Nghiên cứu sự nhân lên tối ứu của dòng Virus Rota VNHR 203 - 030 trên tế bào thận khỉ Tiên Phát Macaca potx

TCNCYH 29 (3) - 2004

9
Nghiên cứu sự nhân lên tối u của dòng virut Rota
VNHR 203-030 trên tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta
Lê Thị Luân
Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin

VNHR 203-30 là chủng virut rota ngời G4P6,8; đợc phân lập từ bệnh phẩm phân có nguồn gốc
từ bệnh nhi nam 9 tháng tuổi vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm 2000. Chủng này là ứng cử
viên để sản xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em Việt Nam. Liều gây nhiễm trên tế bào thận
khỉ tiên phát Macaca Mulatta là 0,1 FFU/1 tế bào.

i. Đặt vấn đề
Việt Nam là nớc đang phát triển có dân
số gần 80 triệu ngời, với tỷ lệ sinh hàng năm
lớn (1,52 triệu trẻ em sơ sinh trong 1 năm) và
tỷ lệ tử vong ở trẻ dới 5 tuổi cao (42,5 trẻ/
1000 trẻ /năm hay 9880 trẻ bị chết /năm)
trong số đó có 15,4% là do bị tiêu chảy [5].
Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy trong 5
năm 1998 đến 2003 tại các bệnh viện lớn của
nớc ta thì tiêu chảy do căn nguyên virut rota
chiếm 45% đến 60% trẻ vào viện do tiêu
chảy. Nếu tỷ lệ chết do virut rota cũng theo tỷ
lệ đó hoặc một nửa tỷ lệ đó thì tỷ lệ tử vong do
nguyên nhân này là 4% đến 8% trong tổng số
trẻ em dới 5 tuổi/năm. Nh vậy trong suốt 5
năm đầu tiên cứ 280-560 trẻ có 1 trẻ chết do
virut rota/năm [5]. Đối với trẻ vào viện, tối

thiểu trẻ phải mất một tuần nằm viện, cha mẹ
của trẻ phải nghỉ việc ít nhất một tuần để
chăm sóc chúng do vậy chi phí cho đi lại,
thuốc men là rất tốn kém. Theo thống kê của
Mỹ, hàng năm chi phí cho thuốc men điều trị
tiêu chảy do virut rota lên tới 246 triệu đô la.
Dân số Mỹ gấp 3 lần dân số nớc ta và coi
dịch vụ y tế cao hơn gấp 10 lần thì số chi phí
cho trẻ em Việt Nam bị tiêu chảy cũng phải
mất 9 triệu đô la Mỹ tơng đơng với 135 tỷ
đồng/năm. Do vậy việc nghiên cứu sản xuất
văcxin không những dự phòng đợc căn bệnh
phổ biến đối với trẻ hiện nay mà còn góp
phần quan trọng trong công tác chăm sóc sức
khoẻ; đồng thời tiết kiệm chi phí cho các gia
đình có trẻ mắc bệnh và cho toàn xã hội.
Hiện nay, trên thế giới các nhà khoa học
đã nghiên cứu rất nhiều về virut rota, đặc biệt
là nghiên cứu sản xuất văcxin phòng bệnh
này. ứng cử viên sáng giá nhất trong sản xuất
văcxin là chủng virut rota dựa trên các týp gây
bệnh cho trẻ em hoặc động vật. Các týp này
đợc phân lập từ bệnh phẩm phân của trẻ hay
động vật, sau đó đợc dùng để tạo chủng
văcxin trên các dòng tế bào theo những qui
trình khác nhau. Cho đến đầu năm 2004 một
số ứng cử viên văcxin sống giảm độc lực
phòng bệnh tiêu chảy do virut rota đang tiến
hành nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai
đoạn cuối trớc khi đợc cấp giấy phép sử

dụng nh văcxin từ chủng G1P8 (Rotarix) của
hãng Glaxo Smith Lines; G10P12 của Lan
Châu Trung Quốc; G3P6 của
Australia;.G1,G2,G3,G4P8 (RotateqT) của
Merk,
Cùng với các nớc trên thế giới, nớc ta
thực hiện giám sát bệnh tiêu chảy do virut
rota từ năm 1998 và đã xác định đợc 4
chủng chính gây bệnh đó là: G1; G2; G4; và
G9 [5]. Chủng G1 và G2 đã đ
ợc cấy chuyển
và nhân lên trên tế bào [1,3] nhng chỉ có
chủng virus rota G4P6,8 là thích nghi trên tế
bào thận khỉ tiên phát. Chủng G4P6,8
(VNHR203) phân lập từ trẻ nam 9 tháng tuổi
vào viện Xanh Pôn vì tiêu chảy cấp năm
2000. Chủng này đợc cấy chuyển thích nghi
30 lần trên các dòng tế bào thích hợp, đặc
biệt là tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta để tạo chủng cho nghiên cứu sản
TCNCYH 29 (3) - 2004

10
xuất văcxin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em
nớc ta. Để virut này nhân lên trên tế bào
thận khỉ có hiệu giá tối u trong nghiên cứu
sản xuất văcxin, điều nhất thiết phải tìm liều
gây nhiễm thích hợp. Do vậy mục tiêu duy
nhất của nghiên cứu này là xác định liều gây
nhiễm để tạo hiệu giá cao nhất khi nhân

chúng trên tế bào thận khỉ tiên phát.
ii. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
Sử dụng chủng virus rota phân lập và cấy
truyền trên tế bào thận khỉ tiên phát từ một
mẫu phân của 1 trẻ bị tiêu chảy cấp do virus
rota đợc gọi là VNHR-203-030. Chủng virus
này đợc chuẩn độ hiệu giá bằng phơng
pháp miễn dịch huỳnh quang trên tế bào thận
khỉ bào thai rhesus (MA104) [2,3] và hiệu giá
tính bằng đơn vị huỳnh quang trong 1ml
(FFU/ml).
Nuôi tế bào thận khỉ tiên phát Macaca
Mulatta bằng môi trờng LHE (Trung tâm
Khoa học Sản xuất văcxin Sabin sản xuất)
10% huyết thanh bê (Gibco- Mỹ). Tách tế bào
thận khỉ tiên phát một lớp theo tỷ lệ 1:5 và
nuôi chúng bằng môi trờng 199 (Trung tâm
Khoa học Sản xuất văcxin Sabin sản xuất)
10% huyết thanh bê (Gibco-Mỹ). Khi tế bào
kín một lớp, đếm số lợng tế bào và sau đó
gây nhiễm tế bào bằng các liều gây nhiễm
khác nhau: (A)3,5 tế bào/ 1FFU; (B)4,5 tế
bào/ 1FFU; (C) 6,3 tế bào/1FFU; (D) 10 tế
bào /1FFU; (E) 30 tế bào/1FFU; (G) 32 tế
bào/1FFU; (H) 50 tế bào/1FFU; (I) 70 tế
bào/1FFU; (K) 90 tế bào/1FFU và (M) 100 tế
bào/1FFU.
Hỗn dịch virus thu đợc từ các liều gây
nhiễm trên đợc bảo quản ở nhiệt độ -20

0
C
hoặc -80
0
C. Chúng đợc đông tan 3 lần, sau
đó ly tâm 3000 vòng/1phút/10phút. Lấy nớc
nổi và chuẩn độ hiệu giá virus rota từ các mẫu
thu đợc bằng phơng pháp miễn dịch huỳnh
quang nh sau:
Bớc 1: Nuôi tế bào MA104 một lớp trên
phiến nhựa 96 giếng, đáy phẳng (sản xuất tại
Đan Mạch-loạt số 047016). Rửa tế bào bằng
2 lần môi trờng muối cơ bản Hank và 1 lần
bằng môi trờng 199 có chất ổn định pH
(heppes), giữ phiến tế bào với môi trờng 199
tại 37
0
C đến khi gây nhiễm virut.
Bớc 2: Hoạt hóa virut VNHR-203-030
bằng dung dịch trysin IX (Gibco-Mỹ) tại 37
o
C
từ 30 đến 60 phút.
Pha loãng virus bậc 10 bằng môi trờng
199 hoặc DMEM có heppes và không có
huyết thanh bê.
Bớc 3: Hút hết môi trờng 199 tại các
giếng tế bào, cho 100àl hỗn dịch virus nồng
độ từ 10
-1

đến 10
-8
vào phiến, mỗi nồng độ 3
giếng, ủ phiến tại 37
0
C trong 18 giờ.
Bớc 4: Cố định tế bào bằng dung dịch
formaldehyt 15àl/ giếng ở 4
0
C trong 30 phút,
sau đó bỏ hết môi trờng và để khô tự nhiên.
Cho 100àl huyết thanh kháng thỏ đa giá
(RRV) với tỷ lệ 1/5000 (pha với PBS 1%
skimmilk) nh kháng thể thứ nhất, để nhiệt độ
phòng thí nghiệm 1 giờ, rửa 3 lần bằng PBS-
Tween và cho 100àl kháng thể tinh khiết dê
gắn huỳnh quang kháng IgG thỏ (ICN-Mỹ) có
xanh Evanblu nh một kháng thể thứ 2, để
phòng thí nghiệm 2 giờ, sau đó rửa và để khô
tự nhiên.
Bớc 5: Đọc kết quả trên kính hiển vi
huỳnh quang vật kính 10.
Tế bào bình thờng là tế bào MA104 bắt
màu da cam đậm.
Tế bào nhiễm virus là tế bào bắt màu xanh
phát quang.
Hiệu giá virus là nồng độ pha loãng nhất
mà tại đó đếm đợc các điểm huỳnh quang
màu xanh của tế bào nhiễm virut trên một
giếng.

Hiệu giá virut (FFU/ml)= n x1/ log 10
-x
x
10.
Trong đó: n là số lợng điểm huỳnh
quang.
10
-x
là nồng độ pha loãng nhất có thể đếm
đợc điểm huỳnh quang.
10 là hệ số tính hiệu giá trong 1ml.
TCNCYH 29 (3) - 2004

11
iii. Kết quả
Kết quả nghiên cứu đợc trình bầy trong
các bảng sau:
Bảng 1. Hiệu giá chủng VNHR-203-030
Hiệu giá
Chủng
Log10
n
FFU/ml
VNHR-203-030 7,0

Bảng 1 cho kết quả hiệu giá chủng
VNHR203-030 là 10
7,0
FFU/ml
Bảng 2. Hiệu giá của virus rota trên các

liều gây nhiễm khác nhau
Hiệu giá
Liều
gây
nhiễm
Số lợng tế
bào gây
nhiễm/1FFU
Log10
n

FFU/ml
FFU/ml
A
3,5 tế bào 6.84 6918309
B 4,5 tế bào 6.65 4466835
C 6,3 tế bào 6.95 8912509
D 10 tế bào 7.08 12022644
E 30 tế bào 6.76 5754399
G 32 tế bào 6.70 5011872
H 50 tế bào 6.72 5248074
I 70 tế bào 6.05 1122018
K 90 tế bào 6.48 3019951
M 100 tế bào 5.50 316227

Bảng 2 cho thấy hiệu giá cao tại 2 liều gây
nhiễm 6,3 tế bào/1FFU và 10 tế bào/1FFU tuy
nhiên hiệu giá cao hơn ở liều gây nhiễm là 10
tế bào/FFU (cao hơn 1,35 lần so với liều gây
nhiễm 6,3 tế bào/1FFU). Hiệu giá thấp dần

khi số lợng tế bào tăng và hiệu giá thấp nhất
là 100 tế bào/FFU.
iv. Bàn luận
Tế bào thận khỉ tiên phát Macaca Mulatta
là tế bào đợc tách từ tổ chức thận khỉ
Macaca Mulatta (khỉ nuôi tại đảo Rều Quảng
Ninh) và có thể cấy chuyển 3 lần liên tiếp. Mỗi
đôi thận khỉ có thể tách đợc khoảng 100-120
chai roux tế bào. Tế bào này đợc nuôi và
phát triển kín 1 lớp bằng môi trờng LHE 10%
huyết thanh bê trong 7 ngày. Khỉ lấy thận
đợc kiểm tra nghiêm ngặt về các tác nhân
ngoại lai theo phơng pháp và tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế thế giới. Khỉ và tế bào thận khỉ
đợc chấp nhận để nghiên cứu và sản xuất
văcxin khi đã qua tất cả thử nghiệm theo yêu
cầu của Tổ chức Y tế thế giới.
Tế bào (MA104) có nguồn gốc từ tế bào
thận bào thai khỉ rherus, đợc chọn lọc tạo
thành dòng tế bào thờng trực, dòng tế bào
có thể cấy chuyển nhiều lần mà không ảnh
hởng đến đặc tính của tế bào, đợc bảo
quản ở -196
0
C và đợc cung cấp bởi Trung
tâm Phòng chống và Kiểm soát bệnh tật
CDC-Atlantta-Mỹ, là nguồn tế bào nhạy cảm
cho sự nhân lên của virus rota và dùng để sử
dụng cho phân lập và kiểm tra hiệu giá virut
rota.

Virut rota nhóm A là virut chính gây bệnh
cho trẻ em dới 5 tuổi [4,5]. Virut này rất khó
nhân lên và thích nghi trên tế bào một lớp cho
đến khi sử dụng enzym trypsin hoạt hóa virut
[6]. Liều gây nhiễm virut cực kỳ quan trọng
trong sự nhân lên của virut, không phải nồng
độ gây nhiễm cao là tạo ra sản phẩm có hiệu
giá cao, cụ thể nh nồng độ gây nhiễm từ 3,5
tế bào/ FFU đến 4,5 tế bào/FFU cho sản
phẩm có hiệu giá thấp hơn tại nồng độ 6,3 tế
bào/FFU và 10 tế bào/FFU. Do vậy việc chọn
ra liều gây nhiễm thích hợp là vô cùng quan
trọng. Liều gây nhiễm thích hợp lợng virus
rota tính theo đơn vị FFU sử dụng cho 01 tế
bào mà tại đó tạo ra sản phẩm có hiệu giá
cao nhất. Nh vậy liều gây nhiễm thích hợp
cho chủng VNHR203-030 là 0,1FFU virus
rota/ 1 tế bào. Liều gây nhiễm này cao hơn so
với liều gây nhiễm của chủng virut bại liệt
trong sản xuất văcxin bại liệt sống uống
(0,0033PFU virus bại liệt/1 tế bào thận khỉ
tiên phát) và cũng cao hơn liều gây nhiễm
chủng virut viêm gan A trong sản xuất văcxin
viêm gan A (0,05PFU virus viêm gan A/1 tế
bào thận khỉ tiên phát).
TCNCYH 29 (3) - 2004

12
V. Kết luận
Chủng virut rota VNHR203-030 nhân lên

tốt nhất trên tế bào thận khỉ tiên phát khi liều
gây nhiễm là 0,1 đơn vị miễn dịch huỳnh
quang trên một tế bào (0,1FFU/ 1 tế bào).
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này là công trình nghiên cứu
lần đầu tiên tại nớc ta về virut rota, nghiên
cứu đợc thực hiện tại phòng thí nghiệm
chuẩn tại Trung tâm Khoa học Sản xuất
Văcxin Sabin, số 135 phố Lò Đúc-Hà Nội.
Nghiên cứu này là một trong những nội dung
giám sát bệnh tiêu chảy do virut rota tại Việt
Nam năm 2003 đề tài hợp tác với Trung tâm
Phòng chống và Kiểm soát Bệnh tật (CDC)
Atlantta-Mỹ và dới sự tài trợ của Tổ chức Y
tế thế giới và của Trung tâm Khoa học Sản
xuất Văcxin Sabin. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới Gs. Nguyễn Văn Mẫn chủ nhiệm
đề tài hợp tác, đã tạo mọi điều kiện cho tôi
chủ động thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin
chân thành cảm ơn tới: Ts. Nguyễn Thị Quỳ;
Ts. Nguyễn Đăng Hiền; Cn. Lê Trung Dũng;
Cn Trần Bích Hạnh và Cn. Nguyễn ánh Tuyết
Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin
đã giúp tôi thực hiện nghiên cứu này.
Tài liệu tham khảo
1. Lê Thị Luân. Quá trình chọn lọc chủng
virut rota týp G2 trên nuôi cấy tế bào. Tạp chí Y
học thực hành; Số 9 (460); Trang 13-15; 2003
2. Lê Thị Luân. Nuôi cấy virut rota gây
bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em dới 5 tuổi trên tế

bào thận khỉ Rherus châu Phi; Tạp chí Y học
thực hành, Số 10 (463), trang 52-53; 2003
3. Lê Thị Luân. Chọn lọc chủng virut rota
G1 trên tế bào thận khỉ Macaca Mulatta. Tạp
chí Y học Thực hành số 9 (460); trang 54-
56;2003
4. Nigel A.C., Jailosi S.G., Robin L.B., et
al. Rotavirus G and P types in children with
acute diarrhea in Blantyre, Malawi, from 1997
to 1998: Predominance of Novel P6G8
strains. Journal of Medical Virology 57: 308-
312; 1999.
5. Nguyen Van Man and et al. The
Epidermiology and Disease Burden of
rotavirus in Vietnam: Sentinel Surveillance at
6 hospitals. The journal of infectious Disease
in America; volume 183: 1707-1712; 2001
6. Esparza J., Gorziglia M., Gil F., and
Romer H Multiplication of Human Rotavirus
in cultured cells: an Electron Microscopic
Study. J.Gen.Virol.,47, 461-472; 1980.

Sumary
The study of priority multiplication rotavirus VNHR 203-030
on Macaca Multta primary monkey kidney cells

VNHR 203-030 is human rotavirus strain G4P6,8. It was isolated from stool sample of male
patient- 9 month of age. He addmited Saint Pont hospital cause by acute diarrhea. This strain
was passaged 30 times in the cell culture. It is candidate for producing rotavaccine. It's M.O.I is
0.1 FFU virus rota/ 1 Primary monkey kidney cells.