hiện dư lượng kháng sinh và điều trị vận chuyển thuốc. Bởi
vậy, nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin, nghiên cứu phương pháp và bộ kít
phát hiện ricin là một trong những vấn đề cần thiết hiện nay.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu phát triển bộ kít phát hiện độc tố ricin dựa trên công nghệ aptamer” nhằm
phát hiện và đinh lượng độc tố ricin trong môi trường nước bằng cách kết hợp giữa
aptamer đặc hiệu ricin cùng với các phương pháp hiện đại là ELISA và real - time PCR.
Luận án được tiến hành với các mục tiêu sau:
- Tách, tinh sạch độc tố ricin từ hạt Thầu Dầu được trồng tại Việt Nam.
- Sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin.
- Phát triển các phương pháp và xây dựng quy trình, sản xuất các thành phần
bộ kít phát hiện ricin và ứng dụng trong phân tích mẫu nước.
Những đóng góp mới của luận án:
- Đã đưa ra quy trình tách chiết và tinh sạch ricin tại Việt Nam dựa trên
phương pháp kết tủa bằng muối trung tính kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký
lọc gel.
- Đã sàng lọc được 03 dịng aptamer đặc hiệu với ricin trong đó aptamer Ar5.9
có ái lực cao nhất với ricin, giá trị Kd = 0,83 nM.
- Đã phát triển được 02 phương pháp phân tích ricin sử dụng aptamer đặc hiệu
ricin và quy trình chế tạo bộ kít phát hiện ricin bằng phương pháp real-time PCR,
bước đầu ứng dụng bộ kít phân tích ricin trong các mẫu nước.
2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 RICIN
1.1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu
Ricin là một loại protein thuộc nhóm chimerolectin, được tìm thấy nhiều trong
tự nhiên, nhất là trong hạt cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L). Cây Thầu Dầu
thuộc họ Euphorbiaceae, chi Ricinus, loài Ricinus communis.L. Cây Thầu Dầu có
nguồn gốc từ vùng Đơng Phi nhưng hiện nay được trồng phổ biến trên toàn cầu. Hạt
Thầu Dầu chứa 45÷50% dầu, 25% chất albuminosid, một số loại tinh dầu và
nitrogen (ricidin), axít malic, một số loại đường và muối, cellulose, ricin và ricinin,
các enzyme thủy phân trong đó có lipase [19]. Theo các nghiên cứu của Funatsu và
cộng sự thì tỷ lệ ricin trong hạt Thầu Dầu tương đối cao, chiếm tới 0,2 – 0,3% khối
lượng khơ. Ngồi ra, ricin cũng tồn tại lâu trong nước, đất mà khơng mất đi hoạt
tính sinh học [49].

Hình 1.1: Cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L) và hạt Thầu Dầu –
Một trong những nguồn cung cấp ricin từ tự nhiên [19]
Trong tế bào của hạt Thầu Dầu, ricin được chứa trong không bào dự trữ
protein. Tương tự như các thành phần dự trữ protein khác của không bào, ricin được
tổng hợp trong q trình chín của hạt và được thủy phân trong vài ngày đầu sau khi
nảy mầm. Ngoài ra, có một số dạng cấu trúc tương tự ricin là ricin D, E và một loại
lectin có liên quan là agglutinin (RCA) cũng được tìm thấy trong hạt Thầu Dầu.
Tổng cộng ricin chiếm khoảng 5% lượng protein tổng số trong hạt trưởng thành [21, 35].
3


Cũng như các lectin có nguồn gốc thực vật khác, ricin có tính đặc hiệu liên kết
với một số loại đường và đặc hiệu ngưng kết nhóm máu. Ricin có thể liên kết với
các phân tử đường đơn hoặc các gốc đường nằm trên bề mặt màng tế bào như
galactose hoặc N - acetyl-galactosamine. Đặc biệt, chuỗi B của phân tử ricin có liên
kết chặt chẽ với gốc đường galactose bằng các liên kết phân cực (liên kết giữa các
nhóm - OH của đường với các đầu phân cực của các gốc axit amin trên phân tử

ricin) và các liên kết không phân cực như liên kết không gian, liên kết Vander Wall [135].
1.1.2. Cấu trúc phân tử và cơ chế tác động của ricin
1.1.2.1 Cấu trúc phân tử của ricin
Các nghiên cứu đã cho thấy ricin có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa với
cấu trúc phân tử gồm hai chuỗi polypeptide được ký hiệu là chuỗi A và chuỗi B.
Hai chuỗi được liên kết với nhau qua cầu nối disulfide (-S-S-). Trong cấu trúc
không gian, chúng cuộn xoắn tạo thành hình cầu [100]. Chuỗi A có khối lượng phân
tử vào khoảng 30-32 kDa, được cấu tạo từ 267 axit amin và là thành phần chính gây
độc cho tế bào. Chuỗi B có khối lượng phân tử khoảng 32-34 kDa, gồm 262 axit
amin tạo nên và là thành phần liên kết đặc hiệu với đường galactose trên bề mặt tế
bào, giúp cho quá trình xâm nhập của ricin vào trong tế bào. Cấu trúc ba chiều của
ricin đã được phân tích bằng phương pháp tinh thể học tia X và được nghiên cứu chi
tiết đến độ phân giải 2,5 Å [109], cấu trúc giả định 3D [96]. Mơ hình này cho phép
mơ tả chính xác và chi tiết về cấu trúc của cả chuỗi A và chuỗi B. Trong một nghiên
cứu khác, cấu trúc của chuỗi A tái tổ hợp đã được phân tích đến độ phân giải 2,3 Å [95].
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuỗi B có đặc tính liên kết đặc hiệu với gốc
đường galactose của màng tế bào để tạo ra glycoprotein, chịu trách nhiệm liên kết
với màng tế bào để vận chuyển ricin qua màng. Chuỗi A là thành phần gây độc cho
tế bào bằng cách liên kết và gây bất hoạt ribosome.

4


Hình 1.2: Cấu trúc khơng gian của ricin [100]
Chuỗi màu đỏ: chuỗi A; Chuỗi màu xanh: chuỗi B; Màu vàng: cầu nối disulfide
Mặc dù ricin được cấu tạo bởi 2 chuỗi, nhưng các chuỗi A và B lại được tổng
hợp cùng nhau như là một bộ phận của một polypeptide tiền chất (preproricin) duy
nhất. Tiền chất này có 576 axit amin trong đó 26 axit amin đầu tiên là chuỗi peptide
tín hiệu định hướng việc chuyển protein mới tạo thành đến mạng lưới nội chất.
Peptide tín hiệu này theo sau bởi một propeptide gồm 9 axit amin, chuỗi A hoàn

chỉnh, một propeptide nội phân tử và chuỗi B. Trong mạng lưới nội chất, proricin
mới tạo thành được glycosyl hóa và 2 chuỗi A và B được liên kết với nhau qua cầu
nối disulfide ở vị trí liên kết propedtide trước khi được chuyển vào không bào thông
qua thể Golgi [28]. Sự vận chuyển nội bào này đi kèm với một số biến đổi chưa
được hiểu rõ, bao gồm cắt ngắn các oligosaccharide và thêm fucose vào chuỗi A.
Khi đến không bào, chuỗi A và chuỗi B kết hợp với nhau qua cầu nối disulfide nhờ
sự loại bỏ các propeptide đầu N và các liên kết nội bộ để hình thành nên phân tử
ricin hồn chỉnh [67].

Hình 1.3. Tiền chất preproricin [39].

5


Hình 1.4: Cấu trúc ricin với các vị trí hoạt động [56].
Chuỗi A (chuỗi màu trắng): có vị trí hoạt động gây độc (phần màu xanh trong chuỗi A)
Chuỗi B (chuỗi màu xanh) có 2 vị trí gắn kết đặc hiệu với galactose (màu xanh lá cây)

Hình 1.5: Cơ chế sinh tổng hợp ricin trong tế bào [41]

6


Ricin được tạo ra dạng hồn chỉnh trong khơng bào nội nhũ và được dự trữ tại
đây, điều này cho phép ricin khơng ảnh hưởng đến các chức năng bình thường của
tế bào chứa nó và đồng thời khơng bào nội nhũ là nơi lưu trữ lâu dài của ricin trong
tế bào của hạt Thầu Dầu [41].
1.1.2.2 Cơ chế tác động của ricin
Khi ricin được ủ với các tế bào ở 370C, độc tố sẽ được hấp thụ vào tế bào bằng
hiện tượng nhập bào. Quá trình nhập bào tương đối chậm, khoảng 10% mỗi giờ và

được đưa vào qua các lớp đệm niêm mạc. Tuy nhiên, các nghiên cứu của Doan đã
chứng tỏ q trình nhập bào khơng liên quan nhiều đến lớp đệm niêm mạc mà thông
qua một con đường khác gọi là qua trung gian thụ thể sử dụng protein clarthin để
tổng hợp thành các túi chứa ricin [39]. Dù là con đường nào thì sau khi nhập bào,
ricin được chuyển đến endosome, tại đây xảy ra 03 trường hợp:
- Trường hợp 1: Ricin được giải phóng ra ngoài tế bào.
- Trường hợp 2: Ricin được vận chuyển đến lysosome và bị phân hủy;
- Trường hợp 3: Ricin được vận chuyển đến bộ máy Golgi (R3).
Khi được vận chuyển đến thể golgi (trường hợp 3), ricin sẽ liên kết với một số
phân tử glycoprotein và glycolipid trên bề mặt của mạng lưới nội chất, gọi là quá
trình đường hóa và sunphate hóa hay cịn gọi là q trình đánh dấu ricin [84]. Sau
đó, chuỗi A sẽ tách khỏi phân tử ricin, được vận chuyển vào nhân và đi đến
ribosme, chúng làm thay đổi cấu trúc rARN 28S của tiểu đơn vị lớn bằng cách thay
thế một base adenine đơn (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL) [101]. Cụ
thể, chuỗi A bám vào adenin vị trí 4324 (A4324) và loại bỏ Adenine này khỏi vùng
trình tự bảo thủ của RNA ribosome 28S trong vòng sarcin-ricin. Vòng sarcin/ricin
là một trình tự lặp lại ngắn và có vị trí gần đầu 3’ của rARN, chuỗi A bám vào vị trí
này để thực hiện quá trình khử, loại bỏ purin A4324. Sau khi bám vào vòng
sarcin/ricin, chuỗi A kẹp A4324 giữa 2 vòng tyrosin của vùng xúc tác và thủy phân
liên kết C-N glycosidic. Kết quả của quá trình thủy phân dẫn đến ARN ribosome
28S mất một adenin tại vị trí 4324.

7


Hình 1.6: Các con đường vận chuyển ricin trong tế bào [20]
Sự thay đổi này làm cho ribosome không thể tương tác với yếu tố kéo dài
chuỗi 1 (eEF-1) và yếu tố kéo dài chuỗi 2 (eEF-2), do vậy ngăn chặn quá trình dịch
mã và dẫn tế bào vào con đường chết theo chương trình [125].

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động gây độc của ricin trong ribosome [125]
8


1.1.3 Độc tính và ứng dụng của ricin
1.1.3.1 Độc tính của ricin
Độc tính của ricin và các triệu chứng ngộ độc phụ thuộc vào con đường xâm
nhập vào cơ thể cũng như liều lượng hấp thụ. Độc tính đã được chứng minh trên
động vật thí nghiệm thơng qua tiêm tĩnh mạch, hít phải, và hấp thụ qua đường uống.
Bên cạnh đó, ricin cũng có thể gây nhiễm độc cho cơ thể bằng cách hấp thụ qua da
bị tổn thương. Các nghiên cứu trên động vật liên quan đến chuột đã chứng minh
rằng liều gây chết 50% (LD50) của ricin được sử dụng đường tiêm là 5-10 µg/kg
trọng lượng cơ thể [97]. LD50 đối với ricin qua đường hô hấp là 5-20 µg/kg trọng
lượng cơ thể nhưng phụ thuộc nhiều vào kích thước hạt mang ricin, với các hạt nhỏ
hơn (< 5 µm) gây tử vong cao hơn vì chúng có thể lắng sâu hơn vào phổi. LD 50 của
ricin qua đường tiêu hóa ở chuột là 5-20 mg/kg trọng lượng cơ thể. So sánh với
đường tiêm và hơ hấp thì giá trị LD50 đường tiêu hóa thấp hơn rất nhiều bởi qua
đường tiêu hóa, ricin sẽ bị phân hủy nhiều trong quá trình xâm nhập vào đường máu
để vận chuyển đến các cơ quan [76]. Chưa có thử nghiệm độc tính của ricin đối với
con người, tuy nhiên có thể dự đốn dựa trên dữ liệu độc tính của các nghiên cứu
trên động vật (cũng như các nghiên cứu trường hợp về sự nhiễm độc do con người
gây ra). Dựa trên các báo cáo này có thể dự đốn LD50 của người tiếp xúc qua
đường tĩnh mạch hoặc hít phải được ước tính là 5-10 µg/kg trọng lượng cơ thể và 120 mg/kg trọng lượng bằng đường uống [41,76]. Các trường hợp ngộ độc ngẫu
nhiên đã được phát hiện cho thấy khi ăn phải 0,5-30 hạt Thầu Dầu đã dẫn đến các
triệu chứng lâm sàng từ nhẹ đến chết [19].
1.1.3.2 Ứng dụng trong y học
Do có độc tính cao với tế bào động vật nên ricin được xem như một trong
những liệu pháp điều trị ung thư như ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, ung thư da.
Trong một công bố của Guyot và cộng sự cho thấy chuỗi A của phân tử ricin được
sử dụng như một loại kháng độc tố liên kết với kháng thể để sử dụng trong điều trị u

ác tính ở người [56]. Trong những năm gần đây, bằng việc sử dụng công nghệ nano
như việc sử dụng phổ biến các chất mang là hạt nano để phân phối thuốc đến các tế
9