Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP 9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Như Quỳnh




NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN
MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC








Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Thị Như Quỳnh


NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN
MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái

TS. Đỗ Minh Hà




Hà Nội – Năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trịnh Hồng Thái,

người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình,
những ý kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Đỗ Minh
Hà trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ của ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan
Phương và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh,
bệnh viện K, Hà Nội; khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội; khoa
sàng lọc máu của Viện Huyết học và truyền máu Trung ương.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm công
nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên
và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 3 năm 2015
Học Viên


Nguyễn Thị Như Quỳnh

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng 3
1.1.1. Ung thư đại trực tràng 3
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng 4
1.1.3. Chẩn đoán và điều trị bệnh 5
1.1.4. Các giai đoạn của UTĐTT 7
1.2. Matrix Metalloproteases (MMP) 10
1.2.1. Khái quát chung về họ Matrix Metalloprotease (MMPs) 10
1.2.2. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase 12
1.2.3. Một số nghiên cứu về họ MMP ở ung thư đại trực tràng 16
1.2.4. Một số nghiên cứu về đa hình đơn nucleotide trên các gen MMP 17
1.2.5. Một số nghiên cứu về đa hình vùng promoter gen MMP-9 19
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21
2.1 Nguyên liệu 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21
2.1.2. Hóa chất 21
2.1.3. Thiết bị 22
2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu 22
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô 23
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu 24
2.2.3. Khuếch đại đoạn gen trên vùng promoter của gen MMP-9 bằng
phương pháp PCR 24
2.2.4. Phương pháp RFLP 26
2.2.5. Điện di 26
2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR 27

2.2.7. Giải trình tự trực tiếp 28
2.2.8. Nhân dòng phân tử 28
2.2.9. Xử lý số liệu và tính toán thống kê 32
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33



3.1. Kết quả phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô của bệnh
nhân UTĐTT 33
3.1.1. Kết quả phân tích biến đổi của gen MMP-9 bằng kỹ thuật PCR-RFLP
33
3.1.2. Kết quả giải trình tự trực tiếp và nhân dòng 35
3.2. Kết quả phân tích biến đổi ADN của gen MMP-9 từ mẫu máu 42
3.2.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen có chứa vị trí biến đổi của promoter gen
MMP-9 42
3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi trong vùng promoter
gen MMP-9 43
3.3. Phân tích mối liên hệ giữa biến đổi C-1562T với một số đặc điểm bệnh
học của bệnh nhân UTĐTT 44
3.4. Phân tích biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình thường
50
KẾT LUẬN 53
KIẾN NGHỊ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54


1
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng 3
Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT 9

Hình 3: Cấu trúc các vùng của MMP 12
Hình 4: Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 25
Hình 5: Vector plasmid pJET1.2 30
Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số
tách từ mô 33
Hình 7: Hình ảnh điện di kết quả cắt enzyme sản phẩm PCR từ ADN tổng số của
mô 34
Hình 8: Hình ảnh kết quả giải trình tự trực tiếp 36
Hình 9: Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào E. Coli DH5α . 37
Hình 10: Hình ảnh điện di ADN plasmid được tách từ E.Coli DH5α 38
Hình 11:

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ plasmid và sản phẩm cắt bằng
enzyme giới hạn 39
Hình 12: Kết quả phân tích trình tự plasmid 40
Hình 13: Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang biến đổi với trình tự tham
khảo sử dụng chương trình BLAST 41
Hình 14: Kết quả so sánh trình tự mẫu mang biến đổi với trình tự tham khảo sử
dụng chương trình BLAST 41
Hình 15: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ mẫu máu thường và bệnh 42
Hình 16:

Hình ảnh cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình
thường cho máu và mẫu máu bệnh nhân UTĐTT 43
Hình 17:
Hình ảnh đ
iện di sản phẩm PCR-RE mẫu mô u-mô lân cận u và mẫu
máu của cùng một bệnh nhân 44
Hình 18: Biểu đồ phân bố biển đổi C-1562T theo vị trí mô 46
Hình 19: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo vị trí ung thư 46

2
Hình 20:Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo độ tuổi 47
Hình 21: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo giai đoạn TNM 48
Hình 22: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình
thường 50




3
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh
khác nhau 9
Bảng 2: Bảng phân loại các nhóm trong họ MMP (ở người) 11
Bảng 3: Hoạt động và ảnh hưởng của họ MMP trong sự tiến triển của các giai
đoạn ung thư 14
Bảng 4 : Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 21
Bảng 5: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 22
Bảng 6: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 25
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR 25
Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI 26
Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu bằng 29
Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector 29
Bảng 11: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9
31
Bảng 12: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi
pJet1.2 31

Bảng 13: Phân bố biến đổi C-1562T của promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung
thư đại trực tràng theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh 455
Bảng 14: Tần suất xuất hiện alen C và T trên đoạn ADN có chứa biến đổi của
promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo một số đặc điểm
bệnh học của bệnh 49
Bảng 15: Tần suất xuất hiện các alen C và T trên đoạn ADN promoter của gen
MMP-9 ở mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT và mẫu máu của người bình thường
50
Bảng 16: Tần suất xuất hiện các alen C và T trên đoạn ADN promoter của gen
MMP-9 ở mẫu máu bệnh nhân UTĐTT và mẫu máu người bình thường 51




4
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid Deoxyribo Nucleic
AFAP Actin Filament Associated Protein
AJCC Ủy ban ung thư Mỹ - American Joint Committee on Cancer
COPD Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính - Chronic Obstructive Pulmonary
Disease
cs Cộng sự
ECM Chất nền ngoại bào - Extralcellular Matrix
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid


EtBr Ethidium Bromide
FAP Đa polyp tuyến gia đình - Familial adenomatous polyposis
FOBT Kiểm tra máu ẩn trong phân - Fecal occult blood test
FISH Lai huỳnh quang tại chỗ - Fluorescence in situ hybridization

HNPCC Ung thư đại trực tràng di truyền không đa polyp - Hereditary
Non-Polyposis Colorectal Cancer
MMP Matrix Metalloproteinase
NK Giết tự nhiên – Nature killer
PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction
RFLP Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn - Restriction
Fragment Length Polymorphism
SDS Sodium dodecyl sulfate
TBE Tris-Borate-EDTA
TGF Yếu tố sinh trưởng kích thích chuyển dạng – Transforming
growth factor
TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase
UTĐTT Ung thư đại trực tràng
VEGF Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu – Vascular Endothelial Growth Factor



1
MỞ ĐẦU
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư phổ biến đứng đầu trong
các loại ung thư đường tiêu hóa tại các nước trên thế giới. Tại Việt Nam và các
nước châu Á, UTĐTT xếp thứ tư ở nam giới (sau ung thư gan, phổi và dạ dày) và
thứ ba ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung và ung thư vú). Từ năm 2007 đến 2011,
ở Việt Nam, chỉ tính riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, đã ghi nhận 3557 ca mắc
bệnh mới UTĐTT (chiếm 10,74% tổng số ca mắc bệnh ung thư) [52].
UTĐTT là một trong những loại ung thư có độ ác tính rất cao đồng nghĩa
với tỷ lệ tử vong cao. Tại Mỹ, năm 2013 ghi nhận tới 142820 ca UTĐTT mới
được chẩn đoán, trong đó có 50830 ca có khả năng dẫn đến tử vong sớm (chiếm
35,59% trường hợp mắc UTĐTT), năm 2014 thống kê có 136830 người mắc
UTĐTT mới và 50310 trường hợp tử vong (chiếm 36,77% trường hợp mắc

UTĐTT) [53].
UTĐTT là kết quả của nhiều quá trình với những giai đoạn phức tạp biến
đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư liên quan tới các gen gây ung thư,
các gen ức chế khối u và vi môi trường khối u. Tương tác giữa mô đệm và biểu
mô đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của ung thư. Liên kết giữa các tế
bào ung thư ác tính với mô đệm xung quanh (nguyên bào sợi, tế bào nội mô và
các tế bào viêm) cũng là nền tảng cho sự phát triển và di căn ung thư. Ngoài các
tế bào mô đệm bên trong khối u, ECM (extracellular matrix – chất nền ngoại
bào) cũng có những tác động quan trọng đối với sự tiến triển ung thư. ECM được
cấu tạo chủ yếu bằng các sợi protein liên kết các cacbohydrat kết hợp cùng với
một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. ECM thực hiện một loạt chức năng trong
việc giúp các tế bào liên kết với nhau tạo nên các mô nhất định và thu nhận thông
tin. Tế bào ung thư sẽ tác động vào ECM làm thay đổi cấu trúc của ECM, từ đó
các tế bào ung thư có thể dễ dàng di chuyển từ u nguyên phát sang các vị trí
khác. Các protein của ECM đóng vai trò quan trọng trong sự tăng sinh và di căn
của tế bào ung thư, các protease khác nhau điều khiển sự tu sửa cũng như phân
giải ECM. Một nhóm cụ thể của các protease là matrix metalloproteinase (MMP)
– enzyme phân giải protein có chứa kim loại đang ngày càng được nghiên cứu
rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam [18].


2
MMP-9 (92kDa collagenase loại IV, gelatinase B) là một thành viên họ
MMP, là protease liên quan chính đến sự suy thoái của ECM. Mức độ biểu hiện
của MMP-9 ở một loạt bệnh ung thư của người cao hơn so với những người khỏe
mạnh. Trong các tế bào u ác tính di căn, mức độ biểu hiện của MMP-9 cũng cao
hơn so với những dòng tế bào u ác tính chưa di căn. Các nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, những biểu hiện quá mức của MMP-9 có đóng góp nhất định vào sự phát
triển cũng như tiến triển của ung thư đại trực tràng. Những biến đổi vùng
promoter gen MMP-9 mã hóa cho protein MMP-9 có thể làm thay đổi cấu trúc và

chức năng protein, do đó có thể tác động tới sự phát triển và di căn của tế bào
ung thư [18]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về những biến đổi vùng
promoter gen MMP-9 ở nhiều bệnh khác nhau trong đó có ung thư. Tuy nhiên ở
Việt Nam đến nay chưa có nghiên cứu nào về biến đổi vùng promoter gen MMP-
9 ở bệnh nhân UTĐTT. Chính vì những lý do như vậy, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở
bệnh nhân ung thư đại trực tràng”. Với mục đích:
- Xác định được biến đổi ADN trong vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở
một nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
- Đánh giá mối liên quan của những biến đổi ADN vùng promoter gen
MMP-9 với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt
Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu
trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.







3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
Ung thư là một loại bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một
cách nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể.
Các tế bào bất thường này có thể xâm nhập vào các mô lân cận hoặc di chuyển
đến các mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào mạch máu hoặc hệ bạch huyết.
Chúng sẽ tập trung lại và tiêu diệt các tế bào bình thường dẫn đến suy thoái chức

năng của các bộ phận mà chúng tiến đến [55].
1.1.1. Ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) thường xảy ra tại các mô đại tràng (phần
dài nhất của ruột già) hoặc trực tràng (vài inch cuối cùng của ruột già trước hậu
môn). Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm đại tràng lên (ascending
colon), đại tràng ngang (transverse colon) và đại tràng xuống (descending colon).
Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối giữa đại tràng và hậu
môn (Hình 1). Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng,
thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư
nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi chung là ung thư
đại trực tràng [53].

Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng [56]


4
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh
học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống kê các tài liệu
tổng quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này là:
1.1.2.1. Yếu tố di truyền
- Sai hỏng trong gen: Các tế bào có thể tăng sinh không kiểm soát nếu có
sai hỏng ADN. Đặc biệt nếu sự sai hỏng này làm tổn thương tới các gen liên
quan đến quá trình phân chia tế bào. Như bốn nhóm gen chính chịu trách nhiệm
cho quá trình phân chia tế bào: Các gen gây ung thý oncogenes; các gen ức chế
khối u nhý p21, p53; các gen kiểm soát quá trình apoptosis và nhóm các gen sửa
chữa ADN. Ung thý xảy ra khi tế bào có ðột biến gen làm cho tế bào không thể
tự sửa chữa ADN bị tổn thýõng vì vậy không thể ði vào quá trình chết theo chu
trình. Bên cạnh các ðột biến ở gen phân chia tế bào, ung thý còn là kết quả của
các ðột biến gen gây ung thý và quá trình ức chế gen ức chế khối u, dẫn ðến sự

tãng sinh tế bào không ðýợc kiểm soát [54].
- Di truyền theo gia ðình: Khoảng 20% UTÐTT ðýợc cho là gây ra bởi ðột
biến gen di truyền. Hội chứng di truyền có liên quan ðến UTÐTT bao gồm: FAP
(đa polyp tuyến gia đình), AFAP là một kiểu nhẹ hơn FAP và HNPCC (UTĐTT
di truyền không do polyp). Những biến đổi này đa phần dẫn đến ung thư ở độ
tuổi còn rất trẻ [53].
- Ngoài ra còn có yếu tố dân tộc: Người Do Thái, người Mỹ gốc Phi có
nguy cơ mắc bệnh UTĐTT cao hơn các dân tộc khác [3].
1.1.2.2. Yếu tố không di truyền
- Chế độ dinh dưỡng: Các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu) và các loại thịt chế
biến (xúc xích, thịt hun khói, đồ hộp) có thể làm tăng nguy cơ ung thư đại trực
tràng. Nấu thịt ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể tạo ra các hóa chất độc hại
làm tăng nguy cơ ung thư. Còn chế độ ăn rau, trái cây và ngũ cốc nguyên hạt có
thể làm giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng [32].
- Vận động: Thói quen lười vận động có thể làm tăng nguy cơ ung thư [15,
26, 36].


5
- Thừa cân: Tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ của việc
mắc và tử vong vì ung thư đại trực tràng [15].
- Hút thuốc: Những người hút thuốc trong thời gian dài cũng có nguy cơ
bị ung thư đại trực tràng cao hơn những người không hút thuốc. Hút thuốc cũng
làm tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư khác [33].
- Sử dụng rượu: Người sử dụng nhiều rượu có khả năng mắc UTĐTT cao
hơn những người không hoặc rất ít khi sử dụng rượu. Khoảng 15% các trường
hợp mắc UTĐTT là do sử dụng quá nhiều rượu [29].
- Bệnh tật: Những người có tiền sử mắc các bệnh đường ruột như viêm
ruột, viêm loét đại tràng; bệnh Crohn và đái tháo đường loại 2 cũng có nguy cơ
mắc bệnh UTĐTT cao hơn người bình thường. Trong các bệnh này, đại tràng

thường bị viêm trong một thời gian dài [11, 50].
1.1.3. Chẩn đoán và điều trị bệnh
Xét nghiệm sàng lọc hay chẩn đoán có thể tìm thấy các polyp hoặc ung
thư trước khi chúng phát triển. Phát hiện sớm rất có ý nghĩa bởi các bác sỹ sẽ lựa
chọn được những phương pháp phù hợp cho từng bệnh nhân, từng giai đoạn
bệnh, giúp quá trình điều trị bệnh hiệu quả hơn [52].
Chẩn đoán
Thăm khám trực tràng: Phương pháp này chỉ phát hiện được không quá
10% trường hợp UTĐTT.
Chụp hình đại tràng với chất cản quang: Phương pháp này dùng thuốc xổ
cùng với dung dịch có tính cản quang (barium) sẽ được tiêm vào trong ruột già
thông qua đường hậu môn khi đó hình ảnh của ruột già được hiển thị trên phim
khi chụp X-quang.
Xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân (FOBT): Sử dụng xét nghiệm này để
xem máu có ẩn trong phân không vì mắt thường không nhìn thấy được.
Xét nghiệm ADN phân: Để tìm kiếm các tế bào UTĐTT hoặc polyp tiền
ung thư.
Nội soi đại trực tràng: Sử dụng ống mỏng, dễ uốn nắn có kết nối với
video camera được đưa vào hậu môn, qua trực tràng và cho phép bác sỹ quan sát


6
toàn bộ đại tràng. Ngoài ra, ống soi này còn có tác dụng để cắt bỏ các khối polyp
và ung thư trong khi làm xét nghiệm.
Chụp cắt lớp ruột già: Sử dụng kỹ thuật cắt lớp điện toán để chụp ảnh của
ruột già. Các hình ảnh sẽ được kết hợp trên máy tính để giúp bác sỹ tìm kiếm
polyp hoặc ung thư.
Soi đại tràng Sigma: Cho phép nhìn thấy những khối u khi chúng còn rất
nhỏ, trước cả khi chúng bị phát hiện bằng xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân.
Tuy nhiên, soi đại tràng Sigma có thể bỏ sót các khối u ở phần trên của ruột già.

Chẩn đoán bằng mô học và tế bào học: Phương pháp này cho phép phân
biệt giữa các tế bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ. Phương
pháp này được coi là chuẩn vàng trong việc xác định UTĐTT, có ý nghĩa rất lớn
trong tiên lượng và điều trị bệnh.
Chẩn đoán phân tử: Đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và
giúp các bác sỹ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp. Hiện nay, chẩn đoán phân tử
thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến: PCR, Realtime PCR, FISH…
có thể phát hiện những bất thường ở các gen một cách chính xác.
Điều trị
Phẫu thuật UTĐTT: Phẫu thuật cắt đại tràng là phương pháp duy nhất
điều trị ung thư đại tràng ở giai đoạn sớm. Phương pháp phẫu thuật đại tràng qua
nội soi cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân một thời gian ngắn sau mổ
(ít đau) nhưng kết quả lâu dài của cắt đại tràng qua nội soi so với mổ mở thì vẫn
trong giai đoạn nghiên cứu. Trong hầu hết các trường hợp, bác sỹ sẽ phải nối lại
những phần còn lành của đại tràng. Khi không thể nối lại những phần còn lành,
cần phải thực hiện phẫu thuật mở thông đại tràng tạm thời hoặc vĩnh viễn.
Khoảng 15% bệnh nhân ung thư đại tràng cần phải mở thông đại tràng vĩnh viễn.
Hóa trị UTĐTT: Hóa trị liệu là phương pháp sử dụng thuốc chống ung thư
để tiêu diệt tế bào ung thư. Hóa trị liệu có thể được sử dụng để tiêu diệt tất cả
những tế bào ung thư còn sót lại trong cơ thể sau phẫu thuật, để kiểm soát sự phát
triển của khối u hoặc để giảm bớt triệu chứng của bệnh. Nhược điểm của phương
pháp này là không chỉ nhằm vào các tế bào bệnh mà còn làm tổn thương đến mô,
tế bào lành như tế bào tủy xương.


7
Xạ trị UTĐTT: Xạ trị còn được gọi là phương pháp phóng xạ, sử dụng tia
X có năng lượng cao để tiêu diệt tế bào ung thư. Hạn chế của phương pháp này là
không áp dụng được khi ung thư đã lan ra toàn cơ thể. Biến chứng của phương
pháp này nhiều khi khá trầm trọng ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh,

gây tổn thương các mô lành, làm cho mô bị chai cứng.
1.1.4. Các giai đoạn của UTĐTT
Hiện nay có hai hệ thống phân chia giai đoạn ung thư [53]:
Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Dukes người Anh đưa ra vào
năm 1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT.
- Dukes A: Ung thư chỉ ở lớp trong cùng của đại tràng hoặc trực tràng.
Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 90%.
- Dukes B: Ung thư đã phát triển thông qua lớp cơ của đại tràng hoặc
trực tràng. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 70%.
- Dukes C: Ung thư đã lan rộng đến ít nhất một hạch bạch huyết ở khu
vực gần đường ruột. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 30%.
- Dukes D: Ung thư đã lan đến một nơi khác trong cơ thể như gan, phổi.
Hiệu quả điều trị không cao, ở giai đoạn này ít được can thiệp phẫu
thuật mà đa số sử dụng các biện pháp mang tính tác động toàn thân
như hóa trị, sử dụng tế bào miễn dịch.
Hệ thống phân chia TNM: Được Ủy ban ung thư Hoa Kỳ (AJCC) và
Hiệp hội chống ung thư quốc tế (UICC) thông qua năm 1974. Sử dụng chung cho
nhiều loại ung thư dựa vào 3 tiêu chí chính: Kích thước khối u, hạch lympho và
sự di căn của khối u (bảng 1). Áp dụng cụ thể cho UTĐTT như sau:
T (Tumor): Cho biết kích cỡ mức độ lan sâu vào thành ruột
- Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin.
- Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc.
- T1: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp niêm mạc – cơ và xâm lấn
đến lớp dưới niêm mạc.
- T2: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp dưới niêm mạc, xâm lấn đến
lớp cơ.


8
- T3: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp cơ và xâm lấn đến các lớp

ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối
u chưa ăn lan đến các cơ quan và mô lân cận.
- T4a: Ung thư đã phát triển xuyên qua thanh mạc.
- T4b: Ung thư đã phát triển xuyên qua thành ðại tràng, dính chặt hoặc
xâm lấn các mô và cõ quan kề cận.
N (Lympho node): Cho biết khối u đã lan đến các hạch bạch huyết và số
lượng hạch.
- Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết do thông tin
không đầy đủ.
- N0: Không có ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận.
- N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận.
- N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2 – 3 hạch bạch huyết kề
cận.
- N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các hạch
bạch huyết, nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết.
N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 – 6 hạch bạch huyết kề cận.
- N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 7 hạch bạch huyết kề cận trở
lên.
M (Metastases): Cho biết mức độ di căn của khối u
- M0: Không có di căn xa.
- M1a: Ung thư đã lan đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch bạch huyết
ở xa.
- M1b: Ung thư đã lan rộng đến từ 1 cơ quan xa trở lên hoặc một nhóm
các hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã lan tràn đến các phần phúc mạc ở xa.
Tóm lại, UTĐTT được chia làm các giai đoạn:
- Giai ðoạn 0: Ung thý chỉ ðýợc tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của
ðại tràng hoặc trực tràng. Ung thý biểu mô tại chỗ là một tên khác cho
UTÐTT giai ðoạn này.
- Giai ðoạn I: Khối u ðã phát triển vào thành trong của ðại tràng hoặc
trực tràng. Khối u chýa phát triển výợt qua thành.

9
- Giai ðoạn II: Khối u phát triển sâu hõn vào trong hoặc xuyên qua thành
ðại tràng hoặc trực tràng. Nó có thể ðã xâm lấn các mô lân cận nhýng
các tế bào ung thý chýa lây lan ðến các hạch bạch huyết.
- Giai ðoạn III: Ung thý ðã lan ðến các hạch bạch huyết gần ðó nhýng
chýa ðến các bộ phận khác của cõ thể.
- Giai ðoạn IV: Ung thý ðã lan ra các bộ phận khác của cõ thể, chẳng
hạn nhý gan hoặc phổi (hình 2).

Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT [52]
Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau
[54]
Giai đoạn TNM
Khả năng sống sót sau
5 năm(%)
Giai đoạn 0 T
is
N
0
M
0
100
Giai đoạn I
T
12
N
0
M

0

90
Giai đoạn II

A
T
3
N
0
M
0
84
Giai đoạn II

B
T
4
N
0
M
0
56
Giai đoạn III

A T
12
N
1
M

0

87
Giai đoạn III

B T
34
N
1
M
0

70
Giai đoạn III

C
T bất kỳ, N
2
M
0
56
Giai đoạn IV T bất kỳ, N bất kỳ, M
1
12


10
1.2. Matrix Metalloproteases (MMP)
1.2.1. Khái quát chung về họ Matrix Metalloprotease (MMPs)
Họ MMP là một họ enzyme có nhiều chức năng trong cơ thể sống, có khả

năng phân giải các protein của chất nền ngoại bào như collagen màng nền hay
lớp gian bào, proteoglycan, fibronectin, laminin, do đó chúng liên quan đến quy
trình tái tạo mô, quá trình phát triển phôi, mang thai, tăng trưởng và quá trình hồi
phục, chữa lành vết thương [40, 5]. Hoạt động của các MMP được kiểm soát bởi
các chất ức chế mô đặc hiệu TIMP (Tissue Inhibitors of Mettaloproteinase) hoặc
các chất ức chế mô không đặc hiệu cụ thể α2-macroglobulin. Sự phá vỡ cân bằng
MMP-TIMP có thể dẫn tới trạng thái bệnh lý như dạng thấp khớp, viêm xương
khớp, xơ vữa động mạch, tăng sinh khối u, di căn và chứng xơ hóa [5, 44].
Các MMP có thể được tự tổng hợp như một nội tiết tố hoặc được chuyển
đến từ ngoài màng dưới dạng proenzyme và quá trình hoạt động của chúng sẽ
được kích hoạt khi loại bỏ đầu N của một propeptide. Để giữ cho các enzyme này
ở dạng nghỉ, các phân tử Zn
2+
phải liên kết với một gốc cysteine tại trung tâm
hoạt động của enzyme. Liên kết này bị ảnh hưởng bởi một số tác nhân như tác
nhân chaotropic, sự phân cắt của các propeptide của các thành viên trong họ
MMP hoặc bởi các protease khác. Khi liên kết này bị phá vỡ, các MMP sẽ được
hoạt hóa và thực hiện một số chức năng của chúng trong cơ thể sống [45]. Họ
MMP bắt đầu đươc biết đến từ nghiên cứu của Gross và Lapière vào năm 1962,
khi họ nghiên cứu về những mảnh đuôi nòng nọc cấy trên môi trường gel có bổ
sung collagen, nhận thấy một loại enzyme đã phân giải collagen trong môi
trường nuôi cấy. Điều đó cho thấy trong thời gian biến thái, ở đuôi nòng nọc xuất
hiện một loại protease có khả năng phân giải collagen [46].
Hiện nay có tất cả 26 enzyme thuộc họ MMP (bảng 2) đã được tìm thấy
và chia thành 6 nhóm dựa vào cơ chất mà nó có thể phân giải, với vùng peptide
có chức năng và trình tự tương đồng [39]. Tuy nhiên không phải MMP nào cũng
được phát hiện ở người, ví dụ như MMP-18 chỉ được phát hiện ở loài Xenopus.

11
Bảng 2: Bảng phân loại các nhóm trong họ MMP (ở người) [40]
Cấu trúc chung của một MMP thường bao gồm: Một propeptit khoảng 80
axit amin, vùng chức năng xúc tác của MMP khoảng 170 axit amin, liên kết
peptit có chiều dài biến động (còn được gọi là hinge region) và một vùng chức
năng hemopexin (Hpx) khoảng 200 axit amin (hình 3).
Nhóm MMP Tên Cõ chất
Collagenases
MMP-1 Collagenase-1 Col I, II, III, VII, VIII, X, gelatin
MMP-8 Collagenase-2
Col I, II, III, VII, VIII, X, aggrecan,
gelatin
MMP-13 Collagenase-3 Col I, II, III, IV, IX, X, XIV, gelatin
Gelatinases
MMP-2 Gelatinase A Gelatin, Col I, II, III, IV, VII, X
MMP-9 Gelatinase B Gelatin, Col IV, V
Stromelysins
MMP-3 Stromelysin-1 Col II, IV, IX, X, XI, gelatin
MMP-10 Stromelysin-2 Col IV, laminin, fibronectin, elastin
MMP-11 Stromelysin-3 Col IV, fibronectin, laminin, aggrecan
Matrilysins
MMP-7 Matrilysin-1 Fibronectin, laminin, Col IV, gelatin
MMP-26 Matrilysin-2 Fibrinogen, fibronectin, gelatin
MT-MMP
MMP-14 MT1-MMP Gelatin, fibronectin, laminin
MMP-15 MT2-MMP Gelatin, fibronectin, laminin
MMP-16 MT3-MMP Gelatin, fibronectin, laminin
MMP-17 MT4-MMP Fibrinogen, fibrin

MMP-24 MT5-MMP Gelatin, fibronectin, laminin
MMP-25 MT6-MMP Gelatin
Các loại khác
MMP-12
Macrophage
metalloelastase
Elastin, fibronectin, Col IV
MMP-19
Aggrecan, elastin, fibrillin, Col IV,
gelatin
MMP-20 Enamelysin Aggrecan
MMP-21 XMMP Aggrecan
MMP-23 Gelatin, casein, fibronectin
MMP-27 CMMP Chýa rõ
MMP-28 Epilysin Chýa rõ


12

Hình 3: Cấu trúc các vùng của MMP [44]

1.2.2. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase

1.2.2.1. Vai trò của họ MMP đối với các quá trình trong cơ thể sống
Họ MMP tham gia vào rất nhiều quá trình trong cơ thể, cụ thể bao gồm:
Di cư tế bào: Sự hiện diện của các chất nền ngoại bào là chướng ngại cho
quá trình di cư của tế bào. Những tế bào bám trên chất nền ngoại bào khi muốn
chuyển từ vị trí này sang vị trí khác phải thay đổi từ kiểu bám dính sang kiểu di
động. Sự thay đổi yêu cầu cần một số quá trình: Sự hoạt hóa chức năng vận động
của khung tế bào, sự phân hóa thuận nghịch tại các vị trí bám dính, các phân tử

bám dính trên bề mặt tế bào cung cấp sức kéo dãn, tháo dỡ của chất nền ngoại
bào để phá vỡ các rào cản vật lý và sự hiện diện của chất dẫn dụ hóa học sẽ định
hướng cho tế bào di cư. Họ MMP tham gia vào tất cả các giai đoạn của quá trình
này. Fisher cùng cs năm 1994, Hiraoka cùng cs năm 1998 đều đã phát hiện thấy
trong mạch, các tế bào nội mô di cư vào ECM xung quanh, còn trong môi trường
nuôi cấy, sự di cư của các tế bào nội mô xuyên qua collagen và fibrin gel bị suy


13
yếu bởi chất ức chế MMP [13, 17]. Năm 1998, Sato và cs cho rằng: Trong thời
gian tu sửa xương, tế bào hủy xương được phục hồi trên bề mặt xương và sự di
cư của chúng cũng có thể bị phụ thuộc vào MMP. Điều đó đã được chứng minh
khi quan sát các tế bào xương trong môi trường nuôi cấy, nhận thấy rằng các chất
ức chế MMP kìm hãm sự di cư của các tế bào hủy xương qua chất nền collagen
[37].
Sự tăng sinh và chết theo chu trình của tế bào: Mặc dù những nghiên
cứu về vai trò của MMP đối với tập tính của tế bào trong nuôi cấy còn rất ít
nhưng các nhà khoa học đã nhận thấy có sự ảnh hưởng của chúng đối với sự sinh
sôi và tồn tại của tế bào.

Năm 2000, Uzui và cs nhận thấy: Trong môi trường nuôi
cấy, chất ức chế của MMP hoặc chất ức chế hóa học hay một kháng thể trung hòa
có thể ảnh hưởng đến MMP-2 làm giảm đáp ứng với tín hiệu phân chia của các tế
bào cơ trơn mạch máu đến các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet
Derived Growth Factor - PDGF). Sự ảnh hưởng của các MMP có thể là tiêu cực
hay tích cực phụ thuộc vào các tín hiệu sinh tồn được tạo ra bởi các sự kiện cụ
thể đi kèm. Những sự khác biệt trong tác động của MMP được phản ánh thông
qua cơ chất của nó trong mỗi phản ứng [42].
Quá trình hình thành hình thái mô: Brown và cs năm 1997 đã ghi nhận:
Khi các tế bào mỡ được cấy trên màng đáy, chúng di chuyển và tổ chức thành

các cụm đa bào lớn. Khi di chuyển đến một diện tích nhất định, những tế bào này
tiết ra MMP-2. Hoạt động của MMP-2 ức chế sự di cư tế bào và giúp các tế bào
tổ chức thành cấu trúc ba chiều [7]. Ngoài ra, năm 1998, nghiên cứu của Fukuda
và cs đã cho thấy: Sự ức chế hoạt động của các MMP ở thận sẽ thúc đẩy sự phân
nhánh, còn ở tuyến nước bọt thì kìm hãm sự phân nhánh [14]. Như vậy, MMP
đóng một số vai trò khác nhau như: Thay đổi ECM, cho phép sự xâm lấn, lựa
chọn các điểm phân nhánh, tổ chức điều tiết ba chiều, điều tiết quá trình chuyển
đổi từ biểu mô tới trung mô.
Điều khiển các phân tử mang hoạt tính sinh học: Hoạt động của MMP
có thể dẫn đến sự hoạt hóa hay bất hoạt của các phân tử mang hoạt tính sinh học.
1.2.2.2. Vai trò của họ MMP trong sự tiến triển loại ung thư


14
Nghiên cứu ung thư cơ bản hiện nay phần lớn tập trung vào các đột biến
gen. Tuy nhiên, chất nền ngoại bào của khối u và các tế bào lân cận khối u, các tế
bào soma cũng có những ảnh hưởng nhất định trong sự tiến triển khối u. Khi đi
sâu nghiên cứu, các nhà khoa học nhận thấy rằng các MMP có thể thay đổi vi
môi trường xung quanh khối u và biểu hiện của các MMP ở các mô ung thư tăng
cao hơn so với ở mô bình thường.
Sáu dấu hiệu cơ bản trong sinh lý học tế bào làm nền tảng cho ung thư đó
là: Tự tạo ra các tín hiệu tăng trưởng, không đáp ứng các tín hiệu ức chế tăng
trưởng, thoát khỏi quá trình chết theo chương trình (apoptosis), sự nhân rộng
không giới hạn, phát triển hệ mạch máu một cách bền vững, cuối cùng là cuộc
xâm lấn mô và di căn (bảng 3). Trước đây, các nhà khoa học chỉ tìm thấy ảnh
hưởng của các MMP trong giai đoạn xâm lấn và di căn. Nhưng những nghiên
cứu gần đây thì lại cho thấy rằng MMP cũng tham gia vào một số giai đoạn của
quá trình phát triển ung thư [16].
Bảng 3: Hoạt động và ảnh hưởng của họ MMP trong sự tiến triển của các giai đoạn ung
thư [16]

MMP Hoạt động Ảnh hưởng
Sự xâm lấn của các tế bào ung thư
Một số MMP như MMP-2 và
MMP-9
Phân giải protein Làm suy giảm các rào cản vật lý
Sự tăng sinh của các tế bào ung thư
MMP-1, -2, -3, -7, -9, -11, -19 Phân tách protein binding - IGF
Tăng sinh
MMP-3, -7
Thay đổi phối tử bám màng của
EGFR (HB-EGF,TGF-α và
Amphiregulin)
MMP-9, -2, -14 Hoạt hóa β-TGF
MMP-7 Thay đổi HB-EGF
Chết theo chương trình của tế bào ung thư
MMP-7 Phân tách phối tử Fas
Chống lại chết theo chương trình
Một số MMPs
Kích hoạt gián tiếp Akt thông
qua hoạt hóa EGFR và IGFR
Tăng sinh mạch máu khối u


15
Một số MMP bao gồm MMP-
2, -9,
MMP-3, -10, -11,
MMP-1, -8, -13
Phân hủy Collagen loại IV Tăng sự tăng sinh mạch máu
Phân hủy collagen loại IV,

XVIII
Giảm sự tăng sinh mạch máu
Kết dính tế bào và di cư
MMP-2 Phân hủy collagen loại IV Điều khiển di cư
MMP-2, -3, -9, -13, -14
Biểu hiện quá mức, có liên quan
tới EMT
Cảm ứng của EMT, Di cư tế bào
MMP-1, -7,
MMP-28
Hoạt hóa α-TGF phân giải
protein
Tác nhân gây cảm ứng mạnh mẽ
của EMT; di cư tế bào
Giám sát miễn dịch
MMP-9
Thay đổi thụ thể α-interleukin-2
trên bề mặt tế bào lympho T
Ngăn chặn các tế bào lympho T
tăng sinh
MMP-9, -2, -14 Thoát khỏi hoạt động của β-TGF
Ngăn chặn các tế bào lympho T
chống lại các tế bào ung thư
MMP-7, -11, -1, -8, -3
Thoát khỏi sự ức chế của α1-
proteinase
Giảm tính nhạy cảm của các tế
bào ung thư với tế bào NK
MMP-7, -8 Phân tách α- và β- chemokines Di cư bạch cầu

16
1.2.3. Một số nghiên cứu về họ MMP ở ung thư đại trực tràng
Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nghiên cứu về cấu trúc
và chức năng của các MMP như: Real-Time PCR, Microarray, lai tại chỗ FISH,
phương pháp hóa mô miễn dịch Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu
về họ MMP và các chất ức chế của các MMP trên đối tượng bệnh nhân UTĐTT
để tìm ra tiềm năng chỉ thị sinh học của chúng.
MMP-1 là một loại collagenase có khả năng làm suy giảm chất nền ngoại
bào, đặc biệt là các collagen loại I, II và III là các thành phần chính của chất nền
kẽ. Năm 2000, Sunami và cs đã nhận thấy mối liên quan giữa mức độ biểu hiện
của MMP-1 với các giai đoạn phát triển của ung thư cũng như những tiên lượng
xấu của bệnh khi nghiên cứu 133 bệnh nhân UTĐTT ở Nhật Bản [41]. Trong
nghiên cứu ở 142 bệnh nhân người Nhật Bản, mức độ xâm lấn, sự xuất hiện của
hạch bạch huyết và di căn có liên quan rất lớn với sự gia tăng nồng độ của MMP-
1 [22]. Một nghiên cứu khác của Bendardaf và cs cho thấy MMP-1 có những
biểu hiện khác nhau đáng kể ở giai đoạn bắt đầu và giai đoạn di căn của UTĐTT
như: MMP-1 tăng mức độ biểu hiện khi có sự xuất hiện của các hạch bạch huyết
và giảm mức độ biểu hiện trong quá trình di căn nguyên phát [4].
MMP-13 có cấu trúc khá tương đồng so với MMP-1, có hiệu quả nhất
trong quá trình phân giải collagen loại II. Nghiên cứu của Leeman và cs đã cho
thấy sự gia tăng biểu hiện của MMP-13 dẫn đến sự giảm khả năng sống sót đối
với các bệnh nhân UTĐTT [24]. Khi nghiên cứu MMP-13 và khả năng điều trị
sau phẫu thuật của những bệnh nhân UTĐTT, các nhà khoa học nhận thấy mối
liên quan giữa các bệnh nhân sau phẫu thuật có sự tăng MMP-13 và khả năng tái
phát bệnh là rất lớn [27].
Sự biểu hiện quá mức của MMP-7 được phát hiện ở 80% trường hợp bệnh
nhân UTĐTT [6]. Nồng độ của MMP-7 đã được chứng minh là có liên quan đến
việc thúc đẩy sự tiến triển ở bệnh và giảm khả năng sống ở bệnh nhân UTĐTT
[25]. Việc sử dụng MMP-7 huỳnh quang để thăm dò phát hiện u tuyến polyposis

coli (Apc)
+ / Min-FCCC
(là những u tuyến đại trực tràng phát triển một cách tự
nhiên) thử nghiệm trên chuột đã xác định được 92% các u tuyến ruột đó, cho thấy
một tiềm năng trong việc sử dụng MMP-7 để phát hiện sớm UTĐTT [9].