Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
********000********




KHA LUN TT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KHA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S
rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT
THUỘC HỌ Pangasiidae







Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN KIỀU DỢI

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007






BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
********000********





ỨNG DỤNG KHA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S
rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT
THUỘC HỌ Pangasiidae







Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS. NGUYỄN VĂN HẢO NGUYỄN KIỀU DỢI
ThS. NGUYỄN VIẾT DŨNG
KS. NGUYỄN NGUYỄN DU




Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007




iii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.
Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy
cô đã tạo điều kiện tốt và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại
trƣờng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo
và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn Chƣơng Trình Thuỷ Sản Ủy Hội Sông MêKông đã
hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này.
Tôi đặc biệt cảm ơn anh Nguyễn Nguyễn Du, anh Nguyễn Viết Dũng đã tận
tâm, nhiệt tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn anh Lâm Ngọc Châu, anh Nguyễn Văn Phụng phòng
Nguồn Lợi Thủy Sản cùng chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu
Quang Trọng phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều

kiện cho tôi hòan thành tốt đề tài.
Sau cùng tôi xin cảm ơn gia đình cùng bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh
Học k29 đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng
hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.


Sinh viên thực hiện
NGUYỄN KIỀU DỢI









iv

ABSTRACT

Morphological study plays important role in post-larvae fish taxonomy of the
family Pangasiidae that contributes significantly to economy of the MeKong River
Basin. However, this method bring limit true results. therefore we analysised the
level of genetic diversity (A partial region of mitochondrial 16S rRNA gene,
approximately 568 base pairs) of three catfish species to support morphological
method.
In this study, 976 specimens, originating from Mekong and Bassac River
(from june 2006 to september 2006) were analysed morphologically. The result, the
family Pangasiidae rate of 36,56% per in total specimens in 2006; three species (P.

hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) rate of 33,63% per in total
Pangasiidae specimens and individual rate of 11,36% per in total number
Pangasiidae.
All Pangasiidae specimens of 2006 don’t analysised DNA because DNA
was broke by formol. 26 individuals (size from 15 mm to 30 mm) from 64
specimens (6/2007) were add from three species: P. hypophthalmus, P. larnaudii, P.
macronema. All specimens were sequenced and compared with standard sequence
in genbank. This result, Sequences of 8/9 samples P. hypophthalmus similary with
P. hypophthalmus (DQ334282, DQ334385, DQ334287). The exception of H1
sample, with one mutation at site nucleotide 26 to GenBank (DQ334282 –
DQ334289); Sequences of 9 samples P. macronema similary from 99% to 100%
sequences of P. macronema to GenBank (DQ334314); Sequences of 8 samples P.
larnaudii similary 100% sequences of three haplotypes P. larnaudii (DQ334303,
DQ334312, DQ334313). All in all, findings from this study demonstrated that
morphological method correspond with three species P. hypophthalmus, P.
larnaudii, P. macronema.





v

TM TẮT

Khóa phân loại hình thái đóng một vai trò quan trọng trong việc định danh cá
bột và cá con thuộc họ Pangasiidae vốn có ý nghĩa về kinh tế đối với vùng Đồng Bằng
Sông Cửu Long. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho độ chính xác nhất định. Vì vậy
chúng tôi phân tích sự khác nhau ở mức độ di truyền cụ thể là vùng 16S rRNA (xấp xỉ
568 bp) trên DNA ty thể (mt DNA) ở 3 loài (đã có sẵn dữ liệu trên ngân hàng gene) để

hỗ trợ phƣơng pháp định danh hình thái.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phân loại bằng hình thái 976 mẫu cá
thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Kết quả
họ Pangasiidae chiếm 36,56% so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006; 3 loài phân tích (P.
hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm 33,63% so với tổng mẫu
Pangasiidae thu đƣợc nhƣng số lƣợng chỉ chiếm 11,36% so với tổng lƣợng cá thể họ
Pangasidae.
Các mẫu cá năm 2006 sau khi khi phân tích hình thái không phân tích đƣợc
DNA (do DNA bị hủy trong formal), 26 cá thể từ 64 mẫu cá bột thu từ 22/6/2007 đến
tháng 30/6/2007 đƣợc bổ sung của 3 loài nêu trên với kích thƣớc khác nhau (từ 15 mm
– 30 mm), giải trình tự và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng genbank để
kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:
 Trình tự 8/9 mẫu loài P. hypophthalmus tƣơng đồng 100% với trình tự 3
kiểu gen P. hypophthalmus trên ngân hàng gene (DQ334282, DQ334285, DQ334287).
Riêng mẫu H1 có một đột biến thay thế nucleotide ở vị trí thứ 26 so với tám kiểu gene
tham khảo trên ngân hàng gene.
 Trình tự 9 mẫu phân tích loài P. macronema giống từ 99% - 100% trình tự
P. macronema trên ngân hàng gene (DQ334314).
 Trình tự 8 mẫu loài P. larnaudii tƣơng đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P.
larnaudii trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312; DQ334313).
Tóm lại, qua kết quả so sánh trình tự của 26 mẫu thuộc 3 loài phân tích với trình
tự dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene đã khẳng định đƣợc khoá phân loại hình thái đối
với các loài mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp.




vi

MỤC LỤC

ĐỀ MỤC TRANG
Lời cảm tạ .................................................................................................................. III
Abstract .................................................................................................................... IV
Tóm tắt ....................................................................................................................... V
Mục lục ..................................................................................................................... VI
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ IX
Danh sách các hình ..................................................................................................... X
Danh sách các bảng và biểu đồ ................................................................................ XI
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2
1.3. Nội dung đề tài ................................................................................................. 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá ..................................................... 3
2.1.1. Nghiên cứu thế giới ....................................................................................... 3
2.1.2. Nghiên cứu trong nƣớc .................................................................................. 4
2.2. Phƣơng pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc
họ Pangasiidae ........................................................................................................ 5
2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá .................. 8
2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ......... 8
2.3.2. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ................ 8
2.3.3. Phƣơng pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .......... 8
2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) ................................................................ 9




vii

2.3.5. Phƣơng pháp PCR.................................................................................... 11
2.3.6. Phƣơng pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động ........................ 12
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ......................................................... 13
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................................... 13
3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 13
3.2.1. Mẫu cá...................................................................................................... 13
3.2.2. Hóa chất ................................................................................................... 13
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 14
3.3. Phƣơng pháp ................................................................................................... 15
3.3.1. Phƣơng pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột .............................. 15
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform...................... 16
3.3.3. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA ............................ 16
3.3.4. Phƣơng pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose ............................ 17
3.3.5. Phƣơng pháp giải trình tự ........................................................................ 18
3.3.6. Phƣơng pháp so sánh các trình tự ............................................................ 18
3.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 18
3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae
........................................................................................................................... 18
3.4.1.1. Giai đoạn định tính ............................................................................ 18
3.4.1.2. Giai đoạn định lƣợng ........................................................................ 20
3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA ......... 21
3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA .............................. 22
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23
4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ
Pangasiidae ........................................................................................................... 23
4.1.1. Kết quả hình thái phân loại ...................................................................... 23
4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính ...................................................................... 25

viii

4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc
năm 2006 ........................................................................................................ 25
4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu
Pangasiidae .................................................................................................... 27
4.1.3. Kết quả giai đoạn định lƣợng .................................................................. 29
4.1.3.1. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác .......... 29
4.1.2.4. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lƣợng cá
thể họ Pangasiidae ......................................................................................... 31
4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA ............... 33
4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA ..................................... 34
4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA ................................................. 34
4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá ............ 38
4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema ...................................... 38
4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus ................................ 40
4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. ......................................... 42
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 44
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 44
5.2. Tồn tại ............................................................................................................. 45
5.3. Đề xuất ............................................................................................................ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 46
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT


bp Cặp bazơ
DNA Deoxyribonucleic acid
mtDNA Mitochondrial DNA
rRNA Ribosomal Ribonucleotide acid
S Svedberg – đơn vị đo lƣờng vận tốc lắng
PCR Polymerase chain reaction
RFLP Restriction Fragment Length Lolymorphism
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
Taq Thermus aquaticus
UI Unit
UV Ultra violet
P. hypophthalmus Pangasianodon hypophthalmus
P. larnaudii Pangasius larnaudii
P. macronema Pangasius macronema
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
Ctv Cộng tác viên




x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Pangasianodon hypophthalmus Sauvage (1878), 15 mm ........................... 6
Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 16 mm. .............................................. 6
Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm. .......................................... 7
Hình 2.4: H.2.5a. Cấu tạo tổng quát của ty thể. .......................................................... 9
Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan ..................................................... 12
Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm ........................ 33
Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm ............................................. 34
Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm ......................................... 34
Hình 4.4. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu
năm 2006 và năm 2005 ............................................................................................. 35
Hình 4.5: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá
đại diện ...................................................................................................................... 38
Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu
cá P. macronema ....................................................................................................... 39
Hình 4.7: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P.
hypophthalmus .......................................................................................................... 41
Hình 4.8: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P.
larnaudii ................................................................................................................... 43






xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG

Bảng 2.1. Số lƣợng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart
Termvidchakorn,2003) ................................................................................................ 7
Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích .............................................................. 37
Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 ............... 25
Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae ....... 25
Biểu đồ 4.3. Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu
đƣợc ........................................................................................................................... 27
Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu
Pangasiidae .............................................................................................................. 27
Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác ......... 29
Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng
Pangasiidae ............................................................................................................... 29
Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ
Pangasiidae ............................................................................................................... 31
Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng
Pangasiidae ............................................................................................................... 31





1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đồng Bằng Sông Cửu Long nƣớc ta thuộc khu vực hạ lƣu sông Mekong, vốn
có nguồn tài nguyên thủy sản phong phú. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng và
sự thay đổi thành phần các loài cá sẽ giúp ích cho việc quản lý và phát triển chiến
lƣợc cho nghề nuôi trồng thủy sản tại khu vực này.

Phƣơng pháp định danh trong phân loại học đóng vai trò quan trọng vào việc
xác định sự đa dạng các loài cá trong tự nhiên. Theo truyền thống, phƣơng pháp
định danh dựa trên các đặc điểm hình thái là phƣơng pháp đã đƣợc phát triển lâu đời
và có độ tin cậy. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp có thể khó phân biệt đƣợc sự
khác nhau giữa những loài có quan hệ gần, do có sự giới hạn về một số đặc trƣng về
hình thái học, đặc biệt khi mẫu vật là cá bột, hơn nữa công tác bảo quản mẫu cá
cũng có thể làm thay đổi màu sắc tự nhiên của cá dẫn đến khó khăn khi phân loại
một số lƣợng lớn mẫu trong thời gian dài.
Gần đây, cùng với sự phát triển và hiểu biết về sinh học phân tử, nhiều chỉ
thị sinh học phân tử đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhƣ là một công cụ hỗ trợ đắc
lực cho công tác định danh các loài cá. Định danh các loài cá dựa vào vật liệu di
truyền cho độ chính xác cao. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp định danh trên cơ sở phân
tích DNA bộ gen thƣờng gặp một số khó khăn do bộ gen có kích thƣớc lớn, một gen
có thể có nhiều bản sao trên nhiều locus, mỗi locus có nhiều allen khác nhau ... Mặt
khác, cá chịu ảnh hƣởng trực tiếp bởi môi trƣờng, nên có thể mang nhiều biến dị di
truyền trên DNA bộ gen làm cho việc phân tích kết quả lại gặp càng nhiều khó
khăn. Các chỉ thị phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thƣờng là
những trình tự có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến dị khác biệt giữa các
loài, vì thế các gen mã hóa ribosomal RNA (rRNA) là một ứng viên tốt dùng định
danh các loài sinh vật. Việt Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu công bố về phân loại
cá dựa vào bộ gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi bƣớc đầu “Ứng dụng khóa




2

phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột
thuộc họ Pangasiidae”. Nhằm hỗ trợ định danh một số loài cá có giá trị kinh tế quan
trọng thuộc họ Pangasiidae trong khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.

1.2. Mục tiêu đề tài
Ứng dụng một số chỉ tiêu trong hệ thống phân loại hình thái vào phân loại cá bột
thuộc họ Pangasidae để xác định số lƣợng và tỷ lệ các loài Pangasianodon
hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema trong các mẫu thu đƣợc từ tháng
6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long.
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra đánh giá độ tin cậy của khóa phân
loại hình thái nêu trên.
1.3. Nội dung đề tài
Định danh các mẫu cá thu đƣợc trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu thuộc
Đồng Bằng Sông Cửu Long trong năm 2006 và 64 mẫu cá bột bổ sung thu từ
22/6/2007 đến 30/6/2007.
Giải trình tự 26 cá thể (vùng 16S rRNA mã hóa bởi mtDNA) các loài: P.
hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thu vào tháng 6/2007.
So sánh trình tự gen trên mtDNA mã hóa vùng 16S rRNA của một số mẫu phân
tích với trình tự có sẵn trên ngân hàng genbank (dữ liệu di truyền) để kiểm tra và
đánh giá phƣơng pháp định danh hình thái truyền thống sử dụng trên cá bột.








3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá

2.1.1. Nghiên cứu thế giới
Các loài cá thuộc họ Pangasiidae (cá da trơn) đƣợc nhiều nhà khoa học trên
thế giới quan tâm từ rất lâu do đặc tính cho thịt ngon, dồi dào trong tự nhiên và đặc
biệt có giá trị kinh tế cao.
Hàng loạt các công trình nghiên cứu phân loại cá Pangasiidae ra đời trên
nguyên tắc chung là dựa vào các đặc điểm hình thái bên ngoài. Theo tác giả Roberts
và Vidthayanon (1991), họ cá tra (Pangasiidae) vùng Đông Nam Á gồm hai giống:
giống Helicophagus Bleeker, 1858, giống này có hai loài; giống Pangasius
Valenciennes, 1840 có 19 loài. Sau đó, tác giả Walter J. Rainboth (1996), đã bổ
sung thêm ba giống mới là Laides Jordan, 1919; Pangasianodon Chevey, 1930 và
Pteropagasius Flowe, 1937. Tuy nhiên, việc định danh các loài cá thuộc họ
Pangasiidae đều dựa vào một số các đặc trƣng chung: số tiết cơ, số lƣợng vi, số
lƣợng và hình dạng răng, vị trí sắc tố xuất hiện và hình dạng cơ thể. Ngoài ra, tác
giả Gehrke (1991), cũng công bố dữ liệu về ảnh hƣởng thức ăn tự nhiên lên sự phát
triển của cá bột. Đặc biệt là xây dựng bộ hình mô tả điểm đặc trƣng gần 500 loài cá
trên sông MeKong. Riêng Apichart Termvidchakorn từ năm 1983 đã tiến hành
nghiên cứu về sự phân bố và phát triển của cá Caragid ở sông Kuroshio và các vùng
lân cận Cho đến năm 2003 ông mới xuất bản bộ hình cá bột và cá con thuộc lƣu vực
sông Mekong, với 62 loài khác nhau thuộc 21 họ và 14 bộ.
Việc phân loại dựa vào hình thái để phân biệt các loài cá thuộc họ
Pangasiidae đem lại nhiều dữ liệu có giá trị. Tuy nhiên, công tác định danh cá bột
và cá con dựa vào các chỉ tiêu bên ngoài cho độ chính xác nhất định do cá có kích
thƣớc quá nhỏ và chƣa trƣởng thành. Vì vậy, việc phát triển các chỉ thị di truyền
phân tử (DNA marker) có ý nghĩa rất lớn trong việc hỗ trợ định danh các loài cá bột




4

và cá con. Các kỹ thuật hiện nay đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thuỷ sản để tạo
ra các DNA marker nhƣ: RFLP, RAPD, AFLP (xem mục 2.3.1; 2.3.2 và mục 2.3.3).
Ngày nay, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm việc định danh hình thái cá
bột và cá con dựa vào vùng 12S rRNA và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể
(mtDNA) (xem mục 2.3.4).
2.1.2. Nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, các nghiên cứu phân loại bằng hình thái cá nƣớc ngọt Đồng
Bằng Sông Cửu Long tuy đã bắt đầu từ lâu nhƣng đến nay chƣa có một tài liệu nào
hoàn chỉnh, đặc biệt là các loại cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae. Mai Đình
Yên và cộng sự (1962) thống kê thành phần loài của một số loài cá bột và cá con
vớt đƣợc trên sông Hồng ở Hà Nội, tuy nhiên lại ít đề cập đến việc mô tả chi tiết
hình thái từng loài ở giai đoạn cá bột và con. Sau đó hàng loạt các tác giả cũng công
bố số liệu về thành phần loài nhƣ: Mai Đình Yên và cộng sự (1979), Trƣơng Thủ
Khoa và Trần Thị Thu Hƣơng (1993), Nguyễn Bạch Loan (1998). Các tác giải trên
đều dựa vào số lƣợng các tia vi; hình dạng các tia vi, thân và miệng; hình dạng và
số lƣợng răng để định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae. Sau đó, tác giả
Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Bạch Loan (1999) cũng đƣa ra một số chỉ tiêu đặc
trƣng và bộ hình về phân loại một số cá con thuộc họ Pangasiidae tƣơng đối hoàn
chỉnh.
Đến nay, Việt Nam vẫn chƣa có một công bố nào về ứng dụng các chỉ thị di
truyền phân tử để định danh các loài cá bột và cá con thuộc họ Pangasiidae. Nhìn
chung, phân loại cá nƣớc ngọt trên sông Cửu Long hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó
khăn do thiếu dữ liệu. Điều này ảnh hƣởng trực tiếp đến việc bảo tồn nguồn tài
nguyên cá vốn có của vùng.




5

2.2. Phƣơng pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con
thuộc họ Pangasiidae
Ngày nay, việc định danh một số loài cá thuộc họ Pangasiidae dựa vào nhiều
nguồn dữ liệu khác nhau. Tuy nhiên, nguyên tắc thực hiện của phƣơng pháp này là
dựa vào các điểm đặc trƣng bên ngoài nhƣ: chiều dài thân, màu sắc (màu sắc trên
đầu, trên thân, trên các tia vi), số tia vi (vi hậu môn, vi ngực, vi bụng, vi lƣng). Các
chỉ tiêu trên quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần. Ngoài ra, ngƣời ta
còn phân biệt các chỉ tiêu trên theo cách khác. Theo Apichart TermvidChakorn
(2003) các loài cá thuộc họ Pangasiidae đều trải qua bốn giai đoạn, mỗi giai đoạn
có điểm đặc trƣng khác nhau:
o Giai đoạn ấu trùng non: chiều dài thân khoảng 10 mm – 15 mm, còn
túi noãn hoàn, vi lƣng chƣa nhìn thấy.
o Giai đoạn ấu trùng trung gian: chiều dài thân khoảng 15 mm – 18 mm,
tia vi lƣng mới xuất hiện nhƣng còn dính màng vi.
o Giai đoạn ấu trùng già: chiều dài thân khoảng 19 mm – 34 mm, vi
lƣng không còn dính màng vi.
o Giai đoạn cá con: chiều dài thân khoảng 35 mm – 50 mm, đầy đủ tia
vi hình thái, không còn các màng vi. Ở giai đoạn nầy các điểm đặc
trƣng của mỗi loài thể hiện tƣơng đối đầy đủ.
Ngoài ra, Apichart Termvidchakorn (2003) mô tả các chỉ tiêu để phân biệt
một số loài cá bột thuộc họ Pangasidae nhƣ sau:
Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878: Giai đoạn chiều dài cơ thể khoảng
15 mm, cơ thể giống hình cái rìu nhỏ, miệng trên và ruột ngắn. Cơ thể có sắc tố đen
trên đầu và phần bụng của thân, sắc tố đen trên vi đuôi. Đến khi chiều dài thân
khoảng 30 mm, các tia vi mọc tƣơng đối đầy đủ: vi lƣng có 1 tia cứng và 6 tia
mềm, vi hậu môn có 1 tia cứng và 29 – 30 tia mềm, vi ngực có một tia cứng và 8 –
9 tia mềm, vi bụng có 8 tia mềm.

6


Hình 2.1. Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878; 15 mm
Pangasius larnaudii Bocourt, 1866: Giai đoạn chiều dài thân khoảng 15 mm:
có hắc tố trên đầu, thân và trên cuống đuôi, màng bụng đƣợc bao phủ bởi hắc tố, vi
đuôi có hắc tố. Đến giai đoạn chiều dài cơ thể khoảng 30 mm: thân dài, miệng
rộng, ruột ngắn, có hắc tố trên đầu, thân, vi lƣng và vi đuôi. Số lƣợng các tia vi: vi
lƣng có 1 tia cứng và 7 tia mềm; vi hậu môn có 1 tia cứng và 28 – 32 tia mềm; vi
ngực có 1 tia cứng và 9 tia mềm; vi bụng có 6 tia mềm.


Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866; 16 mm.
Pangasius macronema Bleeker, 1851: Giai đoạn chiều dài thân khoảng 15
mm, cơ thể có hắc tố trên đầu và thân, màng bụng có hàng hắc tố. Giai đoạn
khoảng 30 mm: cơ thể có hình cái rìu, miệng trên có hình cầu, có hắc tố trên đầu và
thân. Số lƣợng các tia vi: vi lƣng có 1 tia cứng và 7 tia mềm; vi hậu môn có 1 tia
cứng và 30 – 33 tia mềm; vi ngực có 1 tia cứng và 9 tia mềm; vi bụng 1 tia cứng và
6 tia mềm.




7


Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851; 15 mm
Theo Nguyễn Văn Hảo (2005) thì mô tả hình thái đặc trƣng của một số loài

cá thuộc họ Pangasiidae nhƣ sau:
P. hypophthalmus: Thân dài, dẹp về phía đuôi, đầu và mõm hơi dẹp bằng,
khoảng cách hai mắt rộng, răng trên xƣơng lá mía 2 đốm tách rời nhau, mỗi đốm
này nối liền với đốm răng xƣơng khẩu cái và song song với răng hàm trên.
P. larnaudii: Thân dài, phần trƣớc tròn và dẹp dần về phía đuôi, gốc vây
lƣng thẳng dốc, đầu dẹp bằng, mõm tù, hai hàm trên đều nhau, răng hàm nhỏ mịn,
răng xƣơng lá mía xếp thành hai đốm rời nhau và nối với đốm răng xƣơng khẩu cái
ở bên hoặc làm thành một vòng cung liên tục.
P. marcronema: Thân dài, dẹp bên, đầu rộng dẹp bằng, mõm ngắn hàm trên
nhô ra hơn hàm dƣới, răng hàm nhỏ mịn, râu dài kéo quá gốc vi ngực, mắt to lƣng
thẩm. P. macronema trông rất giống P. siamensis nhƣng nhìn kỹ có một vài điểm
khác nhau là: Đƣờng lƣng hơi lõm xuống, đầu hình chóp nhọn, hơi dẹp bên, râu dài
đến gốc vi bụng (dài hơn P. macronema), số lƣợng các tia vi của hai loài nhƣ sau:
P. siamensis P. macronema
Vi lƣng I,7 I,6
Vi hậu môn 34 - 36 31 - 33
Vi ngực I, 10 - 11 I, 8 – 11
Vi bụng i, 6 i, 8
Bảng 2.1. Số lƣợng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart
TermvidChakorn, 2003).




8

2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá
2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Là phƣơng pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn. Nguyên tắc phƣơng
pháp là sau khi thực hiện phản ứng cắt bộ gen bằng một enzyme cắt giới hạn xác

định, từ đó xác định đƣợc có hay không có sự thay đổi một đoạn trình tự DNA qua
kết quả điện di để có thể phát hiện sự khác biệt về đa dạng di truyền của đối tƣợng
đang nghiên cứu. Enzyme nhận biết các vị trí cắt tại 4, 5, 6 hay 8 bp trên dãy trình
tự và cắt tại điểm nhận biết. Kết quả cho ra các đoạn DNA với kích thƣớc khác
nhau đƣợc quan sát trên gel agarose, nhận biết các đọan cần phân tích bằng cách
cho lai các đoạn trên với một probe đặc biệt, tiếp tục quan sát trên gel điện di, đoạn
nào gắn với probe là đoạn cần tìm (Dodgson và ctv, 1997). Khó khăn lớn nhất trong
phƣơng pháp RFLP là xác định mức độ đa hình thấp, khó thực hiện và tốn nhiều
thời gian. Vì vậy, phƣơng pháp này ít đƣợc ứng dụng trong thủy sản.
2.3.2. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật này đƣợc phát triển đầu tiên bởi Welsh và MeClelland (1990);
Williams và ctv (1990). Khuếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên, chiều dài khoảng 8 –
10 bp. Kỹ thuật này đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thủy sản, hàng loạt các kết quả
nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật này rất thành công ở một số loài thủy sinh vật:
Partis và Wells (1996) sử dụng marker RAPD để phân loại thành công nhiều loài
cá, phân tích cấu trúc của tảo biển do Van Oppen và ctv (1996), phân tích cấu trúc
của tôm sú do Klibunga và ctv (2000).
2.3.3. Phƣơng pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Tƣơng tự nhƣ RFLP, nhƣng AFLP là sự kết hợp giữa hai phƣơng pháp RFLP
và RAPD, nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn nhân. Mồi ở đây không thiết kế
ngẫu nhiên mà thiết kế trên trình tự của adaptor và gắn thêm một nucleotide chọn
lọc ở đầu 3’, sau đó gắn tiếp 3 nucleotide. Bấy giờ những trình tự nào có gắn với
adaptor mới đƣợc khuếch đại bằng mồi đặc hiệu với adaptor, điều này có ý nghĩa




9

chọn lọc chặt chẽ hơn các trình tự DNA cần khuếch đại. Young và cộng sự (2001)

đã sử dụng phƣơng pháp AFLP tạo ra 133 loại marker trong đó có 23 loại đƣợc
dùng để chẩn đoán phân biệt các loại cá Hồi. Phƣơng pháp APLP cho độ chính xác
cao tuy nhiên ít đƣợc ứng dụng rộng rãi trong thủy sản do vấn đề kinh tế.
2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA)


H. 2.4a H. 2.4b
Hình 2.4: Hình.2.4a: cấu tạo tổng quát của ty thể (Alberts, 1994). Hình. 2.4b: cấu tạo mtDNA
dạng vòng.( Sutovsky và cộng sự, 1999).
Ở động vật, vật liệu di truyền có trong nhân và một số ít trong ty thể. Ti thể
đƣợc xem nhƣ trung tâm cung cấp năng lƣợng của tế bào. Do ty thể nằm trong tế
bào chất của giao tử cái (trứng) vì thế các gene trên DNA ty thể (mtDNA) tuân theo
quy luật di truyền theo tế bào chất (Birky và cộng sự, 1989). MtDNA ít bị tác động
của môi trƣờng nên ít bị biến dị di truyền (Spinger và Douzery, 1996). Dựa vào
những đặc điểm nêu trên, mtDNA đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật sinh
học phân tử. Đặc biệt là vùng mã hóa các phân tử ribosomal RNA (16S rRNA và
12S rRNA) rất đƣợc quan tâm ứng dụng phục vụ trong công tác nghiên cứu sự phát
sinh loài và định danh loài do chúng có tính bảo tồn cao và kích thƣớc vừa phải
thuận lợi cho việc phân lập, giải trình tự và phân tích trình tự vật liệu di truyền.





10

 Các nghiên cứu về mtDNA ứng dụng trong thủy sản
Do cấu trúc và điểm di truyền đặc biệt nêu trên nên mtDNA marker ngày càng
đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sự đa dạng nguồn vật nuôi thủy sản gồm: cá
Chình (Avise và cộng sự, 1986), cá Lam của (Graves và cộng sự, 1992), cá Đù đỏ

(Gold và cộng sự 1993), cá Mập (Heist và Gold, 1999). Kết hợp với sinh tin học
(bioinformatics), mtDNA đƣợc sử dụng thành công trong việc xây dựng cây phân
loài. Đầu tiên là công trình nghiên cứu của Wheeler và Honeycutt (1988), sau đó là
Smith (1989), Hillis (1993) đều sử dụng trình tự rRNA để quan sát các điểm đột
biến và ứng dụng để xây dựng cây phát sinh loài. Đặc biệt là thành công của
Douzery và Catzeflis (1995) đã giải trình tự vùng 12S rRNA mtDNA nhiều loài để
nghiên cứu sự phân loại của động vật có xƣơng sống. Pouyaud và cộng sự (2000)
thành công về ly trích DNA của cá da trơn Pangasiidae và sử dụng cặp mồi chuyên
biệt (thiết kế bởi Chang và cộng tác viên, 1994) khuếch đại vùng 12S trên mtDNA,
sau đó giải trình tự để quan sát sự khác biệt về khoảng cách di truyền giữa các loài
thuộc họ Pangaiidae qua cây phân loài. Tƣơng tự, Gustiano và cộng sự (2003) phân
tích 907 mẫu cá giống Pangasius thuộc họ ca da trơn Pangasiidae thu từ một số
nƣớc Đông Nam Á nhƣ: Việt Nam, Malaysia, Indonesia chỉ ra sự khác biệt về trình
tự vùng 12S rRNA trên mtDNA của các loài thuộc giống Pangasius ở mức độ từng
base pairs. Vùng 12S rRNA trên mtDNA đƣợc sử dụng để thiết kế mồi. Sau đó giải
trình tự đƣợc 737 nucleotide trên vùng 12S mtDNA của tất cả các loài thuộc giống
Pangasius, và đã xác định các trình tự khác nhau của các mẫu cá phân tích. Kết quả
đƣợc quan sát rõ qua cây phân loài là hầu hết các loài P. kunyit thu từ Việt Nam và
Indonesia có khoảng cách di truyền rất gần nhau, d = 0,003; P. macronema (từ
Indonesia) và P. polyuanodon (thu từ Việt Nam) là d = 0,004; P. djambal và P.
bocourti có d = 0,005. Một nhóm cá P. kunyit thu từ sông Mekong Việt Nam và P.
kunyit thu từ miền Bắc Borneo Malaysia giống nhau đến 77,2%, có khoảng cách di
truyền là d = 0,01. Quan sát nhiều loài khác cũng có kết quả tƣơng tự: P. humeralis
và P. nieuwenhuisii d = 0,006. Nhìn chung, tất cả các nghiên cứu trên đều giải quyết
một vấn đề chung là sử dụng ƣu điểm của mtDNA để xác định mối quan hệ về di




11

truyền của các cá thể cùng loài ở nhiều vị trí địa lý khác nhau và cho ra kết quả rất
thỏa mãn mà phƣơng pháp phân tích hình thái khó giải thích đƣợc.
Pangasiide đƣợc xác định là họ có nhiều loài cá có ý nghĩa kinh tế của vùng
sông MeKong, Tác giả Na-Nakorn và cộng sự (2006) đã thực hiện nghiên cứu hơn
600 cá thể, trong đó có 143 cá thể là Pagasianodon gigas (thu từ Cambodia và Thái
Lan), 95 cá thể Pangasianodon hypophthalmus và 435 cá thể thuộc 7 loài, trong đó
5 loài Pangasius: P. bocourti, P. conchopphilus, P. larnaudii, P. macronema, P.
sanitwongsei và hai giống với hai loài sau: Helicophagus waandersii,
Pteropangasius pleurotaenia. Cặp mồi đƣợc thiết kế chuyên biệt để khuếch đại
vùng 16S trên mtDNA (vùng này có chiều dài 568 bp), sau đó giải trình tự và xây
dựng cây phát sinh loài để quan sát sự đa dạng về di truyền của 5 giống, 9 loài thuộc
họ Pangasiidae. Kết quả có 56 haplotypes từ 9 loài Pagasiidae đã đƣợc xác định.
Trong đó, loài có số lƣợng haplotype cao nhất là P. larnaudii với 11 kiểu và loài có
số lƣợng haplotypes thấp nhất là P. macronema với 2 kiểu. Khi quan sát từ vùng
16S rRNA, sự khác nhau giữa các haplotypes về trình tự nucleotide là rất ít, chỉ từ
một đến ba điểm đột biến. Ở tất cả các loài, sự khác biệt giữa các haplotypes ở mức
độ từ thấp đến trung bình là 0,118 – 0,667 và sự khác biệt gữa các nucleotide thì ở
mức rất thấp: 0,0002 – 0,0016. Ngoài ra, trong kết quả của nghiên cứu này ngƣời ta
còn thấy gần nhƣ tất cả các loài đều xuất hiện đột biến. Điều này đƣợc biện luận
rằng có khả năng do họ Pangasiidae phân bố quá rộng, mặt khác do xuất hiện từ rất
lâu nên có thể bị tiến hóa theo thời gian. Các kết quả trên cho thấy, khi quan sát và
so sánh trình tự mtDNA giải quyết đƣợc nhiều vấn đề trong việc định danh các loài
cá, về quan hệ di truyền một cách nhanh chóng mà phƣơng pháp định danh hình
thái khó giải quyết đƣợc.
2.3.5. Phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, thực chất
đây là phƣơng pháp tạo dòng in vitro. Với sự tham gia của một enzyme chịu nhiệt
DNA polymerase (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990).

12

Khi DNA polymerase họat động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn khi
có sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn oligonucleotide có khả
năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài
mồi để hình thành mạch mới. Khi ta cung cấp hai mồi chuyên biệt, một mồi xuôi
(sens primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer), bắt cặp bổ sung với hai đầu của
trình tự DNA, các triphosphate deoxyribonucleotid sẽ đƣợc enzyme Taq gắn bổ
sung vào đầu 3’OH của mồi.
2.3.6. Phƣơng pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động
Đây là phƣơng pháp giải trình tự cải tiến từ phƣơng pháp Sager. DNA đƣợc
nối dài với sự xúc tác của enzyme DNA polymerase, có sự tham gia của trình tự
mồi ngắn bổ sung với mạch đơn cần giải trình tự, dNTP’s và các thành phần cần
thiết khác, cùng một lƣợng nucleotide có 2’,3’-dideoxyribose đƣợc đánh dấu bằng
chất phát huỳnh quang (bốn màu cho bốn loại bazơ khác nhau). Sau đó, sản phẩm
PCR chứa hỗn hợp các đoạn DNA khi đi qua một điện di mao quản sẽ đƣợc phân
tách và phát huỳnh quang khi đƣợc kích thích bởi tia laser. Trình tự DNA đƣợc ghi
lại thông qua tín hiệu huỳnh quang thu đƣợc trên đồ thị sắc ký.


Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan. Pick màu xanh là vị trí của bazơ Adenine (A),
pick màu đỏ là vị trí của bazơ thymine (T), pick màu đen là vị trí của bazơ Guanine (G), cuối
cùng là pick màu tím là vị trí của bazơ Cytosine (C).

13

Chƣơng 3
VT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian nghiên cứu: từ 19/03/2007 – 20/07/2007.
Địa điểm thực hiện: Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác Thuỷ Sản Nội Địa và
Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh
Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Mẫu cá
Các mẫu cá họ Pangasiidae có chiều dài từ 15 mm– 30 mm đƣợc thu vào
mùa lũ năm 2006 (từ tháng 6-2006 đến tháng 9-2006) và tháng 6/2007, từ hai nhánh
sông Tiền và sông Hậu, hiện đang đƣợc lƣu giữ tại Phòng Nguồn Lợi và Khai Thác
Thủy Sản Nội Địa, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2.
3.2.2. Hóa chất
NaOH-SDS (sodium dodecyl sulfate): 40%, 100 ml dung dịch này gồm có: NaOH
0,5N, 2 g/100 ml: 5 ml; SDS 0,25%, 0,25 g/100ml: 5 ml; cuối cùng cho nƣớc vào
đủ 100 ml.
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (PCI, 25:24:1): hòa tan 25 ml phenol, 24 ml
chloroform và 1 ml isoamyl ancohol.
Ethanol 75 %, ethanol 100%.
Sodium acetate 3M, pH 5.2: 10 ml dung dịch này gồm: 2,46 g muối CH
3
COONa
(3M= 246); khoảng 4 ml nƣớc cất, sau đó chuẩn pH 5.2 với CH
3
COOH. Thêm nƣớc
vừa đủ 10 ml.
TBE 10X (tris borate EDTA) (pH = 8,3) 10 X: Hòa tan 108 g tris và 55 g boric acid

trong khoảng 600 ml H
2
O. Sau đó thêm 9,8 g EDTA (ethylene diamine tetra acetic)




14

và chỉnh thể tích bằng H
2
O cho đủ 1 lít. TBE 1X sử dụng trong điện di: pha 100 ml
TBE 10X cho nƣớc cất và đủ 1lít.
Dung dịch nạp mẫu bromophenol 6X: 0,25% (w/v) bromophenol blue và 40% (v/v)
glycerol.
Ethidium bromide: hòa tan 50 mg ethidium bromide trong 5 ml nƣớc cất hai lần và
bảo quản trong chai tránh sáng.
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị và dụng cụ dùng trong phân tích hình thái
o Kính hiển vi sôi nổi với độ phóng đại 40 lần.
o Thƣớc kẽ ôli, đĩa petri và các thiết bị hỗ trợ cho việc định loại.
o Các dụng cụ kéo, kẹp, kim.
Thiết bị và dụng cụ dùng trong phân tích DNA
* Thiết bị sử dụng
- Máy Vortex (Zx
3
Velp).
- Máy block nhiệt khô.
- Máy ly tâm.
- Máy PCR (Thermocycle – Biorad).

- Bộ điện di (Biorad Hybaid).
- Bàn đọc UV (White/UV Transillminator).
- Tủ mát, tủ lạnh -20
0
C (Liebherr).
- Tủ cấy vô trùng (Laminar – Box).
- Cân phân tích.
- Lò viba.