Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơn trên cây lúa Oryza sative L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------

CHÂU TẤN PHÁT

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR
VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN
MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Cần Thơ - 2012


ii

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc
-------------

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu:”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR
và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là
của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Châu Tấn Phát


iii

LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành biết ơn các Thầy, các Cô hướng dẫn khoa học:
-

GS.TS. Nguyễn Thị Lang, đã hết lòng chỉ dẫn những nội dung cần thiết
thực hiện các mơn học, các thí nghiệm và nội dung nghiên cứu để hồn
thành luận án.

-

GS.TS. Bùi Chí Bửu, đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung,
phương pháp và kế hoạch triển khai thành công các môn học, thực hiện
các thí nghiệm.

-

Các thầy cơ tham gia giảng dạy lớp nghiên cứu sinh khóa 1 của cơ sở đào
tạo Viện Lúa đồng bằng sơng Cửu Long.

Khơng thể hồn thành luận án nếu khơng có sự giúp đở hướng dẫn khoa học
và động viên của Cô và Thầy.
Xin chân thành biết ơn Hội đồng đánh giá luận án cấp Cơ Sở: đã dành nhiều

thời gian để đọc và đóng góp nhiều ý kiến qúi báu cho luận án được hoàn thiện.
Xin chân thành cảm ơn:
-

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

-

Ban giám đốc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã giúp đỡ tạo điều
kiện cho tôi trong học tập và thực hiện đề tài.

-

Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ.

-

Ban giám hiệu và tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt thời gian tôi theo học chương trình cao học tại đây.

-

Phịng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu
Long, đã theo dõi, động viên tơi trong suốt q trình học tập cũng như
thực hiện đề tài tốt nghiệp.

-

Bộ môn Di Truyền và Chọn Giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu
Long, đã giúp đỡ về trang thiết bị cũng như hướng dẫn chun mơn trong

suốt q trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.


iv

-

Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã
động viên và tạo điều kiện về thời gian giúp tơi có thể hồn thành luận án
trong thời gian qui định.

-

TS. Bùi Thị Thanh Tâm, TS. Phạm Trung Nghĩa đã đóng góp nhiều ý
kiến q báu để hồn thiện cho các mơn học chun đề và luận án.

-

Sau cùng, xin cảm thông sự hy sinh, chia sẽ và động viên của cha mẹ, em
gái, vợ và người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần
không nhỏ vào sự thành công của luận án.

Tác giả luận án

Châu Tấn Phát


1

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi
sống hơn 50 % dân số thế giới [62]. Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu
thốn, lương thực khơng đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu là ăn no. Nhưng ngày nay do
mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì nhu cầu ăn no đã thay đổi, việc ăn
ngon, có dinh dưỡng cao dần dần trở thành nhu cầu quan trọng không thể thiếu đối
với con người. Mặt khác, ngày nay nước ta đã qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển
sang thời kỳ sản xuất phải có lời và đang xuất hiện những mơ hình sản xuất vừa có
lời, vừa bền vững trong mơi trường sinh thái trong lành. Một trong những mơ hình
này là làm lúa thơm đặc sản, do đó chất lượng gạo được xem như là một trong
những mục tiêu hàng đầu, trong đó mùi thơm được đánh giá rất cao trên thị trường
xuất khẩu gạo của thế giới. Sản lượng gạo thơm từ các giống lúa thơm cổ truyền
như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk
Mali, Basmati,... thì có rất ít khơng đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và khó mở rộng
diện tích. Do đó các nhà chọn giống đã liên tục nghiên cứu và lai tạo ra những
giống lúa mới có chất lượng cao và giữ được mùi thơm đặc trưng của giống.
Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học đã
ứng dụng những kỹ thuật trong sinh học phân tử như tái tổ hợp DNA, giải mã chuỗi
trình tự gen. Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC Bacterial Artificial Chromosome) như là một cơng cụ có sức thuyết phục mạnh mẽ
nhất để xây dựng thư viện bộ gen cho cây lúa, thành lập bản đồ vật lý có chất lượng
cao và dùng để hợp nhất bản đồ vật lý với bản đồ di truyền. Bên cạnh đó, việc sử
dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa cũng
là một trong những ứng dụng từ thư viện BAC.
Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: ”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và
dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” được thực
hiện.


2

2.Mục tiêu nghiên cứu
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr”
trên các dòng giống làm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dịng con
lai có chứa gen mùi thơm.
- Khai thác thư viện BAC để hổ trợ tìm kiếm những chỉ thị liên kết với tính
trạng mùi thơm trên cây lúa.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
- Xác định những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết với gen “fgr” trên cây
lúa giúp cho việc chọn dòng con lai hiệu quả hơn.
- Xác định những dòng BAC DNA để tạo các chỉ thị mới liên kết với gen qui
định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BAC để hiểu rõ hơn về kỹ thuật dịng hóa
gen mục tiêu, phục vụ nghiên cứu sâu hơn về chức năng gen này.
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Đề tài đã góp phần bổ sung những dịng lúa có triển vọng biểu thị mùi thơm
thông qua ứng dụng những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt với gen “fgr”
phục vụ cho việc phát triển những giống lúa thơm cao sản ở ĐBSCL.
- Với những kết quả đạt được từ việc khai thác thư viện BAC, đề tài đã tìm
và phân tích chỉ thị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ
cho chọn giống lúa.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao
sản hiện đang được duy trì và nhân giống.
- Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi
thơm.
- Phạm vi nghiên cứu:
+ Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên kết
với gen “fgr” trên nhiễm sắc thể số 8 và ứng dụng kết quả trên để chọn giống lúa
cao sản có gen mục tiêu.

3

+ Phân lập được đoạn phân tử mang gen mục tiêu.
+ Chưa phân tích phổ chức năng (gene profile).
+ Chưa nghiên cứu được điều kiện để gen thể hiện (gene expression)
ở các qui mô khác nhau.


4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài
1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố mơi trường ảnh
hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa
1.1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm và sự thể hiện của chúng trên các bộ
phận của cây lúa
Mùi thơm của hạt gạo được xác định do nhóm formaldehyde, ammonia và
hydrogen sulfide tạo nên. Một vài nghiên cứu còn ghi nhận mùi thơm là do sự tăng
của propanol, pentanol và hexanol trong quá trình tồn trữ. Ngày nay bằng phương
pháp hiện đại đã xác định mùi thơm được tạo thành bởi hàng trăm lọai
hydrocacbon, alcohol, aldehyde, keton, acid, phenol, pyridine và những hợp chất
khác đã được ghi nhận trong cơm [3], [70].
Tác giả Kim [64] báo cáo rằng các hợp phần hydrocacbon khơng khác nhau
có ý nghĩa giữa lúa thơm và khơng thơm, tuy nhiên lúa thơm có mức độ cao hơn về
alcohol, aldehyde, keton, acid; trong đó lúa thơm có nồng độ 2-acetyl-1-pyrroline
cao gấp 15 lần so với lúa khơng thơm.

Lorieux và ctv [76] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và
IR64 (không thơm), kết quả khơng tìm thấy chất 2-acetyl-1-pyrroline ở IR64
(khơng thơm), trong khi đó giống lúa thơm Azucena có hàm lượng cao về chất này.
Trong số 89 hợp chất phân tích, xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt
giữa giống lúa thơm và khơng thơm đó là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline,
benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 và hexanol.
Tác giả Buttery và ctv [39] đề nghị rằng sự khác nhau giữa lúa thơm và
không thơm không chỉ ở sự hiện diện hay vắng mặt của chất 2-acetyl-1-pyrroline
mà còn trong sự khác nhau về số lượng của hoạt chất có trong lúa gạo. Nhiều alen


5

của một gen thơm có thể tạo ra sự biến đổi nhỏ trong cùng một enzyme kết quả là
dẫn đến tính thơm khác nhau.
Tác giả Buttery và ctv [40] đã phân tích và xác định 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) như là một thành phần quan trọng đóng góp vào mùi thơm của các giống lúa
thơm. Theo đánh giá về chất lượng mùi thơm của 2-acetyl-1-pyrroline được mô tả
giống như mùi của ngô nổ. Xác định nồng độ mùi thơm của 10 giống lúa, khoảng
nồng độ từ 6 ppb đến 90ppb với lúa chà trắng. Lúa chưa chà trắng nồng độ 2-acetyl1-pyrroline là 100-200ppb. Vì thế có thể nghĩ rằng bề mặt lớp aloron của hạt gạo
giữ một vai trò quan trọng trong việc hình thành mùi thơm của cơm khi nấu. Mũi
của người có thể phát hiện được hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline ở nồng độ
0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan trong điều kiện nhất định và với những
người có khứu giác bình thường kết quả có thể tin tưởng được.[47]
Các tác giả Ahmed và ctv [31], Lin và ctv [74] đã khẳng định lại báo cáo của
Buttery và ctv [40], Paule và ctv [84] rằng 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính
tạo nên mùi đặc trưng cho các giống lúa thơm.
Bên cạnh đó, Buttery và ctv [38] đã phân tích lá của cây lá dứa (Pandabases
amaryllifolius) nhận thấy rằng thành phần bay hơi chính cũng là 2-acetyl-1pyrroline (2AP) và có một sự liên hệ rất mật thiết giữa chất 2-acetyl-1-pyrroline
trong lá của cây lá dứa và lúa thơm. Nồng độ của chất 2-acetyl-1-pyrroline trong lá
của cây lá dứa cao hơn gấp 10 lần trong lúa thơm và cao hơn gấp 100 lần trong lúa

khơng thơm.
Tóm lại, hiện nay có hai quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo.
Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm được tạo ra từ các hợp chất aldehyde
(CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lưu hùynh. Quan điểm thứ hai cho rằng
chất thơm lúa gạo, do vịng ryrrol kiểm sóat tính thơm của chất 2-acetyl-1-pyrroline
[34]. Tác giả Kader và Delseny [59] cho rằng có sự khác nhau trong việc thể hiện
mùi thơm trên các bộ phận của cây lúa, hợp chất 2AP được thể hiện một cách tự
nhiên từ giai đoạn mạ cho đến khi chín và đặc biệt là trong giai đoạn hạt trưởng
thành trên các bộ phận của cây lúa ngoại trừ rễ, mùi thơm được tích lũy nhiều nhất


6

trên bộ phận hạt lúa. Bên cạnh đó, các tác giả Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv
[102] cũng khẳng định mùi thơm không thể hiện hoặc thể hiện rất thấp không đáng
kể trên bộ phận rễ lúa.
1.1.1.2 Gen thơm
Li và Gu [71] cũng nghiên cứu về sự di truyền và vị trí của gen thơm trên
lúa. Sự lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm đã cho thấy rằng các gen của
chúng có alen với nhau.
Tác giả Bradbury và ctv [78] đã phân tích mùi thơm của lúa Basmati và
Jasmine với sự thể hiện của 2-acetyl-1-pyrroline. Một gen lặn fgr trên NST số 8 của
lúa qui định sự thể hiện tính trạng quan trọng này và có một gen tương ứng mã hóa
protein có tên gọi là Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) thể hiện sự đa hình
có ý nghĩa trong vùng chứa gen thơm. Gen fgr có sự tương đồng với gen mã hóa
BAD2 trong lúa và có thể xem gen fgr là một dạng đột biến của gen mã hóa BAD2.
Ngược lại, gen mã hóa BAD1 định vị trên nhiễm sắc thể số 4. Gen mã hóa BAD
liên kết với gen kháng stress trong cây trồng.
Tác giả Shi và ctv [107] cũng kết luận gen fgr là gen lặn nằm trên NST số 8
liên quan đến mùi thơm của lúa. Gen này có một alen lặn mất chức năng bad2 và

alen trội BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không thơm. Tổng số 34 giống
lúa thơm và không thơm đã được nghiên cứu và giải trình tự đoạn phân tử
BAD2/bad2. Trong số 24 giống lúa thơm có 12 giống chứa alen bad2 (bad2-E7),
với sự kiện mất đi 8 cặp bazơ và 3 SNPs trên exon số 7, số cịn lại có một alen bad2
mới (bad2-E2) - chuỗi trình tự tương đồng với bad2-E7 nhưng đã mất đi 7 cặp bazơ
trên exon số 2. Cả hai alen này đều qui định mùi thơm của lúa. Dựa trên chuỗi trình
tự khác nhau giữa BAD2 và 2 alen lặn bad2 đã phát triển những chỉ thị phân tử giúp
cho việc xác định dịng lúa thơm, phân biệt rõ dịng khơng thơm và thơm xét về
kiểu gen. Tuy nhiên, kiểu hình biểu thị ra bên ngồi vơ cùng phức tạp điều này có
thể do điều kiện mơi trường qui định sự ức chế hoặc kích hoạt promoter để gen thể
hiện mùi thơm.


7

Bên cạnh đó, tác giả Fitzgerald và ctv [80] cũng đã có nhận xét tương tự với
tác giả Shi và ctv [107]: 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính tạo nên mùi thơm
trong lúa và được tích lũy do bởi sự mất đi 8 cặp bazơ trong một alen ở locus “fgr”.
Trong nghiên cứu này, 2-acetyl-1-pyrroline được định lượng. Sự thể hiện hay vắng
mặt của alen fgr đã được xác định trong 464 mẫu của các giống lúa truyền thống
của Trung Tâm Ngân Hàng Gen IRRI mang tên T.T.Chang. Kết quả cho thấy rằng
nhiều giống lúa thơm, đặc biệt từ Nam và Đông Nam Á, không biểu thị sự mất đi 8
cặp bazơ, nhưng sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline vẫn được xác định trong cả dạng
gạo và dạng cơm của những giống này. Sự mất đi 8 cặp bazơ trong locus fgr không
chỉ là ngun nhân qui định mùi thơm mà cịn có một đột biến khác đã điều khiển
sự tích lũy sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline. Protein tổng số 2-acetyl-1-pyrroline được
mã hóa bởi những gen đồng dạng fgr khơng biểu thị khác biệt có ý nghĩa so với
kiểu gen n-fgr. Một vài kiểu gen fgr, đặc biệt từ Nam Á mã hóa protein này với sự
tích lũy số lượng lớn 2-acetyl-1-pyrroline như Basmati. Sự đột biến tạo ra 2-acetyl1-pyrroline trong các giống lúa thơm n-fgr có thể được tạo ra một vài lần trong q
trình thuần hóa và tiến hóa. Gen fgr và các alen khác liên quan tới 2-acetyl-1pyrroline đã qui tụ lại trong các giống lúa thơm ở Nam Á tạo ra các giống lúa đặc

sản cổ truyền có mùi thơm cao. Sự xác định nhiều đột biến đối với 2-acetyl-1pyrroline có thể xảy ra trong các chương trình chọn giống lúa để đa dạng nguồn di
truyền của 2-acetyl-1-pyrroline nhằm phát triển giống lúa có mùi thơm cao và chất
lượng tốt.
1.1.1.3 Một số yếu tố mơi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi
thơm trên lúa
+ Nhiệt độ
Theo tác giả Juliano [57b] việc hình thành mùi thơm trong hạt tăng lên ở
nhiệt độ thấp trong suốt giai đoạn vào chắc của hạt. Giống lúa Basmati yêu cầu
nhiệt độ thấp (25oC ban ngày, 21oC ban đêm trong suốt quá trình trưởng thành) thì
tốt cho việc hình thành mùi thơm.


8

+ Đất
Nhân tố đất cũng ảnh hưởng đến mùi thơm và các tính trạng chất lượng khác
thơng qua dinh dưỡng cây trồng và mối quan hệ tương tác của các chất dinh dưỡng
bay hơi với các thành phần bay hơi có liên quan đến mùi thơm. Singh và ctv [94]
nhận thấy có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mùi thơm của lúa ở hai thửa
ruộng liền kề nhau mặc dù là cùng một giống. Điều kiện đất tơi xốp và đất vùng cao
cũng giúp hình thành mùi thơm được tốt hơn.
Bên cạnh đó, Bocchi và ctv [36] đã đánh giá sự ảnh hưởng của các đặc tính
đất trên chất lượng mùi thơm của lúa trên ruộng thử nghiệm ở Pavia, Italy và kết
luận rằng hàm lượng cao nhất của các chất bay hơi trong hạt có liên quan đến các
loại đất có hàm lượng sét thấp và hàm lượng cát cao. Ảnh hưởng của tương tác kiểu
gen và đất trên chất lượng hạt lúa của lúa Japonica thì cũng được báo cáo bởi Lee
và ctv [68].
+ Tập quán canh tác
Theo Singh và ctv [94] lúa sẽ có mùi thơm hơn khi cây lúa được sạ trực tiếp
so với khi được cấy. Bên cạnh đó thời gian thu hoạch là một nhân tố khác có ảnh

hưởng đến mùi thơm và những tính trạng chất lượng khác ở lúa. Việc trì hoản thu
hoạch sau khi chín có thể làm giảm mùi thơm. Cả năng suất và phẩm chất hạt sẽ
giảm đi nếu việc thu họach vượt quá thời gian này. Sự tác động của việc trì hỗn thu
họach trên phẩm chất lúa gạo thông qua sự giảm hay thay đổi trong các thành phần
hạt do bởi nhiệt độ, ẩm độ, côn trùng dịch hại và các vi sinh vật khác.
+ Độ thuần giống
Theo Singh và Singh [93] trong hầu hết các vùng trồng lúa thơm bản địa ở
Ấn Độ, người nông dân thường sử dụng hạt của các thế hệ trước. Khơng có chương
trình cải thiện năng suất cho các giống lúa này. Kết quả là hạt không thuần dẫn đến
việc giảm đi mùi thơm.
Tóm lại, các thành phần di truyền, tập quán canh tác, môi trường và các nhân
tố khác có ảnh hưởng đến sự thể hiện của mùi thơm và các tính trạng chất lượng
trên lúa thơm. Cùng một giống được trồng ở các nơi khác nhau có thể khơng sản


9

xuất hạt có chất lượng như nhau. Tính trạng chất lượng của các giống này được thể
hiện tốt nhất trong các vùng bản địa của chúng khi được trồng.
1.1.2 Nguyên lý và yêu cầu trong chọn giống bằng MAS
Chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử MAS là kỹ thuật chọn tạo giống kết hợp
giữa phương pháp truyền thống với phương pháp công nghệ sinh học hiện đại. Để
làm được việc này cần xác định được cặp bố mẹ mang những đặc tính mong muốn
và các gen qui định các đặc tính đó đã được lập bản đồ và có những chỉ thị phân tử
liên kết chặt với các đặc tính đó. Tiêu chuẩn quan trọng nhất trong lựa chọn bố mẹ
phải có sự tương phản rất lớn về tính trạng mục tiêu có trong bố mẹ và sự di truyền
của tính trạng này ở bố mẹ. Xét về mức độ đa hình giữa bố mẹ, tính chất này càng
lớn kết quả càng tốt [2]. Bên cạnh đó, nguyên lý cơ bản trong chọn giống bằng
MAS là sử dụng phương pháp lai truyền thống và phương pháp lai hồi giao
(Backcross-BC) nhiều lần cho đến khi đạt được thế hệ BC mong muốn. Trong qúa

trình này sẽ sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn các cá thể có kiểu gen mong muốn.
Cuối cùng đến một thế hệ nào đó sẽ chọn ra cá thể cho tự thụ để tạo dịng thuần có
mang kiểu gen mong muốn cần cải tạo. Phương pháp chọn tạo giống này vừa chính
xác vừa có thể rút ngắn thời gian chọn lọc, diện tích triển khai do có thể phân tích
và chọn được các giống mang gen ngay ở giai đoạn sớm, thí dụ như cây gieo từ hạt
sau 7-10 ngày mà không cần chờ đến khi thu họach [20].
1.1.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn BAC (Bacterial Artificial
Chromosome)
1.1.3.1 Khái niệm BAC DNA và BAC contigs
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)- nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn.
BAC DNA là các vòng plasmid BAC chứa đọan DNA ngoại lai được chèn vào vị trí
mục tiêu trên nhiễm sắc thể này. Các plasmid BAC có khả năng tự nhân lên độc lập
với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Plasmid BAC có thể tồn tại từ một đến hàng trăm
phiên bản trong một tế bào vi khuẩn.


10

BAC contigs hay BAC “contiguous sequence” là một đoạn dài của chuỗi
trình tự được xây dựng bởi một số các trình tự ngắn, chuỗi trình tự này có các đoạn
phân tử chồng lấp lên nhau [3].
1.1.3.2 Xây dựng BAC contig
Những dịng BAC có tính chồng lấp lên nhau được gọi với thuật ngữ là
“contig”, có thể được xây dựng thơng qua:
+ Việc thanh lọc khuẩn lạc (colony).
+ Kỹ thuật “chromosome walking”.
+ Kỹ thuật “DNA fingerprinting”.
+ Chỉ thị STS (những chỉ thị được chuyển đổi từ RFLP)[3].
Theo tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [67] phân tích PCR với chỉ thị STS được
sử dụng để thanh lọc các dịng BAC có tính chất chồng lấp và hình thành những

“contig” của kho lưu trữ BAC từ DNA của quần thể đơn bội kép giống lúa
IR64/Azucena. Kho lưu trữ này gồm có 18.432 dòng. Thực hiện thanh lọc DNA của
thư viện BAC với 120 mồi STS. Tổng số dòng BAC đã được phân lập là 86 dòng
trên 23 loci của 38 mồi STS. Một vài contig đã được “neo” giữ trên những nhiễm
sắc thể cây lúa trên cơ sở bản đồ dấu chuẩn phân tử STS của quần thể đơn bội kép
từ cặp lai IR64/Azucena. Kết quả cho thấy phân tích PCR với mồi STS là một
phương tiện rất tốt để tìm ra những dịng BAC có tính chất chồng lấp để hình thành
contig. Phương pháp này cũng đã xác định được các dòng BAC mang những đoạn
phân tử chuyên biệt như vậy.
Theo tác giả Wang và ctv [105] trong nghiên cứu xây dựng một BAC contig
chứa Xa-4 locus trên nhiễm sắc thể số 11. Gen kháng vi khuẩn bạc lá Xa4 đã được
sử dụng một cách rộng rãi để khai thác gen kháng trong nhiều chương trình chọn
giống lúa của Châu Á và được đề nghị là có tính kháng ổn định trong nhiều giống
lúa thương mại [81]. Một phần của nhóm gen kháng bao gồm Xa3, Pi-1 (t), Pik, và
Pi-f trên nhiễm sắc thể 11 [69]; [111]. Tuy nhiên, các dòng lúa chồng gen Xa4 với
các gen kháng vi khuẩn bạc lá khác cho kết quả mức độ kháng cao hơn và thậm chí
là phổ kháng rộng hơn so với bệnh này chỉ với một gen kháng đơn gen [54]. Vì vậy


11

mà, Xa4 đã được coi như là một mục tiêu cho tách dòng định vị. Xa4 đã được xác
định lần đầu tiên bởi tác giả Yoshimura và ctv [117] trên nhiễm sắc thể 11 trên lúa
gần với chỉ thị G181 (chỉ thị RFLP). Gần đây, một vài chuỗi trình tự tương đồng
gen kháng (RGAs) khuếch đại từ DNA bộ gen cây lúa với các mồi chuyển đổi đã
được lập bản đồ trong vùng này [69]. Thanh lọc RGAs cùng với locus Xa4, khai
thác theo kiểu tiếp cận dựa trên PCR [83]; [118]. Một trong số những chuỗi tương
đồng gen kháng là RSI3 với mức tương đồng cao với gen được biết là NBS-LRR đã
được tìm thấy cùng với Xa4 trong một quần thể F2 có nguồn gốc từ giống IR24 và
quần thể NIL Xa4 (IRBB4); RSI3 nằm giữa hai chỉ thị RFLP là G181 và L1044.

Chiến lược này có tên gọi là “Chromosome landing”, “Chromosome landing” có xu
hướng chọn lọc phong phú các chỉ thị DNA trong phạm vi vùng cM phụ chung
quanh gen mục tiêu [99]. Vì vậy, RSI3 có thể được sử dụng để đánh dấu ở vị trí
Xa4. Để tách ly gen Xa4, một thư viện BAC bao gồm 55.296 dòng của IRBB56 đã
được xây dựng. Các chỉ thị RSI3, G181, và L1044 được sử dụng để thanh lọc thư
viện BAC. Kết quả đã thanh lọc được 18, 13 và 106 dòng BAC theo thứ tự các chỉ
thị như trên. Trong số 18 dòng BAC đã được nhận biết bởi RSI3 có bốn dịng BAC
(1F21, 26D24, 56M22 và 111E1) cũng đã được nhận biết bởi chỉ thị G181 và sáu
dòng BAC (1F21, 33M8, 56M22, 61A13, 104B15 và 111E1) được nhận biết bởi chỉ
thị L1044. Trên cơ sở cắt hạn chế của enzyme HindIII, 12 trong số 18 dòng BAC đã
được chọn lọc và cắt với enzyme cắt giới hạn HindIII phục vụ cho phân tích
Southern. Sử dụng G181 làm đoạn dò kết quả đã nhận biết một băng sau khi phân
tích Sounthern với các dịng BAC: 56M22, 111E1 và 26D24. Vì vậy, chỉ thị G181
coi như nằm trên phần trùng lắp của những dòng BAC này. Sử dụng L1044 làm
đoạn dị sau khi phân tích Sounthern kết quả đã nhận ra các băng trên 2 vị trí khác
nhau: một băng cho các dòng BAC 56M22 và 111E1, cái còn lại cho các dòng BAC
104B15, 33M8 và 61A13. Ước tính khoảng cách di truyền giữa G181 và L1044.
Chỉ thị L1044 nằm trong phần trùng lấp của 3 dòng BAC là 104B15, 33M8 và
61A13. Sử dụng RSI3 làm đoạn dị trong phân tích Southern kết quả đã nhận biết
từ 2 tới 5 băng trong mỗi nhóm ít nhất là 2 dòng BAC. Mối quan hệ trùng lấp giữa


12

các dịng BAC đã được phân tích thêm thơng qua phân tích Southern sử dụng đoạn
dị được thiết kế từ các dịng BAC trên với TAIL-PCR [75]. Kích thước đoạn chèn
của mỗi dịng BAC được xác định thơng qua điện di CHEF sau khi cắt với enzyme
cắt giới hạn NotI. Một BAC contig dài khoảng 420kb phủ trên vị trí gen Xa4 đã
được xây dựng. Trong số 339 cá thể từ quần thể F2 của những dòng đẳng gen Xa4,
mồi được thiết kế từ trình tự đầu cuối của đoạn chèn của các dòng BAC: 56M22F

đã nhận biết 3 tái tổ hợp, 26D24R nhận biết 5 tái tổ hợp và 104B15R nhận biết 6 tái
tổ hợp. Các tái tổ hợp được nhận biết bởi 56M22F thì khác so với các tái tổ hợp
được nhận biết bởi 26D24R và 104B15R, Xa4 có thể coi là nằm trong vùng giữa
56M22F và 26D24R với chiều dài vật lý ước tính khoảng 90kb. Chỉ thị RSI3 có
mức độ tương đồng cao với vùng NBS của lớp gen NBS-LRR và đồng cách ly với
gen Xa4, có khả năng chỉ thị RSI3 là một phần của một thành viên trong họ gia đình
gen Xa4. Chỉ thị RSI3 có thể nhận biết được 5 băng HindIII. Trong số những dòng
BAC được nhận biết bởi chỉ thị RSI3 thơng qua phân tích Southern, dịng BAC
106P13 có thể hiển thị tất cả những băng lai và bao bọc vùng giữa hai chỉ thị
56M22F và 26D24R. Vì vậy, dịng BAC 106P13 có lẽ chứa alen Xa4 và đã được
chọn lọc cho những đánh giá sau này.

Hình 1.1: Bản đồ vật lý của Xa4 locus.
Ghi chú: Hàng đầu tiên là nhiễm sắc thể 11. Dưới là khoảng cách di truyền và khoảng cách vật lý.
Khoảng cách vật lý tương đương với kích thước đoạn DNA được dịng hóa và được đánh giá thơng qua
điện di CHEF. Các dịng BAC trùng lấp được thể hiện bằng những thanh đen đậm. Vùng giữa 56M22F và
26D24R thể hiện bằng đường gạch chấm thẳng đứng có thể chứa gen Xa4. ( Nguồn: Wang và ctv [105] )


13

1.1.3.3 Một số thông tin về BAC DNA
BAC vectơ được phóng thích từ “E.coli F factor plasmid”, bao gồm các gen
điều khiển số bản sao có tính giới hạn và sự tự tái bản DNA có tính đẳng hướng. Cả
hai tính chất này đều giúp cho plasmid được duy trì và ổn định. Khả năng nhân
dòng của BAC là 400kb. Cấu trúc căn bản của BAC vectơ được phát triển từ
plasmid F nội sinh. Plasmid F bao gồm 4 vùng cần thiết có chức năng ổn định
plasmid và quyết định số bản sao đó là: ParA, ParB, OriS, RepE. Cả hai ParA và
ParB đều cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid. Bên cạnh đó, ParB cịn cần
cho việc kết hợp với F factor khác. OriS là nguồn tự tái bản DNA, có tính chất đồng

hướng. RepE mang tính hiệu của protein E, cần trong quá trình tự tái bản từ OriS và
cần trong q trình kiểm sốt bản sao. Người ta cho vào gen kháng
chloramphenicol, dùng để chọn lọc các thế hệ có tính chất kháng sinh [3].
Dịng E.coli được sử dụng phổ biến nhất cho kỹ thuật nhân dòng nhiễm sắc
thể nhân tạo trong vi khuẩn (BAC) là DH10B Hanahan [52]. Đặc điểm chính của
dịng này là có những đột biến ngăn trở:
(1) Phân cắt DNA lạ do hệ men nội sinh (hsd / RMS)
(2) Phân cắt DNA có gốc methyl (5’-methylcytosine hoặc methyladenine, 5’hydromethylcytosine) (mcrA, mcrB, mcrC, mrr)
(3) Sự tái tổ hợp (recA1)
Vì hệ thống BAC cịn q mới mẻ, do vậy chỉ có vài lồi thực vật được thiết
lập thư viện. Thí dụ, thư viện trên lúa IR64 [115]. Trên cao lương có 13.750 dịng
BAC [109]. Thư viện này ước khoảng 90% genome của cao lương và 14% bị tạp
với trình tự của thể lạp.
Tác giả Zhang và ctv [119] đã xây dựng thư viện BAC cho cây lúa thuộc
nhóm japonica và indica. Kết quả ghi nhận tương tự như trên cao lương. Những kết
quả đầu tiên này cho thấy BAC rất có triển vọng trong ứng dụng sinh học phân tử
để phân tích genome thực vật.


14

Kho lưu trữ BAC trên lúa hiện nay có 18.432 dòng trên quần thể DH của tổ
hợp lai IR64/Azucena [114]; [115]. Khả năng chèn vào lớn nhất của BAC là 364kb.
Có 75% dịng BAC có khả năng mang 76-135kb, trung bình là 107kb.
Mỗi dịng BAC được ký hiệu theo số đĩa (plate) (X), số hàng (Y) và số cột
(Z). Thí dụ, BAC trong trường hợp IR64/Azucena tại IRRI (Philippines) được theo
dõi có 48 đĩa đánh số từ P1 đến P48. Có 16 hàng đánh thứ tự từ A đến P và có 24
cột đánh thứ tự từ C1 đến C24.
1.1.3.4 Một số thư viện BAC trên thế giới và Việt Nam
Theo Khush và ctv [62] thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC)

trên lúa đã được công bố bởi RGRP (Rice Genome Research Program) và thư viện
nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) bởi Wang và ctv [104].
Wang và ctv [104] đã phát triển lần đầu tiên thư viện BAC phục vụ tích cực
cho việc xây dựng bản đồ vật lý trên bộ genome cây lúa. Thư viện BAC này chứa
khoảng 11.000 dịng với kích thước đoạn chèn trung bình là 125kb. Trong đó có 12
dịng đã được lai với 3 DNA chỉ thị liên kết gần với locus Xa21.
Yang và ctv [115] đã phát triển thư viện BAC năng suất cao và phát triển
rộng rãi trên giống lúa indica IR64. Thư viện này có chứa 18.432 dịng với kích
thước đọan chèn trung bình 107kb. Một vài dịng BAC trùng lấp đã được xác định
thơng qua lai colony với các chỉ thị RFLP trên nhiễm sắc thể số 4.
Zhang và ctv [120] đã xây dựng 2 thư viện BAC trên lúa chứa 22.000 dịng
với kích thước đọan chèn trung bình lần lượt là 130 và 150kb.
Hiện nay, ở Việt Nam tại Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đang ứng
dụng thư viện BAC trên giống lúa IR64 trên gen rầy nâu bao gồm 18.432 dòng cho
những nghiên cứu gần đây tại cơ sở [66].
Ngòai ra, ở Trung Quốc đã xây dựng một thư viện BAC với kích thước đọan
chèn trung bình của dịng lúa hoang thơng thường, YJCWR, thu thập từ Yuanjiang,
tỉnh Yunnan. Thư viện bao gồm 52.992 dịng với kích thước đoạn chèn trung bình
50kb [110].


15

Ở Mỹ, hiện nay có 2 thư viện BAC đã được công bố rộng rãi là Oryza sativa
TP164 (54 x 384 well plates) với kích thước đọan chèn trung bình là 140kb. Thư
viện BAC trên Oryza rufipogon (56 x 384 well plates) với kích thuớc đọan chèn
trung bình 120kb [106].
1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền
1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa
1.2.1.1 Mùi thơm trên lúa do một gen lặn kiểm soát

Tác giả Berner và ctv [35] tổng kết rằng tính thơm của giống Della được qui
định bởi một gen lặn trong nhân. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và đã được
xác định qua kỹ thuật RFLP [31]. Các tác giả Ghose và Butany [50], Reddy và
Reddy [87], Sood và Siddiq [96] cũng đã đề nghị tính thơm được qui định bởi một
gen lặn nằm trong nhân tế bào chi phối.
Reddy và Reddy [87] đã báo cáo mùi thơm cũng được điều khiển bởi một
gen lặn và nhận thấy rằng có sự vắng mặt của một enzyme đồng đẳng riêng biệt
thuộc loại ester đi kèm với sự hình thành tính thơm trên lúa.
Trong quần thể phân ly F2 thơm và trong các dòng bố mẹ thơm, Huang và
Zou [53] nhận thấy các cây F1 từ tất cả các cặp lai thuận nghịch đều khơng thơm
điều này cho thấy rằng có một gen lặn điều khiển tính thơm. Sự đánh giá mùi thơm
của cây F2 cho tỉ lệ 3:1 (không thơm: thơm) sự phân ly đã khẳng định lại gen thơm
là một gen lặn trong lúa.
Hai tác giả Katare và Jambhale [60] đã nghiên cứu về sự di truyền của mùi
thơm trong 4 tổ hợp lai có liên quan trên các giống Kasturi, Ambemohar-197
(thơm) và Jaya, Mahsuri (không thơm). Trong tất cả các cặp lai cũng nhận thấy sự
di truyền được quản lý bởi một gen lặn.
Song và ctv [95] đã lai 4 giống thơm lưỡng bội với ba giống không thơm, và
hai tổ hợp lai tương tự nhau được làm tự tứ bội hóa. Tất cả các cây F1 của 4 cặp lai
thuận nghịch tự tứ bội hóa và 5 con lưỡng bội đều không thơm với tỉ lệ không thơm
và thơm ở F2 là 35:1 và 3:1. Kết quả này cho thấy rằng sự di truyền của mùi thơm
được điều khiển bởi một gen lặn.


16

Berner và Hoff [35] đã báo cáo về sự di truyền gen lặn đơn của tính thơm và
đề nghị rằng mùi thơm có thể được nhận biết trong phần hạt không chứa phôi nhũ
của hạt đơn bằng cách nhai phần này nhằm tiết kiệm phần hạt chứa phôi nhũ.
Trong nghiên cứu của Pinson [85] về sự di truyền của mùi thơm trên 6 giống

lúa nhận thấy sự mất đi mùi thơm của lá trong con lai F1 (thơm x không thơm) cho
thấy tính lặn của mùi thơm trong tất cả các giống nghiên cứu. Tỉ lệ phân ly F2 từ hai
giống, Jasmine 85 và PI457917, mỗi giống chứa một gen đơn về mùi thơm, và tính
thơm của các lá F1 từ các tổ hợp lai với nhau và với A-310, Delta-X cho thấy rằng
gen thơm trong 4 giống là có alen với nhau. Tuy nhiên, Amber và Dragon Eyeball100 mỗi giống đều chứa hai gen thơm và một gen mới sẽ thêm vào một alen cho các
gen trong A-310, Delta-X, Jasmine 85 và P457917.
Sadhukhan và ctv [90] báo cáo rằng mùi thơm trên các giống thơm
Govindobhog và Kataribhog có alen với nhau và được điều khiển bởi một gen lặn.
Dựa vào nghiên cứu của 50 dòng tái tổ hợp lai F8 (single-seed descent) phát
triển từ tổ hợp lai BG1 x Koshihikari, sự di truyền của mùi thơm và một vài tính
trạng nơng học khác đi kèm với nó đã được tìm ra bởi Kato và Itani [61]. Kiểm tra
cảm quan về sự phân ly mùi thơm hạt cho thấy rằng sự khác nhau về mùi thơm giữa
BG1 và Koshihikari được điều khiển bởi một gen lặn, có nguồn gốc từ các giống
lúa indica thơm của Trung Quốc, Chang Hsian Tao, một bố mẹ của BG1.
Berner và Hoff [35] báo cáo rằng khi các hạt độc lập từ cây F1 được nhai và
đánh giá tính thơm và khơng thơm, kết quả cho thấy hạt của cây F1 phân ly theo tỉ
lệ 3:1 (không thơm: thơm). Mùi thơm thể hiện trong lá cũng giống như trong hạt,
mùi thơm là lặn, chỉ những cây đồng hợp lặn mới thơm.
Sood và Siddiq [96] nghiên cứu di truyền tính thơm của 7 tổ hợp lai giữa
giống thơm và không thơm. Kết quả, cây F1 không thơm và sự phân ly theo tỉ lệ
3(không thơm) : 1 (thơm) ở thế hệ F2 cho thấy tính thơm được kiểm sóat bởi một
gen lặn.


17

IRRI [55] cũng nhắc lại kết quả tương tự của Benner và Hoff [36] về tổ hợp
lai giữa giống Della (thơm)/Dawn (không thơm) với tỉ lệ 3(không thơm): 1(thơm) ở
thế hệ F2.
Li và ctv [73] cũng nhận thấy rằng tính thơm của mô lá hoặc hạt cũng được

điều khiển bởi một gen lặn.
Tóm lại, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng sự di truyền mùi thơm trên
cây lúa có liên quan đến một gen lặn kiểm sốt tính trạng này [33], [35], [37], [71],
[72], [90], [91], [97].
1.2.1.2 Mùi thơm trên cây lúa do một gen trội kiểm soát
Kết quả nghiên cứu của 2 tác giả Kadam và Patankar [58] cho rằng gen thơm
là một gen trội. Bên cạnh đó, một gen trội cũng đã được báo cáo là điều khiển mùi
thơm trên lúa bởi Jodon và ctv [57a].
1.2.1.3 Mùi thơm trên cây lúa do đa gen kiểm soát
Từ kết quả phân ly với tỉ lệ 13 (không thơm) : 3 (thơm) ở F2 giữa 2 giống
thơm/không thơm, Charkravaty [41] kết luận có một gen ức chế liên quan đến tính
thơm của lúa trong số 2 gen lặn được phát hiện.
Một số nghiên cứu khác thì cho rằng tính thơm do: hai gen lặn họat động lặp
đọan (tỉ lệ 1:15 ở F2) [44]; ba gen lặn (tỉ lệ 27:37 ở F2). [58], [82], [86]
Vivekanandan và Giridharan [103] đã báo cáo có hai gen lặn điều khiển mùi
thơm phụ thuộc vào kiểu gen sử dụng trong việc lai tạo trong nghiên cứu.
Hai tác giả Tripathi và Rao [100] cho rằng mùi thơm được điều khiển bởi hai
gen trội bổ sung (SK1và SK2), các gen này độc lập với các gen điều khiển màu lá và
màu vỏ chín. Sử dụng tổ hợp lai Pankaj (lúa thường)/Kalabhat (lúa thơm), kết quả
cho tỉ lệ phân ly 9 (thơm) : 7 (không thơm) ở thế hệ F2.
Geetha [48] cũng báo cáo có hai gen lặn thay cho một gen điều khiển mùi
thơm trên lúa.
Tsuzuki và Shimokawa [101] quan sát tỉ lệ 13:3 (không thơm: thơm) trong
F2 cho thấy rằng một gen cho mùi thơm và một gen đi kèm theo có khả năng để
phát triển mùi thơm.


18

IRRI [55] đã liệt kê kết luận của nhiều tác giả cho rằng ba gen trội bổ sung

kiểm sốt tính thơm [82], [86]. Đồng ý với các quan điểm trên, Nagaraju và ctv [82]
cũng nhận thấy rằng mùi thơm được điều khiển bởi sự họat động của ba gen trội bổ
sung và đề nghị phân tích lá coi như là phương pháp đơn giản và tốt nhất để phân
tích mùi thơm.
Hai khoa học gia Ấn Độ Kadam và Patankar [58] đã nghiên cứu quần thể lai
giữa giống Kolamba (lúa thường) và giống lúa Sukhadasi (lúa thơm), sử dụng
phương pháp đun nóng gạo lứt trong ống nghiệm với nước lọc. Kết quả cho thấy
các cá thể F1 đều thơm và tỉ lệ phân ly ở thế hệ F2 là 27(thơm) : 37(khơng thơm);
giả thuyết rằng có 3 gen trội bổ sung kiểm sốt tính thơm: Oa, Ob, Oc họat động.
Reddy và Sathyanarayanaiah kết luận rằng mùi thơm được qui định bởi 3
gen lặn bổ sung [86].
Tuy nhiên, tác giả Dhulappanavar [43] lại cho rằng mùi thơm được qui định
bởi 4 gen lặn bổ sung. Dhulappanavar đã sử dụng phương pháp cảm quan để nghiên
cứu tính thơm con lai của giống T-141(khơng thơm)/ Kagisali 44-1(thơm). Theo giả
thuyết có 4 gen bổ sung từ thế hệ F2 với 81(thơm) : 175(không thơm).
Sự di truyền đa gen cũng đã được đề nghị cho mùi thơm trên lúa bởi
Richharia và ctv [88].
Siddiq [92] đã báo cáo có 3 gen lặn, 2 trong số chúng rất quan trọng cho việc
biểu hiện mùi thơm.
Khush và Dela Cruz [63] đã đề nghị rằng mùi thơm là một tính trạng số
lượng khi các con phân ly thể hiện mức độ khác nhau về mùi thơm được quan sát
trong các tổ hợp lai giữa lúa thơm và không thơm. Cũng có khả năng một gen chính
về mùi thơm và một vài gen bổ sung hay QTLs. Tuy vậy, cũng không loại trừ ảnh
hưởng của tương tác GxE trong sự thể hiện mùi thơm.
Bên cạnh đó, hai tác giả Kader và Delseny [59] cũng kết luận mùi thơm là
QTLs, mùi thơm được điều khiển bởi một gen chính trên nhiễm sắc thể số 8 và hai
gen phụ trên nhiễm sắc thể số 4 và số 12.


19

Tác giả Pinson [85] cho rằng một trong số những lý do dẫn đến sự nhầm lẫn
về gen thơm đó là do sự phân tích các giống lúa khác nhau, tập trung vào 6 giống để
đánh giá kiểu gen thơm có liên quan và đã nhận thấy rằng Jasmine 85, A-310,
Della-X và PI45917 mỗi giống đều chứa một gen đơn về mùi thơm và có alen với
nhau. Giống Amber và Dragon Eyeball 100 mỗi giống đều chứa 2 gen thơm, một
gen mới thêm vào một alen cho gen trong A-310, Della-X, Jasmine 85 và PI457917.
Tóm lại, đã có nhiều quan điểm khác nhau về sự di truyền gen qui định mùi
thơm trên cây lúa điều này có thể do sự phân tích các giống lúa khác nhau hay nền
tảng về di truyền khác nhau của các vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu [59], vì
thế phải có những khu vực xác định cho việc canh tác các giống lúa có mùi thơm
nơi các tính trạng số lượng của chúng được thể hiện một cách tốt nhất.
Ở thời điểm hiện tại, mặt dù các kiểm tra cũng khá nhạy đối với việc có hay
khơng có mùi thơm, nhưng nó vẫn không đủ phân biệt được các mức độ khác nhau
của mùi thơm. Khơng có phương pháp về số lượng nào để nhận biết mùi thơm. Có
lẽ là do sự ảnh hưởng của mơi trường (tính thơm có hệ số di truyền rất thấp [18])
trên sự biểu hiện mùi thơm và sự thiếu phương pháp đánh giá về số lượng cho các
mức độ khác nhau của mùi thơm.
1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR trong chọn
lọc gen mùi thơm
1.2.2.1 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen
mùi thơm
Bản đồ fine mapping về gen mùi thơm trên nhiễm sắc thể số 8 được tác giả
Nguyễn Thị Lang và ctv [3] thiết kế thông qua ứng dụng SSR (microsatellite) với
khoảng cách di truyền giữa gen fgr với chỉ thị RM223 là 1,8cM và với chỉ thị
RG28FL-RB (được thiết kế lại từ trình tự của chỉ thị RG28) là 1,6cM, được xem là
có liên kết chặt với gen fgr. Hai chỉ thị RG28FL-RB và RM223 có thể sử dụng
trong chương trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử [67].
RG28FL: 5’-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3’
RG28RB: 5’-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3’

20

(Nguồn: Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu [65])
RM223F: 5’-GAGTGAGCTTGGGCTGAAAC-3’
RM223R: 5’-GAAGGCAAGTCTTGGCACTG-3’
(Nguồn: Nguyễn Thị Lang và Nguyễn Thúy Liễu [17])
Bên cạnh đó, chỉ thị RM223 có sự liên kết với gen chống chịu mặn với
khoảng cách di truyền là 6,3cM trên nhiễm sắc thể số 8 ở giai đoạn mạ [11].
Đề tài ứng dụng đánh dấu vi vệ tinh trong chọn giống lúa (Oryza sativa L.)
có mùi thơm đã được tác giả Bùi Thị Dương Khuyều thực hiện vào năm 2004 [7]
trên bộ giống lúa mùa địa phương (193 giống) với kết quả có 4 alen liên kết với chỉ
thị RM223.
Tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [12]; [13] thực hiện đề tài nghiên cứu về
mùi thơm ứng dụng dấu chuẩn phân tử thông qua các kỹ thuật SSR và STS thử
nghiệm trên nhiều chỉ thị khác nhau. Kết quả chỉ có 12 chỉ thị SSR nằm trên nhiễm
sắc thể số 8 là RM134, RM118, OSR34, RM38, RM25, RM310, RM344, RM42,
RM223, RM284, RM308 có biểu hiện đa hình trong cặp lai OM1490/Khao Dawk
Mali 105. Đối với chỉ thị STS, đa hình trong cặp lai OM1490/Khao Dawk Mali 105
trên chỉ thị RG28 biểu thị khá rõ.
Theo tác giả Nguyễn Thị Lang [9] đánh giá mùi thơm thông qua kiểu gen,
sản phẩm PCR trên gel agarose 3% với chỉ thị RM223 cho thấy có sự đa hình trên
các giống: Thơm Sớm, Nếp Sương Găng, Nhỏ Thơm, Nếp Sáp, Trắng Hịa Bình,
Khao Dawk Mali 105, Nàng Thơm Chợ Đào, Nàng Thơm Muộn, Nàng Thơm
Thanh Trà, Bơng Cu Tím, Cổ Na, Nàng Hương [15]. Các giống này là những giống
đặc sản địa phương có chứa gen thơm được phát hiện thông qua sử dụng chỉ thị
phân tử RM223. Dùng phần mềm PopGen phân nhóm và phân tích khoảng cách di
truyền bằng chỉ thị phân tử trên cơ sở biểu hiện đa hình, kết hợp với phần mềm
NTSYS phân tích nhanh giản đồ phân nhóm di truyền dựa trên xếp nhóm bằng

phương pháp SAHN, sắp xếp các giống thành những cụm nhóm khác nhau trên cơ
sở mức độ di truyền. NTSYS phân nhóm 46 mẫu lúa mùa địa phương tại 8 loci khác
nhau. Từ kết quả phân tích nhóm di truyền về mùi thơm cho thấy giống Hoa Lài


21

(thơm nhẹ) và Bơng Hường (khơng thơm) có mức độ dung hợp nhỏ hơn 65%. Hai
giống được sử dụng làm bố mẹ này có khoảng cách di truyền liên kết với tính trạng
mùi thơm trên 35% [14].
Đối với lúa mùa địa phương, tập trung nghiên cứu các mẫu lúa thu thập khác
nhau từ giống lúa Nàng Thơm Chợ Đào. Do vậy nhiều mẫu trong cùng một giống
được chọn lựa và đánh giá về tính trạng mùi thơm. Tuy nhiên, về mùi thơm trên các
dòng này rất biến động [17].
Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa Tám bằng chỉ thị microsatellite đã được tác
giả Trần Danh Sửu và ctv [19] thực hiện. Hai mươi hai (22) giống lúa thơm thuộc
nhóm lúa Tám đã được đánh giá thông qua việc sử dụng 48 chỉ thị SSR trên 12
nhiễm sắc thể của bộ gen cây lúa. Kết quả cho thấy rằng số lượng alen trung bình
cho mỗi chỉ thị SSR là 3,37 alen. Các alen dị hợp tử được coi như có tần suất cao
trong lúa thơm. Tất cả 22 giống lúa thơm trong nghiên cứu này thuộc nhóm
japonica. Hai giống có tên gọi là Tám Nghĩa Lạc (acc No.5122) và Tám Ấp Bẹ (acc
No.5126) được coi như là cùng một giống nhưng với tên gọi khác nhau.
Đề tài nghiên cứu cấp bộ về chọn tạo giống lúa năng suất cao, phẩm chất tốt
phục vụ xuất khẩu đã được tác giả Bùi Chí Bửu [1] thực hiện và báo cáo. Trong đó
đề tài nhánh là cơng trình nghiên cứu chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt ở
ĐBSCL đã được tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [16] thực hiện thông qua ứng dụng
chỉ thị RG28FL-RB để phát hiện cá thể có gen fgr đối với giống Nàng Nhen Thơm
của tỉnh An Giang. Ứng dụng chỉ thị này để đánh giá 1000 cá thể giống lúa Nàng
Nhen Thơm cho thấy mức độ biến động của những cá thể chọn lọc rất lớn. Nhóm 1
(khơng thơm) chiếm 60%, nhóm 2 (thơm nhẹ) chiếm 37%, nhóm 3 (thơm trung

bình) chiếm 3% và nhóm 4 (rất thơm) chiếm 0,001%.
Đánh giá về kiểu hình và kiểu gen cho mùi thơm trên lúa đã được hai tác giả
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu [4] thực hiện và báo cáo trong đề tài chọn giống
phẩm chất cho ĐBSCL. Đối với lúa cao sản, phân tích trên 46 giống lúa cải tiến,
ngắn ngày có năng suất cao. Dùng IR64 làm giống đối chứng không thơm và giống
thơm là Jasmine 85. Phân tích mùi thơm trên lá, thân, trên gạo trắng và gạo lức. Kết