Nghiên cứu đa hình di truyền gen cox 1 và cox 2 trên adn ty thể liên quan đến bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO TỔNG KẾT
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN
CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài:

Nghiên cứu đa hình di truyền gen COX-1 và COX-2
trên ADN ty thể liên quan đến bệnh nhân ung thư
đại trực tràng ở Việt Nam

Mã số đề tài:

QG.15.05

Chủ nhiệm đề tài:

ThS. Phạm Thị Bích

Hà Nội, 2017


PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình di truyền gen COX-1 và COX-2 trên ADN ty thể liên
quan đến bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Việt Nam
1.2. Mã số: QG.15.05
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT Chức danh, học vị, họ và tên
1.

ThS. Phạm Thị Bích

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

Khoa Sinh học, Trường

Chủ nhiệm đề tài

ĐHKHTN, ĐHQGHN
2. ThS. Lê Lan Phương

Khoa Sinh học, Trường
ĐHKHTN, ĐHQGHN

Thư ký

3. TS. Đỗ Minh Hà

Khoa Sinh học, Trường
ĐHKHTN, ĐHQGHN

Thành viên

4. ThS. Nguyễn Thị Tú Linh

Khoa Sinh học, Trường
ĐHKHTN, ĐHQGHN

Thành viên

Bệnh viện K, Hà Nội

Thành viên

5. PGS.TS. Tạ Văn Tờ

1.4. Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Điện thoại: 04 3 8584515

Fax: 04 38583061

E-mail:
Website: www.hus.vnu.edu.vn
Địa chỉ: 334, Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS. Nguyễn Văn Nội
Số tài khoản: 8123.1, Mã đơn vị quan hệ ngân sách: 1059420
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Đống Đa
1.5. Thời gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 02 năm 2017
1.5.2. Gia hạn (nếu có): đến tháng… năm…
1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 02 năm 2017
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 160 triệu đồng.
1


PHẦN II. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Đặt vấn đề
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư phổ biến ở người. Trên
thế giới, trong tổng số các loại ung thư, UTĐTT xếp thứ ba sau ung thư phổi và ung thư tiền
liệt tuyến ở nam giới, đứng thứ hai sau ung thư vú ở nữ giới. Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ
năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày, vú. Tỷ lệ mắc UTĐTT chiếm khoảng 8,7% tổng số bệnh
nhân ung thư (globocan, 2012). UTĐTT là loại ung thư có tiên lượng tốt nếu bệnh nhân
được chẩn đốn và điều trị khi cịn ở giai đoạn sớm. Tuy nhiên, tỷ lệ tử vong do UTĐTT
vẫn ở mức cao, điều đó cho thấy thực trạng chẩn đốn bệnh ở giai đoạn sớm vẫn cịn hạn
chế đặc biệt ở các nước chậm phát triển (globocan, 2012).
Có nhiều yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc UTĐTT như chế độ ăn uống, tuổi tác,
lối sống, nghề nghiệp và hội chứng đa polyp theo gia đình. Đặc biệt, các nghiên gần đây đã
chỉ ra rằng biến đổi trên ADN ty thể là một yếu tố góp phần làm tăng nguy cơ mắc bệnh.
Kết quả nghiên cứu về biến đổi trên ADN ty thể cho thấy đây là hướng nghiên cứu tiềm
năng để tìm các chỉ thị giúp hỗ trợ chẩn đoán ung thư (Czarnecka và cs, 2010).
Gen cytochrome c oxidase I (MT-CO1 hay COX-1) và gen cytochrome c oxidase II (MTCO2 hay COX-2) được định vị trên sợi nặng của ADN ty thể, từ vị trí nu 5904 đến 7455 (gen
COX-1), từ vị trí nu 7586 đến 8269 (gen COX-2). Gen COX-1 và COX-2 mã hóa cho sản phẩm
tương ứng là cytocrome c oxidase I và cytocrome c oxidase II, là hai enzyme quan trọng thuộc
phức hệ IV của chuỗi hô hấp ty thể ( Sự thay đổi
trong cấu trúc và chức năng của các protein thuộc phức hệ này có thể tác động tới quá trình sinh
năng lượng của tế bào gây ảnh hưởng đến chức năng của cơ thể. Một số đột biến, đa hình trên
gen COX-1, COX-2 ty thể đã được xác định có liên quan với một số bệnh ở người bao gồm cả
bệnh ung thư. Trên bệnh UTĐTT, Chihara và cs đã sàng lọc được biến đổi G6709A thuộc gen
COX-1. Biến đổi G6709A làm thay đổi axit amin Glycine thành Glutamic tại vị trí 269. Biến
đổi này có thể làm thay đổi hình dạng của protein CO1 đặc biệt là thay đổi cấu trúc xoắn α thứ
cấp vì vậy có thể ảnh hưởng đến chức năng của phân tử protein này. Ngồi ra, kết quả giải trình
tự cịn chỉ ra một số biến đổi khác trên gen COX-1 như biến đổi G5973A làm thay đổi axit amin
Alanine thành Threonine tại vị trí 24 trong chuỗi axit amin, biến đổi tại vị trí 6146 khơng làm
thay đổi axit amin (Chihara và cs, 2011). Cũng trên đối tượng bệnh UTĐTT, Greaves và cs đã
xác định được đột biến A6277G thuộc gen COX-1 dẫn đến sự thay đổi axit amin Glycine thành
Alanine tại vị trí 125 (Greaves và cs, 2006).

2


Trên gen COX-2 ty thể, một số đột biến cũng đã được xác định trên nhóm bệnh nhân hội
chứng MAP (MUTYH associated polyposis) là hội chứng có nguy cơ cao dẫn đến UTĐTT.
Đặc biệt, đột biến G7763A xuất hiện với tần suất cao và có liên quan đến đột biến gen KRAS
là gen trên nhân đã được xác định có liên quan đến hội chứng MAP (Venesio và cs, 2013).
Cũng tương tự trên nhóm bệnh nhân MAP, bệnh nhân FAP (hội chứng đa polyp theo gia
đình), Errichiello và cs đã chỉ ra rằng đột biến ADN ty thể xảy ra chủ yếu ở bệnh nhân MAP
(p=0.0055), ngoài ra phát hiện 17 đột biến thường phân bố chủ yếu ở gen COX-2 (p<0.0001)
và thường ở dạng đột biến thay đổi nucleotide từ dạng G thành A (Errichiello và cs, 2015).
Ngoài ra, các biến đổi trên gen COX-1, COX-2 còn được xác định trên bệnh ung thư vú
(Ghatak và cs, 2014; Tan và cs, 2002), ung thư tuyến tiền liệt (Arnold và cs, 2013; Anna và
cs, 2009). Ở Việt Nam, cho đến nay cũng có những cơng bố liên quan đến đột biến ADN
ty thể trên một số bệnh như bệnh nhân nghi hội chứng cơ não (Huệ và cs, 2012), h ội
chứng MELAS (Huệ và cs, 2012) bệnh ung thư vú (Anh và cs, 2015; Trang và cs, 2015).
Trên đối tượng bệnh UTĐTT, nghiên cứu về đột biến ADN ty thể và mối liên quan giữa
đột biến ADN ty thể với bệnh UTĐTT vẫn còn là một hướng nghiên cứu mới, có triển
vọng để tìm ra các chỉ thị hỗ trợ chẩn đốn hoặc giải thích ngun nhân gây bệnh. Vì vậy,
từ những lý do trên, trong phạm vi của đề tài này chúng tôi tiến hành sàng lọc các biến đổi
(đột biến, đa hình) của gen COX-1, COX-2 ty thể và đánh giá mối liên quan giữa một số
biến đổi trên các gen COX-1, COX-2 xác định được với các đặc điểm bệnh học của bệnh
UTĐTT. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 2 năm 2015 đến tháng 2 năm 2017 tại Phịng
thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ
Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN.
2. Mục tiêu
1. Xác định được đa hình di truyền của gen COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể ở một
nhóm mẫu quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng người Việt Nam.
2. Xác định được mối liên quan giữa một số dạng đa hình di truyền của các gen COX-1
và COX-2 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu.

3


3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1 . Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu mô u, mô lân cận u (LCU) và một số mẫu máu được
cung cấp k m theo mẫu mô của các bệnh nhân bị bệnh UTĐTT. Mẫu ung thư được cung cấp
từ Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Hà Nội. Mẫu máu của người kh e mạnh bình thường
(máu ĐC) dùng làm đối chứng. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu ung thư là những mẫu được lấy từ
các bệnh nhân có kết quả giải phẫu bệnh sau phẫu thuật là ung thư biểu mô tuyến, dạng ung
thư nguyên phát, v ng không bị hoại tử (được xác định tại Khoa Giải phẫu bệnh của Bệnh
viện). Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân UTĐTT do di căn từ các mô, cơ quan khác tới. Mơ u lấy
tại vị trí trung tâm của khối u, mơ LCU lấy tai vị trí cách khối u từ 5-10cm.
Các hóa chất chính được sử d ng trong nghiên cứu (Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Các h a chất chính được sử dụng trong nghiên cứu
STT Hóa chất
Kit QIAamp DNA Mini Kit
1
GeneJET Whole Blood Genomic DNA
Purification Mini Kit
Agarose, APS, Acrylamide, Bis2
Acrylamide
Các cặp mồi d ng cho phân tích PCR3
RFLP,
Hot Start PCR Master Mix 2x
4
5
6

Các enzyme cắt giới hạn
Kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR
pGEM T easy, T4 DNA ligase, pJET1.2,
chủng vi khuẩn E.coli DH5α
GeneRuler 100 bp DNA Ladder

Hãng cung cấp
QIAGEN (Đức)
Thermo Scientific (Mỹ)
Invitrogen (Mỹ),
Pharmacia (Th y Điển)
IDT, Invitrogen (Mỹ)
Thermo Scientific, Mỹ
Fermentas / New
England Biolabs (NEB)

Mục đích
Tách chiết
ADN tổng số
Điện di
PCR
PCR-RFLP

Promega, Fermentas,
Novagen

Nhân dòng

Thermo Scientific (Mỹ)

ADN chuẩn

3.2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu
1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư và mẫu máu bằng kit tách
chiết thương phẩm: Kit QIAamp DNA Mini Kit, GeneJET Whole Blood Genomic
DNA Purification Mini Kit, các bước tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2. Phương pháp điện di trên gel agarose, polyacrylamide để kiểm tra độ sạch của sản
phẩm tách chiết, sự có mặt của sản phẩm PCR, sản phẩm cắt bằng enzyme.
3. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu cho PCR: d ng phần mềm thiết kế mồi Primer
Premier 3, primer Blast trên NCBI để thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng
PCR để khuếch đại toàn bộ gen COX-1 và COX-2 thu sản phẩm để xác định trình tự
và hai cặp mồi d ng cho PCR-RFLP.
4


4. Phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, so sánh kết quả giải trình tự với
trình tự ADN ty thể chuẩn được công bố trên NCBI mã số (NC_012920.1) để xác
định các biến đổi trên gen COX-1, COX-2.
5. Phương pháp PCR kết hợp với cắt ADN bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP). Kỹ
thuật này d ng để khuếch đại các đoạn ADN đồng thời d ng enzyme cắt để nhận
biết các biến đổi. Hai enzyme được sử d ng để xác định biến đổi tại vị trí 6340 và
7853 có trình tự nhận biết và sản phẩm sau khi cắt được trình bày trong bảng 3.2.
6. Nhân dịng trực tiếp đoạn gen chứa vị trí biến đổi vào vector pJET 1.2 nhằm: Phân
lập một đoạn gen (ADN) đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử ADN ban đầu được
tách chiết từ các mẫu sinh học.
7. Phân tích số liệu bằng các phương pháp thống kê. Sử d ng kiểm định chính xác của
Fisher và kiểm định Khi bình phương (Chi-square test – χ2) với mức ý nghĩa α =
0,05 để phân tích mối liên quan giữa biến đổi xác định được trên 2 gen COX-1,
COX-2 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT. Các giá trị có ý
nghĩa thống kê khi P < 0,05 theo 2 phía.

Bảng 3.2. Các enzyme giới hạn d ng trong nghiên cứu
Tên
enzyme

Trình tự nh n biết

Vị trí đích
(gen)

Sản phẩm c t

HincII

5’-GTY↓RAC-3’
R=G; Y=T, C

G7853A
(COX-2)



257 bp và 215 bp



113 bp,
144 bp và
215 bp

BccI

5’CCATC(N4) ↓3'

C6340T
(COX-1)



161 bp



128 bp và
33 bp

Biến đổi

Không biến
đổi

4. Tổng hợp kết quả nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đạt được những kết quả ph hợp với m c tiêu
nghiên cứu đã đề ra.
4.1. Kết quả thu th p và tách chiết ADN tổng số từ các m u nghiên cứu
Chúng tôi đã thu thập được 86 cặp mẫu mô ung thư (86 mẫu mô u, 86 mẫu mô LCU) của
86 bệnh nhân UTĐTT. 67 mẫu máu của của người kh e mạnh (máu ĐC). Danh sách bệnh
nhân UTĐTT kèm theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng chi tiết theo Ph l c nghiên cứu 1.
Một số đặc điểm của bệnh nhân UTĐTT được thống kê theo số lượng (n) gồm: nam giới
(n=41), nữ giới (n=45), với độ tuổi trung bình 58,71 13 trong đó trên 50 tuổi (n=66), dưới
50 tuổi (n=18). Theo vị trí ung thư gồm: ung thư trực tràng (n=41), ung thư đại tràng và đại

trực tràng (n=45). Theo mức độ xâm lấn khối u (giai đoạn T) gồm: giai đoạn T1 (n=9), giai
5


đoạn T2 (n=35, giai đoạn T3 và T4 (n= 40). Theo mức độ di căn hạch (giai đoạn N) gồm
chưa có sự di căn hạch (giai đoạn No) (n=51), có sự di căn hạch (giai đoạn N1, N2) (n=32).
Theo kích thước khối u: có kích thước u nh hơn 3cm (n=21), kích thước u từ 3 đến 3,5 cm
(n=16), kích thước u lớn hơn 3,5 cm (n=42). Theo mức độ biệt hóa: mức độ biệt hóa cao
(n=10), mức độ biệt hóa vừa (n=39), mức độ biệt hóa k m (n=6). Theo giai đoạn bệnh (giai
đoạnTNM) gồm có: giai đoạn I (n=30), giai đoạn II (n=21), giai đoạn III và IV (n=33).
ADN tổng số của các mẫu nghiên cứu được tách chiết bằng kit tách chiết của hãng
Qiagen. Kết quả tách chiết ADN của một số mẫu nghiên cứu được minh họa trong Hình 4.1.

Hình 4.1: Ảnh điện di sản phẩm ADN tổng số từ một số m u nghiên cứu
Giếng 1,2: từ mô u, giếng 3, 4 từ mô U
giếng 5, 6: từ m u Đ , giếng 7: m u

2

n n n UTĐTT,
n n n UTĐTT

Hình 4.1 cho thấy sản phẩm ADN tổng số thu được từ các mẫu nghiên cứu đều có băng
ADN sáng, khá r n t. ADN tổng số sau khi tách chiết được đo mật độ hấp th ánh sáng tử
ngoại và xác định hàm lượng để ph c v cho các nghiên cứu tiếp sau.
4.2. Quy trình kỹ thu t phân tích đa hình di truyền của gen COX-1 và COX-2 thuộc
ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng
Chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu đã đăng ký theo thuyết minh đề tài để
xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền của gen COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể
ở bệnh nhân UTĐTT và đã thu được những kết quả tương ứng sau:

4.2.1. Kết quả thiết kế 2 cặp mồi, điều kiện phản ứng PCR nhân để nhân bản toàn bộ gen
COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể ở các mẫu nghiên cứu
Sử d ng chương trình Primer-BLAST thuộc NCBI (Mỹ), primer 3, trình tự ADN ty thể
chuẩn (NC_012920.1) để thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR nhân bản toàn bộ gen
COX-1 và COX-2 để sàng lọc các biến đổi thuộc gen COX-1, COX-2 ty thể. Chúng tôi đã
thiết kế được 2 cặp mồi COX-1.2, COX-2.2 với trình tự và vị trí bắt cặp được trình bày
trong Bảng 4.1
6


Bảng 4.1. Trình tự và vị trí b t cặp của hai cặp m i COX-1.2 và COX-2.2
Tên m i

Gen
đích

COX-1.2

COX-1

COX-2.2

COX-2

Kích thước sản
phẩm PCR
(bp), (vị trí)
1745
(5851-7595)

Trình tự m i xi
(5’-3’)

Trình tự m i ngược
(5’-3’)

CTT TAG ATT TAC GT
CCA ATG CTT

CATGTGCCATTA
AGATATATA GGAT

1060
(7375-84340)

ACC TGG AGT GAC
TAT ATG GAT

GAT GAG GAA TAG TGT
AAG GAG

Bằng thực nghiệm, chúng tơi đã tiến hành tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR cho
từng cặp mồi. Kết quả đã lựa chọn được điều kiện phù hợp để tiến hành PCR nhân bản toàn
bộ gen COX-1 và COX-2 như sau:
Đối với gen COX-1: Thành phần PCR bao gồm: 6,25µl Hot Start 2X Master Mix;
200nM mồi xi và mồi ngược; 2 ng l ADN khn, sau đó bổ sung H2O đến 12,5 l. Chu
trình nhiệt gồm các bước: biến tính ở 940C trong 30 giây, khuếch đại 35 chu kỳ (940C: 30
giây, 600C: 30 giây, 680C: 130 giây), 680C: 5 phút. Đối với gen COX-2 thành phần PCR
tương tự như đối với gen COX-1, chu trình nhiệt chỉ thay nhiệt độ bắt mồi là 520C và k o
dài chuỗi trong 60 giây. Kết quả PCR đối với hai cặp mồi, thành phần PCR, chu trình nhiệt

sau khi tối ưu được minh họa ở Hình 4.2

Hình 4.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp m i COX-1.2(A); COX-2.2 (B)
Giếng M: T ng uẩn 1k , Giếng 1-6
n
v : Sản p ẩm P R tương ứng
6 n n n trong ng i n ứu. Giếng (-): Đối ứng m

Hình 4.2 cho thấy sản phẩm PCR cho băng r n t, khơng xuất hiện băng ph , băng lạ.
Kích thước băng khoảng 1060 bp và 1745 bp đúng theo tính tốn lý thuyết. Giếng đối chứng
âm không lên băng. Như vậy, với cặp mồi COX-1.2, COX-2.2 chúng tôi đã khuếch đại
thành cơng đoạn ADN chứa tồn bộ gen COX-1, COX-2 ty thể ph c v cho việc xác định
trình tự gen.
7


4.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân lên từ 2 gen
COX-1 và COX-2
Toàn bộ gen COX-1, COX-2 ty thể được nhân lên với cặp mồi COX-1.2 và COX-2.2
bằng phản ứng PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp. Kết quả giải
trình tự được minh họa trong Hình 4.3 và 4.4.

Hình 4.3. Một số vị trí biến đổi trên gen COX-1 ty thể
, : iến đổi T6253 , 6340T/ (dạng k ông đồng n ất) - mẫu #17401,
: iến đổi 6455T- mẫu #17180; D: iến đổi 7299G - mẫu #3753

Hình 4.4. Một số vị trí biến đổi trên gen COX-2 ty thể
, , , D, E:
vị trí iến đổi nu leotide dẫn đến t y đổi xit min
mẫu #4120, #3089, #19561, # 37158, #11777, tương ứng.

F: iến đổi nu leotide k ông l m t y đổi xit min mẫu #42440

Kết quả giải trình tự Hình 4.3 và 4.4 cho thấy các đỉnh r ràng, khơng có đỉnh ph ,
không bị nhiễu như vậy việc tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự đã đạt yêu cầu. Đối
với gen COX-1, trong 25 mẫu được giải trình tự thành công, chúng tôi đã xác định được 17
biến đổi, trong đó có 4 biến đổi làm thay đổi axit amin (C6340T; T6253T; A7299G;
C6455T) (Hình 4.3) và 13 biến đổi ở dạng đồng nghĩa (Bảng 4.2). Một điều đặc biệt là trong
số các biến đổi đồng nghĩa, biến đổi C7028T là biến đổi xuất hiện với tần suất cao (24 25
mẫu). Kết quả Bảng 4.2 cho thấy phần lớn các biến đổi xác định được đều ở dạng đồng
nghĩa (13 17 trường hợp). Các dạng biến đổi hay gặp là dạng biến đổi C>T (7 17 trường
hợp), tiếp đó là A>G (5 17 trường hợp).
8


Bảng 4.2. Các vị trí biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở 25 m u UTĐTT
STT

Vị trí
biến đổi

Loại
biến đổi

Thay đổi
axit amin

1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

6253
6338
6340
6392
6445
6455
6515
6752
6800
6884
6932
6960
6962
7028
7196
7250

7299

T>C
A>G
C>T
T>C
C>T
C>T
T>C
A>G
C>T
C>T
A>G
C>T
G>A
C>T
C>A
A>G
A>G

M>T
L>L
T >I
N>N
F>F
T>M
A>A
L>L
V>V
L>L

G>G
L>L
L>L
A>A
L>L
T>T
M>V

Số lượng
Cơng bố
Tần suất
m u có
trên
(%)
biến đổi
MITOMAP
1
4
+
1
4
+
1
4
+
3
12
+
1
4

+
2
8
+
1
4
+
1
4
+
3
12
+
4
16
+
1
4
+
1
4
+
3
12
+
24
96
+
2
8

+
1
4
+
1
4
+

Đối với gen COX-2 ty thể, trong 31 mẫu được giải trình tự thành công, chúng tôi đã xác
định được 13 biến đổi, trong đó có 5 biến đổi làm thay đổi axit amin (T7674C, T7679C,
G7775A, G7853A và C8130T) và 8 biến đổi ở dạng đồng nghĩa (Hình 4.4, Bảng 4.3).
Bảng 4.3. Thống kê các vị trí biến đổi trên gen COX-2 ty thể ở 31 m u UTĐTT
Số lượng
Cơng bố
Vị trí
Loại
Thay đổi
Tần suất
STT
m u có
trên
biến đổi
biến đổi
axit amin
(%)
biến đổi
MITOMAP
1
7674
T>C

1
3,1
+
I>T
2
7679
T>C
1
3,1
+
F>L
3
7684
T>C
L>L
3
9,4
+
4
7711
T>C
L>L
1
3,1
+
5
7759
T>C
A>A
1

3,1
+
6
7775
G>A
1
3,1
+
V>I
7
7789
G>A
L>L
2
6,3
+
8
7853
G>A
4
12,5
+
V>I
9
7861
T>C
D>D
1
3,1
+

10
8080
C>A
V>V
1
3,1
+
11
8130
C>T
1
3,1
+
T>I
12
8167
T>C
G>G
2
6,3
+
13
8200
T>C
S>S
1
3,1
+
Ghi chú: +: Đã có cơng bố

Kết quả Bảng 4.3 cho thấy, dạng biến đổi T>C chiếm tỷ lệ cao nhất (8 13 trường
hợp), tiếp theo là dạng biến đổi G>A (3 13 trường hợp).
9


4.2.3. Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T và G78543A trên gen COX-1 và COX-2 bằng
phương pháp PCR-RFLP
Biến đổi C6340T thuộc gen COX-1, G7853A thuộc gen COX-2 là biến đổi làm thay đổi
axit amin và được xác định ở một số loại ung thư. Trong nghiên cứu này, hai biến đổi trên
được xác định ở dạng không đồng nhất và có tần suất cao. Vì vậy, chúng tơi đã tiến hành
sàng lọc biến đổi C6340T, G7853A bằng phương pháp PCR-RFLP trên những bệnh nhân
khác để xác định tần suất của biến đổi và đánh giá mối liên quan với bệnh UTĐTT. Chúng
tôi đã thiết kế được hai cặp mồi để nhân bản đoạn gen chứa vị trí 6340 trên gen COX-1 có
kích thước sản phẩm PCR là 161bp (cặp mồi COX-1.1 (6221F; 6381R) và đọan gen chứa vị
trí 7853 trên gen COX-2 có kích thước sản phẩm PCR là 472 bp (cặp mồi COX-2.2). Kết
quả PCR-RFLP được minh họa trên Hình 4.5 và 4.6.

A

B

Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR được c t bằng enzyme BccI trên mô u,
LCU, m u máu của bệnh nhân UTĐTT (gel polyacrylamide 10%)
Hình A: Giếng M: T ng DN uẩn 50 p. Giếng (+): Đối ứng dương l sản
p ẩm ắt enzyme (mẫu ó iến đổi tại vị trí 6340 dạng k ơng đồng n ất đượ
k ẳng địn ằng giải tr n tự); ặp giếng (1, 2); (3, 4); (5, 6) l sản p ẩm P R v
sản p ẩm ắt ằng enzyme tương ứng
mô LCU (dạng k ông đồng n ất), mô u
(dạng iến đổi đồng n ất) mẫu m u (dạng k ông iến đổi)
n n n #16689,

giếng 7 sản p ẩm ắt
mô u n n n #17401 dạng k ông đồng n ất, giếng (-)
đối ứng m sản p ẩm P R đượ t y ằng H2O trong p ản ứng ắt. Hình B: Kết
quả đi n di một số mẫu iến đổi dạng k ông đồng n ất: Giếng 1, 4, 7 l sản p ẩm
P R,
giếng (2,3); (5,6); (8,9) l sản p ẩm ắt
mẫu #17401 U
(l n ận u), #17401U (mô U), #16689 U tương ứng

Kết quả điện di ở Hình 4.5A cho thấy: sản phẩm PCR (giếng 1, 3, 5) có kích tương ứng
161 bp, các băng r , khơng có băng ph , chứng t cặp mồi COX-1.1được thiết kế là đặc
hiệu. Sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân #16689 (giếng 2, 4, 6) cho thấy ở mô LCU xuất
hiện biến đổi ở dạng không đồng nhất, ở mô u biến đổi đồng nhất, ở mẫu máu không xuất
hiện biến đổi. Như vậy, biến đổi C6340T xuất hiện ở mô u, LCU nhưng không xuất hiện
trên máu ở c ng một bệnh nhân. Trên cơ sở phân tích này chứng t biến đổi C6340T là dạng
10


đột biến sơma. Kết quả điện di Hình 4.5B cho thấy một số mẫu biến đổi ở dạng không đồng
nhất. Tuy nhiên, mức độ biến đổi trên mô u và mơ lân cận u có sự khác biệt lớn. Ở bệnh
nhân 17401 mô lân cận u, trên bản gel điện di băng 161bp đại diện cho những bản sao mang
đột biến mờ hơn so với băng 128bp đại diện cho bản sao không mang đột biến (giếng 2, 3)
trên mô u kết quả lại ngược lại (giếng 5, 6) Hình 4.5B.
Biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 trong các m u nghiên cứu
Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc biến đổi G7853A bằng phương pháp PCR-RFLP. Kết
quả PCR-RFLP được minh họa trên Hình 4.6.

Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR được c t bằng enzyme HincII
trên mô u, LCU, m u máu của bệnh nhân UTĐTT (gel agarose 2,5%)
(U: mô u, U: mô l n ận u, M: mẫu m u, N: n n n)

Giếng M: T ng DN uẩn 50 p. Giếng 1: Đối ứng dương- sản p ẩm ắt enzyme (mẫu
ó iến đổi G7853 đượ k ẳng địn ằng giải tr n tự); giếng: 2,4,6,8,10,12: Sản p ẩm P R;
giếng: 3,5,7,9,11,13: Sản p ẩm ắt ằng enzyme HincII; giếng (-): đối ứng m.

Kết quả điện di ở Hình 4.6 cho thấy: sản phẩm PCR (giếng 2, 4, 6, 8, 10, 12) có kích
tương ứng 472 bp, các băng r , khơng có băng ph , chứng t cặp mồi COX-2.1 được thiết
kế là đặc hiệu. Sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân #17176 (giếng 3, 5, 7) cho thấy ở mô u
và LCU xuất hiện biến đổi (sản phẩm cắt có 2 băng: 257, 215 bp - giếng 3, 5), trong khi đó
ở mẫu máu khơng có biến đổi (xuất hiện 3 băng: 113, 144, 215 bp - giếng 7). Ở bệnh nhân
#17180 (giếng 9, 11, 13) xuất hiện biến đổi trên cả mô u, LCU, mẫu máu (sản phẩm cắt đều
cho 2 băng 257 và 215 bp). Như vậy, kết quả PCR-RFLP cho thấy biến đổi G7853A có sự
khác biệt giữa mẫu mơ và mẫu máu trên c ng một bệnh nhân 17176, do đó có thể cho rằng
biến đổi G7853A là dạng đột biến sôma. Mặt khác, kết quả cắt enzyme cũng cho thấy ở tất
cả các mẫu chỉ thu được 2 băng (257 và 215 bp với trường hợp có biến đổi) hoặc 3 băng
(113, 144 và 215 bp với trường hợp khơng có biến đổi), chứng t biến đổi G7853A trên gen
COX-2 ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy).
11


4.2.4. Nhân dịng và ác đ nh trình tự nucleotide c

các đoạn gen m ng đột biến và

dạng bình thường tương ứng
Tiếp nối kết quả phân tích các đột biến C6340T, G7853A bằng PCR-RFLP, các đoạn
gen mang đột biến và dạng bình thường được nhân dịng vào vector pJET 1.2 và biến nạp
vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α. Plasmid vector tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm được
tách, tinh sạch, giải trình tự nucleotide và so sánh với trình tự gen tương ứng đã được công
bố trong NCBI (NC_012920.1). Với mỗi vị trí, chúng tơi lựa chọn 2 mẫu dạng có biến đổi
và dạng khơng biến đổi để tiến hành nhân dòng. Kết quả nhân dòng được minh họa trong

Hình 4.7 và 4.8.

Hình 4.7. Ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid mang đoạn chèn chứa vị trí 6340 dạng đột biến (A)
và dạng không đột biến (B) được biến nạp vào E.coli DH5α

Hình 4.8. Ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid mang đoạn chèn chứa vị trí 7853 dạng đột biến (A)
và dạng không đột biến (B) được biến nạp vào E.coli DH5α

Các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có bổ sung ampicillin được chúng tôi tiến hành kiểm
tra PCR sử d ng cặp mồi đặc hiệu COX-1.2 và COX-2.2. Nếu sản phẩm PCR điện di cho
băng kích thước tương ứng kích thước của đoạn gen chèn là 161 bp và 472 bp tương ứng thì
chúng tơi tiến hành tinh sạch sản phẩm nhân dịng và gửi giải trình tự. Kết quả giải trình tự
được minh họa trong Hình 4.9 và 4.10.

12


Hình 4.9. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen COX-1 với trình tự gen chuẩn và trình tự
nucleotide khơng chứa đột biến tại vị trí 6340(A) và có biến đổi tại vị trí 6340T (B)

Hình 4.10. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen COX-2 với trình tự gen chuẩn bằng
chương trình Blast và trình tự nucleotide khơng chứa đột biến tại vị trí 7853 (A)
và c đột biến tại vị trí 7853 (B)

Như vậy, chúng tơi đã nhân dịng thành cơng dạng biến đổi và khơng biến đổi tại vị trí
6340 và 7853 thuộc các gen COX-1 và COX-2 tương ứng.
4.2.5. Đánh giá kết quả phân tích đ hình di truyền c

gen COX-1 và COX-2 thuộc

ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng.
Tổng số mẫu sàng lọc biến đổi C6340T bằng hai phương pháp giải trình tự và PCRRFLP là 86 cặp mẫu. Trong đó trên mơ u phát hiện có 1/86 (chiếm 1,16%) mẫu biến đổi
đồng nhất từ C thành T, 2 86 mẫu có biến đổi ở dạng khơng đồng nhất (heteroplasmy). Trên
mơ LCU có 1 mẫu biến đổi đồng nhất (chiếm 1,16%) và 2 mẫu có biến đổi ở dạng dị tế bào
chất. Tính chung trên cả mơ u và LCU tần suất biến đổi C6340T chiếm 3,48% (3 86 mẫu).
So với máu đối chứng và máu bệnh (đều có tần suất biến đổi C6340T là 0%) thì tần suất
dạng biến đổi ở mơ của bệnh nhân UTĐTT có xu hướng cao hơn, tuy nhiên chưa tìm thấy
khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ biến đổi C6340T giữa mô và mẫu máu ĐC (P>0,05)
(Bảng 4.4).

13


Bảng 4.4. Phân bố của biến đổi T6340C và nguy cơ của bệnh UTĐTT
Tần suất T6340C
Loại mô

6340T, n (%) 6340C, n (%)

Mô u của bệnh nhân
UTĐTT, % (n)

3(3,48)

OR (CI 95%)

83(96,52)

P

5,65
0,25

Máu đối chứng, % (n)

(0,28-111,69)
0 (0)

67(100)

Ghi chú: n: Số bệnh nhân

Sử d ng test chính xác của Fisher và kiểm định Chi-square test (χ2) để đánh giá mối liên
quan giữa biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh
nhân UTĐTT. Tổng hợp kết quả giải trình tự và kết quả phân tích PCR- RFLP cho thấy tần
suất biến đổi G7853A trên mô u (15,1%) thấp hơn so với mô LCU (21,2%). Tuy nhiên, sự
khác biệt về tần suất biến đổi G7853A giữa mô u và LCU khơng có ý nghĩa thống kê
(p>0,05). Dùng chỉ số chênh (odd ratio - OR) để đánh giá nguy cơ của biến đổi G7853A và
bệnh UTĐTT, kết quả kiểm định OR cho thấy 7853A là một yếu tố có xu hướng làm tăng
nguy cơ mắc bệnh UTĐTT (OR=1,25, CI 95%: 0,29-5,18) (Bảng 4.5).
Theo các đặc điểm của bệnh UTĐTT cho thấy, biến đổi G7853A liên quan với giới tính
và giai đoạn T của bệnh (p<0,05), không liên quan với một số đặc điểm khác như độ tuổi,
kích thước khối u, mức độ biệt hóa, giai đoạn N, giai đoạn bệnh (P>0,05), (Bảng 4.6).
Bảng 4.5: Tần suất biến đổi G7853A và nguy cơ UTĐTT
Tần suất G7853A
Loại mô
7853G, n (%)

7853A, n (%)

54 (80,6)

13 (19,4)

10 (75)

3 (25)

Mô LCU

67 (78,8)

18 (21,2)

Mô U

73 (84,9)

13 (15,1)

Máu ĐC
Máu BN UTĐTT

OR (CI 95%)

P

1,25(0,29-5,18)

0,76

0,203

14


Bảng 4.6: Mối liên quan giữa biến đổi G7853A với một số đặc điểm bệnh học
của bệnh UTĐTT
Số
lượng

Đặc điểm

Tần suất G7853A n
(%)
7853A

7853G

P

Tuổi

<50
>=50

18
66

4(22,20)

12(18,20)

14(77,80)
54(81,82)

0,73*

Giới tính

Nam
Nữ

41
45

13(31,71)
3(6,67)

28(68,29)
42(93,33)

0.002* *

Đại tràng+ĐTT

45

7(15,56)

38(84,44)

Trực tràng

41

9(21,95)

32(78,05)

Rõ
Vừa

10
39

1(10)
8 (20,51)

9(90)
31(79,49)

Kém

6

2(33,33)

4(66,67)

<3

>=3; <=3,5

21
16

4(19,05)
4(25,00)

17(80,95)
12(75)

>3,5

42

8(19,05)

34(80,95)

No

51

7(13,73)

44(86,27)

N1+N2

32

8(28,57)

24(71,43)

T1
T2

9
35

5(55,56)
7(20,00)

4(44,44)
28(80,00)

T3+T4

40

3(7,50)

37(92,50)

I
II

30
21

6(20)
1(4,76)

24(80,00)
20(95,24)

III + IV

33

8(24,24)

25(75,76)

Vị trí ung thư

Độ biệt hóa

Kích thước
u(cm)
Giai đoạn N

Giai đoạn T

Giai đoạn bệnh

0.45**

0,49*

0,86 *

0,19**

0,0028**

0.15 *

Ghi chú. Gi i đoạn I: T1-2N0M0; gi i đoạn II: T3-4N0M0; gi i đoạn III: Tbất kỳ N1-2M0;
gi i đoạn IV: Tbất kỳ N bất kỳ M1 ; *: giá tr p tính theo kiểm đ nh Fisher;
**: Kiểm đ nh Khi bình phương ( χ2)

Nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được 4 17 biến đổi trên gen COX-1, 5/13 biến đổi
trên gen COX-2 làm thay đổi axitamin. Các biến đổi này đều chưa được công bố trên đối
tượng UTĐTT trên thế giới. Mặt khác, trong 4 biến đổi thuộc gen COX-1 có hai biến đổi
dạng C>T cũng là dạng biến đổi mà trong công bố của Venesio và cs, 2013 đã xác định
được trên bệnh nhân UTĐTT người Ý. Trên gen COX-2 chúng tôi xác định được 2 4 biến
đổi dang G>A làm thay đổi axitamin cũng là dạng biến đổi thường được xác định thấy trên
bệnh nhân UTĐTT người Ý (Venesio và cs, 2013). Đặc biệt nghiên cứu của chúng tơi cịn
cho thấy biến đổi C6340T ở dạng không đồng nhất. Như vậy, so sánh với kết quả công bố
15


trên thế giới trên đối tượng bệnh nhân UTĐTT thì kết quả trong nghiên cứu của chúng tơi
có những điểm mới như biến đổi C6340T, G7853A lần đầu tiên xác định thấy ở bệnh nhân
UTĐTT người Việt Nam, biến đổi C6340T là biến đổi ở dạng khơng hồn tồn. Ngồi ra
trong nghiên cứu này chúng tơi cịn đánh giá được biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 có
liên quan đến giới tính và giai đoạn T của bệnh nhân UTĐTT.
Kết lu n

- Chúng tôi đã sàng lọc được 17 biến đổi trên gen COX-1, 13 biến đổi trên gen COX-2 ty
thể trong đó có 5 biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-2, 4 biến đổi làm thay đổi
axit amin trên gen COX-1 ở bệnh nhân UTĐTT. Tần suất biến đổi C6340T là 3,48%,
G7853A trên mô u và LCU tương ứng là 15,1% và 21,2%.
- Đánh giá được mối liên quan giữa biến đổi biến đổi G7853A với các đặc điểm bệnh học
lâm sàng của bệnh UTĐTT. Biến đổi C6340T, là dạng đột biến sôma và xác định được ở cả
dạng đồng nhất và không đồng nhất, là một yếu tố có xu hướng làm tăng nguy cơ gây bệnh.
Biến đổi G7853A có liên quan với giới tính, giai đoạn T (P<0,05), nhưng khơng có liên
quan với các đặc điểm khác của bệnh UTĐTT như độ tuổi, vị trí khối u, kích thước khối u,
mức độ biệt hóa, giai đoạn bệnh (P>0,05).

16


TÀI IỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Tô Thị vân Anh, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Trịnh Hồng Thái, (2015), Biến đổi
của gen ND1 ty thể ở bệnh nhân ung thư vú , Tạp chí Sinh học số 37 (1), tr. 143-149.
2. Trương Thị Huệ, Phạm Minh Huệ, Lê Ngọc Yến, Phạm Thị Vân Anh, Ngô Diễm Ngọc,
Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở một số bệnh nhân
nghi hội chứng cơ não”, Tạp chí Sinh học số 34 (2), tr. 246-252.
3. Trương Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn
Nghĩa (2012), “Phát hiện và định lượng đột biến A3243G trong hệ gen ty thể ở hội chứng
MELAS”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học số 10 (3), tr. 423-429.
4. Lưu Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Tạ Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái
(2015), Mất đoạn 4977bp trên ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú , Tạp chí Sinh học số
37 (1), tr. 111-116.

Tài liệu tiếng Anh và trang web
5. Anna M. R., Albert M. Julie A. Douglas., John A. P.(2009), “Sequence Variation in the

Mitochondrial Gene Cytochrome c Oxidase Subunit I and Prostate Cancer in African
American Men” Prostate. 69(9): pp.956–960.
6. Arnold RS., Sun Q., Sun CQ. (2013), “An inherited heteroplasmic mutation in
mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer altersreactive oxygen, reactive
nitrogen and proliferation”, Biomed Res Int. doi: 10.1155/2013/239257
7. Chihara N., Amo T., Tokunaga A., Yuzuriha R., Wolf AM., Asoh S., Suzuki H., Uchida E.,
Ohta S. (2011), “Mitochondrial DNA alterations in colorectal cancer cell lines”, J Nippon
Med Sch. 78(1), pp. 13-21
8. Ghatak S., Lallawmzuali D., Lalmawia., Sapkota R., Zothanpuia., Pautu JL., Muthukumaran
RB., Senthil Kumar N. (2014), “Mitochondrial D-loop and cytochrome oxidase C subunit I
polymorphisms among the breast cancer patients of Mizoram, Northeast India”, Curr Genet.
60(3), pp. 201-12.
9. Greaves LC., Preston SL., Tadrous PJ., Taylor RW, Barron MJ., Oukrif D., Leedham SJ.,
Deheragoda M., Sasieni P., Novelli MR., Jankowski JA., Turnbull DM., Wright NA.,
McDonald SA. (2006), “Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic
stem cells, and mutated clones expand by crypt fission”, Proc Natl Acad Sci U S A. 103(3),
pp. 714-719.
10. Czarnecka AM, Cza.rnecki JS., Kukwa W., Cappello F., Scińska A., Kukwa. (2010),“A
Molecular oncology focus - is carcinogenesis a 'mitochondriopathy'?” J Biomed Sci. doi:
10.1186/1423-0127-17-31.
17


11. Errichiello E., Balsamo A., Cerni M., Venesio T. (2015), “Mitochondrial variants in MTCO2 and D-loop instability are involved in MUTYH-associated polyposis”, J Mol Med
(Berl). 93(11), pp.1271-1281.
12. Tan DJ., Bai RK., Wong LJ. (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial
DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res. 62(4), pp. 972-976.
13. Venesio T, Balsamo A, Errichiello E, et al.

(2013), “Oxidative DNA damage drives

carcinogenesis in MUTYH-associated-polyposis by specific mutations of mitochondrial and
MAPK genes”, Mod pathol , 2013 (26), pp. 1371-1381.
14. . A human mitochondrial genome database (2016).
15. (2016)
16. />
18


5. Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết lu n
Chúng tôi đã đạt được các m c tiêu và hoàn thành yêu cầu về sản phẩm của đề tài. C
thể, chúng tôi đã sàng lọc thấy 4/17 biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-1, 5/13
biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-2 ty thể. Biến đổi C6340T thuộc gen COX-1
là dạng đột biến sôma và xác định được ở cả dạng đồng nhất và không đồng nhất, là một
yếu tố làm tăng nguy cơ gây bệnh. Biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 có liên quan với giới
tính và giai đoạn T (P<0,05), nhưng khơng có liên quan với các đặc điểm khác của bệnh
UTĐTT như độ tuổi, vị trí khối u, mức độ biệt hóa, giai đoạn bệnh (P>0,05). Như vậy,
nghiên cứu này đã cung cấp thông tin về một số biến đổi thuộc gen COX-1 và COX-2 ty thể
ở bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam. Đồng thời kết quả nghiên cứu cũng đánh giá được
mối liên quan giữa biến đổi G7853A với một số đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh
UTĐTT ở Việt Nam. Đặc biệt, biến đổi G7853A có liên quan đến giai đoạn T của bệnh.
T m t t kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
T m t t kết quả bằng tiếng Việt
Nghiên cứu được thực hiện nhằm sàng lọc các biến đổi (đột biến, đa hình) trên hai gen
O -1 v

O -2 ty thể ở mẫu mơ của một nhóm bệnh nhân UTĐTT, xác định được mối

liên quan giữa một số dạng biến đổi của gen COX-1 và COX-2 với các đặc điểm bệnh học
lâm sàng ở nhóm mẫu nghiên cứu. Sử d ng phương pháp giải trình tự ADN trực tiếp từ sản

phẩm PCR và PCR-RFLP, chúng tôi đã sàng lọc thấy 4 17 biến đổi làm thay đổi axit amin
thuộc gen COX-1, 5/13 biến đổi làm thay đổi axit amin thuộc gen COX-2 ty thể. Biến đổi
G7853A thuộc gen COX-2 ty thể ở mô u và mô LCU với tần suất tương ứng là 15,1 và
21,2%, là dạng đột biến sơma và có liên quan với giới tính, giai đoạn T (P<0,05), nhưng
khơng liên quan đến các đặc điểm bệnh học khác như kích thước u, vị trí u, mức độ biệt hóa,
giai đoạn bệnh và độ tuổi (P>0,05). Biến đổi C6340T thuộc gen COX-1 xác định được ở cả
dạng đồng nhất và không đồng nhất với tần suất là 3,48%. Hai biến đổi C6340T và G7853A
không liên quan r rệt đến bệnh UTĐTT, nhưng có xu hướng làm tăng nguy cơ gây bệnh
đối với những người mang hai biến đổi này.
T m t t kết quả bằng tiếng Anh
The aims of this study are to screen alterations of mitochondrial COX-1 gene (mtCOX-1
gene) and mitochondrial COX-2 gene (mtCOX-2 gene) in a group of colorectal cancer patients
in Vietnam and then determined the association between these alterations and some
pathological characteristics of colorectal cancer. We used PCR-RFLP combining with DNA
19


directly sequencing method in order to determine alterations. 17 alterations of mtCOX-1 gene
were detected by using DNA sequencing method. Four detected alterations including C6340T
were involved in amino acid substitutions. 13 alterations of COX-2 gene were detected in
which, five alterations result in substitution of amino acid. Frequences of G7853A alteration
in tumor tissue and adjacent tumor tissue were 15,1 and 21,2%, respectively. The G7853A
was shown to be a somatic mutation. This alteration was significantly associated with gender
and T stage (P<0,05), but not with some other pathological characteristics including the age,
tumor size, tumor location, cell differentiation and TNM stage (P>0,05). Percentage of
samples carrying C6340T in CRC tissues group was 3,48% and this alteration was detected in
both homoplasmy and heteroplasmy in tissue samples and was shown to be a somatic
mutation too. Overall, the study demonstrated a lack of association between G7853A and
C6340T alterations and CRC susceptibility. However, a tendency to increase risk of CRC was
in patients harbouring the G7853A and C6340Talterations.

20


PHẦN III. SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI
3.1. Kết quả nghiên cứu

TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thu t
Đăng ký

Đạt được

1

Bài báo

02 bài báo trong nước

02 bài báo trong nước

2

Đào tạo

Hỗ trợ đào tạo 01 tiến sĩ

- 01 NCS là chủ nhiệm đề tài
đã có quyết định bảo vệ cấp
sở theo quyết định số:
4684 QĐ-ĐHKHTN
- 01 CN đã tốt nghiệp
- 01 thạc sĩ đang thực hiện
luận văn

3

Quy trình

4

Bộ dẫn liệu

Quy trình kỹ thuật phân tích
đa hình di truyền của gen
COX-1 và COX-2 trên bệnh
nhân ung thư đại trực tràng
Dẫn liệu liên quan giữa đa
hình gen COX-1 và COX-2
ty thể với bệnh ung thư đại
trực tràng.

Đã hoàn thiện

Đã hoàn thiện

21

3.2. Hình thức, cấp độ cơng bố kết quả

Tình trạng

Sản phẩm

TT

Ghi địa chỉ và

Đánh

cảm ơn sự tài trợ

giá

của ĐHQGHN

chung

đúng quy định

(Đạt,
khơng
đạt)

1

Cơng trình cơng bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI Scopus

2

Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản

3

Đăng ký sở hữu trí tuệ

4

Bài báo quốc tế khơng thuộc hệ thống ISI Scopus

5

Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc
gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

5.1
1. Phạm Thị Bích, Nguyễn Thị Tươi, Trịnh
Hồng Thái (2016), Biến đổi trên gen COX-2
ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng ",
Tạp

Đã in

Có

Đạt

Có

Đạt

í Sin lý ọ Vi t N m, 20(4), tr. 40-47

5.2 Phạm Thị Bích, Lê Thị Quỳnh Thơ, Trịnh
Hồng Thái (2016), "Biến đổi trên gen COX-1
ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng" Tạp
íK o

ọ ĐHQGHN: K o

Đã in

ọ Y Dượ ,

Tập 32, Số 2 (2016), tr.17-25
6

Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng của đơn vị sử d ng

7

Kết quả dự kiến được ứng d ng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở ứng
d ng KH&CN

22

3.3. Kết quả đào tạo
Thời gian và kinh phí Cơng trình cơng bố liên quan
TT

Họ và tên

tham gia đề tài
(số t

(Sản p ẩm KH N, luận n,

ng/số tiền)

Đã bảo vệ

luận văn)

Nghiên cứu sinh
1

Phạm Thị Bích

24 tháng/40 triệu

Quyết định tên luận án và quyết Đã có quyết

đồng

định bảo vệ cấp cơ sở

định bảo vệ

02 bài báo

cơ sở số
4684 QĐĐHKHTN

Cử nhân
1.

Lê Thị Quỳnh Thơ

12 tháng

Quyết định tên luận văn cao học Quyết định tên
Đồng tác giả 01 bài báo

đề tài số
8983 QĐĐHKHTN

2.

Nguyễn Thị Tươi

12 tháng

Khóa luận tốt nghiệp,

2016

Đồng tác giả 01 bài báo

23


PHẦN IV. TỔNG HỢP KẾT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI
TT

Sản phẩm

Số

Số lượng đã

lượng

hoàn thành

đăng
ký
1

Bài báo cơng bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống

0

0

ISI/Scopus

2

Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản

0

0

3

Đăng ký sở hữu trí tuệ

0

0

4

Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus

0

0

5

Số lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp

02

02

0

0

0

0

chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học
đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
6

Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng
của đơn vị sử d ng

7

Kết quả dự kiến được ứng d ng tại các cơ quan hoạch định
chính sách hoặc cơ sở ứng d ng KH&CN

8

Đào tạo/hỗ trợ đào tạo NCS

01

Đã có quyết
định bảo vệ

cơ sở

9

Đào tạo thạc s

0

01 học viên
đang thực
hiện luận văn

10

Đào tạo cử nhân

0

01

24