Nhân dòng gene quy định protein capsid vỏ virus HPV (hepatopancreatic parvovirus) trong escherichia coli để tạo kháng thể trong chẩn đoán bệnh trên tôm sú

Trang 1

1 

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................ 3 

1.1.  Tính cấp thiết của đề tài. ......................................................................................... 3 
1.2.  Tên đề tài. ................................................................................................................ 3 
1.3.  Mục tiêu đề tài. ........................................................................................................ 3 

2 

TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 4 

2.1.  Tổng quan về bệnh học trên tôm sú. ....................................................................... 4 
2.1.1  Bệnh virus [2,6,9,13,14,15,16,17,18,23,26,29,33,34,35]. ............................... 4 
2.1.1.1  Nhóm cấp tính. ......................................................................................... 4 
2.1.1.2  Nhóm mãn tính. ........................................................................................ 7 
2.1.2  Bệnh vi khuẩn [1,3,16,17,19]. ......................................................................... 8 
2.1.2.1  Nhóm cấp tính .......................................................................................... 8 
2.1.2.2  Nhóm mãn tính. ........................................................................................ 9 
2.1.3  Bệnh Parasites [16,17]. .................................................................................. 10 
2.1.4  Bệnh nấm [16,17]. ......................................................................................... 10 
2.1.5  Bệnh viêm gan tụy hepatopancreatic parvovirus [16,17,18,19,23,25,]. ........ 11 
2.2.  Tổng quan về kỹ thuật tạo dòng. ........................................................................... 14 
2.2.1  Phương pháp thiết kế mồi [21]. ..................................................................... 14 
2.2.2  Phương pháp PCR [21]. ................................................................................. 15 
2.2.3  Phương pháp nối ghép các đoạn gen[8,31]. ................................................... 16 
2.2.4  Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli DH5α [9,10,11]............................. 17 
2.2.4.1  Hóa biến nạp. .......................................................................................... 17 

2.2.4.2  Điện biến nạp.......................................................................................... 18 
2.2.4.3  Phương pháp chọn dòng vector nhân dòng trong E.coli. ....................... 19 
2.2.5  Tế bào nhân dòng E.coli [4,28]...................................................................... 21 
2.2.5.1  Phân loại: ................................................................................................ 21 
2.2.5.2  Ưu điểm:................................................................................................. 22 
2.2.5.3  Khuyết điểm: .......................................................................................... 22 
2.2.6  Chọn tế bào nhân dòng E.coli [10,11]. .......................................................... 22 

3 

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. ................................................................... 23 

3.1.  Sơ đồ chung........................................................................................................... 23 
3.2.  Vật liệu hóa chất nghiên cứu. ................................................................................ 25 
3.2.1  Chủng vi khuẩn. ............................................................................................. 25 
3.2.2  Plasmid. ......................................................................................................... 25 
3.2.2.1  Plasmid nhân dòng pJET 1.2 .................................................................. 25 
3.2.2.2  Enzyme cắt và nối đoạn gen DNA tái tổ hợp. ........................................ 26 
3.2.3  Hóa chất và mơi trường. ................................................................................ 26 
3.2.3.1  Hóa chất:................................................................................................. 26 
3.2.3.2  Dụng cụ, thiết bị: .................................................................................... 28 
3.2.3.3  Các phương pháp thí nghiệm.................................................................. 28 

4 
5 
6 

THỜI GIAN ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN LUẬN VĂN. ............................. 36 
NHÂN SỰ THỰC HIỆN.......................................................................... 37 
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. ................................................................... 38 

6.1.  Xác định số dòng HPV nhiễm trên tôm sú. ........................................................... 38 
6.2.  Lâm sàng tôm sú teo gan và các bệnh nhiễm kèm. ............................................... 41 
6.2.1  Khẳng định lâm sàng và kiểm chứng bằng PCR tìm chứng dương HPV:..... 41 

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 2

6.2.1.1  Bệnh lý: .................................................................................................. 41 
6.2.1.2  Kiểm chứng bằng phương pháp PCR. .................................................... 42 
6.2.1.3  Kết quả PCR mồi đặc hiệu H441 và các bệnh đồng nhiễm: .................. 43 
6.2.2  Thiết kế mồi cho nhân dòng capsid VP vào trong plasmid PJET1.2 tạo dòng
PJET1.2 – moncap. ...................................................................................................... 49 
6.2.2.1  Thiết kế primer: ...................................................................................... 49 
6.2.3  Phân lập đoạn gen mã hóa capsid VP: ........................................................... 49 
6.2.4  Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mã hóa đoạn gen capsid VP
50 
6.2.4.1  Cloning Kit (Fermentas):........................................................................ 50 
6.3.  Kết quả giải trình tự đoạn gen VP. ........................................................................ 52 
6.3.1  Clustal cả trình tự nucleotide của đoạn gene chèn vào plasmid nhân dịng
PJET1.2 và đoạn gene mã hóa capsid VP trên gene bank ........................................... 52 
6.3.2  Align PJET1.2–moncap11 với trình tự trên gene bank: ................................ 56 
6.3.3  Align PJET1.2–moncap12 với trình tự trên gene bank: ................................ 61 
6.3.4  Align và clustalW trình tự acid amin của protein tái tổ hợp VP với trình tự
acid amin của protein trên gene bank: ......................................................................... 66 
6.3.4.1  Align: ...................................................................................................... 66 

6.3.4.2  Clustalw: ................................................................................................. 67 
6.3.4.3  Kết luận: ................................................................................................. 69 

7 

TÀI LIỆU THAM KHẢO. ....................................................................... 70 

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 3

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. Tính cấp thiết của đề tài.
Những năm gần đây, bệnh dịch virus tôm sú ngày một lan nhanh và gây thiệt hại
kinh tế như một thảm họa không báo trước cho nền kinh tế nước nhà và thế giới .
Bệnh virus nói chung và bệnh virus tơm nói riêng như đốm trắng, đỏ thân, đầu
vàng, cịi, hoại tử, teo gan ... khơng có thuốc điều trị. Năm nay, dịch bệnh teo gan
kèm theo bệnh phân trắng đã làm cho tôm chết hàng loạt sau một cơn mưa dầm,
nắng hạn, gió bấc hay đứng gió. Bệnh teo gan do virus HPV (Hepatopancreatic
parvovirus), REO III & IV (Reo-like virus of the hepatopancreas) hay vi khuẩn như
vibrio và NHP (Necrotizing Hepatopancreatitis) gây ra [12, 32]. Do đó, việc chuẩn
đốn bệnh virus HPV gây teo gan tôm ở giai đoạn con giống và tôm mẹ với thời
gian ngắn nhất và hiệu quả nhất là một trong các vấn đề cấp thiết nhất hiện nay.
Việc chuẩn đốn bệnh HPV trong tơm hiện nay chủ yếu bằng phương pháp PCR.

Phương pháp này khá nhạy, song giá thành còn cao cà chỉ thực hiện được trong các
phịng thí nghiệm có trang bị máy PCR. Việc chuẩn đốn bệnh tại các đồng ruộng
có thể dùng các que thử khá đơn giản dựa trên nguyên lý kháng nguyên – kháng thể.
Để có thể tiến tới sử dụng phương pháp chuẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch,
chúng tôi tiến hành đề tài tạo kháng nguyên protein đặc hiệu cho HPV.
1.2. Tên đề tài.
Nhân dòng gene quy định protein vỏ capsid virus HPV (Hepatopancreatic
parvovirus) trong tế bào E.coli để tạo kháng thể trong chuẩn đoán bệnh trên tơm sú.
1.3. Mục tiêu đề tài.
• Xác định số dịng virus HPV, biểu hiện lâm sàng
• Xác định các bệnh nhiễm kèm trên tơm sú Việt Nam.
• Phân lập đoạn gen capsid VP virus HPV.
• Tạo dịng tế bào vi khuẩn Escherichia coli mang gene capsid VP .

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 4

2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

2.1. Tổng quan về bệnh học trên tơm sú.
2.1.1 Bệnh virus [2,6,9,13,14,15,16,17,18,23,26,29,33,34,35].
2.1.1.1 Nhóm cấp tính.
a. Yellow head virus (YHV).
Phân loại:

YHV là virus có nhân là RNA, mạch đơn, họ rhabdoviruses, có 3 dịng: Yellowhead virus YHV, gill-associated virus GAV, và lymphoid organ virus LOV.
Triệu chứng:
Phần sống đầu ngực màu vàng do gan tôm bị vàng qua lớp mai trên đầu. Biểu hiện
ban đầu bệnh này là gan tơm có màu vàng xanh xám bao quanh từ ngồi vào trong,
đơi khi từ màu xanh chuyển sang màu nâu nhạt.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:
• Nước biển: 3 – 4 ngày.
• Nước ao ni tơm: 7 – 10 ngày.
• Xác tơm đơng lạnh ở – 600C: 6 tháng.
• Thời gian tồn tại virus này trên tôm bệnh đầu vàng hấp hối và chết đến nay
vẫn chưa được biết.
b. Taura syndrome virus (TSV).
Phân loại:
TSV là virus có nhân là RNA mạch đơn, lớp Picornavirales, họ Dicistroviridae.
Triệu chứng:
Xuất hiện đốm trắng đỏ trên đi quạt, sau đó đi quạt đỏ sáng dần như bị chín
phần thịt đi và cuối cùng đuôi quạt bị rụng đi.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:
• Vẫn cịn hoạt động ở 00C.
• Thời gian tồn tại virus này trên tơm bệnh hấp hối và chết đến nay vẫn chưa
được biết.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 5

c. White Spot syndrome (WSSV).

Phân loại:
WSSV là virus có nhân là DNA, mạch đôi, họ Nimaviridae.
Triệu chứng: xuất hiện nhiều đốm trắng trên lớp cutin áo trên đầu tôm. Những
khoanh trịn chứa nhiều canxi trên vỏ, vỏ tơm mềm nhũng dễ vỡ như miếng gạch
vụng. Kích thước khoanh trịn này khoảng 0.5 – 2 mm.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: nước biển: 4 – 7 ngày.
d. Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis virus (IHHNV).
Phân loại:
IHHNV là virus có nhân là DNA, mạch đơn, họ Parvoviridae.
Triệu chứng: các phần phụ và đầu tôm bị biến dạng như hai mắt không đối xứng,
các chủy và chân bơi bị ngắn hơn bình thường. Đường viền trên lớp áo cutin chuyển
từ màu sáng sang màu sậm hay cả lớp áo có màu sậm hơn. Sau đó, thịt tơm có màu
hơi xanh. Roi và anten bị biến dạng khiến tôm bơi lảo đảo mất căn bằng.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: chưa biết.
e. Baculavirus penaei (PsSNPV).
Phân loại:
PvSNV là virus có nhân DNA, mạch đơi, họ Baculoviridae.
Triệu chứng: đoạn ruột giữa có màu trắng sữa.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:
Nước biển: 4 ngày ở nhiệt độ 300C, 7 ngày ở 250C,12 ngày ở 200C, 20 ngày ở
150C, 120 phút ở 450C, 30 phút ở 500C, 5 phút ở 600C. Bất hoạt ở pH = 1.0 – 4.0.
f. Baculoviral midgut galnd necrosis virus (BMNV).
Phân loại:
BMNV là virus có nhân là DNA, mạch đôi, họ Baculoviridae.
Triệu chứng:
Gan tôm xuất hiện vùng màu trắng, đục hơi mờ. Tôm giống dạng post bơi lờ đờ trên
mặt nước và có đoạn ruột giữa màu trắng.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 6

Nước biển: 4 ngày ở nhiệt độ 300C, 7 ngày ở 250C,12 ngày ở 200C, 20 ngày ở
150C, 120 phút ở 450C, 30 phút ở 500C,5 phút ở 600C. Bất hoạt ở pH = 1.0 – 4.0.
g. Monodon baculovirus (MBV).
Phân loại:
MBV là virus có nhân là DNA, mạch đơi, họ Baculoviridae.
Triệu chứng: gan tơm màu trắng bệch và kích thước tơm nhỏ hơn bình thường rất
nhiều.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:
Nước ao nuôi tôm và nươc biển: 4 ngày ở nhiệt độ 300C, 7 ngày ở 250C,12 ngày ở
200C, 20 ngày ở 150C, 120 phút ở 450C, 30 phút ở 500C,5 phút ở 600C. Bất hoạt ở
pH = 1.0 – 4.0.Thời gian tồn tại virus này trên tôm hấp hối và chết đến nay vẫn
chưa được biết.
h. Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).
Phân loại:
IPNV là virus có nhân là RNA, mạch đơi, họ Birnaviridae, có ít nhất 9 dịng.
Triệu chứng:
• Tơm giống hơn mê, bơi lờ đờ, phần ngực và chân bụng xuất hiện nhiều viết
loét, bị rối loạn vận động vào lúc trời chuyển mưa và xuất hiện cầu vịng.
• Tơm trưởng thành thường khơng chết khi bị nhiễm. Tôm bị nhiễm phát bệnh
khi gan tôm bị thối hóa.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:
Nước ao nuôi tôm và nươc biển: 30 phút ở 600C và pH = 3, 5 giờ ở pH = 7 – 9, 10
phút ở pH = 12.5, 1 giờ ở pH = 2.5, nhiều tuần ở 100C, nhiều tháng ở 40C.
i. Rhabdovirus of Penaeid shrimp (RPS).

Phân loại:
RPS là virus có nhân là RNA, mạch đơn, họ rhabdoviridae.
Triệu chứng: khơng rõ ràng và có liên quan tới hệ miễn dịch của tơm. Cơ quan
lympho bị phình to.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 7

2.1.1.2 Nhóm mãn tính.
a. Reo III và IV.
Phân loại:
REO III và IV là virus có nhân là DNA, mạch đôi, họ Reoviridae.
Triệu chứng:
Biểu hiện chưa rõ rãng như tăng trưởng kém, tăng mùi hôi trên bề mặt, vỏ tôm bị
melanie hóa, cơ bị đục, mềm thân, thường gan tơm bị teo và màu xanh. Tôm nhiễm
virus này thường mắc các chứng bệnh đường ruột và thần kinh như rối loạn vận
động. Vị trí virus tấn cơng vào gan tơm là tế bào F và R trên gan.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: chưa biết rõ.
b. Hepatopancreatic parvovirus (HPV).
Phân loại:
HPV là virus có nhân là DNA, mạch đơn, họ parvoviridae.
Triệu chứng:
Gan tơm có bị teo, có kích thước bằng khoảng 1/3 so với gan bình thường, chai và
dai. Giai đoạn cuối, gan bị nhũng rữa nhưng lớp biểu mô vẫn rất dai. Màu sắc gan
tôm biến đổi tùy theo các bệnh nhiễm kèm như màu xanh nếu nhiễm cùng với
vibrio, màu trắng bệch nếu nhiễm cùng với MBV ...

Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: chưa biết rõ
c. Lymphodial parvo like virus (LPV)
Phân loại:
LPV là virus có nhân là DNA, sợi đơn, họ parvoviridae.
Triệu chứng: giống với IHHNV.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: chưa biết rõ.
d. Lymphoid organ virus (LOV) và Gill associated virus (GAV)
Phân loại:
LOV và GAV là virus có nhân là RNA, mạch đơn, họ rhabdoviruses.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 8

Triệu chứng:
Gan tơm thường có màu nâu hay vàng, kích thước to hơn, nhân tế bào gan bị trương
phình nên gan dễ vỡ, biểu mô mềm và nhũng. Trạng thái bơi lờ đờ tấp bờ vào buổi
sáng sớm.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: Nước biển và nước ao: 4 ngày ở nhiệt độ 25
– 280C. 30 phút ở 600C.
e. Spawner isolated mortality virus (SMV)
Phân loại:
SMV là virus có nhân DNA, mạch đơn, họ parvovirus.
Triệu chứng: Tồn thân bị đỏ sậm và phân có màu đỏ.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: chưa biết rõ.
2.1.2 Bệnh vi khuẩn [1,3,16,17,19].
2.1.2.1 Nhóm cấp tính

a. Necrotizing hepatopancreatis (NHP).
Triệu chứng: hôn mê, bơi lờ đờ, tăng mùi hôi, biếng ăn, đen mang, mềm thân, tỉ lệ
chết cao trong vòng 30 ngày kể từ ngày nhiễm bệnh. Gan tôm bị teo và có màu xanh
trắng bao quanh gan, mềm nhũng.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập: nhiệt độ nước trong ao cao từ 29 – 300C hay
độ muối mặn từ 20 – 40 % là điều kiện để vi khuẩn này phát triển rất mạnh.
b. Vibrio species (vibriosis).
Phân loại: có nhiều dịng: V. harveyi, V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus, V. penaeicida, V. damsela, V. fluvialis, V. anguillarum, V. campbelli,
V. nereis, V. cholerae (non 01) and V. splendidus and Vibrio sp. Tuy nhiên
V.cholerae nhiễm trên tôm sú nhiều nhất.
Nguyên nhân:
Nước ao nuôi kém chất lượng như: giàu dinh dưỡng, màu nước đen, đáy ao bị đóng
đáy do dư thức ăn hay xác tôm chết quá nhiều. Nhiệt độ nước cao và lượng oxy hòa
tan trong nước kém. Mật độ nuôi quá dày.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 9

Triệu chứng:
Thiếu oxy biểu hiện qua toàn thân bị đỏ, mang chuyển màu từ đỏ sang nâu. Kén ăn,
bơi tấp bờ. Đồng thời có thể phát sáng nếu tơm bị nhiễm V. harveyi và V.
splendidus.
Phần tổn thương bị loét thêm do bacteria shell disease gây ra hay các phần rìa của
mang. Màu cơ bị mờ đục như đám mây. Vết loét nhiễm trên gan và ruột sẽ gây
nhiễm trùng máu. Gan tơm có màu mờ đục và xanh. Mang có màu nâu.

c. Rickettsia.
Triệu chứng:
Gan tơm xuất hiện màu trắng và chấm đen rải rác. Tôm kén ăn, màu vỏ sậm, chậm
lớn, thường nhiễm kèm với virus và vi khuẩn.
d. Aerococcus viridans var homari.
Triệu chứng:
Sức khỏe tôm yếu và chết rất đột ngột trong tư thế nằm ngang. Các nguyên tố sắc
đóng thành vết đen nhỏ trên lớp mơ cơ mang hay bộ phận khác trong suốt quá trình
nhiễm.
Khả năng phát triển và tồn tại độc lập:
Nước ao nuôi tôm và nươc biển: 30 phút ở 600C và pH = 3, 5 giờ ở pH = 7 – 9, 10
phút ở pH = 12.5, 1 giờ ở pH = 2.5, nhiều tuần ở 100C, nhiều tháng ở 40C.
2.1.2.2 Nhóm mãn tính.
a. Mycobacteria (mycobacteriosis)
Triệu chứng: chưa rõ, lớp mơ và cơ không sáng và mờ đục. Mấu gan tôm xuất hiện
màu đen vì bị melanine hóa. Vùng màu đen này có thể bị lan nhanh ra các vung
khác tại các mô liên kết các cơ quan như tim, buồng trứng, cơ, cơ quan nhận tín
hiệu, mang. Bệnh phát triển nhanh khi nhiễm kèm với vi khuẩn gram âm và vi
khuẩn chịu acid.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 10

b. Chitinoclastic bacteria (other than vibrios) associated with shell disease.
Triệu chứng: xuất hiện đốm nâu hay đen trên bề mặt cutin. Vết này lan rộng ra các
vùng xung quanh khơng có hình dáng rõ ràng. Thường gặp ở tơm nuôi thâm canh

và quảng canh cải tiến.
c. Aeromonas sp. Và Pseudomonas sp. (Necrosis và septicemias)
Triệu chứng: thường nhiễm chung với các vi khuẩn khác, trạng thái bơi lờ đờ và bị
rối loạn vận động, xuất hiện nhiều đốm nâu trên mang và vùng bụng. Toàn thân
chuyển màu thành đen hay đỏ.
d. Epibiont bacteria which cause fouling (principally leucothrix mucor).
Triệu chứng: xuất hiện mùi hơi, tồn than bị nhớt hay đóng rong ở các khe mang
chuyển từ màu vàng nâu sang màu vàng đen.
2.1.3 Bệnh Parasites [16,17].
a. Microsporidia
Triệu chứng: cơ vân bị mờ đục do micosporidia thay thế lớp cơ này. Vỏ tơm bị
nhiễm thường có màu xanh đen hay đen.
b. Hematodinium-like organism
Triệu chứng: đi tơm có màu phấn trắng và có chứa chất nhờn có của thực vật ký
sinh.
c. Parauronema spp.
Triệu chứng: các lông mịn bị lấp đầy khoang bụng và các khe hở nên tơm có màu
sậm.
2.1.4 Bệnh nấm [16,17].
Fusarium solani (Fusariosis)
Triệu chứng: đen mang và nhiễm kèm với các động thực vật ký sinh và vi khuẩn.
Các phần phụ của đầu và đuôi bị biến dạng hoặc bị mất đi. Các vết lở do nấm này
gây ra thường có màu sậm đen do bị melanine hóa cutine. Nấm chỉ nhiễm ở các vị
trí đầu, đi, phần mang và phần cơ nằm sát mang.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân

Trang 11

2.1.5 Bệnh viêm gan tụy hepatopancreatic parvovirus [16,17,18,19,23,25,].
a. Phân loại.
• Họ: parvoviridae (virus mang gen đơn).
• Họ phụ: Densovirinae.
• Chi: parvovirus.
• Lồi: Hepatopancreatic parvovirus.
• Có 4 dịng virus HPV: HPVmon, HPVchin, HPVmerg và HPVsemi.

Hình tơm bạc (tơm nương:
P.merguiensis) bị teo gan

Hình tơm sú (P.monodon) bị teo gan

Hình tơm đất (P. chinensis) bị teo gan

Hình tơm thẻ rằn (P. semisulcatus) bị
teo gan

• Là virus có nhân DNA, sợi đơn.
b. Cấu tạo.
• Có 20 mặt.
• Đường kính: 20 – 25 nm.
• Có một mảnh nhỏ (particle) nặng 6*106 Da.
• Phân tử DNA nặng khoảng 1.5*106 Da.
Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân

Trang 12

• Lớp vỏ áo gồm 32 capsomer tạo nên protein vỏ tương đối lớn.
• Trọng lượng capsid vỏ 92.29 kDa.
• Là virus tự trị, hay virus khơng có khuyết điểm nên có khả năng tự nhân đơi
trong tế bào ký chủ nhờ hệ enzyme sao mã của tế bào chủ, hay nói cách khác
virus này tham gia vào chu trình tiềm tan trong quá trình xâm nhập và chờ
đợi trong tế bào ký chủ.
• Virion khơng chứa viral và enzyme tế bào, mạch đơn thiếu base bổ sung cuối
cùng (terminal) hay lặp lại trình tự. Do đó, q trình khép vịng theo cách
này hay cách khác khơng được hình thành. Tuy nhiên, phân tử DNA này
cũng có mang trình tự xuôi ngược bổ sung giống nhau (complementary
palindromic sequences) dạng cấu trúc kẹp tóc hình chữ Y (Y shaped
hairpins) ở cả hai đầu tận cùng. Với cấu trúc thế này, việc bảo tồn trình tự
DNA rất cao trong quá trình tiến hóa.
• Trình tự DNA tồn bộ genome cho thấy có 3 vị trí ORF trên mạch đơn phần
xác định (positive polarity), phía bên trái mã hóa cho NS1 và NS2, phía bên
phải mã hóa cho VP.
• Phần khơng bổ sung rất giàu thymine (khoảng 30%).
c. Cơ chế gây bệnh.
Quá trình sao chép trong nhân tế bào khơng cần hịa tan nhân tế bào ký chủ. Chúng
tùy thuộc vào hệ thống sao chép của DNA tế bào chủ, cụ thể là DNA polymerase
γNS1 cũng có liên quan. Q trình này xảy ra hầu hết ở pha S và G2 trong quá trình
tổng hợp DNA tế bào chủ. Thực vậy, DNA của virus không thể tăng số copy trong
tế bào mà khơng có q trình sao chép riêng, nên hệ enzyme tổng hợp DNA của tế
bào chủ ln hoạt hóa suốt pha S. Q trình sao chép này dường như khơng liên
quan tới chu kỳ riêng của virus này và RNA primer vì trình tự đầu 3‘ giàu G/C. Vị
trí sao chép DNA của virus được đánh dấu riêng bằng vị trí nick chuyên biệt trên
phân tử DNA gốc theo chiều 5‘ – 3‘. Sản phẩm DNA của virus trong tế bào chủ

gồm 2 loại: DNA đầy đủ trình tự ban đầu và DNA mất một phần nucletotid từ đầu
mạch tới vị trí nick.
Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 13

Quá trình sao mã của DNA nhờ vào RNA polymerase tế bào chủ. Vị trí bắt đầu sao
mã gần với cấu trúc kẹp tóc đầu 3‘. Lượng lớn mRNA nhất được tạo ra bằng với
trọng lượng DNA của nhân đang diễn ra quá trình sao chép trong tế bào. Quá trình
cắt ghép RNA xảy ra lúc này nhằm tạo ra mRNA cuối cùng. Có 3 mRNA tạo ra,
NS1 và NS2 (khơng mã hóa cấu trúc capsid virus mà chỉ mã hóa protein tham gia
q trình làm tan màng tế bào chủ và sao chép DNA virus), và VP (vỏ virus). VP
gồm có VP1 và VP2. VP2 được tách thành VP3, tùy thuộc vào thời gian nhiễm
bệnh.
d. Lâm sàng.
Quan sát màu gan tôm qua lớp áo mang ở vùng gan mờ.

Giải phẩu: bóc bỏ lớp áo cutine bao trùm gan tơm quan sát thấy bị dai, và chai
cứng, kích thước gan tôm nhỏ hơn khoảng 1/3 so với gan tôm bình thường.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 14

2.2. Tổng quan về kỹ thuật tạo dòng.
Phương pháp tạo dòng gen trước hết cần đoạn gen DNA được phân lập và tinh sạch.
Sau đó đoạn DNA này được lắp ráp với vector nhân dòng bằng enzyme nối giới
hạn.
2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi [21].
• Thiết kế mồi rất quan trọng vì mồi tùy thuộc vào vị trí bắt cặp bổ sung trên
mạch DNA theo chiều 5’ – 3’, số lượng A/T và G/C vừa phải không quá giàu
cũng khơng q nghèo (45 – 65%). Chọn những vị trí khơng phải cấu trúc
kẹp tóc và cấu trúc khơng đối xứng.
• Chiều dài oligonucleotid khoảng từ 20 – 25 nu, khơng dài hơn 40 nu.
• Tm đóng vai trị quan trọng trong quá trình bắt cặp giữa mồi với mạch gốc.
Vì Tm giống như chất dung hịa trung gian giữa 2 trạng thái tương đồng nhau
(two-state transition” gồm dạng cuộn ngẫu nhiên và mạch đơi) và khơng đưa
vị trí tương đối này vào những vị trí có cấu trúc gấp khúc hay giống nhau Để
có nhiều cấu trúc tương tự nhau, cần xác định Tm có thể thay đổi để: nhiệt
độ ở vị trí phân nữa chuỗi (dùng cho nồng độ DNA thấp trong phản ứng
PCR) dạng cấu trúc chuyên biệt (ví dụ: lai mạch đơi) và chuỗi cịn lại của
chuỗi đang giới hạn đề ở dạng trung gian và cuộn ngẫu nhiên. Đôi khi, Tm
vẫn không được xác định rõ ràng vì khơng có nhiệt độ nào nằm ở giữa chuỗi.
Tm được tính bằng cơng thức.: Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C)
• Vị trí bắt cặp của mồi tùy thuộc vào nồng độ muối magnesium, DMSO,
glycerol, formaline, urea, nhiều fluorophore, nhiều nucleotide bổ sung bao
gồm PNA, LNA, morpholino, phosphorothioate, alkynyl pyrimidine, nồng
độ mồi và các yếu tố khác trong dịch chiết DNA, trong đó yếu tố mồi, nhiệt
độ bắt cặp mồi và magnesium quyết định 90 – 95 % phản ứng PCR có thành
cơng hay khơng.
• Tuy nhiên trong phản ứng multiplex PCR, tất cả các sản phẩm được khuyết
đại rõ ràng như nhau với cùng điều kiện nồng độ, nhiệt độ và chu kỳ. Do đó
mồi được thiết kế dựa vào chương trình Primer 3 để chọn lựa đoạn trình tự
Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 15

oligonucleotid có Tm thích hợp nhất theo cơng thức: deltaG0T = - RT * ln
(K).
2.2.2 Phương pháp PCR [21].
a. Chu kỳ.
• Chu kỳ 1: 94 hoặc 950C:30 – 60 giây, là thời gian phân tách mạch, có thể rút
ngắn thời gian còn khoảng 15 giây nếu đoạn khuếch đại ngắn.
• Chu kỳ 2: Nhiệt độ Ta của mồi: 20 – 45 giây, nhiệt độ mồi bắt cặp trên vị trí
đặc hiệu.
• Chu kỳ 3: 720C: thời gian taq kéo dài trình tự bổ sung. 1000bp/1phút.
• Chu kỳ 4: 720C: 5 – 10 phút, thời gian kết thúc cho những taq nào chưa kéo
dài xong.
• Bảo quản mẫu: 4 – 150C cho PCR DNA và – 200C cho PCR RNA.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.
• Vị trí bắt cặp mồi.
• Nồng độ MgCl2và nhiệt độ mồi. Nồng độ muối magnesium quá cao hay quá
thấp cũng ức chế DNA polymerase, tối ưu nhất ở nồng độ cuối 1.5μM trong
thể tích mono PCR, 3 – 10μM cho thể tích multiplex PCR, tối ưu nhất ở
8mM (G.Zangenberg, unpublished data).
• Nồng độ dNTP cũng đóng vai trị quan trọng trong tính tốn nồng độ MgCl2.
Ví dụ: mức chuẩn cho phản ứng khuếch đại là nồng độ 1.5μM MgCl2 và 200
μM mỗi loại dNTP thì nồng độ MgCl2 tốt nhất là 0.7mM vì bản chất DNA
liên kết với 800μM Mg2+ .
• Nồng độ taq khoảng 5 – 10 U trong 100μl thể tích phản ứng.
• Nồng độ dNTP (Deoxynucleoside triphosphates): nồng độ cuối 0.2μM cho

mỗi loại và 25μg DNA mẫu trong 100ul thể tích phản ứng PCR.
• Nồng độ mồi: nồng độ cuối 200 – 250 nM cho phản ứng mono và multiplex
PCR.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 16

• Nồng độ DNA mẫu khoảng 10 – 100ng (3 000 – 30 000 copy mạch đơn
(single – copy genes)). Nếu nồng độ DNA lớn hơn 100 ng thì ức chế DNA
polymerase. Thêm vào đó, q trình khuếch đại DNA cũng bị tắt nghẽn vì
vượt q mức bão hịa. Đối với multiplex PCR cần giảm nồng độ DNA mẫu,
khoảng 250 pg và tăng chu kỳ khuếch đại.
• Thể tích từ 10μl tới 100μl, hiệu quả nhất ở 50μl.
• Dung dịch đệm buffer và muối: nồng độ muối KCl tùy thuộc vào loại DNA
polymerase. Thành phần này chủ yếu gồm Tris – HCl và KCl, ví dụ Stoffel
CM hoạt hóa ở nồng độ: 10mM Tris – HCl (pH = 8) và 10mM KCl.
• Sản phẩm khuếch đại hay lượng DNA mẫu cũng ảnh hưởng đến polymerase
trong phản ứng multiplex PCR, vì nếu sản phẩm khuếch đại và DNA mẫu
quá nhiều đạt trạng thái cân bằng hay bão hòa và dẫn đến ức chế polymerase.
2.2.3 Phương pháp nối ghép các đoạn gen[8,31].
Phương pháp nối ghép các đoạn gen là cách dùng enzyme cắt giới hạn và nối có
tính đặc hiệu cao (cắt duy nhất tại vị trí nhận biết trên sợi đơi) sao cho hai vị trí nối
khớp với nhau.
a. Enzyme cắt giới hạn.
Enzyme cắt giới hạn có hai nhóm: endonuclease và exonuclease. Endonuclease là
những enzyme cắt DNA ở giữa phân tử, và exonuclease cắt từ hai đầu múc của

phân tử DNA.
Dựa vào đặc tính cắt của enzyme, người ta chia enzyme thành loại enzyme cắt giới
hạn:
• Loại I: khi enzyme biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến
cách đó khoảng 1000-5000 nucleotides và cắt.
• Loại II: enzyme nhận biết được trình tự và cắt ngay vị trí đó.
• Loại III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng
20 nucleotide.
Trong 3 loại, enzyme loại II được quan tâm và dùng nhiều nhất.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 17

b. Enzyme nối:
Enzyme nối ở động vật có bốn loại:
• DNA ligase I: nối đoạn Okazaki suốt q trình sao chép DNA và tổng hợp
các đoạn DNA ngắn.
• DNA ligase II: cắt có lựa chọn dạng DNA ligase III liên kết trong phần
khơng phân chia tế bào.
• DNA ligase III: phức hợp với DNA sửa sai XRCC1 để sửa sai các base đột
biến và tổng hợp đoạn DNA.
• DNA ligase IV: phức hợp với DNA XRCC4, xúc tác bước cuối cùng trong
kết thúc mạch đôi DNA không tương đồng và ngừng sửa sai. Điều này cũng
đòi hỏi tổng hợp V(D)J, q trình này phát sinh tính đa dạng trong miễn dịch
và vị trí receptor tế bào T suốt quá trình phát triển hệ miễn dịch.
Enzyme nối dùng cho nối ghép vector và đoạn gen biến nạp vào tế bào E.coli.

• E.coli DNA ligase: enzyme được li trích từ vi khuẩn E.coli và xúc tác phản
ứng nối hai trình tự DNA có đầu so le (đầu dính).
• T4 DNA ligase: có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli. Enzyme này
có khả năng nối hai trình tự DNA đầu tà (đầu bằng).
• T4 RNA ligase: enzyme được trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, xúc tác
quá trình nối hai trình tự ARN bằng liên kết phosphodiester.
2.2.4 Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli DH5α [9,10,11].
Biến nạp có 2 phương pháp: hóa biến nạp và điện biến nạp để chuyển plasmid vào
tế bào đích vi khuẩn.
2.2.4.1 Hóa biến nạp.
1) Giống tế bào được giữ trong glycerol ở - 800C.
2) Hút 100μl giống cho vào 3ml môi trường LB. Nuôi lắc 250rpm/ 370C/ qua
đêm. (12-16 giờ).
3) Hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào 100ml LB. Nuôi lắc 250rpm/ 370C. Đo OD
sao cho OD600 khoảng 0.35-0.4.
4) Làm lạnh dịch nuôi cấy ở 00C trong 10 phút.
Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 18

5) Ly tâm 2700xg/10phút/40C. Bỏ dịch nổi. Úp tube lên giấy thấm để loại hết
mơi trường.
6) Hịa cặn tế bào trong 50 ml dung dịch CaCl2+ 80mM MgCl2+ 20mM đã giữ
lạnh trước.
7) Ly tâm 2700xg/10phút/40C. Loại bỏ dịch nổi.
8) Hòa cặn tế bào trong 10 ml CaCl2+ 100mM lạnnh. Ủ đá trong 30 phút.
9) Ly tâm 1100xg/5 phút/40C. Loại dịch nổi.

10) Tiếp tục ly tâm 1100xg/5 phút/40C. Loại dịch nổi.
11) Hòa cặn tế bào trong 1 ml CaCl2 100Mm + 15% glycerol bằng vortex nhẹ.
12) Trữ lạnh ngay -800C.
2.2.4.2 Điện biến nạp.
1) Giống tế bào được giữ trong glycerol ở - 800C.
2) Hút 100 μl giống cho vào 3ml môi trường LB. Nuôi lắc 250rpm/ 370C/ qua
đêm. (12-16 giờ).
3) Hút 2.5 ml dịch nuôi cấy cho vào 500ml LB. Nuôi lắc 250rpm/ 370C. Đo OD
sao cho OD600 khoảng 0.5 – 0.7.
4) Làm lạnh dịch nuôi cấy ở 00C trong 15 phút.
5) Ly tâm 4200rpm/20phút/20C. Bỏ dịch nổi. Úp tube lên giấy thấm để loại hết
mơi trường.
6) Hịa cặn tế bào trong 5 ml nước lạnh trước và thêm 500ml nước lạnh 20C và
trộn đều.
7) Ly tâm 4200rpm/20phút/20C. Loại bỏ dịch nổi.
8) Hòa cặn tế bào trong phần dịch còn lại.
9) Hòa cặn tế bào glycerol 10% bằng pipet nhẹ.
10) Trữ lạnh ngay -800C.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 19

2.2.4.3 Phương pháp chọn dòng vector nhân dòng trong E.coli.
Chủ yếu dựa vào vị trí polyliner, kích thước vector, khả năng copy của vector, và
khả năng chọn lọc của vector. Cụ thể là:
• Là một đoạn phân tử DNA có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào

chủ, tồn tại độc lập trong tế bào không phụ thuộc sự sao chép bộ gen của tế
bào chủ.
• Có khả năng chứa đoạn DNA ngoại lai.
• Có những trình tự nhận biết duy nhất của những enzyme giới hạn, nghĩa là
chỉ tồn tại một vị trí nhận biết cho mỗi enzyme giới hạn.
• Có gen đánh dấu tức gen chi phối hình thành tính trạng có khả năng biểu
hiện ra bên ngoài để dể dàng nhận biết. Gen đánh dấu được gọi là những
Marker. Chính nhờ marker, người nghiên cứu dể dàng nhận biết và tách tế
bào có chứa gen cần chuyển tải ra khỏi quần thể sinh vật. Thơng thường đó
là tính kháng với kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vector sống được trên
mơi trường có kháng sinh.
• Có kích thước nhỏ, càng nhỏ càng tốt vì vector có kích thước nhỏ thì càng dễ
xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác và càng được sao chép nhanh và có hiệu
quả.
Có ba loại vector: plasmid của vi khuẩn E.coli, cosmid và thực khuẩn thể, ...
a. Plasmid:
Là những đoạn DNA ngắn (2-3 kb) dạng vịng, mạch đơi, nằm ngoài NST, sao chép
độc lập với sự sao chép NST của vi khuẩn, có khả năng gắn vào bộ gen NST.
Đặc điểm của plasmid:
Tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào, nghĩa là plasmid nhân đôi sẽ tạo thành
những vịng nhỏ dính liền nhau, cấu trúc này gọi là các caten, các caten sẽ đứt ra
đưa plasmid về dạng thẳng, nếu bên cạnh đó nhiễm sắc thể của vi khuẩn khi sinh
sản cũng bị đứt ra thì chúng có thể gắn lại với nhau tạo thành một thể thống nhất và
cơ chế này có thể di truyền cho các tế bào con cháu. Đấy là cơ chế tái tổ hợp gen
nội bào.
Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân

Trang 20

Plasmid có khả năng vận chuyển gen: plasmid có thể làm vật chủ trung gian tức là
những cấu trúc có khả năng tự sinh sản, có khả năng gắn kết vào mình những gen
lạ, rồi chuyển giao những gen lạ này vào một tế bào khác.
Khả năng sinh sản rất nhanh và hoạt tính mạnh của plasmid, plasmid có thể đi từ tế
bào vi khuẩn này sang tế bào vi khuẩn khác với tốc độ rất nhanh, sau một thời gian
plasmid có thể xâm nhập vào tất cả các cá thể của chủng vi khuẩn ấy. Có sự kết hợp
với DNA của nhiễm sắc thể của vi khuẩn, plasmid tăng hoạt tính của mình lên hàng
trăm lần.
Các plasmid thường dùng làm vector chuyển vào E.coli là: pBR322, pBR325,
pUC12, pUC13, M13mp18, …
Plasmid có khả năng mang đoạn gen lạ chuyển nạp vào tế bào khoảng <15kp.
b. Phage:
Phage thể hiện tính độc đối với vi khuẩn qua chu trình sinh sản gây độc của phage:
phage có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn, đình chỉ quá trình trao đổi chất
của vi khuẩn, lấy nguyên liệu từ tế bào vi khuẩn để xây dựng nên các thành phần
của nó, do vậy hình thành những đoạn DNA tái tổ hợp bao gồm những đoạn gen
của phage và vi khuẩn.
Phage mới được hình thành có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, sinh sản và
không gây chết vi khuẩn. Quá trình tái tổ gen xảy ra làm gen cần chuyễn tải vơ tình
được gắn vào bộ nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhận.
Qua thực nghiệm việc sử dụng phage làm thể mang (vector) có nhiều ưu điểm hơn
so với plasmid vì phage có những đặc điểm giúp sự xâm nhập vào tế bào vi khuẩn
hiệu quả hơn nhiều hơn so với sự chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn. Kích thước
đoạn DNA mà phage có thể tiếp nhận lớn hơn nhiều so với plasmid (plasmid có thể
gắn 8-10 kb DNA lạ, cịn phage có thể tiếp nhận đoạn DNA lạ có kích thước 15-20
kb).
c. Cosmid:
Cosmid là những vector nhân tạo đựợc ghép nối từ một plasmid có các gen kháng

chất kháng sinh với các trình tự . Cosmid trong DNA của thực khuẩn thể người.

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 21

Trong tế bào vi khuẩn, thực khuẩn thể hoạt động như một plasmid và không phá vỡ
tế bào vi khuẩn.
2.2.5 Tế bào nhân dịng E.coli [4,28].
Có nhiều loại tế bào chủ có thể biểu hiện gen mong muốn dưới sự kiểm sốt của
promoter thích hợp. Các tế bào E.coli thường được dùng trong biểu hiện protein
như : BL21, DH1, JM103, JA221, HB101, Rosetta, Origami….Các chủng tế bào
này được biến đổi để tạo ra các đặc tính thích hợp cho sự biểu hiện protein như:
Hạn chế tiết ra các protease phân cắt protein tái tổ hợp, tăng tính tan của protein,
..Việc chọn lựa tế bào biểu hiện tuỳ thuộc vào bản chất của protein.
E.coli.
2.2.5.1 Phân loại:
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Gamma proteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Escherichi.

Lồi:

Escherichia coli.

Hình thái vi khuẩn E.coli

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân


Trang 22

2.2.5.2 Ưu điểm:
• Cấu tạo tế bào đơn giản, có vách tế bào mỏng.
• Là trực khuẩn gram âm, hình gậy, di động bằng tiêm mao quanh tế bào,

không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại khơng có độc lực khơng
có capsul, kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu trịn, một số dịng có
lơng bám (pili), hiếu khí tùy nghi nên tốc độ sinh trưởng nhanh và nhận phân
tử oxigen trong khơng khí như chất nhận điện tử từ chất chuyển điện tử
NADH để phân giải glucose thành CO2, H2O và năng lượng ATP cho tế
bào. Nhưng nếu số lượng tế bào trong dịch ni cấy vượt q ngưỡng cho
phép nên oxy hịa tan trong dịch nuôi cấy bị thiếu, tế bào chuyển sang q
trình kỵ khí, tạo etanol và CO2, hay lactate và sucinate. Sản phẩm lên men ức
chế quá trình tạo sinh khối tế bào.
• Mức giới hạn sinh thái rộng.
• Bộ gen đã được hiểu biết rõ, khoảng 3 triệu bp.
• Có thể biểu hiện gen của cả tế bào eukaryote và prokaryote
• Sinh sản nhanh, khoảng 20 – 30 phút 1 thế hệ.
• Mơi trường nuối cấy đơn giản giàu sinh dưỡng gồm glucose và muối nhắm
cung cấp nitơ, phospho và một ít kim loại, đặc biệt là rẻ tiền.
• Có thể thao tác bằng tay các kỹ thuật di truyền.
• Dễ chấp nhận DNA lạ.
2.2.5.3 Khuyết điểm:
• Protein tái tổ hợp khơng giống protein tự nhiên vì khơng có gắn những đi
đặc trưng.
• Mức biểu hiện của protein trong tế bào E.coli không cao bằng trong tế bào
eukaryote.
2.2.6 Chọn tế bào nhân dòng E.coli [10,11].
Chủng nhân dòng DH5a -T1R là chủng đột biến gen: F- 80dlacZ M15 (lacZYAargF) U169 recA1, endA1 hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44 -, thi-1, gyrA96. Như:

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân

Trang 23

3

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

Gồm 3 phần:
• Xác định số dịng HPV nhiễm trên tơm sú.
• Phân lập đoạn gen mã hóa capsid VP.
• Tạo dịng vector có mang gen mã hóa VP.
3.1. Sơ đồ chung.
Mẫu tơm teo gan
Quan sát lâm sàng
Mô học
Xác định lâm sàng HPV
Chứng dương HPV
Thiết kế cặp mồi đặc hiệu dựa
trên trình tự của genebank ncbi.
Thử các cặp mồi với
chứng dương HPV

Thiết kế mồi
cloning cho gen VP

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Xác định các bệnh
nhiễm kèm.

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân

Trang 24

Thiết kế mồi cloning gen VP
Tinh sạch đoạn gen VP
Ghép đoạn gen VP vào plasmid pJET1.2
Chuyển nạp plasmid pJET1.2
vào tế bào E.coli DH5α
Nuôi cấy tế bào mang plasmid
pJET1.2 trên mơi trường LB có 40
μg/ml X-gal và 50 μg/ml Ampiciline
Chọn lọc khuẩn lạc

Màu trắng (Plasmid
có đoạn gen VP)

Màu xanh (Plasmid
khơng có gen VP)

Tách plasmid
Thực hiện phản ứng cắt bằng
enzyme cắt cloning gene VP
Điện di
giải trình tự để kiểm tra sự hiện diện
gene VP trong tế bào biến nạp

Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân

Trang 25

3.2. Vật liệu hóa chất nghiên cứu.
3.2.1 Chủng vi khuẩn.
Chủng tế bào E.coli DH5α.
3.2.2 Plasmid.
3.2.2.1 Plasmid nhân dòng pJET 1.2
• Kích thước: 2974 bp.
• Vector plasmid pJET 1.2 có những đặc tính quan trọng trong việc tạo dịng
như:
• Có trình tự sao chép rep (pMB1) và điểm khởi sự sao chép, cho phép vector
pJET được sao chép nhiều lần trong tế bào E.coli.
• Có chứa gen Eco 47IR và gen ApR kháng Ampicillin, dùng để chọn lọc tế
bào mang plasmid tái tổ hợp.
• Được thiết kế ở dạng ready-to-use: đâu bằng, dễ dàng nối với sản phẩm PCR,
có chứa nhóm 5’-phosphoryl.
• Có chứa trình tự T7 promoter cho phép phiên mã RNA, dịch mã thành
protein trong invitro bởi phage T7. Nghĩa là nếu phage T7 xâm nhiễm vào vi
khuẩn, nó sẽ tạo ra các protein tương ứng với các đoạn gen trên vector và
đoạn DNA chèn. Điều này cho phép các nhà khoa học xác định trình tự của
protein và đoạn DNA đã chèn trước đó.

Hình 7. Cấu trúc plasmid pJET 1.2
Luận Văn Tốt Nghiệp Thạc sỹ

Học viên: Nguyễn Huỳnh Bảo Chân