Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thuỷ phân từ gluten lúa mì để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THUỶ PHÂN TỪ
GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
THỰC PHẨM
Mã số: 2013/02-CNSHTPMT

Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN LỆ HÀ

Tp. Hồ Chí Minh, 5/2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THUỶ PHÂN TỪ
GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
THỰC PHẨM
Mã số: 2013/02-CNSHTPMT

Xác nhận của Chủ tịch HĐ nghiệm thu

Chủ nhiệm đề tài

(ký, ghi rõ họ tên) (ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 5/2017


TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Đề tài tập trung nghiên cứu quá trình thủy phân gluten lúa mì lần lượt với hai
enzyme: Alcalase và Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu peptides mạch ngắn
và acid amin. Gluten lúa mì có hàm ẩm 7.8%, chứa 75.7% protein, bao gồm các
glutenin có khối lượng phân tử 52-70kDa, các gliadin có khối lượng phân tử từ 3038KDa, ngồi ra cịn có các tiểu đơn vị trong thành phần của glutenin có khối lượng
phân tử thấp hơn nằm trong khoảng 12-15KDa.Quá trình thủy phân được thực hiện lần
lượt: ban đầu xúc tác là enzyme Alcalase, một endo-protease, sau đó là xúc tác
Flavourzyme. Các thơng số thích hợp của quá trình thủy phân gluten lúa mì với
Alcalase thu được như sau: tỷ lệ enzyme/cơ chất là 0.116 AU/g, nhiệt độ 60oC, pH 8.0,
thời gian thủy phân 120 phút. Dịch thủy phân thu được có hàm lượng Nitơ tổng
17.76±0.202g/L, hàm lượng amoniac 0.273±0.01g/L, hàm lượng acid amin tự do là
30.166mg/g. Sản phẩm thủy phân với Alacalase tiếp tục được thủy phân với
Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu acid amin tự do và các peptides ngắn. Điều
kiện thủy phân với Flavourzyme là: tỷ lệ enzyme/cơ chất 0.204AU/g, pH 6.5, nhiệt độ
45oC, thời gian 210 phút. Sản phẩm thủy phân với quy trình này có hàm lượng Nitơ
tổng là 18.497±0.369 g/L, hàm lượng ammoniac lần lượt là và 0.474±0.012 g/L, và
hàm lượng acid amin tự do102.527 mg/g. Dịch thủy phân thu được bao gồm các
peptides có khối lượng phân tử 35kDa và dưới 10KDa.


ABSTRACT
In this work, we focused onprocess of wheat gluten hydrolyzed utilizing

enzymes Alcalase and Flavourzyme to enrich peptides and acid amine.Protein
concentration of wheat gluten is 75.7%, including glutenin and gliadin molecular are
range from 52 to70 kDa and from 30 to 38 kDa, respectively.In addition, glutenin
containlow molecular weight subunitsfluctuating between 12 and 15KDa.The
parameters of hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme were determined. Prehydrolysis process was carried out by enzymes Alcalase, an endo-protease. At the
optimal of enzyme Alcalase concentrationof0.116 AU/g, temperature of60°C, pH of
8.0 and hydrolysis time of 120 minutes,hydrolyzate reached total nitrogen content of
17.76 ± 0.202 g/L, ammonia content of0.273 ± 0.01 g/L andfree acid aminecontent of
30.166mg/g. Product was continued to hydrolyze by Flavourzyme to obtain free acid
amine and short chain peptides. The optimal parameters of hydrolysis using
Flavourzyme were enzyme concentration of 0.204 AU/g, pH of 6.5, temperature of
45oC and hydrolysis time of 210 minutes. Total nitrogen, ammonia and free acid amine
content of product were 18.497±0.369 g/L, 0.474±0.012 g/L and 102.527 mg/g,
respectively. The final product presented peptides whose molecular weight is 35 kDa
and less than 10 kDa.


MỤC LỤC
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

i

TĨM TẮT ĐỀ TÀI

iii

DANH MỤC BẢNG

v

DANH MỤC HÌNH

vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

vi

GIỚI THIỆU

1

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN
1.1 Thành phần gluten lúa mì
1.1.1 Giới thiệu chung gluten lúa mì
1.1.2 Thành phần protein trong lúa mì
1.2 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân và ứng dụng trong thực phẩm
1.2.1 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân
1.2.2 Ứng dụng dịch đạm thủy phân
1.3 Các phương pháp thủy phân protein
1.3.1 Phương pháp sinh học
1.3.2 Phương pháp kết hợp
1.4 Giới thiệu về enzyme protease Alcalase và Flavourzyme
1.4.1 Enzyme Alcalase
1.4.2 Enzyme Flavourzyme
1.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về quá trình thủy phân gluten

3
3

3
4
6
6
9
10
10
11
12
12
13
14

CHƯƠNG 2.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất
2.1.1 Gluten lúa mì
2.1.2 Enzyme Alcalase và Flavourzyme
2.1.3 Hóa chất
2.2 Dụng cụ và thiết bị
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nội dung nghiên cứu
2.3.2 Bố trí thí nghiệm
2.3.3 Phương pháp phân tích
2.4 Phương pháp xử lý kết quả thí nghiệm

17
17
17
17

19
19
20
20
21
32
33

CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm
3.1.1 Khảo sát hoạt tính enzyme
3.1.2 Khảo sát thành phần nguyên liệu

34
34
34
35


3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng Alcalase
36
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân bằng Alcalase
36
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình thủy phân
40
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
44
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase
48

3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng Flavourzyme sau khi xử
lý với Alcalase
52
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzmye/cơ chất
52
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân
57
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân
60
3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến q trình thủy phân
64
3.4 Phân tích thành phần dịch thủy phần
68
3.4.1 Hàm lượng nito tổng và amoniac trong dịch thủy phân
68
3.4.2 Kết quả phân tích khối lượng phân tử của dịch thủy phân và nguyên liệu
68
3.4.3 Kết quả phân tích thành phần acid amin tự do bằng HPLC
70
CHƯƠNG 4.

KẾT LUẬN

72

TÀI LIỆU THAM KHẢO

75

PHỤ LỤC

Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu

80
85


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 2 Hàm lượng protein và hàm lượng protein hòa tan khi thủy phân bằng các
enzyme khác nhau
10
Bảng 2. 1 Thành phần gluten lúa mì do nhà sản xuất cung cấp 17
Bảng 2. 2 Các đặc tính của enzyme Alcalase do nhà sản xuất cung cấp

18

Bảng 2. 3 Các đặc tính của enzyme Flavourzyme do nhà sản xuất cung cấp 18
Bảng 3. 1 Hoạt tính enzyme Alcalase và Flavourzyme 34
Bảng 3. 2 Thành phần nguyên liệu gluten lúa mì 35
Bảng 3. 3 Hàm lượng Nito tổng và amoniac trong dịch thủy phân

68

Bảng 3. 4 Thành phần aicd amin tự do trong dịch thủy phân 70
Comment [NT1]: số trang để cuối dòng


DANH MỤC HÌNH

Comment [NT2]: số trang để cuối dịng

Hình 1. 1 Kích thước hạt protein trong mạng gluten ở trạng thái tự do (a) và kéo căng
(b)
6
Hình 1. 2 Mức độ thủy phân của gluten theo thời gian với các enzyme khác nhau
ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
Hình 1. 3 Cơ chế phản ứng thủy phân cơ chất protein của Substilisin Carlsberge
Hình 2. 1 Nội dung nghiên cứu

14

20

Hình 2. 2 Sơ đồ tiến hành thủy phân gluten bằng enzyme Alcalase

21

Hình 2. 3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bằng Alcalase
23
Hình 2. 4 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng Alcalase
24
Hình 2. 5 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

25

Hình 2. 6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân bằng Alcalase
26
Hình 2. 7 Sơ đồ thủy phân bằng enzyme Flavourzyme có tiền xử lý Alcalase 27
Hình 2. 8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bằng
Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase
28

Hình 2. 9 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng
Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase
29
Hình 2. 10 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân bằng
Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase
30
Hình 2. 11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân bằng
Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase
31
Hình 3. 1 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân của gluten theo thời gian ở các tỷ lệ E/S
khác nhau 36
Hình 3. 2 Mức độ thủy phân sau 120 phút với các tỷ lệ E/S khác nhau

vi

37


Hình 3. 3 Hàm lượng protein hịa tan của dịch gluten sau thủy phân ở các nồng độ
enzyme khác nhau theo thời gian 38
Hình 3. 4 Hàm lượng protein hịa tan sau 120 phút với các nồng độ enzyme khác nhau
39
Hình 3. 5 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau
41
Hình 3. 6 Mức độ thủy phân sau 120 phút ở các nhiệt độ khác nhau 42
Hình 3. 7 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan theo thời gian ở các nhiệt độ
khác nhau 43
Hình 3. 8 Hàm lượng protein hòa tan sau 120 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau
44
Hình 3. 9 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian ở các giá trị pH khác nhau

45
Hình 3. 10 Mức độ thủy phân tại các nhiệt độ khác nhau

46

Hình 3. 11 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan ở các pH khác nhau theo thời
gian 47
Hình 3. 12 Hàm lượng protein hịa tan ở các pH khác nhau

48

Hình 3. 13 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian 49
Hình 3. 15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến hàm lượng aa theo thời gian
52
Hình 3. 16 Hàm lượng aa sau 180 phút theo các nồng độ enzyme khác nhau

53

Hình 3. 17 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH 54
Hình 3. 18 Mức độ thủy phân sau 180 phút theo các nồng độ enzyme khác nhau 55
Hình 3. 19 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng aa theo thời gian
57
Hình 3. 20 Hàm lượng aa sau 180 phút theo các nhiệt độ khác nhau 58
Hình 3. 21 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH 59
Hình 3. 22 Mức độ thủy phânsau 180 phút tại các nhiệt độ khác nhau

vii

60

Hình 3. 23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng aa theo thời gian

61

Hình 3. 24 Hàm lượng aa sau 180 phút tại các giá trị pH khác nhau 62
Hình 3. 25 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến DH 63
Hình 3. 26 Mức độ thủy phân sau 180 phút tại các pH khác nhau

64

Hình 3. 27 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng aa

65

Hình 3. 28 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian lên mức độ thủy phân 66
Hình 3. 29 Khối lượng phân tử của gluten (NL), dịch thủy phân Alcalase 2h, dịch thủy
phân với Alcalase 3h, dịch thủy phân với Alcalase và Flavourzyme(A-L)
69

viii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
WGH: Wheat gluten hydrolysates : dịch thủy phân gluten lúa mì
WG: Wheat gluten: gluten lúa mì
DH: Degree hydrolysis: mức độ thủy phân
aa: Acid amin
EAI: Emulsification activity index: chỉ số tạo nhũ
E/S: Enzyme/substract : tỷ lệ enzyme/cơ chất

ACE: Angiotensin-converting enzyme : chất ức chế men chuyển
UF: Ultrafiltration – Siêu lọc
AU: Anson unit: đơn vị Anson
ADG: acetic deamide gluten: deamide gluten bằng acid acetic
HDG: acid clohydric deamide gluten: deamide gluten bằng acid HCl
Ala: Alanine
Arg : Arginine
Asp: Aspartic acid
Cys: Cystein
Glu: Glutamic
Gln: Glutamine
His: Histidine
Ile: Iso-leucine
Leu: Leucine
Lys: Lysine
Met: Methionine
Phe: Phenylalanine
Pro: Proline

vi

Comment [NT3]: chuyển nội dung này lên trước
danh mục bảng


Ser: Serine
Thr: Threonine
Tyr: Tyrosine
Val: Valine
Try: Tryptophan

vii


GIỚI THIỆU
Glutenlà protein lúa mì được tách ra trong quá trình sản xuất bột mì. Hiện nay,
gluten lúa mì được sử dụng chủ yếu để làm tăng độ dai, đàn hồi của khối bột nhào khi
sản xuất bánh mì và giúp tạo cấu trúc cho các sản phẩm thực phẩm như xúc xích, thức
ăn cho vật ni…Tuy nhiên, một số người khơng thể sử dụng được các sản phẩm có
chứa gluten bởi vì gluten gây ra triệu chứng dị ứng gọi là bệnh Celiac, hệ đề kháng
trong cơ thể người bệnh sẽ chống lại chất đạm trong lúa mì và các loại ngũ cốc khác.
Gluten chứa đầy đủ các acid amin trong đó có cả các acid amin khơng thay thế, ngồi
ra trong gluten cịn chứa lượng lớn acid glutamic, một acid amin góp phần tạo nên vị
umami cho dịch đạm. Là một nguồn thực phẩm tốt, có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng
ứng dụng của gluten lúa mì bị hạn chế bởi khả năng hịa tan kém của nó.
Nhiều nghiên cứu tập trung vào các phương pháp hóa học hoặc enzyme để thủy
phân gluten lúa mì nhằmtăng cường độ hịa tan, tạo bọt và tăng tính chất nhũ hóa. Có
thể thủy phân gluten bằng xúc tác vơ cơ, nhưng nhược điểm là tạo nhiều sản phẩm
khơng có lợi chosức khỏe. Khi thủy phân bằng HCl không điều khiển được quá trình
thủy phân, HCl kết hợp với chất béo trong nguyên liệu tạo thành hợp chất tiền ung thư:
mono-dichloropropanols, monocholoropropanols (Nagodawithana, 1994).Quá trình
thủy phân bằng NaOH phá hủy một số acid amin thiết yếu như tryptophan, serine,
cysteine(Hall, 1992).Phương pháp thủy phân bằng enzyme thể hiện nhiều ưu điểm hơn
so với thủy phân bằng phương pháp hóa học: q trình thủy phân khơng địi hỏi các
điều kiện nhiệt độ và áp suất cao như thủy phân bằng phương pháp hóa học, sản phẩm
thủy phân chứa nhiều acid amin cần thiết cho cơ thể. Ngồi ra, phản ứng thủy phân
bằng enzyme có tính đặc hiệu cao, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên,
quá trình thủy phân bằng enzyme cần thời gian kéo dài hơn so với quá trình thủy phân
bằng phương pháp hóa học.
Dịch thủy phân có nhiều ứng dụng khác nhau: bổ sung vào thực phẩm, làm phụ

gia, làm gia vị. Hiên nay, natriglutamate được sử dụng như chất tạo vị bằng con đường
lên men, tuy nhiên người tiêu dùng mong muốn sử dụng sản phẩm gia vị có nguồn gốc
1


tự nhiên. Ở Nhật nhiều sản phẩm thủy phân có nguồn gốc tự nhiên như: dịch thủy phân
từ thực vật, cá, chất chiết nấm men đã được nghiên cứu (Ueda Y, 1997). Hedwig và
Amado (2002) cũng cho rằng các peptides từ protein thực vật như: lúa mì, bắp, đậu
nành khi thủy phân bằng enzyme chứa nhiều acid glutamic và acid pyroglutamic tạo vị
umami cho sản phẩm. Chất lượng dịch thủy phân được cải thiện là do thành phần
amino acid, các peptides nhỏ, muối và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi.
Thơng qua các tài liệu tham khảothì Alcalase làenzyme cho hiệu quả thủy phân
cao nhất. Tuy nhiên Alcalase khi thủy phân tạo ra các peptides mạch ngắn trong đó có
nhiều peptides kỵ nước tạo vị đắng cho sản phẩm. Một phương pháp nhằm giảm vị
đắng này là sử dụng kết hợp exo-peptidase. Trong số các exo-peptidase thì
Flavourzyme là enzyme thủy phân các peptides tại vị trí N-, tạo ra các acid amin tự do
và peptides mạch ngắn hơn, tăng chất lượng dịch thủy phân và cơ thể dễ hấp thu hơn.
Vì vậy trong đề tài này chúng tơi tâ ̣p trung nghiên cứu thủy phân gluten lúa mì bằng
enzyme Alcalase vàFlavourzyme với các nội dung như sau:
 Khảo sát quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Alcalase
 Khảo sát quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Flavourzyme
sau khi xử lý với enzyme Alcalase.
Chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu sẽ thu hút nhiều sự quan tâm , dịch thủy
phân thu được có nhiều ứng dụng nhằm nâng cao giá trị sử dụng của gluten.

2


CHƢƠNG 1.
1.1

TỔNG QUAN

Thành phầngluten lúa mì
1.1.1 Giới thiệu chung gluten lúa mì
Protein của lúa mì được chia làm bốn loại: albumin, globulin, gliadin, và

glutenin. Trong đó albumin và globulin chiếm khoảng 20%, gliadin và glutenin chiếm
khoảng 80% (tỷ lệ của hai loại protein này xấp xỉ nhau).Thành phần chất khô của
gluten lúa mì dao động từ 60-85% protein, 5-10% lipid, phần còn lại là tinh bột và các
carbohydrates khác. Gluten lúa mì chứa khoảng 20 loại acid amin, các acid amin khơng
thay thế đều có trong thành phần lúa mì, đặc biệt nổi bật với hàm lượng acid glutamic,
glutamine và proline cao, hàm lượng các acid amin chứa nhóm tích điện thấp.
Ở pH=7.0 các protein của gluten ít tích điện. Hàm lượng glutamine cao hình
thành nhiều liên kết hydro giữa các chuỗi peptides với nhau hoặc với phân tử nước do
đó tạo cho gluten có tính nhớt cao. Hàm lượng các acid amin ưa béo tham gia vào cấu
trúc bậc 4 của glutenin và liên kết với lipid. Hàm lượng prolin rất cao (10-15%) đặc
biệt là gliadin cũng ảnh hưởng đến cấu trúc bậc 2 của protein gồm xoắn α và xếp β, các
gốc cystine vượt xa các gốc cystein chứng tỏ có liên kết disulfua trong liên kết
protein.Trong gluten lúa mì có khoảng 20 aa trong đó các aa khơng thay thế đều có
trong thành phần gluten lúa mì.(Clodualdo và cộng sự, 1994)
Khi tiến hành thủy phân gluten lúa mì và các phân đoạn protein Glutenin và
Gliadin bằng HCl 6M trong 24h ở 110oC, sau đó cơ đặc dịch thu được và tiến hành
phân tích HPAEC-IPAD thu được thành phần acid amin như sau:
Bảng 1. 1Thành phần amino acid trong gluten lúa mì khi thủy phân bằng HCl 6M
trong 24h ở 110oC(Ine Rombouts, 2009)
Gluten

Ala

Glutenin

Gliadin

(mol %)

(µmol/g)

(mol %)

(µmol/g)

(mol %)

(µmol/g)

3.5

270

4.1

315

3.0

225

3

Arg

3.2

245

3.1

240

2.9

215

Asx

2.8

215

3.2

250

2.3

170

Cys

2.2

170

1.9

150

2.4

180

Glx

31.9

2450

28.1

2180

33.8

2510

Gly

5.4

420

7.2

560

2.9

215

His

1.7

130

1.7

135

1.7

125

Ile

4.1

315

4.0

305

4.7

345

Leu

7.2

550

7.1

550

7.8

580

Lys

1.4

110

2.0

155

0.6

45

Met

1.3

100

1.4

105

1.2

90

Phe

4.4

335

4.0

310

5.1

380

Pro

14.1

1080

12.4

965

17.1

1270

Ser

5.7

440

8.0

620

4.3

320

Thr

2.8

215

3.3

255

2.3

170

Tyr

2.8

220

3.1

235

2.6

195

Val

5.4

415

5.5

425

5.3

395

1.1.2 Thành phần protein trong lúa mì
 Gliadin
α- gliadin là tên gọi riêng của prolamin lúa mì. Trong lúa mì có 2 prolamin chính:
-

Gliadin α, β, γ có phân tử lượng 30000-45000 Da

-

Gliadin ω có phân tử lượng nằm giữa 60000-80000 Da

-

Các gliadin của lúa mì có tính đa hình lớn. Các gliadin lúa mì ở dạng đơn chuỗi.
Dựa vào sự phân bố các acid amin ở đầu tận cùng N- của các gliadin α, β, γ người ta

biết được 30 acid amin đầu của chúng rất giống nhau trong đó có 20 acid amin đầu

4


tiên tạo thành peptid có tín hiệu ưa béo. Peptid này có gốc lysine ở gần cuối N, tiếp
đó là các acid amin ưa béo và cuối cùng là gốc alanine nối với protein. Các gliadin ω
có hàm lượng glutamine và prolin rất cao. Phần lớn các gốc glutamine đều dưới
dạng amide. Gliadin ω có chứa hoặc khơng chứa các acid amin có S do đó trong
phân tử khơng có cầu disulfua. Các gliadin α,β,γ cịn có một số cầu disufua trong
phân tử do đó làm cho cấu trúc bậc 3 chặt và bền.
-

Các gliadin ω có hàm lượng glutamine và prolin rất cao chiếm 75% . Phần lớn các
gốc acid glutamic đều ở dưới dạng amide gliadin ω chứa rất ít hoặc khơng chứa các
acid amin có S trong phân tử khơng có cầu disulfua.Khi hình thành mạng lưới gluten
các gliadin sẽ liên kết với nhau bằng cầu hydro giữa các gốc glutamine để tạo ra
những sợi có phân tử lượng hàng triệu Da.
 Glutenin
Các glutenin có xu hướng tự liên kết với nhau bằng các tương tác ưa béo, bằng liên
kết hydro và cầu disulfua lớn hơn so với gliadin.Các glutenin cịn có tính đa hình
mạnh mẽ. Khi phá hủy cầu disulfua giữa các phân tử người ta thu được 25 tiểu đơn
vị glutenin. Chia thành 3 kiểu:
-

Tiểu đơn vị kiểu A : khơng hồn tan trong etanol, có khối lượng phân tử thấp
(10000-70000 Da) và rất giàu các acid amin có tính bazo.

-

Tiểu đơn vị kiểu B khơng hồn tan trong ethanol nhưng có khối lượng phân tử
cao (60000-1400000 Da) giàu glycine, proline và glutamine, nghèo cystine tỷ lệ
xoắn α trong phân tử thấp.

-

Tiểu đơn vị kiểu C hồn tan trong ethanol có phân tử 35000-45000.

Các tiểu đơn vị liên hợp với nhau bằng cầu hydro, tương tác ưa béo, disulfua. Khi
các tiểu đơn vị liên hợp lại tạo thành các sợi. Ở trạng thái ngậm nước, các glutenin
tạo ra một khuôn hoặc màng mỏng chắc, đàn hồi, có tính cố kết cao, chịu kéo
căng.(J.A.Bietz và cộng sự, 1970)(J.H.Woychik và cộng sự, 1961).
5


Hình 1. 1Kích thước hạt protein trong mạng gluten ở trạng thái tự do (a) và kéo căng
(b)
1.2

Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phânvà ứng dụng trong thực phẩm
1.2.1 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân

Khả năng hòa tan trong nước
Alder Nissen (1986)cho rằng sự gia tăng độ tan của dịch thủy phân so với
protein ban đầu là do việc giảm cấu trúc bậc hai và do enzyme giải
phóngpolypeptidesngắn hơn từ protein. Chobert và cộng sự (1988) cho rằng khi thủy
phân protein có bathay đổicơbản: tăng số lượngnhómphân cực, làm tăng tính ưa
nướcsản phẩm, giảmkhối lượng phân tử, và thay đổi cấu tạophân tử. Saukhithủy
phân,mốiliênkếtthứ cấp trongprotein glutenlúa mì bị phá hủy làmsuy yếusự gắn kết và
sứcbám dính củamạnggluten làm tăng khả năng hịa tan.

Jinshui Wang và cộng sự (2006) tiến hành thủy phân gluten (DH = 2.8%) sau đó
tiến hành lọc UF phân tách các phâncác đoạn peptides với khối lượng phân tử khác
nhau: 100, 50, 20 kDa. Các phân đoạn thủy phân có độ hịa tan cao hơn so với gluten
lúa mì và dịch thủy phân ban đầu tại tất cả các giá trị pH.
Khả năng tạo nhũ
6


Theo Jinshui wang và cộng sự (2006) thì khả năng tạo nhũ (EAI) của các phân
đoạn peptidesphụ thuộc vào giá trị pH. EAI của gluten lúa mì giảm trong mơi trường
pH trung tính, nhưng tăng trong mơi trường có tính acid và kiềm. Theo Chiai và cộng
sự (1982)EAI thấp nhất có thể tương ứng với điểm đẳng điện của protein. Ngoài ra khả
năng ổn định nhũ tương của dịch thủy phân gluten lúa mì và các phần phân đoạn
peptides tại các giá trị pH acid và kiềm cao hơn so với khi ở pH 7.0 (Yves Popineau,
Blandine Huchel, 2002).
Khả năng tạo bọt
Protein là những tác nhân tạo bọt tốt, chúng nhanh chóng khuếch tán đến bề mặt
khơng khí-nước. Sự tạo bọt tương ứng với số lượng amino acid kỵ nước tiếp xúc trên
bề mặt của phân tử protein(Damodaran, 1990).Sự phân tán protein làm giảm sức căng
bề mặt tại bề mặt nước/khơng khí, do đó tạo ra khả năng tạo bọt (Turgeon và cộng sự,
1992).
XiangZhen Kong(2007) cho rằng khi thủy phân có giới hạn làm tăng số lượng
các mạch polypeptidesgiúp tăng hoạt động bề mặt, giúp nhiều khí được giữ lại hơn,
khả năng tạo bọt tăng. Khi mức độ thủy phân tăng lên (DH 10% và 15%), khả năng tạo
bọt giảm, điều đó được giải thích do sự tạo thành các mạch peptides ngắn làm giảm
hoạt động bề mặt.
Tính chất chống oxy hóa
Gluten lúa mìcóáilựcmạnh với dầu và các chấtkhơng phân cựckhác, glutenthủy
phânsẽ có tác dụng chống lạisự oxy hóa củaacid béo. Kunio Stuetsuna và cộng sự
(2002) phân tách các peptides thu được khi thủy phân gluten với enzyme trích ly từ dạ

dày heo với cột SaphadexG25, kết quả là phân đoạn có M = 5400-8000 Da có khả năng
chống oxy hóa mạnh hơn tocopherol với thời giam cảm ứng 7.5 ngày.
Theo Kexue Zhu và cộng sự (2006),dịch thủy phân gluten bằng Alcalase có một
số peptidescó khả năng chống oxy hóa. Các peptides này gồm 5-16 amino acid, bao
gồm cả các acid amin kỵ nước, Val hoặc Leu, tại các vị trí N-, và Pro, Tyr và His.Chen
7


và cộng sự (1998) cho rằng histidine N- có khả năng chống oxy hóa cao hơn các
peptides. Ngồi ra, các acid amin, chẳng hạn như Tyr, Met, His, Lys, và Trp, thường
được xem như là chất chống oxy hóa.
Tạo vị cho umani cho dịch thủy phân
Noguch và cộng sự (1975) cho rằng protein thực vật thủy phân được sử dụng
làm gia vị cho thực phẩm vì sản phẩm thủy phân tạo hương vị "umami" giống như
glutamate.Hedwig Schlichtherle-Cenny và Renato Amado (2002) tiến hành thủy phân
gluten lúa mì bằng 3 phương pháp khác nhau: WGH-1 được thủy phân chỉ sử dụng
protease Flavourzyme. WGH-2 bổ sung glutaminase để xúc tác cho sự chuyển đổi
glutamine sinh ra thành acid glutamic tự do. WGH-3 được xử lý HCl trước khi thủy
phân để chuyển đổiprotein- glutamine thành axit glutamic- protein. Cácmức độ thủy
phân của dịch thu được từ 25 đến 35%, cho thấy rằngphần lớn các acid amin có mặt
làpeptidescó khối lượng phân tử nhỏ. WGH-1 chứa nồng độ cao của glutamine tự do
5.7% và chỉ có rất ítacid glutamic tự do 0.8%. Mặt khác, WGH-2 glutaminetự do 0.6%,
acid glutamic tự do 7.6%. Nồng độ acid glutamine và glutamic trong WGH-3 là 3.5và
2.5%. Theo các tác giả này , dịch WGH-3 là ít đắng nhất và cho vị giống umami
nhất.Trong dịch thủy phân ngoài acid glutamic,thì các acid hữu cơ cũng góp phần tạo
hương vị cho dịch thủy phân.Bốnpeptides pyroglutamyl được xác định: pGlu-Pro-Ser,
pGlu-Pro, pGlu-Pro-Glu, và pGlu-Pro-Gln cho vị giống như umami.
Seung Hyun Koo và cộng sự (2011) tiến hành thủy phân gluten với 3 loại
enzyme khác nhau: Alcalase, Flavourzyme, Protamex. Tiến hành đánh giá cảm quan
thì dịch thủy phân với Alcalase đắng nhất. Cịn Flavourzyme và Protamex khi tăng

mức độ thủy phân thì tăng vị đắng và vị umami khơng bị ảnh hưởng. Ngồi ra dịch
thủy phân bằng Alcalase sau 24h cịn có hoạt tính chống oxy hóa cao.
Hoạt tính opioid
Peptides có hoạt tính opioid (an thầ n , giảm đau) bắt nguồn từ các protein thực
vật. Ngồi protein sữa, gluten lúa mì là nguồn giàu các peptides opioid (exorphins).
Theo Anne Pihlanto và cộng sự (2003) các enzyme như Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin
8


thủy phân gluten cho ra các peptides như: Gly-Tyr-Tyr-Pro-Thr (exorphin A5), TyrGly-Gly-Trp-Leu (Exorphin B5) và Tyr-Pro-Ile-Ser-Leu (exorphin C).
Xiang và cộng sự (2008) tiến hành thủy phân gluten bằng các enzyme khác
nhau: Alcalase, Pancreatin, Pepsin, Protamex, Neutrase, Flavourzyme. Cácdịch thủy
phânthu được vớiProtamexvàNeutrase khơng cóhoạt tínhopioid.WGHsthu được
vớiAlcalasevàPepsincho thấy hoạt tínhopioid tăngkhi tăngthời gianthủy phân, đặc biệt
là

Alcalasethủy

phân

6h

và

pepsin

thủy

phân

24h

IC50là1.21±0.25và1.57±0.21mg protein/mL.Các tác giả cũng lọc tách

vớigiá

trị

các phân đoa ̣n

trong dịch thủy phân bằ ng màng UF và xác đinh
̣ đươ ̣c hoa ̣t tính opioid tâ ̣p trung ở các
peptides có phân tử lượng <3kDa.
1.2.2 Ứng dụng dịch đạm thủy phân
Hiện nay ứng dụng gluten lúa mì rất hạn chế như làm phụ gia trong quá trình
sản xuất xúc xích, bánh mì... Gluten lúa mì thủy phân cho các hỗn hợp peptides có khả
năng hịa tan cao và thay đổi khả năng tạo bọt và nhũ hóa. Các tính chất này phụ thuộc
đặc điểm, tùy thuộc vào mức độ thủy phân. Ngồi mục đích thủy phân gluten lúa mì
nhằmcải thiện cáctính chất chức năng mà protein lúa mì khơng có thì một số nghiên
cứucịn

hướng đế n

việc

tạo ra

peptidesphân

tử

thấp.

Theo

Gonzalez-

Tello(1994)peptidesnàycólợi thế làđượchấp thụ trongruộtvàcótác dụnggây dị ứngthấp.
Theo các nghiên cứu thì dịch thủy phân có những tính chất cơng nghệ như tạo
bọt, tạo nhũ có thể dùng làm phụ gia tạo bọt. Ngoài ra, dịch thủy phân với hàm lượng
đạm cao và các peptides mạch ngắn có thể được sử dụng làm gia vị, làm nước chấm.
Trong dịch thủy phânchứa các peptidescó khả năng chống oxy hóa chất béo. Do
đó có thể sử dụng dịch hydrolysates gluten lúa mì làm chất chống oxy hóa tự nhiên
thay thế cho các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHA, BHT… Các peptides trong
dịch thủy phân cịn có hoạt tính sinh học như: an thần, giảm đau, ức chế ACE.

9


1.3

Các phƣơng pháp thủy phân protein
1.3.1

Phương pháp sinh học

Xiang và cộng sự (2007) tiến hành thủy phân Gluten lúa mì với sáu loại
enzyme khác nhau. Tố c đô ̣ t

hủy phân gluten lúa mì với Alcalase,Trypsin,

Pancreatin,Neutrase và Protamex tăng nhanh trong 30 phút đầu tiên và sau đó tăng
chậm. Alcalase cho DH cao nhất và hiệu quả hơn so với những enzyme khác.
Hiệu suất thủy phân protein bằng các enzym khác nhau đã được đưa ra trong
Bảng 1.2. Mặc dù có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân, loại enzyme
được sử dụng cóảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất và tính chất của sản phẩm cuối cùng.
Bảng 1. 2Hàm lượng protein và hàm lượng protein hòa tan khi thủy phân bằng các
enzyme khác nhau
Dịch thủy phân gluten

Hàm lƣợng protein (%)

Hàm lƣợng protein hòa tan
(%)

Alcalase 2.4L

79.7 ± 0.73

81.3 ± 0.13

PTN 6.0S

80.9 ± 0.28

42.5 ± 0.68

Pepsin

78.3 ± 0.51

53.3 ± 0.42

Pancreatin

80.2 ± 0.16

61.6 ± 0.37

Protamex

80.8 ± 0.35

43.8 ± 0.28

Neutrase

80.5 ± 0.43

46.3 ± 0.39

Các tác giả cho rằng sự gia tăng độ tan của dịch thủy phân so vớiprotein ban đầu
là do việcgiảm cấu trúc thứ cấp và cũng do enzyme thủy phân protein tạo thành
polypeptidesngắn hơn. Dịch thủy phân với với Alcalase tạo thành polypeptidescó phân
tử lươ ̣ng dưới 10 kDa.

10


1.3.2

Phương pháp kết hợp

1.3.2.1

Kết hợp xử lý nhiệt và thủy phân bằng enzyme

Theo Zhang (2012) đã tiến hành sấy gluten ở 120oC trong 30 phút, sau đó gluten
được đem thủy phân bằng Alcalase ở 55oC, pH8.0. Mức độthủyphâncủa gluten lúa
mìđãđượccải thiện đáng kểbởitiền xử lýnhiệt. DHđạt30%sau1hthủy phânvàcho
thấytăng10%so vớiglutenlúa mì khơng qua xử lý.Lượng các peptides có M<1000Da
tăng từ 17.6% lên 30.7% so với với gluten không qua xử lý nhiệt.
Tốc độ thủy phân gluten lúa mì bằ ng Alcalase cóthểđược tăng tốc bằng tiền xử
lý nhiệt khô, sản phẩm thu được có

nhiều peptides có phân tửlươ ̣ng

thấp(M<5000Da).So sánh cấu trúc thứ cấpcủa gluten nguyên liệu và gluten xử lý nhiệt
kết quảthu được số lượng gấp nếp βtăng từ 41.5 đến 51.2% và tăng xoắnαtừ 24.5 đến
26% và sự biến mất của các cấu trúc mở rộng.Cấu trúc mở rộng là những cấu trúc thứ
cấp phổ biếnnhư xoắn polyproline và gấp nếp α.Tỷ lệ xoắn α và gấp nếp βgiảm trong
gluten qua xử lý nhiệtvà chứng tỏ sự biến đổi của cấu trúc bậc 2.
Tính kỵ nước bề mặt(Ho)của gluten lúa mìtăngtừ56.7đến74.5% sau khixử lý
nhiệtkhơ. Khi proteinđược gia nhiệttrong dung dịch nướcHogiảmchủ yếu là dosự tương
tác của nhiệttiếp xúc vớinhóm kỵ nướctrongprotein.Cùng với sự thay đổi cấu trúc thứ
cấp,và phá vỡ liên kết disulfua giúp enzym có thể tiếp cận cơ chất.
1.3.2.2

Kết hợp xử lý bằng acid và thủy phân bằng enzyme

Young Shick Hong và cộng sự (2011) tiến hành thủy phân gluten lúa mì với
nồng độ 6% (w/w) có tiền xử lý acid HCl 0.1N ở 95oC trong 1 giờ và kết hợp với
enzyme Alcalase thủy phân trong 3 giờ.Khối lượng phân tử của các phân
tửpeptidestrongdịch

thủy

phânlúa

mìđãđượcxácđịnhphù

hợpvớithời

gian

xử

lýtrongquátrìnhthủy phân. Sau24 giờ thủy phân thì dịch thủy phân chứapolypeptides,
oligopeptidesvà các acidamin tự dovới các kích thướckhácnhau.

11


1.4

Giới thiệu về enzyme protease Alcalase và Flavourzyme
1.4.1

Enzyme Alcalase

Giới thiệu
Enzyme Alcalase là loại endopeptidase thủy phân protein, thuộc loại enzyme
một cấu tử, được thu nhận bằng quá trình lên men bề sâu của lồi vi khuẩn Bacillus
Licheniformis.
Thành phần chính trong sản phẩm thương mại enzyme Alcalase là Subtilisin
Carlsberg (alkaline protease A), một serin protease.Trong hệ thống danh pháp
MEROPS phân loại protease, Subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh SB của nhóm
serine protease (EC.3.4.21.-) với điểm đặc trưng là chứa đơn phân serine nằm trong
trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Subtilisin Carlsberg là một chuỗi polypeptides
chứa 274 acid amin, khối lượng phân tử 27300 Da. Subtilisin Carlsberg là một enzyme
chịu nhiệt, với nhiệt độ hoạt động tối ưu từ 55oC đến 65oC, hoạt động tốt trong vùng
pH kiềm tính từ 7 đến 8.5.
Trung tâm hoạt động
Trung tâm hoạt động của Subtilisin Carlsberg bao gồm bộ ba acid amin: serine ở
vị trí 221, histidine ở vị trí 64, và aspartic acid ở vị trí 32.
Protease có cấu trúc gấp nếp để các amino acid này có thể tương tác với nhau
theo một cách nhất định nhằm thủy phân nhiều cơ chất khác nhau. Histidine đóng vai
trị như chất nhận proton, hay một bazơ, nhận nguyên tử H từ nhóm OH của serine.
Serine mất đi một proton, sẽ hình thành liên kết mới với nguyên tử C trong nhóm
carbonyl của liên kết peptides trong cơ chất. Nhóm carboxylic acid trong aspartic acid
tích điện âm, giúp ổn định chuỗi điện tích dương của histidine.
Cơ chế phản ứng thủy phân
Cơ chế thủy phân protein của Subtilisin Carlsberg được chia thành hai bước:

12


 Bước 1: Phản ứng acyl hóa (là phản ứng thay thế nguyên tử H trong nhóm OH bằng nhóm R-CO-)
Khi một polypeptides di chuyển đến trung tâm hoạt động, nhóm imidazole trong
phân tử histidine sẽ lấy đi nguyên tử H trong nhóm -OH của serine, ngay lập tức O2của serine hình thành liên kết mới với nguyên tử C trong liên kết peptides của cơ chất,

dẫn đến liên kết peptides giữa C-N bị phá vỡ. Sự phá vỡ liên kết peptides này làm cho
serine bị acyl hóa bởi nhóm carbonyl của amino acid. Nhóm -NH trong liên kết
peptides liên kết với nguyên tử H của histidine (nguyên tử H histidine lấy từ serine),
hình thành một peptides mới.
 Bước 2: Khử acyl hóa
Khi có mặt phân tử H2O, nguyên tử O trong nhóm -OH của H2O sẽ tấn cơng vào
ngun tử C trong nhóm carbonyl trên ester serine, liên kết giữa C và O của serine bị
phá vỡ, hình thành một peptides độc lập. Nguyên tử H còn lại của H2O sẽ hình thành
liên kết với O của serine, giúp trung tâm hoạt động của enzyme được phục
hồi.(DonLon, 2007)
1.4.2

Enzyme Flavourzyme

Enzyme Flavourzyme được sản xuất qua quá trình lên men của nấm mốc
Aspergilus Oryaze. Flavourzyme thuộc loại enzyme aminopeptidase, enzyme sẽ xúc
tác thủy phân tại vị trí N- , sản phẩm thủy phân chủ yếu là các acid amin và dipeptides,
tripeptides và các peptides mạch ngắn.
Các ion Pb2+, Cu2+ và Fe2+ có tác dụng ức chế enzyme làm giảm hoạt tính
enzyme Flavourzyme, trong khi đó ion Zn 2+ có tác dụng hoạt hóa làm tăng hoạt tính
enzyme lên 84% so với ban đầu, các ion Mg2+, Ca2+, Mn2+ không ảnh hưởng đến hoạt
tính enzyme. (Shie-Jea Lin, 2010)

13