Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn ở cây lúa oryza sativa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Thu Tươi

NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN
SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------

Nguyễn Thị Thu Tươi

NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HÓA VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN
SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU KIỆN MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số : 60420121
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.Đỗ Thị Phúc

Hà Nội – 2018

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các cơng trình khác. Nếu
khơng đúng như đã nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về đề tài của mình
Người cam đoan

Nguyễn Thị Thu Tươi

iii


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Phúc là người đã chỉ
bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Di Truyền học - Khoa Sinh
học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và trang
bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện luận văn
của mình.
Tơi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, ủng hộ và động
viên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2018
Nguyễn Thị Thu Tươi

iv


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1. ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA ..... 3
1.1.1. Khái quát về đất nhiễm mặn ............................................................................3
1.1.2. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam ..............................................................4
1.1.3. Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa .....6
1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC VẬT
................................................................................................................................... 10
1.2.1. Giới thiệu chung về họ gen SOS .....................................................................10
1.2.2. Vai trò của SOS trong khả năng chống chịu mặn của cây trồng ..................12
1.2.3. Giới thiệu về gen SOS1 ở cây lúa ..................................................................14
1.3. HIỆN TƯỢNG METHYL HĨA ADN VÀ VAI TRỊ CỦA METHYL HÓA
ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG.................................. 15
1.3.1. Khái quát về hiện tượng methyl hóa ADN .....................................................15
1.3.2. Mối liên quan giữa sự methyl hóa ADN và khả năng chống chịu điều kiện
bất lợi ở thực vật. ......................................................................................................16
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ METHYL HĨA, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN SOS1 Ở THỰC VẬT TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM ................. 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu Methyl hóa gen SOS1 ..................................................18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu biểu hiện gen SOS1 ở điều kiện mặn ...........................18
1.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU METHYL HÓA ..................................... 19
1.5.1. MSP (Methyl Specific PCR) ............................................................................19
1.5.2. Giải trình tự bisulfite .....................................................................................21
1.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN Ở MỨC ĐỘ PHIÊN MÃ
................................................................................................................................... 22
1.6.1. Real Time RT-PCR (reverse transcription PCR) ...........................................22
1.6.2. RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang ..............................................23
1.6.3. RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR TaqMan) .....23
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 25
2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .......................................................................... 25

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................25

v


2.1.2. Mồi phản ứng PCR .........................................................................................25
2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................26
2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu .......................................................................27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 27
2.2.1. Trồng cây, xử lý mặn, thu mẫu và phương pháp đánh giá kiểu hình .............27
2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng MSP ..................................................................28
2.2.3. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu sự methyl hóa gen SOS1 .....29
2.2.4. Nhóm phương pháp sử dụng trong nghiên cứu mức độ biểu hiện gen SOS1 32
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 35
3.1. ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH .......................................................... 35
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái lá ......................................................................35
3.1.2. Đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các giống lúa .................................36
3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ METHYL HÓA CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU
KIỆN MẶN .............................................................................................................. 38
3.2.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP......................................................38
3.2.2. Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1 ..........................................................40
3.2.3. Phân tích vị trí cytosine bị methyl hóa gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn
...................................................................................................................................41
3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN SOS1 ĐÁP ỨNG VỚI ĐIỀU
KIỆN MẶN .............................................................................................................. 44
3.3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng Real time PCR .....................................44
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện mặn đến mức độ biểu hiện gen SOS1 ....45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 50

vi


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

Cs

Cộng sự

DEGs

Differentially expressed genes

IRRI

International Rice Research Institute

NCBI

National Center for Biotechnology Information

MSP

Methyl specific polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi
trùng hợp đặc hiệu methyl)

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-qPCR

real-time reverse transcription polymerase chain reaction

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hình nucleotide đơn)

TBE

Tris borate EDTA

TE

Tris – EDTA

ScaBP8

Calcium Binding Protein 8

SOS

Salt Overly Sensitive

vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình trạng xâm nhập mặn tại đồng bằng sơng Cửu Long ............................ 5
Hình 1.2. Ảnh hưởng của mặn đến hình thái cây lúa ................................................... 8
Hình 1.3. Các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mặn ở mức độ rễ, thân và lá.... 9
Hình 1.4. Con đường SOS tham gia duy trì cân bằng ion ở rễ cây ............................ 11
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 ở cây lúa .............................................................. 14
Hình 1.6. Sơ đồ đại diện của các con đường methyl hóa cytosine, demethylation, và
mutagenesis của cytosine và 5-mC ............................................................................... 16
Hình 1.7. Methylate-specific PCR ............................................................................... 20
Hình 1.8. Xác định methyl hóa bằng cách sử dụng methylSEQr™ của AB Bisulfite
Conversion Kit và thiết bị CE để phân tích DNA. ........................................................ 22
Hình 1.9. Sơ đồ real-time PCR TaqMan . .................................................................... 24
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .............................................................. 31
Hình 3.1. Biểu đồ điểm xếp hạng trung bình của 4 giống lúa sau 14 ngày xử lý mặn.35
Hình 3.2. Biểu đồ về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 4 giống lúa trong điều kiện
thường và sau 14 ngày xử lý mặn ở 100 mM NaCl. ..................................................... 37
Hình 3.3. Cấu trúc gen SOS1 với 2 vùng methyl hóa cao b và c ................................. 38
Hình 3.4. Kết quả khảo sát methyl hóa vùng promoter của gen SOS1 ........................ 39
Hình 3.5. Sơ đồ vị trí bắt cặp mồi methyl trên gen SOS1 ............................................ 40
Hình 3.6. Đánh giá sự methyl hóa gen SOS1 bằng PCR (MSP) đối với 4 giống lúa tương
ứng được xử lý mặn (100 mM NaCl) và giống đối chứng tại các thời điểm 1, 3, 24 giờ
sau xử lý mặn. ............................................................................................................... 41
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen SOS1 giống Nipponbare. ..................................... 43
Hình 3.8. Kết quả đo đường cong nóng chảy .............................................................. 45
Hình 3.9. Biểu hiện của gen SOS1 ở 4 giống lúa được phân tích bằng phương pháp
realtime PCR định lượng. ............................................................................................. 46

viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng....... 3
Bảng 1.2. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng ................................................... 4
Bảng 1.3. Quan hệ giữa EC và năng suất lúa ................................................................ 7
Bảng 2.1. Danh sách các mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 25
Bảng 2.2. Chỉ số scoring để đánh giá đặc điểm hình thái lá của IRRI ........................ 28
Bảng 2.3. Các thành phần của phản ứng PCR ............................................................ 30
Bảng 3.1. Các vị trí nucleotit bị methyl hóa ................................................................ 43

ix


MỞ ĐẦU
Biến đổi khí hậu làm gia tăng tần suất lũ lụt, hạn hán, nước biển dâng và thay đổi
quy luật mùa vụ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống nhân sinh và tác động trực
tiếp đến sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa nước. Đất nhiễm mặn gây ảnh
hưởng đến năng suất, chất lượng cây trồng và vấn đề đất nhiễm mặn ngày càng là thách
thức lớn đối với nền sản xuất lúa [26].
Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng trên thế giới, là nguồn lương
thực chính ni sống hơn 1/3 dân số thế giới. Việt Nam với trên 75% dân số phụ thuộc
chủ yếu vào sản xuất nông nghiệp và 100% người Việt Nam sử dụng lúa gạo làm lương
thực chính. Tuy nhiên, hiện nay tình trạng đất nhiễm mặn ngày một gia tăng, năng suất
lúa trồng trên các vùng đất nhiễm mặn bị giảm, thậm chí nhiều nơi bị mất trắng. Do
đó, đất trồng lúa bị xâm nhiễm mặn đang là trở ngại và khó khăn lớn đối với nơng dân
và cũng là vấn đề gây tác động đến an ninh lương thực Quốc gia. Như vậy, giải pháp
chiến lược có tính bền vững để hạn chế ảnh hưởng của nhiễm mặn đến sản xuất lúa là
gieo cấy các giống lúa có khả năng chịu mặn [26].
Methyl hóa ADN có vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen, làm tắt
hoạt động của transposon đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường. Sự hiểu biết về

methyl hóa ADN của các gen giúp hiểu rõ hơn về vai trò của gen trong khả năng chống
chịu của cây trồng. Gen Salt Overly Sensitive 1 (SOS1) được chứng minh là có vai trị
quan trọng trong việc đào thải Na+ khỏi tế bào, do đó góp phần vào khả năng chống
chịu mặn của cây trồng. Tuy nhiên, điều hòa biểu hiện gen SOS1 thơng qua cơ chế
methyl hóa ADN trong điều kiện mặn chưa được nghiên cứu ở cây lúa. Chính vì vậy,
chúng tơi lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều
kiện mặn ở cây lúa (Oryza sativa)”
nhằm đánh giá được sự methyl hóa ADN và mức độ biểu hiện gen SOS1 đáp ứng với
điều kiện mặn ở cây lúa, đồng thời đặt cơ sở khoa học bước đầu về nghiên cứu cơ chế
điều hòa biểu hiện gen SOS1 thơng qua cơ chế methyl hóa ADN trong điều kiện mặn.

1


Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với các nội dung sau:
➢ Đánh giá đặc điểm kiểu hình lúa dưới điều kiện mặn
➢ Đánh giá sự methyl hóa của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn
➢ Đánh giá mức độ biểu hiện của gen SOS1 đáp ứng với điều kiện mặn

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẤT NHIỄM MẶN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NÓ ĐỐI VỚI CÂY LÚA
1.1.1. Khái quát về đất nhiễm mặn
Đất nhiễm mặn là đất có chứa một lượng muối hòa tan cao đủ gây ảnh hưởng đến
sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [4].
Đất mặn được hình thành do hai nguyên nhân: thứ nhất là sự tích tụ muối tự nhiên
và thứ hai là do xâm thực mặn từ nước biển. Đất mặn do ngun nhân thứ nhất thường

hình thành trên các vùng khơ hạn hoặc bán khơ hạn, nơi lượng nước bốc thốt hơi cao
hơn lượng mưa và hiện tượng tích tụ muối tự nhiên thường xuyên xảy ra. Các muối
này chủ yếu là dạng anion Cl-, SO42- cùng với các cation Na+, Ca2+, Mg2+, K+. Chúng
có thể hình thành từ q trình phong hóa đất và khống, hay được di chuyển vào đất
do mưa và nước tưới. Với nguyên nhân thứ hai đất mặn được hình thành từ các vùng
biển cũ trong lục địa, do các mạch nước ngầm nhiễm mặn nên muối được bốc lên theo
các mao dẫn lên tầng đất mặt [4].
Dựa theo nồng độ muối hòa tan trong đất, người ta phân loại đất mặn thành
nhiều loại khác nhau:
Bảng 1.1.
Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng [28]
Phân loại

Độ dẫn điện

Nồng độ muối

đất mặn

của đất (dS/m)

hịa tan (‰)

Khơng mặn

0–2

0 – 1,28

Mặn ít

2–4

1,28 – 2,56

4–8

2,56 – 5,12

Mặn

8 – 16

5,12 – 10,24

Rất mặn

> 16

> 10,24

Mặn trung
bình

3

Ảnh hưởng đến cây trồng
Mặn ảnh hưởng khơng đáng kể
Năng suất của nhiều loại cây có
thể bị giới hạn

Năng suất của nhiều loại cây
trồng bị giới hạn
Chỉ một số cây trồng chịu đựng
được
Chỉ rất ít cây trồng chịu đựng
được.


Mỗi loại cây trồng có khả năng chịu mặn khác nhau, được đánh giá qua chỉ số
ngưỡng chịu mặn. Ngưỡng chịu mặn là giá trị mà tại đó, cây trồng bắt đầu bị thiệt hại
năng suất được thể hiện qua bảng 1.2:
Bảng 1.2. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng [30]
Ngưỡng chịu mặn
STT

Cây trồng

Tên khoa học

Nồng độ
EC (dS/m)

muối tan
(‰)

1

Bắp

Zea mays L.

1,7

1,088

2

Đậu phộng

Arachis hypogaea L.

3,2

2,048

3

Lúa

Oryza sativa L.

3,0

1,92

4

Đậu nành

Glycine max (L.) Merrrill

5,0

3,2

Vulgaris Beta L.

7,0

4,48

5

Củ cải
đường

6

Mía

Saccharum officinarum L.

1,7

1,088

7

Cải bắp

B. oleracea L. (Capitata Group)

1,8

1,152

8

Cà rốt

Daucus carota L.

1,0

0,64

9

Đậu đũa

Vigna unguiculata (L.) Walp.

4,9

3,136

14

Khoai lang

Ipomoea batatas (L.) Lam.

1,5

0,96

15

Cà chua

2,5

1,6

Lycopersicum Lycopersicon(L.)
Karst. ex Farw.

1.1.2. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam
Ở Việt Nam, tình trạng đáng báo động về sự xâm nhập mặn diễn biến ngày càng
tăng. Theo báo cáo của Bộ Khoa học và Công nghệ (2016) [1], cuối năm 2015 và
những tháng đầu năm 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại đồng bằng sông Cửu Long
được đánh giá nặng nề nhất trong 100 năm qua. Ngay từ tháng 2, độ mặn đã duy trì ở
mức cao và nghiêm trọng. Trên sông Tiền và sông Hậu, độ mặn là trên 45‰, xâm nhập
4


sâu tới 70 km tính từ cửa sơng, thậm chí có nơi lên đến 85 km (trong khi theo Trung
tâm phịng tránh và giảm nhẹ thiên tai thì độ mặn bằng 4‰ đã được coi là bị xâm nhập
mặn) [1].
Tại Hội nghị biến đổi khí hậu tác động đến nơng nghiệp, Rạch Giá, Kiên Giang

năm 2013, nhiều tác giả đã nhấn mạnh, nếu mực nước biển dâng 12 cm (năm 2020);
30 cm (năm 2050) thì diện tích đất trồng lúa bị ngập vĩnh viễn tại khu vực đồng bằng
sông Cửu Long sẽ là 1,4% và 6,0% tương ứng 1.317 và 1.345,44 km2 [8]. Đặc biệt,
việc nuôi trồng thủy sản không có quy hoạch cùng việc dự trữ nước của các đập thủy
lợi, thủy điện của các quốc gia vùng thượng nguồn hay hiện tượng nước biển dâng làm
cho nhiễm mặn ngày càng nghiêm trọng chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long [2].

Hình 1.1. Tình trạng xâm nhập mặn tại đồng bằng sơng Cửu Long [3]
Các dịng sơng ở Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long đang bị
xâm nhập mặn sâu vào nội địa trên 70 km và có chiều hướng gia tăng nhanh. Độ mặn
5


đo được ở các điểm quan trắc cũng tăng. Tại Sóc Trăng, độ mặn đo được từ tháng
01/2015 tại trạm Đại Ngãi là 8‰ trong và cuối tháng 3 là 6,5‰ trong khi cùng kỳ năm
2014 độ mặn chỉ tới 4‰. Tại Hậu Giang, tình hình xâm nhập mặn diễn biến rất phức
tạp và cũng có chiều hướng gia tăng, độ mặn đo được ở thành phố Vị Thanh là 12‰,
có thời điểm (cuối tháng 3/2015) mỗi ngày độ mặn tăng 0,5 - 1‰ và di chuyển sâu vào
đất liền 2 - 3 km/ngày [7].
Các vùng lúa nhiễm mặn ở đồng bằng sơng Hồng thuộc các tỉnh như Thái Bình,
Hải Phịng, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa,… Vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị
nhiễm mặn khoảng 20.000 ha ở cả 2 dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm
nhiễm từ 0,3 - 0,5%. Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn. Tỉnh Nam Định
có khoảng 10.000 ha. Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đất nhiễm mặn. Quan
trọng hơn, dưới tác động của biến đổi khí hậu tồn cầu như hiện nay, dự báo khi mức
nước biển dâng cao, diện tích đất nhiễm mặn ở Việt Nam có thể sẽ tăng lên nhanh và
đây sẽ là khó khăn rất lớn cho sản xuất lúa trong tương lai.
1.1.3. Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây lúa
1.1.3.1. Ảnh hưởng của mặn đến các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây lúa
Ảnh hưởng của mặn đến sinh trưởng, phát triển của cây lúa được đánh giá bằng

mức độ thiệt hại ở từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau. Ở mức nhiễm mặn
trung bình và thấp có thể ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây, gây nên
những thay đổi về hình thái, sinh lý, sinh hóa và làm giảm năng suất, trong khi mức độ
nhiễm mặn cao sẽ làm cây chết [30]. Mối quan hệ giữa EC (Electro Conductivity - chỉ
số diễn tả tổng nồng độ ion hòa tan trong dung dịch) và năng suất lúa được trình bày ở
bảng 1.3.

6


Bảng 1.3. Quan hệ giữa EC và năng suất lúa
Theo Akita [8], mặn làm giảm diện tích lá ở cây lúa. Trong điều kiện thiệt hại
nhẹ, khối lượng khơ có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm
trọng vì diện tích lá giảm. Nếu ảnh hưởng mặn lớn hơn, khối lượng khô của
chồi và rễ sẽ giảm tương ứng. Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ bị ảnh hưởng nhiều hơn lá
non. Ảnh hưởng của độ mặn thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây lúa chịu được mặn trong quá trình nảy mầm,
nhưng trở nên rất nhạy cảm trong thời kỳ mạ non. Mặc dù chịu được mặn trong suốt
thời gian sinh trưởngvà phát triển, cây lúa lại rất nhạy cảm với độ mặn trong thời gian
thụ phấn và thụ tinh [33].
1.1.3.2. Ảnh hưởng của mặn đến đặc điểm hình thái của cây lúa
Năm 1980, Ponnamperuma và Bandyopadhya [7], đã chỉ ra những biểu hiện
đặc trưng nhất về mặt hình thái do tác động của mặn là cây lúa sinh trưởng, phát
triển kém, lá cuốn lại, khô đầu lá, phiến lá xuất hiện nhiều chấm lốm đốm màu trắng
và lá bên dưới bị khô cháy. Theo Singh (2006) [48], hầu hết các thơng số như số nhánh
ít, bơng lép, số hoa trên bơng ít, khối lượng 1000 hạt thấp và cháy lá đều là biểu hiện
của sự ảnh hưởng mặn.

7

Hình 1.2. Ảnh hưởng của mặn đến hình thái cây lúa [49]
Các triệu chứng chính về mặt hình thái theo Singh (2006) [48] là lá chuyển màu
nâu và chết (trong trường hợp mặn kiềm), cây thấp, đẻ nhánh kém, tăng số bông bất
thụ, chỉ số thu hoạch thấp, giảm số hạt trên bông, giảm khối lượng 1000 hạt, năng suất
thấp và thay đổi thời gian sinh trưởng, lá cuốn lại, lá khô trắng, rễ sinh trưởng kém và
ruộng lúa sinh trưởng, phát triển không đồng đều.
1.1.3.3. Ảnh hưởng của mặn đến đặc tính sinh lý, sinh hóa và điều hịa biểu hiện gen
của cây lúa
Theo Singh (2006) [48], dưới điều kiện mặn cao, hầu hết các cây trồng có
những thay đổi về mặt sinh lý và sinh hoá như tăng vận chuyển Na+ tới chồi, tích lũy
Natri nhiều hơn trong các lá già, tăng hấp thu ion Cl-, giảm hấp thu ion K+, giảm khối
lượng tươi và khô của chồi và rễ, giảm hấp thu photpho và kẽm, thay đổi enzyme, tăng
cường sự hoà tan các hợp chất hữu cơ không độc hại và tăng mức polyamine.
Theo Amirjani và Monhammad (2010) [9], mặn ảnh hưởng đến cả sự phát triển
lá và tình trạng nước của cây lúa. Tác dụng thẩm thấu do độ mặn của đất có thể gây ra
rối loạn cân bằng nước trong quá trình sinh trưởng, đồng thời hạn chế sự sinh trưởng,
kích thích sự đóng khí khổng và làm giảm quá trình quang hợp. Cây phản ứng bằng
cách điều chỉnh thẩm thấu, thường bằng cách tăng nồng độ Na+ và Cl- trong các mô
của chúng, mặc dù sự tích lũy các ion vơ cơ như vậy có thể gây độc, làm tổn thương tế
bào cũng như làm ảnh hưởng cả q trình quang hợp và hơ hấp. Sự điều chỉnh phần
8


nào áp suất thẩm thấu này không đủ để tránh tình trạng thiếu nước trong cây, do đó
làm sụt giảm hàm lượng nước trong rễ.
Khả năng chịu mặn của lúa chủ yếu theo hai cơ chế: loại trừ ion và khả năng thẩm
thấu [36]. Loại trừ ion chủ yếu liên quan đến quá trình vận chuyển Na+ và Cl- trong
rễ và ngăn ngừa sự tích tụ dư thừa của Na+ và Cl- trong lá. Loại trừ ion bao gồm việc
tìm kiếm Na+ từ xylem, và thải loại Na+ ra khỏi tế bào. Khả năng chịu mặn của lúa

được điều chỉnh bởi các tín hiệu đường dài làm giảm sự phát triển của chồi và được
kích hoạt trước khi tích lũy Na+. Khả năng chịu mặn của mô liên quan đến việc cô lập
Na+ trong không bào, tổng hợp các chất tan tương thích và sản xuất các enzyme xúc
tác phân giải hoạt tính độc của oxi. Hình 1.3 cho thấy phác hoạ các cơ chế và gen có
liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa.

Hình 1.3. Các nhóm gen liên quan đến khả năng chịu mặn ở mức độ rễ, thân và lá

9


Một số loại gen quan trọng trong cơ chế chịu mặn của lúa là OsSOS1, OsNHX1
(Na+ / H+ antiporters), OsHKT2, 1 (Na+ / K+ symporter), OsCAX1, OsAKT1 (K+ kênh
chẩn đoán chính xác), OsKCO1 (Kênh chỉnh K+ ra bên ngồi), OsTPC1 (kênh thẩm
thấu Ca2+), OsCLC1 (kênh Cl) và OsNRT1; 2 (vận chuyển nitrat) [27].
1.2. GIỚI THIỆU VỀ HỌ GEN SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Ở THỰC
VẬT
1.2.1. Giới thiệu chung về họ gen SOS
Mặn ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen, trong đó có một số gen quan
trọng như : NHXs, SOS, HKTs. Trong đó, hai yếu tố chính giúp duy trì lượng Na+ thấp
trong tế bào chất của thực vật là các kênh trao đổi (exchanger) Na+/H+ hiện diện trên
màng không bào (tonoplast) NHX1 và kênh đối chuyển (antiporter) Na+ /H+ - SOS1
trên màng sinh chất (plasma membrane). Hầu hết các kênh NHXs cần thiết cho quá
trình khử độc Na+ thông qua sự cô lập Na+ trong không bào thực vật, trong khi con
đường tín hiệu Salt Overly Sensitive (SOS) được ghi nhận là xuất Na+ ra khỏi tế bào
[25].
Ở cấp độ phân tử, con đường Salt Overly Sensitive (SOS) bao gồm các protein
SOS3, SOS2 và SOS1 đóng vai trị quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nồng độ
của các ion trong tế bào. Trong đó, SOS1 là protein vận chuyển ion Na+/ H+ nằm trên
màng tế bào và được điều chỉnh bởi phức hợp protein kinase SOS2-SOS3 [37]. Gen

mã hóa cho SOS1 chủ yếu biểu hiện ở lớp tế bào biểu bì rễ và trong xylem ở ranh giới
xylem-symplast trong cơ thể thực vật, trong khi SOS3 mã hóa cho một protein gắn
Canxi có chức năng cảm biến sự gia tăng nồng độ Canxi gây ra do dư thừa Na+ trong
tế bào chất. SOS2 mã hóa cho protein kinase serine/ threonine với 446 amino axit và
khối lượng phân tử ước tính là 51 kD [29]. SOS2 có một đầu N-terminal khoảng 270
axit amin và đuôi C-terminal quy định các chức năng kinase. Khi gắn kết với Ca2+,
SOS3 có thể tương tác và kích hoạt protein kinase serine/ threonine SOS2. Các tương
tác SOS3-SOS2 hoặc SCaBP8-SOS2 kích hoạt hoạt động của protein SOS1 giúp ngăn
cản sự tăng quá mức nồng độ Na+/H+ trong tế bào [25].

10


Hình 1.4. Con đường SOS tham gia duy trì cân bằng ion ở rễ cây [25]
Chú thích: Các mũi tên nét liền biểu thị các tương tác đã được thiết lập, các đường
nét đứt chỉ ra mối liên kết được đề xuất giữa các thành phần được trình bày.)
Gần đây, một số lượng lớn các bằng chứng nghiên cứu cho thấy sự đa dạng chức
năng của các protein trong con đường SOS cũng rất quan trọng đối với khả năng chịu
mặn. Một số báo cáo đã chỉ ra rằng, trong rễ, các protein SOS có những chức năng mới
ngồi cân bằng nồng độ ion natri đó là duy trì khung xương tế bào dưới điều kiện bất
lợi và phát triển rễ bên thông qua điều chỉnh gradient auxin dưới điều kiện mặn. Nghiên
cứu các đột biến đơn hình của các gen trong con đường SOS biểu hiện các kiểu hình
khiếm khuyết đối với rễ, củ, gốc, cho thấy hoạt động của các gen SOS là rất cần thiết
cho việc thiết lập sự phát triển của tế bào thượng bì phần gốc nhằm đáp ứng với điều
kiện mặn và duy trì sự cân bằng nồng độ ion trong các tế bào [25]. Trong năm 2007,
Verslues và các đồng nghiệp đã chứng minh rằng SOS2 tương tác với Nucleoside
Diphosphate Kinase 2, Catalase 2 và 3, cho thấy SOS2 là một phần của nút tín hiệu kết
11

nối phản ứng đáp ứng với điều kiện mặn và tín hiệu ROS [53]. Ngồi ra, các bằng
chứng khác cũng cho thấy SOS2 tương tác và điều chỉnh hoạt động của các protein
nằm trên màng không bào như CAX1 và Vaccin ATPaa Vacuolar (V-ATPase) điều
này chứng tỏ rằng SOS2 đóng vai trị trung tâm của các q trình vận chuyển [53].
SOS2 cũng được chứng minh tương tác với ABI2, cho thấy một sự liên hệ giữa con
đường ABA và con đường SOS [42]. Những kết quả này cho thấy một mạng lưới phức
tạp liên quan đến phản ứng của thực vật trong điều kiện mặn có liên quan đến con
đường SOS.
1.2.2. Vai trò của SOS trong khả năng chống chịu mặn của cây trồng
Ở thực vật, sự cân bằng nồng độ ion chủ yếu có liên quan đến con đường tín hiệu
SOS, trong đó SOS1 đóng vai trị quan trọng trọng việc thải loại trực tiếp Na+ ra môi
trường đất giúp kiểm sốt q trình vận chuyển Na+ trong tế bào. Bên cạnh đó, các báo
cáo trước đây cũng cho thấy SOS1 đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt sự cơ
lập Na+ trong khơng bào và điều chỉnh lượng Na+ vào xylem [37]. Điều này cho thấy
SOS1 có liên quan đến nhiều quá trình trung gian trong đáp ứng với điều kiện mặn ở
thực vật.
Ở Arabidopsis, SOS1 mã hóa cho một protein vận chuyển Na+/ H+ với một khối
lượng phân tử được dự đoán là 127 kD [25]. Vùng N-terminal của SOS1 là kỵ nước và
có thể chứa từ 10 đến 12 domain xuyên màng, tùy thuộc vào chương trình dự đốn
được sử dụng để phân tích. SOS1 đại diện cho một lớp các protein mới vận chuyển
Na+/ H+ có thể hoạt động trên màng tế bào [25]. Đặc biệt, đi dài kỵ nước của SOS1
được dự đốn là nằm trong bào tương. Chiều dài đuôi của SOS1 sẽ tạo ra nhiều cơ hội
để tương tác với vô số các protein dự kiến sẽ điều chỉnh hoạt động của nó. Mức độ
biểu hiện của gen SOS1 được điều chỉnh bởi điều kiện bất lợi mặn [25]. Không giống
nhiều loại gen đáp ứng điều kiện mặn khác, quy định này rất cụ thể đối với NaCl và
không xảy ra trong con đường ABA hoặc đáp ứng với điều kiện lạnh [25]. Như vậy,
mơ hình này cho thấy rằng SOS1 có chức năng trong việc thu nhận Na+ từ xylem hoặc
thải loại Na+ qua xylem.
Vai trò của SOS1 trong việc kiểm soát sự cân bằng ion đã được thể hiện thơng
qua sự kết hợp các phân tích sinh lý, sinh hóa và di truyền học. Sử dụng các chủng nấm

12


men đột biến để nghiên cứu, SOS1 lần đầu tiên được chứng minh có thể vận chuyển
Na+ ra khỏi tế bào dưới điều kiện mặn [21]. Phân tích sinh lý của cây đột biến SOS1
cùng với các nghiên cứu biểu hiện gen ở Arabidopsis cho thấy SOS1 có liên quan đến
quá trình thải loại ion từ tế bào chất ra mơi trường xung quanh, trong các tế bào biểu
bì và các mơ mạch, do đó duy trì nồng độ Na+ trong các tế bào rễ [45]. Một vài nghiên
cứu khác đã cho thấy sự biểu hiện của tất cả ba gen SOS được tạo ra bởi stress mặn
trong rễ, và đặc biệt, mức độ biểu hiện SOS1 cao đã được phát hiện trong các tế bào
biểu bì phần gốc của A. thaliana [45]. Có thể hiểu rằng trong trường hợp nồng độ NaCl
thấp, Na+ trung gian do SOS1 gây ra cho mơi trường tăng trưởng bởi các tế bào biểu
bì có thể là đủ để duy trì trạng thái cân bằng ion và các chức năng tế bào thích hợp.
Quá trình loại trừ ion đặc biệt này trong các tế bào biểu bì gốc có thể được điều chỉnh
bởi cả con đường tín hiệu phụ thuộc vào con đường SOS. Một nghiên cứu gần đây đã
chỉ ra rằng, phần lớn các q trình sinh lý và sinh hóa của các loại tế bào đặc biệt rất
nhạy cảm với stress mặn trong rễ [19]. Phân tích Microarray cho thấy rằng biểu hiện
gen SOS3 thể hiện cảm ứng khác biệt trong các loại tế bào nằm ở các vùng rễ phát triển
khác nhau để đáp ứng với stress mặn.
Các nghiên cứu ở một số loài đã chỉ ra rằng SOS1 được bảo tồn ở các thực vật
bậc cao bao gồm cả lá đơn và lá kép [45]. Đặc biệt là, hoạt động của SOS1 đã được
chứng minh là cần thiết cho các đặc tính chịu mặn của Thellungiella salsuginea (cịn
gọi là T. halophila), một loài thực vật chịu mặn tự nhiên liên quan chặt chẽ đến
Arabidopsis [25]. Việc giảm 50% hoặc tăng cao hơn mức biểu hiện SOS1 bằng cách
sử dụng RNAi dẫn đến sự tích tụ ion cao gây độc cho T. salsuginea [25]. Do đó, tín
hiệu SOS3 / SCaBP8-SOS2-SOS1 là một cơ chế điều tiết tối ưu trong việc loại trừ ion
Na+ và cân bằng nồng độ ion trong tế bào.
Các nghiên cứu trong A.thaliana, những cây đột biến thiếu gen SOS1 cho thấy
cực kỳ nhạy cảm với điều kiện mặn và có khiếm khuyết khác nhau trong việc thải loại
Na+ và vận chuyển ion [25]. Khi biểu hiện trên màng tế bào S.cerevisia, SOS1 hoạt

động như một chất vận chuyển Na+ / H+ làm giảm nồng độ Na+ trong tế bào chất [25].
Ở Arabidopsis, việc đưa các gen SOS1 vào các cây bị đột biến sos1 đã giúp khôi phục
khả năng chịu mặn của dòng đột biến này. Sau 3 giờ xử lý mặn, mức độ biểu hiện của

13


gen SOS1 trong rễ cây Arabidopsis đã tăng lên khoảng 2 lần và đạt đến cực đại 6 lần
sau 15 giờ trong khi nó giảm trong mơ lá [9]. Ở vùng tiếp xúc gốc-đất, SOS1 sẽ thải
loại một lượng các ion Na+ dư thừa từ các tế bào biểu bì gốc ra ngồi mơi trường đất.
Ngồi ra, phân tích khả năng vận chuyển Na+ trong cây bị đột biến sos1 theo các mức
độ mặn khác nhau đã chỉ ra rằng SOS1 cũng tham gia phân phối lại Na+ giữa các mô,
tế bào và các cơ quan trong cơ thể thực vật [42]. Ở độ mặn trung bình (25 mM NaCl),
các cây đột biến gen sos1 tích tụ ít Na+ trong các cơ quan hơn các cây bình thường,
khơng đột biến gen. Điều này cho thấy SOS1 có chức năng vận chuyển Na+ vào xylem
để phân phối đến chồi, lá. Ngược lại, ở độ mặn cao (100 mM NaCl), rễ và các cơ quan
khác của cây đột biến sos1 tích tụ nhiều Na+ hơn các cây bình thường, có thể là do sự
loại bỏ Na+ ở lớp tế bào biểu bì gốc và gradient điện hóa lớn của Na+ ở cây bình thường
tốt hơn cây đột biến [42].
Vậy từ những nghiên cứu ở trên có thể kết luận được SOS1 đóng vai trị vơ cùng
quan trọng trong khả năng đáp ứng với điều kiện mặn ở cây trồng. SOS1 vừa có vai trị
thải loại các ion Na+ dư thừa ra ngồi môi trường, vừa tham gia phân phối lại ion Na+
giữa các cơ quan trong cơ thể, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn trong điều
kiện mặn.
1.2.3. Giới thiệu về gen SOS1 ở cây lúa
Lúa (Oryza sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng ở các vùng
nhiệt đới và ôn đới trên thế giới. Trong số những bất lợi về mơi trường, độ mặn là yếu
tố chính làm giảm chất lượng và năng suất của cây. Ở lúa, gen SOS1
(LOC_Os12g44360) mã hóa cho một protein vận chuyển Na+/H+ nằm trên màng tế bào
có độ dài 14451 bp, gồm 23 exon và 22 intron với độ dài trình tự cds là 3447 bp tương

ứng 1148 acid amin (Hình 1.5)

Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc gen SOS1 ở cây lúa
14


Tương tự như ở Arabidopsis, gen SOS1 ở lúa có vai trò quan trọng trọng việc thải
loại trực tiếp NaCl ra mơi trường giúp kiểm sốt q trình vận chuyển Na+ trong tế
bào. Đồng thời, SOS1 cũng đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm soát sự phân phối
Na+ trong khơng bào và xylem [41].
1.3. HIỆN TƯỢNG METHYL HĨA ADN VÀ VAI TRỊ CỦA METHYL HĨA
ADN TRONG CHỐNG CHỊU STRESS Ở CÂY TRỒNG
1.3.1. Khái quát về hiện tượng methyl hóa ADN
Methyl hóa ADN là một trong những cơ chế sửa đổi gen có vai trị quan trọng
trong việc điều hịa hoạt động của gen. Không giống như trong tế bào động vật, sự
methyl hóa ADN trong tế bào thực vật khơng chỉ xảy ra ở vùng trình tự CG đối xứng
mà cịn ở các vùng trình tự CHH và CHG (với H = A, T hoặc C) có tỷ lệ phần trăm
thấp hơn, tương ứng là 1,7% và 6,7%. Methyl hóa ADN với tỷ lệ phần trăm cao chủ
yếu được tìm thấy trong heterochromatin nơi chứa các transposons và các trình tự lặp
đi lặp lại [10]. Methyl hóa ở thực vật thường xảy ra trong hệ gen và chỉ có 5% gen
được methyl hóa trong promoter của chúng, cơ chế này thường liên quan đến sự ức
chế biểu hiện gen.

15


Hình 1.6. Sơ đồ đại diện của các con đường methyl hóa cytosine, demethylation, và
mutagenesis của cytosine và 5-mC. [40]
Methyl hóa ADN rất quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng
để đáp ứng các điều kiện bất lợi từ môi trường [40]. Là một trong những sửa đổi cấu

trúc ADN đầu tiên được phát hiện, methyl hóa ADN đã được quan sát thấy ở nhiều
sinh vật. Việc methyl hoá ADN nhân tạo thường xảy ra ở vị trí 5 của cytosine, tạo ra
5-methylcytosine. Trong các điều kiện tăng trưởng bình thường, tỷ lệ cytosines được
methyl hóa trong thực vật là 20-30% [40]. Có rất nhiều bằng chứng chỉ ra rằng những
thay đổi của gen khi bị methyl hóa ảnh hưởng đáng kể đến khả năng đáp ứng của thực
vật đối với các điều kiện bất lợi từ môi trường [40].
1.3.2. Mối liên quan giữa sự methyl hóa ADN và khả năng chống chịu điều kiện
bất lợi ở thực vật.
Methyl hóa ADN để đáp ứng với các điều kiện bất lợi từ môi trường được chứng
minh là đặc tính của cơ quan và gen [62]. Trong nghiên cứu của Zhikang Li và cộng
16