Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Nguyễn Duy Phương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HĨA NHÂN
TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
CỦA THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
_______________________

Nguyễn Duy Phương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HĨA NHÂN
TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
CỦA THỰC VẬT

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62420116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS Phạm Xuân Hội
2. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội – 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được
thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phạm Xuân Hội và GS.TS. Phan
Tuấn Nghĩa.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào cơng
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tơi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2016
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Duy Phương


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền
Nông nghiệp), GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) và TS.
Narendra Tuteja (Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế, New
Delhi, Ấn Độ) là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận
án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
(Trường ĐH KHTN) và Ban lãnh
Phịng Sau Đại học

đạo Viện Di truyền Nơng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về tất cả
các thủ tục cần thiết trong q trình học tập và thực hiện luận án.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ mơn Sinh lý thực vật - Hóa
sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy trong suốt khóa học và tập thể
cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN), nhóm nghiên cứu của
TS. Narendra Tuteja và các bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tơi
để hồn thành luận án tốt nghiệp này.
Tơi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm,
cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học và Cơng
nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã cấp kinh phí nghiên cứu thông qua Đề tài mã số
106.06-2011.69 và Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc tế
(Italy) đã hỗ trợ về mặt tài chính và khoa học thơng qua Chương trình học bổng
“Sandwich PhD Fellowship”.
Hà Nội ngày 20 tháng 02 năm 2016
Nguyễn Duy Phương


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... 4
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... 7
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ 8
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 10
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 13
1.1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT ........... 13
1.1.1. Giới thiệu chung về hạn hán .................................................................. 13
1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ................................ 13
1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật ............................................... 14
1.1.4. Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn ................................................. 16
1.1.5. Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật ........................... 19

1.2. ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN ........................ 25
1.2.1. Promoter cảm ứng với điều kiện hạn ..................................................... 25
1.2.2. Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã.................................................... 27
1.2.3. Điều hòa dịch mã................................................................................... 30
1.2.4. Phân vùng mRNA trong tế bào chất ...................................................... 30
1.2.5. Điều hòa sau dịch mã ............................................................................ 31
1.2.6. Vai trò điều hòa hoạt động gen của RNA khơng mã hóa ........................ 32
1.3. VAI TRỊ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG HẠN ............... 33
1.3.1. Nhân tố phiên mã AP2/ERF .................................................................. 35
1.3.2. Nhân tố phiên mã NAC ......................................................................... 36
1.3.3. Nhân tố phiên mã WRKY ..................................................................... 37
1.3.4. Một số nhân tố phiên mã khác ............................................................... 38
1


1.4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG
CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT .................................................. 40
1.4.1. Nghiên cứu chuyển gen vào lúa ............................................................. 40
1.4.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn ...................... 43
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 47
2.1. VẬT LIỆU...................................................................................................... 47
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 47
2.1.2. Chủng vi sinh vật .................................................................................. 47
2.1.3. Vector và oligonucleotide ...................................................................... 47
2.1.4. Hóa chất ................................................................................................ 49
2.1.5. Thiết bị .................................................................................................. 49
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 49
2.2.1. Xử lý mẫu thực vật ................................................................................ 49
2.2.2. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA ........................................................ 50
2.2.3. Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T ...................................... 53

2.2.4. Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF ................................................ 55
2.2.5. Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA ............................................................. 58
2.2.6. Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp .................... 65
2.2.7. Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF ............................................... 68
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U & THẢO LUẬN ....................................... 72
3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở LÚA......................... 72
3.1.1. Tổng hợp thƣ viện cDNA thứ cấp .......................................................... 72
3.1.2. Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã bằng kỹ thuật Y1H ................... 73
3.1.3. Nhân dịng gen mã hóa protein OsNLI-IF .............................................. 77

2


3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF ........ 80
3.2.1. Biểu hiện của gen OsNLI-IF trong các điều kiện stress phi sinh học ...... 80
3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích của OsNLI-IF ............... 84
3.2.3. Hoạt tính hoạt hóa q trình phiên mã của OsNLI-IF ............................ 88
3.2.4. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF .......................................... 93
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF ................................................. 98
3.3.1. Thiết kế hệ vector biểu hiện pCAMBIA1301 ........................................ 98
3.3.2. Thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101 .................................................... 103
3.4. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN ....... 107
3.4.1. Biến nạp vector biểu hiện vào A. tumefaciens LBA4404 ..................... 107
3.4.2. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá ....................... 108
3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện của OsNLI-IF trong cây lúa chuyển gen ............ 121
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 132
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 133
DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........ 134
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 135
PHỤ LỤC............................................................................................................ 147

3


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

3-AT

3-Amino-1, 2, 4-triazole

A. thaliana

Arabidopsis thaliana

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

ABA

Abscisic acid

ABRE

Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT
(ACGT-containing abscisic acid response element)

AD

(acting domain)

AMP

Adenosine monophosphate

ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

BAP

6-Benzylaminopurine

BD

(binding domain)

BĐKH

Biến đổi khí hậu

bp

Cặp bazơ (base pair)

BSA

Albumin huyết thanh bị (Bovine serum albumin)

CBB

Coomassie Brilliant Blue

cDNA

DNA

Ct

Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle)

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

DEPC

Diethylpyrocarbonate

DMSO

Dimethyl sulfoxide

dNTP

Deoxyribonucleoside Triphosphate

DRE

Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element)

DREB

Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE

ung (complementary deoxyribonucleic acid)

4


(dehydration responsive element-binding protein)
E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

HSP

Protein sốc nhiệt (Heat shock protein)

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb

Kilobase

LB

Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani

LEA

Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của
phơi (late embryogenesis abundant)

LiAc

Lithium acetate
đa điểm cắt (multiple cloning site)

MCS
MOPS

Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic

mRNA

Messenger ribonucleic acid

MS

Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog

MS-R

Môi trƣờng MS nuôi cấy lúa

MS-T

Môi trƣờng MS nuôi cấy thuốc lá

NAA

1-naphthaleneacetic acid

NAC

NAM/ATAF1/2/CUC2

NACRS

Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition
sequence)

NLI-IF

Nhân tố tƣơng tác với yếu tố tƣơng tác LIM trong
nhân (nuclear LIM interactor-interacting factor)

NST

Nhiễm sắc thể

OD

Mật độ quang học (optical density)

ORF

Khung đọc mở (open reading frame)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction)

5


PEG

Polyethylene glycol

ROS

Các dạ

RT-PCR

Phản ứng nhân bản DNA

ng (reactive oxygen species)
(reverse

transcription polymerase chain reaction)
S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

SDM

Môi trƣờng dinh dƣỡng tối thiểu (synthetic defined
medium)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Điện di gel polyacrylamide

(SDS -

Polyacrylamide gel electrophoresis)

TAE

Đệm Tris-acetate-EDTA

TBE

Đệm Tris-borate-EDTA

TE

Đệm Tris-EDTA

TF

Nhân tố phiên mã (transcription factor)

Ti-plasmid

Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid)

-Trp/-Ura/Leu/-His/-Ade

Mơi trƣờng khuyết dƣỡng khơng có Triptophan/
Uracil/ Leucine/ Histidine/ Adenine

X-Gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

Y1H

Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên
tƣơng tác DNA-protein (yeast one hybrid)

Y2H

Kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men dựa trên
tƣơng tác protein-protein (yeast two hybrid)

YEM

Môi trƣờng nuôi cấy
(yeast extract – manitol)

YPD

Môi trƣờng nuôi cấy

nấm men

destrose (yeast extract peptone dextrose)

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Gen mã hóa nhân tố phiên mã tăng cƣờng tính chịu hạn của lúa. ........... 46
Bảng 2.1: Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu.......................... 48
Bảng 2.2: Thành phần gel polyacrylamide chứa SDS. ........................................... 66
Bảng 2.3: Thành phần môi trƣờng MS cơ bản. ...................................................... 69

Bảng 3.1: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y1H .......... 75
Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích JRC0332 và JRC0528.................... 76
Bảng 3.3: Kết quả sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress bằng kỹ thuật Y2H .......... 96
Bảng 3.4: Protein tƣơng tác với OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện cDNA .................. 96
Bảng 3.5: Tỉ lệ nảy mầm của dòng thuốc lá T1 trên môi trƣờng MS. .................... 111
Bảng 3.6: Tỉ lệ nảy mầm của dịng thuốc lá T1 trên mơi trƣờng có Hygromycin .... 112
Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T1........................................ 113
Bảng 3.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý stress hạn các dòng thuốc lá. .......................... 120
Bảng 3.9: Kết quả chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. ......... 123
Bảng 3.10: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T1 . ................................... 124
Bảng 3.11: Tỉ lệ cây lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn. ............................... 130

7


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Mạng lƣới các nhân tố phiên mã tham gia đáp ứng stress. ...................... 34
Hình 2.1: Mơ hình thí nghiệm xử lý stress hạn cây chuyển gen. ............................ 50
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF ........................................... 57
Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF ........... 58
Hình 2.4: Sơ đồ vector HybriZAP-2.1 và vector pAD-GAL4-2.1 .......................... 59
Hình 2.5: Sơ đồ phƣơng pháp sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y1H......................... 62
Hình 2.6: Sơ đồ phƣơng pháp sàng lọc thƣ viện cDNA bằng Y2H......................... 64
Hình 3.1: Chuẩn hố nồng độ thƣ viện cDNA thứ cấp ........................................... 72
Hình 3.2: Kiểm tra thƣ viện cDNA thứ cấp bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc ............. 73
Hình 3.3: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện trong nấm men ....................................... 74
Hình 3.4: Nhân bản đoạn gen OsNLI-IF bằng kỹ thuật PCR .................................. 78
Hình 3.5: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF ...................... 79
Hình 3.6: Trình tự OsNLI-IF trong vector tái tổ hợp pGEM/OsNLI-IF.................... 80
Hình 3.7: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện mơi trƣờng bất lợi ............. 82

Hình 3.8: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pAD-GAL4 ........................................... 85
Hình 3.9: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pAD/OsNLI-IF ......................... 86
Hình 3.10: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF trong nấm men........... 87
Hình 3.11: Ghép nối OsNLI-IF vào vector YEpGAP ............................................. 89
Hình 3.12: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp YEpGAP/OsNLI-IF ................ 90
Hình 3.13: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF trong nấm men ................. 91
Hình 3.14: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pGBKT7 ............................................. 94
Hình 3.15: PCR và cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp pGBKT7/OsNLI-IF................. 94
Hình 3.16: Sơ đồ q trình điều hịa hoạt động chức năng của OsNLI-IF .............. 97
Hình 3.17: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pRT101 ............................................... 99
Hình 3.18: PCR và cắt giới hạn pRT/OsNLI-IF-S và pRT/OsNLI-IF-AS ............ 100
Hình 3.19: Ghép nối cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào pCAMBIA1301 ....................... 101
Hình 3.20: PCR và cắt giới hạn pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS..... 102
Hình 3.21: Ghép nối OsNLI-IF vào vector pBI-Ubi và pBI-Lip9 ......................... 104
8


Hình 3.22: PCR khuẩn lạc mang pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF ....... 104
Hình 3.23: PCR và cắt giới hạn pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Lip9/OsNLI-IF ........ 105
Hình 3.24: PCR khuẩn lạc mang pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS .... 107
Hình 3.25: PCR khuẩn lạc mang pBI-Lip9/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF ....... 108
ấu trúc gen 35S:OsNLI-IF vào cây thuốc lá ......................... 109
Hình 3.27: PCR kiểm tra các dịng thuốc lá tái sinh ............................................. 110
Hình 3.28: Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA ............... 114
Hình 3.29: Kiểm tra kháng thể IgG tinh sạch ....................................................... 115
Hình 3.30: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 ........ 116
Hình 3.31: Khả năng sinh trƣởng của các dịng thuốc lá chuyển gen T1 ............... 118
Hình 3.32: Khả năng chống chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen .............. 119
ấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF vào lúa ............................... 122
Hình 3.34: Biểu hiện của OsNLI-IF trong các cây lúa chuyển gen T1 .................. 126

Hình 3.35: Hình thái của cây lúa chuyển gen T1 giai đoạn 3 lá non ...................... 128
Hình 3.36: Khả năng phục hồi sau xử lý stress hạn của cây lúa chuyển gen T1 .... 129

9


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hạn là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất nông
nghiệp, làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng và dẫn tới tình trạng mất an ninh
lƣơng thực. Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi khí hậu tồn cầu, tình trạng hạn hán
xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc
vƣợt quá tầm kiểm soát của con ngƣời. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên
quan tới tính chịu hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu
hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và tăng sản lƣợng nơng
nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia.
Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen liên quan
chặt chẽ với quá trình phiên mã. Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc chức năng
quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật.
Do đó, việc nghiên cứu phân lập và

đặc tính

gen mã hóa nhân tố

phiên mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hƣớng triển vọng và nhận đƣợc
sự quan tâm đặc biệt. Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính
chịu hạn đã đƣợc xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác nhau. Các gen
mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng
với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trị điều hịa biểu hiện của

rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực
vật. Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đã đƣợc chứng minh tăng
cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen.
Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập
gen chịu hạn

mục

tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ

chuyển gen thực vật đã đƣợc một số phịng thí nghiệm quan tâm. Tuy nhiên, hầu
hết các nghiên cứu về gen chống chịu stress mơi trƣờng nói chung và chống chịu
hạn nói riêng đều sử dụng các nguồn gen từ nƣớc ngồi hoặc các gen đã đƣợc
cơng bố bởi các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới. Cho đến nay, chúng ta vẫn

10


chƣa có một nghiên cứu cơ bản hồn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức
năng gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen
mã hóa nhân tố phiên mã.

, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu
gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
-

Phân lập và xác định

trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF

điều khiển tính chịu hạn từ lúa.
-

Nghiên cứu

một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-

IF phân lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mơ hình.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF
liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn của lúa Oryza sativa L. (Pusa Basmati 1).
nội dung
-

chính:

Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNLI-IF liên quan đến chống chịu
điều kiện bất lợi ở lúa.

-

Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF.

-

Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực vật.

-

Nghiên cứu

biểu hiện

OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình.

4. Địa điểm nghiên cứu
Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại 3 địa điểm chính:
-

Bộ mơn Bệnh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nơng
nghiệp Việt Nam).

-

e
.

-

Phịng Thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật di
truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ).

11


5. Đóng góp mới của luận án
Luận án là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về
nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng gen OsNLI-IF chƣa đƣợc xác định
chức năng. Gen OsNLI-IF đƣợc chứng minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt

động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và
có khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mơ hình (thuốc lá/
lúa). Ngồi ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển bởi các promoter
hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều kiện stress (Lip9) đã
đƣợc chuyển vào cây mơ hình để nghiên cứu biểu hiện gen.
6. Ứng dụng thực tiễn của luận án
Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai trị tăng
cƣờng tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây chuyển gen. Trên cơ sở
kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF do luận án tạo ra đang đƣợc
nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông…
để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của
sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu tồn cầu.

12


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1.

HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

1.1.1. Giới thiệu chung về hạn hán
Nƣớc là thành phần cơ bản nhất của sự sống, tất cả mọi sinh vật đều cần có
nƣớc để duy trì sự sống

. Chính vì vậy, nguồn nƣớc trong mơi trƣờng sống

rất quan trọng đối với đời sống của sinh vật. Đặc biệt đối với thực vật, nƣớc có vai
trị sống còn, quyết định sự tồn tại và phát triển của thực vật. Nhu cầu về nƣớc của
thực vật phụ thuộc vào từng loài và từng giai đoạn phát triển của chúng.

Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nƣớc do
môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn cụ thể, làm
ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Trong nông nghiệp,
hạn hán đƣợc xác định khi đất khơng có đủ độ ẩm và lƣợng mƣa không đủ cung
cấp cho mùa màng, làm cho cây trồng khơng đủ độ ẩm để duy trì sự tăng trƣởng
và sản lƣợng trung bình. Ảnh hƣởng của hạn hán trong nơng nghiệp rất khó
ƣớc lƣợng vì tính phức tạp trong sự tăng trƣởng cây trồng và khả năng xuất hiện
của các nhân tố khác nhƣ sâu bọ, cỏ dại, đất kém màu mỡ và sự ô nhiễm môi
trƣờng cũng ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng và năng suất của cây trồng [20].
Các yếu tố gây hạn của môi trƣờng nhƣ thành phần thổ nhƣỡng, thời tiết, khí
hậu, nhiệt độ, gió nóng… gây nên hiện tƣợng thiếu nƣớc của cây,

nguyên

nhân chính là do sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa tế bào và môi trƣờng, dẫn
đến sự thiếu hụt nƣớc trong tế bào. Tùy theo mức độ, hạn đƣợc chia ra thành ba
loại: hạn khơng khí, hạn đất và hạn toàn diện. Đối với mỗi loại sẽ gây ra những ảnh
hƣởng khác nhau, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì có thể dẫn đến tình trạng hủy
hoại cây trồng, mùa màng... [20, 105].
1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp
Trong các yếu tố bất lợi của mơi trƣờng, hạn hán là nhân tố chính và phổ
biến nhất gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sản xuất nơng nghiệp. Do biến đổi khí hậu
(BĐKH) tồn cầu, hiện nay các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm
khoảng 1% tổng diện tích đất nơng nghiệp và đƣợc dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối
13


thế kỉ 21 [126]. Mức độ ảnh hƣởng của hạn hán trong nông nghiệp phụ thuộc vào
tần suất, cƣờng độ, tính khắc nghiệt

và tính nhạy cảm

của đối tƣợng

cây trồng. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với nơng nghiệp có thể diễn ra theo chu kỳ
hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất lƣợng sản phẩm, giảm năng suất,
tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do sâu bọ, tăng chi phí tƣới tiêu, dẫn tới
làm mất sản lƣợng cây trồng và giảm thu nhập của ngƣời nông dân. Tác động của
hạn hán làm sản lƣợng lúa gạo tụt giảm; lƣợng gạo dự trữ thấp đã buộc các quốc gia
xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới (trong đó có Việt Nam) phải áp dụng chính sách
hạn chế xuất khẩu để đảm bảo an ninh lƣơng thực quốc gia, trong khi nhu cầu nhập
khẩu gạo của các quốc gia khác (đặc biệt là Trung Quốc) tăng cao. Đây chính là
nguyên nhân tạo ra cơn sốt gạo năm 2008, đẩy giá gạo lên mức cao kỷ lục mới
(>1.000 USD/tấn) và gây ra những tác động tiêu cực đến đời sống kinh tế [3, 134].
Việt Nam với nền kinh tế chủ yếu dựa vào sản xuất nông nghiệp cũng là
một trong số các quốc gia nằm trong vùng chịu ảnh hƣởng nặng nề của hiện
tƣợng BĐKH. Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lƣợng lúa gạo
hai vụ xuân và vụ mùa trên khắp cả nƣớc, đặc biệt là vùng đồng bằng sơng Hồng
sẽ có xu hƣớng giảm dần, có thể giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào
năm 2070. Hệ quả của các tác động này là áp lực ngày càng tăng đối với giá lúa
gạo trên thị trƣờng thế giới do Việt Nam là một trong những nƣớc xuất khẩu gạo
quan trọng nhất trên thế giới. Chính vì vậy, các chính sách tăng trƣởng xanh và
tồn diện trong ngành nơng nghiệp để đối phó với hạn hán phải đƣợc chính phủ
xem là vấn đề trọng tâm cần giải quyết và cần có sự tham gia của tất cả các thành
phần trong xã hội [135].
1.1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đối với thực vật
Môi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở
tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [38].
Hạn hán khi xảy ra sẽ gây ảnh hƣởng đầu tiên tới quá trình trao đổi nƣớc với
mơi trƣờng và q trình kiểm sốt hàm lƣợng nƣớc trong cơ thể của thực vật. Đây là

quá trình đƣợc điều hịa bởi nhiều yếu tố khác nhau nhƣ lƣợng nƣớc dự trữ trong
14


mô, thế nƣớc của lá, khả năng hoạt động của khí khổng, tốc độ bay hơi nƣớc, nhiệt
độ lá và tán lá... Khi tiếp xúc với hạn hán, thế nƣớc trong lá, hàm lƣợng nƣớc trong
cơ thể, tốc độ thoát hơi nƣớc và độ dẫn của khí khổng đều bị giảm, trong khi nhiệt
độ lá tăng lên. Một số loài thực vật duy trì hiệu quả sử dụng nƣớc (tỉ số giữa trọng
lƣợng khô và lƣợng nƣớc tiêu thụ) trong giai đoạn hạn hán bằng cách giảm sự mất
nƣớc. Tuy nhiên, khi hạn hán xảy ra trong phạm vi rộng và quy mô lớn, hiệu quả sử
dụng nƣớc của phần lớn các loài thực vật đều giảm rõ rệt [16, 38].
Sự mất cân bằng trao đổi nƣớc trong điều kiện hạn làm giảm sức trƣơng tế
bào, dẫn tới những ảnh hƣởng về sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Ở thực vật
bậc cao, khi cây bị thiếu nƣớc nghiêm trọng, quá trình kéo dài tế bào bị ức chế do
dòng nƣớc từ xylem dẫn tới các tế bào đang trong quá trình nguyên phân bị cản trở.
Hệ quả là thực vật bị giảm chiều cao, giảm diện tích che phủ của lá và cuối cùng dẫn
tới giảm khả năng sinh trƣởng và tích lũy sinh khối [16, 38].
Ở các loài thực vật bậc cao, sự thiếu hụt nƣớc trong môi trƣờng đất thƣờng
làm giảm khả năng sử dụng, hấp thụ, vận chuyển và trao đổi chất dinh dƣỡng. Khi
bị hạn hán, rễ không thể hấp thu và vận chuyển chất dinh dƣỡng tới thân, do đó
ảnh hƣởng tới quá trình trao đổi chất của tế bào. Ngồi ra, tốc độ thoát hơi nƣớc
giảm trong điều kiện hạn cũng làm giảm khả năng hấp thụ và hiệu quả sử dụng
chất dinh dƣỡng của thực vật. [16, 38].
Để giảm sự thoát hơi nƣớc trong điều kiện môi trƣờng khô hạn, thực vật
thƣờng có một số cơ chế thích nghi nhƣ đóng khí khổng, giảm tiết diện lá, thu hẹp
độ che phủ tán lá hay tăng tính nhạy cảm của lá non. Tuy nhiên, đây lại là những
yếu tố gây ảnh hƣởng trực tiếp tới bộ máy quang hợp vì ngăn cản dịng CO2 đi vào
lá và làm giảm q trình cố định cacbon, dẫn tới sự giảm khả năng tổng hợp và
tích lũy sinh khối của thực vật. Ngồi ra, do bị thiếu nƣớc, thể tích tế bào giảm, độ
nhớt của tế bào chất tăng làm tăng tính tƣơng tác giữa các phân tử và ảnh hƣởng

tới hoạt động chức năng của các enzyme và các thành phần sắc tố của bộ máy
quang hợp [16, 38]. Ngoài ra, sự ức chế phản ứng phosphoryl hóa và tổng hợp
ATP từ ADP cũng là một yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình quang hợp. Cùng với đó,
15


sự thay đổi khả năng sử dụng CO2 của diệp lục (do đóng khí khổng) cũng là một
ngun nhân làm giảm hoạt động bộ máy quang hợp [38].
Khả năng đồng hóa CO2 giảm trong điều kiện mơi trƣờng khơ hạn dẫn tới hệ
quả làm tăng tính nhạy cảm của thực vật với những tổn thƣơng do ánh sáng mặt trời
gây nên. Đồng thời, khi quá trình quang hợp bị ảnh hƣởng còn gây ra sự dƣ thừa
điện tử, là nguyên nhân chính làm sản sinh các dạng oxy
tế bào, bao gồm các gốc anion superoxide,

(ROS) gây độc

hydroxyl, hydro peroxide, alkoxy

(RO) và oxy nguyên tử. ROS đƣợc hình thành theo cả hai cơ chế phụ thuộc và
không phụ thuộc enzyme. ROS có thể đƣợc tạo ra dƣới dạng sản phẩm phụ trong
chuỗi truyền điện tử của lục lạp, ti thể và màng tế bào chất. Bên cạnh đó, trong tế
bào có rất nhiều enzyme tham gia vào các phản ứng sinh ROS nhƣ xanthine
oxidase, superoxide dismutase, peroxidase, catalase, amino acid oxidase, glucose
oxidase... Sự tích lũy ROS trong điều kiện hạn có thể gây ra rất nhiều các tổn
thƣơng cho tế bào: peroxide hóa lipid gây tổn thƣơng màng tế bào, oxy hóa và phân
giải protein, bất hoạt enzyme, phân giải DNA… [38].
Hơ hấp cũng là một q trình sinh lý bị ảnh hƣởng bởi những tác động của
hạn hán. Khi môi trƣờng đất trở nên khô hạn, bộ máy hô hấp của các tế bào rễ (nơi
tiêu thụ sản phẩm cacbon đƣợc cố định từ quá trình quang hợp nhiều nhất trong cơ
thể thực vật) tăng cƣờng hoạt động rất mạnh nhằm duy trì sự sinh trƣởng, tích lũy

sinh khối và thực hiện các hoạt động chức năng quan trọng của rễ. Tuy nhiên, tốc
độ quang hợp thƣờng bị giới hạn do ảnh hƣởng của sự khơ hạn, chính điều này đã
gây nên hiện tƣợng mất cân bằng các nguồn cacbon trong cơ thể thực vật, dẫn tới
giảm quá trình tổng hợp ATP và tăng sản sinh ROS gây độc tế bào [38].
1.1.4. Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn
Trong mơi trƣờng tự nhiên, thực vật đối phó với điều kiện khô hạn hán bằng
rất nhiều đáp ứng khác nhau để duy trì sự sống. Đối với cây trồng, “chịu hạn” đƣợc
định nghĩa là khả năng sinh trƣởng, ra hoa và cho sản lƣợng cao trong điều kiện
nguồn cung cấp nƣớc không đầy đủ. Môi trƣờng khô hạn làm xuất hiện hàng loạt
các phản ứng không đặc trƣng trong tế bào, dẫn tới hàng loạt các tổn thƣơng cho cơ
16


thể thực vật. Để đối phó với điều kiện hạn hán, trƣớc tiên thực vật sẽ khởi động cơ
chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nƣớc, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp
độ khác nhau. Đáp ứng của thực vật với điều kiện hạn có thể chia thành ba loại: đáp
ứng hình thái, đáp ứng sinh lý và đáp ứng hóa sinh [18, 38].
1.1.4.1. Đáp ứng hình thái
Đáp ứng hình thái là một cơ chế thích nghi của thực vật với điều kiện mơi
trƣờng hạn hán kéo dài. Ở mức độ hình thái, thực vật đáp ứng lại với điều kiện hạn
bằng hai khả năng: trốn hạn (escape) và tránh hạn (avoidance) [38].
Trốn hạn là cách thực vật rút ngắn chu kỳ sống hay thời gian sinh trƣởng để
có thể sinh sản trƣớc khi môi trƣờng trở nên khô hạn. Thay đổi thời gian ra hoa là
một dấu hiệu quan trọng chứng tỏ sự thích nghi của thực vật với mơi trƣờng, thƣờng
xuất hiện khi thời gian sinh trƣởng bị giới hạn bởi điều kiện hạn và nhiệt độ cao.
Trong nông nghiệp, việc kết hợp thời gian sinh trƣởng của cây trồng với thời gian
đất có độ ẩm cao là yếu tố quyết định tạo ra sản lƣợng thu hoạch cao. [17, 38].
Tránh hạn là cơ chế thực vật thay đổi linh hoạt kiểu hình để giảm thiểu sự
mất nƣớc, đồng thời duy trì lƣợng nƣớc hấp thụ vào cơ thể trong điều kiện hạn hán.
Khi môi trƣờng trở nên khô hạn, thực vật phát triển một hệ rễ dày và đâm sâu để có

thể hấp thụ đầy đủ lƣợng nƣớc cho q trình sinh trƣởng. Ở một số loài thực vật
thuộc họ cọ, ví dụ nhƣ cây dừa cịn có hiện tƣợng thay đổi đƣờng kính và cấu trúc
thân để đáp ứng với điều kiện mơi trƣờng hạn hán. Ngồi ra, để giảm sự thoát hơi
nƣớc, thực vật thƣờng hạn chế số lƣợng, tiết diện và độ che phủ của lá. Trong điều
kiện nhiệt độ cao, sự hình thành các lớp bảo vệ trên bề mặt lá nhƣ lông tơ cũng là
một cơ chế giúp giảm nhiệt độ và tốc độ thoát hơi nƣớc trên bề mặt lá, đồng thời
tăng mức độ phản xạ ánh sáng để bảo vệ lá [38].
1.1.4.2. Đáp ứng sinh lý
Các đáp ứng tức thì trong thời gian ngắn của thực vật khi cơ thể bị thiếu
nƣớc do khô hạn chủ yếu liên quan tới các đáp ứng sinh lý. Để thích nghi với điều
kiện mơi trƣờng khơ hạn, thực vật chủ yếu tập trung vào việc duy trì thế nƣớc trong
các mơ, cơ quan quan trọng. Tích lũy và dự trữ nƣớc trong cơ thể là phƣơng thức
17


thích nghi phổ biến nhất của các lồi thực vật với stress hạn. Hạn chế sự thốt hơi
nƣớc thơng qua hoạt động đóng khí khổng (qua trung gian acid abcisic) cũng là một
cơ chế đáp ứng nhanh với hạn của thực vật. Một số biến đổi thích nghi trong điều
kiện hạn thƣờng thấy ở thực vật nhƣ hình thành mơ xốp dự trữ nƣớc, thay đổi tính
thấm biểu bì, cuốn lá và rụng lá để giảm thoát hơi nƣớc... Bên cạnh đó, để bù đắp
lƣợng nƣớc bị thiếu hụt do môi trƣờng khô hạn, rễ thực vật đã phát triển đặc tính
hƣớng nƣớc rất nhạy, giúp thực vật có thể phát hiện ra các tầng đất có gradient nƣớc
cao và hƣớng sự phát triển các nhánh rễ tới những vị trí này [18].
Thực vật có khả năng đối phó với stress hạn bằng cách giảm hoạt động trao
đổi chất. Một số lồi thực vật cịn có khả năng duy trì các chức năng sinh học trong
điều kiện thế nƣớc thấp. Thực vật C4 thích nghi với hạn hán nhờ khả năng giảm
thiểu sự mất hơi nƣớc trong quá trình cố định CO2 (thơng qua cơ chế tích lũy CO2
vào ban đêm), do đó chỉ sử dụng một lƣợng nƣớc rất ít so với với thực vật C3 [18].
Một đáp ứng sinh lý phổ biến khác của thực vật với điều kiện hạn là điều
chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ quá trình tổng hợp mới một số hợp chất nhƣ đƣờng,

hịa tan trong nƣớc

acid amin, glycine-betaine... Các

có khả năng

bắt giữ các phân tử nƣớc trong giai đoạn môi trƣờng khô hạn, đồng thời không gây
độc tế bào hay cản trở trao đổi chất của tế bào khi tích lũy ở nồng độ cao [18].
1.1.4.3. Đáp ứng hóa sinh
Đáp ứng hóa sinh đầu tiên của tế bào nhâ

với các loại stress sinh học

(biotic) và phi sinh học (abiotic) là sản sinh ra ROS. Ở thực vật, quá trình sản sinh
ROS là một đáp ứng phòng vệ sớm của tế bào với stress hạn. ROS bao gồm
superoxide, peroxide

ốc hydroxyl, đƣợc tạo ra trong quá trình trao đổi chất

bình thƣờng liên quan đến oxy và đóng vai trị quan trọng đối với các con đƣờng
truyền tín hiệu của tế bào. Q trình hoạt hóa oxy xảy ra theo hai cơ chế: (i) cơ chế
đảo chiều quay của các electron không bắt cặp và (ii) cơ chế khử đơn cực. Theo cơ
chế thứ nhất, nguyên tử oxy ở trạng thái “triplet” khi hấp thụ đủ năng lƣợng sẽ đảo
chiều quay của một điện tử không bắt cặp để tạo ra trạng thái “singlet” với hai điện tử
quay ngƣợc chiều. Cơ chế hoạt hóa oxy thứ hai trải qua các phản ứng khử đơn cực
18


oxy tạo thành superoxide, peroxide hydro, gốc hydroxyl và nƣớc. Trong điều kiện
hạn hán, các ROS hoạt động nhƣ những phân tử tín hiệu thứ cấp để khởi động các

phản ứng phòng vệ của tế bào. Tuy nhiên, khi hàm lƣợng ROS tăng cao trong giai
đoạn tế bào bị stress hạn sẽ gây ra các tổn thƣơng oxy hóa cho tế bào. Do có tính
phản ứng rất mạnh, các ROS có thể gây peroxide hóa lipid, phân giải protein, oxy hóa
DNA và thậm chí có thể gây chết tế bào. Để giảm thiểu ảnh hƣởng của stress oxy hóa
sinh ra trong điều kiện môi trƣờng khô hạn, thực vật đã hình thành một hệ thống bảo vệ
chống oxy hóa rất phức tạp, bao gồm các enzyme (ví dụ nhƣ superoxide dismutase,
catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, glutathione reductase…) và các thành phần
không phải enzyme (ví dụ nhƣ glutathione, acid ascorbic, carotenoid...). ROS đƣợc loại
bỏ khỏi tế bào theo cả hai cơ chế phụ thuộc và khơng phụ thuộc enzyme, trong đó sử
dụng enzyme là cơ chế hiệu quả nhất để chống lại stress oxy hóa [13, 16, 38].
1.1.5. Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật
Đáp ứng chống chịu hạn của thực vật đƣợc thực hiện thông qua một chuỗi các
quá trình rất phức tạp, với sự tham gia của hàng loạt yếu tố: ABA, citokinin, auxin,
ethylene... khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu; canxi và IP3 đóng vai trị chất truyền tín
hiệu thứ cấp; các chất hịa tan, protein sốc nhiệt (HSP), protein LEA, osmotin, protein
chống oxy hóa, aquaporin... là các yếu tố trực tiếp tham gia đáp ứng stress. Q trình
đáp ứng với điều kiện mơi trƣờng khơ hạn của thực vật có thể chia thành 3 giai đoạn:
nhận tín hiệu, dẫn truyền tín hiệu

đáp ứng chống chịu [13].

Nhận tín hiệu là bƣớc đầu tiên để thực vật đáp ứng với stress môi trƣờng.
Một “cảm biến stress” phải có khả năng phát hiện những thay đổi của điều kiện mơi
trƣờng và dẫn truyền tín hiệu stress khởi đầu đến đúng đích tế bào. Mỗi một loại
kích thích của mơi trƣờng sẽ tạo ra một thơng tin đặc trƣng gửi tới tế bào thực vật
và thực vật nhận biết thông tin này thông qua rất nhiều loại thụ thể khác nhau. Tuy
nhiên, hầu hết các thụ thể nhận tín hiệu mơi trƣờng và cơ chế nhận biết tín hiệu cho
tới nay vẫn chƣa đƣợc xác định. Cho tới nay, các nhà khoa học vẫn cho rằng rễ là
cơ quan

có khả năng cảm nhận stress hạn của mơi trƣờng và ABA là phân tử

tín hiệu nội sinh có vai trị then chốt trong q trình này [18, 95]. Một số nghiên

19


cứu trên cây mơ hình Arabidopsis thaliana cho thấy histidine kinase AtHK1 cũng
có thể liên quan tới q trình cảm nhận tín hiệu thay đổi áp suất thẩm thấu. Sự
biểu hiện của AtHK1 kéo theo sự biểu hiện của một số nhân tố phiên mã đáp ứng
stress (ví dụ nhƣ AREB1, ANAC, DREB2A) và các protein này đóng vai trị là
yếu tố điều hịa dƣơng tính của đáp ứng chống chịu hạn và mặn theo cả hai con
đƣờng phụ thuộc và không phụ thuộc ABA ở A. thaliana. Tuy nhiên, những bằng
chứng cụ thể chứng minh vai trò của các protein này vẫn chƣa đƣợc tìm ra. Dựa
trên thực tế các nhân tố môi trƣờng nhƣ hạn, mặn và lạnh đều dẫn tới sự thay đổi
về áp suất thẩm thấu và kích thích tế bào thực vật sinh ra các đáp ứng đặc trƣng,
điều này có thể chứng minh sự tồn tại của các thụ thể cảm nhận áp suất thẩm thấu
riêng biệt cho từng con đƣờng dẫn truyền tín hiệu stress [13, 18, 41].
Con đƣờng truyền tín hiệu stress của môi trƣờng đƣợc khởi động khi tế bào
thực vật nhận đƣợc kích thích ngoại bào. Sau khi các thụ thể trên màng tế bào nhận
biết tín hiệu stress hạn và các protein màng xử lý tín hiệu, tế bào sẽ sản sinh ra các
phân tử tín hiệu thứ cấp thông qua các phản ứng enzyme đặc trƣng. Phân tử tín hiệu
thứ cấp đƣợc chia thành ba loại cơ bản: (i) các phân tử kị nƣớc (ví dụ nhƣ
diacylglycerol, IP3 và phosphatidylinositol) liên kết với màng và có thể khuếch tán từ
màng sinh chất vào vùng cận màng để phản ứng và điều hòa các protein đáp ứng trên
màng; (ii) các phân tử ƣa nƣớc (ví dụ nhƣ cAMP, cGMP và Ca2+) nằm trong tế bào
chất

(iii) các phân tử khí (ví dụ nhƣ NO và CO) có thể khuếch tán xuyên qua tế

bào chất và màng tế bào. Ngoài ra, các ROS sinh ra trong điều kiện stress hạn cũng
đóng vai trị là phân tử tín hiệu thứ cấp trong con đƣờng truyền tín hiệu của tế bào tới
bộ máy đáp ứng stress. Một số loại phân tử tín hiệu khác đƣợc dự trữ trong các bào
quan riêng và có thể đƣợc giải phóng nhanh chóng khi cần thiết nhƣ Ca2+ [13, 41].
Phân tử tín hiệu thứ cấp thƣờng khởi đầu bằng một chuỗi các phản ứng
phosphoryl hóa protein và cuối cùng tác động tới các protein đích trực tiếp tham
gia vào đáp ứng thích nghi stress hoặc các nhân tố phiên mã điều khiển một nhóm
gen chức năng đặc trƣng. Các protein do các gen này mã hóa có thể tham gia vào
quá trình tổng hợp các phân tử điều hòa nhƣ ABA, ethylene và acid salicylic để
20


tiếp tục khởi động một vịng truyền tín hiệu thứ cấp khác. Q trình truyền tín hiệu
địi hỏi các điều kiện chính xác về khơng gian và thời gian đối với tất cả các phân
tử tín hiệu. Chính vì vậy, ngồi các thành phần trực tiếp dẫn truyền tín hiệu, trong
tế bào cịn có những phân tử nhất định tham gia vào q trình biến đổi, đóng gói
hoặc cấu thành các thành phần tín hiệu. Các phân tử hỗ trợ này bao gồm các yếu
tố biến đổi protein, ví dụ nhƣ enzyme

lipid hóa, methyl hóa,

glycosyl hóa và ubiquitin hóa protein… [13].
Phosphoryl hóa protein là một trong những cơ chế chính

thực vật kiểm

sốt các q trình tế bào nhằm đáp ứng với các tín hiệu stress của mơi trƣờng.
Protein kinase liên quan tới đáp ứng stress của thực vật đƣợc chia thành hai nhóm
chính: protein kinase hoạt hóa mitogen (mitogen-activated protein kinase – MAPK)
và protein kinase phụ thuộc canxi (calcium-dependent protein kinase – CDPK). Cả

hai nhóm protein này đều liên quan tới q trình đáp ứng với nhiều loại stress mơi
trƣờng khác nhau (trong đó có stress hạn) và đều đƣợc hoạt hóa rất nhanh ngay sau
khi tế bào tiếp xúc với yếu tố stress [13, 41].
Chuỗi truyền tín hiệu MAPK đặc trƣng bởi sự tham gia của ba thành phần
protein kinase, bao gồm MAPKKK (mitogen-activated protein kinase kinase
kinase), MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase) và MAPK. Chu trình
phosphoryl hóa MAPK liên kết với rất nhiều loại phân tử tín hiệu thứ cấp thông
qua sự tƣơng tác với các loại kinase khác hoặc protein G. Một số nghiên cứu đã
chứng minh

H2O2 và một số ion kim loại nặng nhƣ đồng, kẽm có thể hoạt hóa

con đƣờng truyền tín hiệu MAPK. Tuy nhiên, hầu hết các phân tử tín hiệu thứ cấp
hoạt hóa con đƣờng MAPK vẫn chƣa đƣợc tìm ra [13, 41].
Con đƣờng dẫn truyền tín hiệu stress khởi đầu bởi Ca2+ có sự tham gia của
nhiều loại protein kinase liên kết canxi khác nhau, bao gồm CaM (calmodulin), CBL
(calcineurin B-like protein), CIPK (calcineurin B-like-interacting protein kinase) và
CDPK. Q trình hoạt hóa các protein này phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ trong tế bào
chất và khả năng liên kết với Ca2+. Các phân tử CDPK hoạt hóa đáp ứng tín hiệu bằng
cách phosphoryl hóa các cơ chất đặc trƣng (ví dụ nhƣ sucrose synthase ở lúa, ngô và
21