Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (571.63 KB, 7 trang )
<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1></div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>
<i><b> </b></i>
<b>K</b>
<b>Ỹ THUẬT PCR</b>
<i><b>(Polymerase Chain Reaction) </b></i>
<b>I. MỞ ĐẦU:</b>
Kỹ thuật PCR (viết tắt từ chữ Polymerase Chain Reaction), hay còn gọi là phản
ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase hoặc phản ứng chuỗi tổng hợp ADN, do
Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Kỹ thuật PCR đã đưa lại một cuộc cách
mạng trong di truyền phân tử, khuếch đại <i>in vitro có ch</i>ọn lọc bằng tạo dịng <i>in vitro </i>
mà khơng cần sự hiện diện của tế bào, khắc phục được nhược điểm thao tác phức tạp
và cần thời gian dài của kỹ thuật tạo dòng in vivo. Nhờ phản ứng PCR, một đoạn ADN
ở một vùng bất kỳ trong bộ gien được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự
nucleotide ở hai đầu đoạn đó đã biết.
<b>II. NGUYÊN TẮC CƠ BẢN:</b>
Kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN
polymerase dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ
sung với sợi này. Các sợi ADN khuôn mạch đơn có thể tạo ra theo cách đơn giản là
đun nóng dung dịch ADN mạch kép đến gần nhiệt độ sôi.
</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>
<i><b> </b></i>
cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 đến 30 nucleotid), đoạn này gắn bổ sung
vào ADN khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.
Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khn cho q trình tổng hợp nếu các
đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn
mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN
tổng hợp mới được bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi
kia (Hình 1c). Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện
</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>
<i><b> </b></i>
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
Các đoạn mồi
<i>Các đoạn mong muốn</i>
<i>… và cứ thế tiếp tục</i>
<b>Hình 1.</b> <i>Sơ đồ nguyên lý phản ứng chuỗi </i>
<i>trùng hợp PCR.</i>
(Để đơn giản hóa sơ đồ, từ phần (d) khơng
vẽ hai sợi ADN khuôn ban đầu)
b) Các sợi tách nhau ra khi gia nhiệt
94oC, sau đó hạ xuống 30-65oC,
trong 30 giây để các đoạn mồi
gắn vào hai vị trí tương hợp trên
ADN
c) Taq polymerase tổng hợp các sợi
ADN mới tương hợp với sợi
khuôn, bắt đầu từ đoạn mồi kéo
dài về phía đoạn mồi nằm bên sợi
kia.
d) Hỗn hợp phản ứng lại được gia
nhiệt. Sợi ban đầu và sợi mới
tổng hợp tách nhau ra. Trên hai
sợi mới tổng hợp xuất hiện 2
điểm bám cho các đoạn mồi gắn
vào.
e) Taq polymerase tổng hợp các sợi
ADN tương hợp mới, nhưng các
chuỗi mới lần này chỉ tiến đến
đúng vị trí đã được xác định bởi
các cặp đoạn mồi đã lựa chọn.
f) Quá trình được lặp lại, các đoạn
mồi tiếp tục gắn vào các sợi mới
tổng hợp.
g) <i>Taq polymerase t</i>ổng hợp các
đoạn tương hợp sinh ra hai đoạn
ADN mạch kép giống hệt đoạn
cần tổng hợp. Quá trình cứ thế
tiếp tục.
a) Vật liệu khởi đầu là phân tử
</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>
<i><b> </b></i>
Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng
hợp, các sợi này sau đó lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước
gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng
PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2<i>n-2</i> bản sao các phân tử
ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi (Bảng1).
<b>Bảng 1.</b> Hi<i>ệu quả nhân ADN của kỹ thuật PCR</i>
<b>Số chu kỳ </b>
<i><b>(n) </b></i>
<b>Số phân tử ADN </b>
<b>mạch kép sinh ra</b>
<b>Số chu kỳ </b>
<i><b>(n) </b></i>
<b>Số phân tử ADN </b>
<b>mạch kép sinh ra</b>
1 0 17 32.768
2 0 18 65.536
3 2 19 131.072
4 4 20 262.144
5 8 21 524.288
6 16 22 1.048.567
7 32 23 2.097.152
8 64 24 4.194.304
9 128 25 8.388.608
10 256 26 16.777.216
11 512 27 33.544.432
12 1.024 28 67.108.864
</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>
<i><b> </b></i>
Các phương pháp sinh học phân tử giúp xác nhận quan hệ huyết thống hoặc phát
hiện tội phạm chính xác từ những người nghi ngờ. Chỉ cần trên hiện trường cịn rất ít
mẫu vật: một vài giọt máu khô, vệt tinh dịch, vài sợi lơng hay mẫu tóc, hay thậm chí
mẫu tàn thuốc có dính vài tế bào niêm mạc miệng.
<b>CÂU HỎI</b>
1. Hãy giải thích cơ chế của phản ứng trong PCR?
2. Tại sao trong thành phần của đoạn mồi không được chứa quá nhiều cặp GC?
3. Nêu ứng dụng của phản ứng chuỗi PCR?
4. Tóm tắt các kỹ thuật cải tiến của PCR?
<b>Tài liệu tham khảo</b>
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), <i>Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – </i>
<i>Ứng dụng)</i>, Nxb. Giáo dục.
</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>
<i><b>PGS. TS. Nguy</b><b>ễn Văn Thanh</b></i><b>Hình 4.</b> Sơ đồ kỹ thuật PCR-RFLP
DNA đích
Đoạn mồi
3'
5' 3' 5'
Tế bào VK
Taq polymerase
Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR
Restriction enzyme
Máy luân nhiệt
(Thermocycler)
DNA cắt giới hạn
</div>
<!--links-->
