Phát triển quy trình xác định glyphosat trong mẫu đồ uống bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ NỘI

TRẦN THỊ HÀ

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG
GLYPHOSAT TRONG MẪU ĐỒ UỐNG BẰNG PHƢƠNG
PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2021


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HÀ NỘI

TRẦN THỊ HÀ

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG
GLYPHOSAT TRONG MẪU ĐỒ UỐNG BẰNG PHƢƠNG
PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chun ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. PHẠM HÙNG VIỆT
TS. NGUYỄN HỮU TÂN

Hà Nội - 2021


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn GS.TS. Phạm Hùng
Việt người thầy đã tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cơ tại khoa Hóa học, trường Đại
học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã truyền cho em những kiến thức làm nền tảng để
em hoàn thành luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ trong Trung tâm Nghiên
cứu Môi trường và Phát triển Bền vững - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, các anh
chị em trong nhóm Điện di mao quản, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thanh Đàm và ThS.
Nguyễn Mạnh Huy đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn.
Em cũng xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ về kinh phí từ đề tài nhiệm vụ thường
xun theo chức năng của Phịng thí nghiệm trọng điểm KLATEFOS năm 2020 với mã
số TXTCN.20.05
Cuối cùng là lời cảm ơn gia đình, những người đã cổ vũ và động viên để em
có thể hồn thành cơng việc của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Tác giả luận văn

Trần Thị Hà


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU-------------------------------------------------------------------------------- 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN -------------------------------------------------------- 3
1.1.

Thuốc diệt cỏ glyphosat ----------------------------------------------------- 3

1.1.1.

Lịch sử sử dụng glyphosat ------------------------------------------------- 3

1.1.2.

Cấu tạo và tính chất hóa lý của glyphosat ------------------------------- 3

1.1.3.

Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosat trên thế giới và tại Việt

Nam--------------------------------------------------------------------------------------- 5
1.1.4.

Độc tính của glyphosat ----------------------------------------------------- 6

1.1.5.

Sự tồn tại của glyphosat trong môi trường ------------------------------- 7

1.1.6.

Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MLR) ---------------------------------- 8

1.2.

Tổng quan về trà------------------------------------------------------------- 10

1.3.

Một số phƣơng pháp xác định glyphosat -------------------------------- 12

1.3.1.

Các phương pháp xác định glyphosat ----------------------------------- 12

1.3.2.

Các phương pháp xử lý mẫu trong xác định glyphosat ---------------- 17

1.3.3.

So sánh các phương pháp và đề xuất phương pháp nghiên cứu thích

hợp-------------------------------------------------------------------------------------- 18
1.4.

Tổng quan về phƣơng pháp điện di mao quản ------------------------- 19

1.4.1.

Nguyên tắc của điện di mao quản (CE) --------------------------------- 19

1.4.2.

Detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C⁴D) ------------------------------- 21

1.4.3.

Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp CE – C4D -------------------- 21

1.5.
1.5.1.

Tổng quan về phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) ---------------------- 26
Khái niệm ------------------------------------------------------------------- 26


1.5.2. Ưu điểm của phương pháp chiết pha rắn SPE ----------------------------- 27
1.5.3. Nguyên tắc chọn cột và các yếu tố ảnh hường đến quá trình chiết pha
rắn--------------------------------------------------------------------------------------- 27
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ----------- 29
2.1.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ----------------------------------------- 29

2.1.1.

Mục tiêu nghiên cứu ------------------------------------------------------- 29

2.1.2.

Nội dung nghiên cứu ------------------------------------------------------- 29

2.2.

Hóa chất ----------------------------------------------------------------------- 29

2.3.

Thiết bị ------------------------------------------------------------------------ 29

2.3.1.

Hệ thiết bị điện di mao quản ---------------------------------------------- 30

2.3.2.

Các thiết bị khác ----------------------------------------------------------- 30

2.4.

Chuẩn bị hóa chất và mẫu phân tích ------------------------------------ 31

2.4.1.

Chuẩn bị hóa chất ---------------------------------------------------------- 31

2.4.2.

Chuẩn bị mẫu --------------------------------------------------------------- 31

2.5.

Khảo sát điều kiện hóa học ------------------------------------------------ 32

2.5.1.

Khảo sát thành phần dung dịch điện li nền ----------------------------- 32

2.5.2.

Khảo sát nồng độ histidin ------------------------------------------------- 32

2.5.3.

Khảo sát pH dung dịch điện ly nền -------------------------------------- 32

2.6.

Khảo sát thông số thiết bị -------------------------------------------------- 32

2.6.1.

Khảo sát điện thế tách ----------------------------------------------------- 32

2.6.2.

Khảo sát điều kiện bơm mẫu ---------------------------------------------- 33

2.7.

Khảo sát điều kiện chiết ---------------------------------------------------- 33

2.7.1.

Khảo sát dung môi rửa giải ----------------------------------------------- 33

2.7.2.

Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải ------------------------------------- 34

2.8.

Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích ---------------- 34

2.8.1.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ------------ 34

2.8.2.

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn -------------------------------------- 34

2.8.3.

Độ chụm --------------------------------------------------------------------- 35

2.8.4.

Độ đúng --------------------------------------------------------------------- 35

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ------------------------------------ 36
3.1.

Khảo sát các điều kiện phân tích trên thiết bị CE – C4D------------- 36

3.1.1.

Khảo sát ảnh hưởng của thành phần BGE ------------------------------ 36

3.1.2.

Khảo sát nồng độ của dung dịch đệm------------------------------------ 38

3.1.3.

Khảo sát ảnh hưởng của pH đệm----------------------------------------- 39

3.1.4.

Khảo sát điện thế tách ----------------------------------------------------- 41

3.1.5.

Khảo sát điều kiện bơm mẫu ---------------------------------------------- 43

3.2.

Khảo sát điều kiện làm giàu và tách chiết pha rắn -------------------- 45

3.2.1.

Khảo sát dung môi rửa giải ----------------------------------------------- 45

3.2.2.

Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải ------------------------------------- 46

3.3.

Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp ---------------------------- 48

3.3.1.

LOD, LOQ ------------------------------------------------------------------ 48

3.3.2.

Khoảng tuyến tính và đường chuẩn -------------------------------------- 49

3.3.3.

Đánh giá độ chụm ---------------------------------------------------------- 51

3.3.4.

Độ đúng --------------------------------------------------------------------- 51

KẾT LUẬN --------------------------------------------------------------------------- 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO --------------------------------------------------------- 55

PHỤ LỤC------------------------- ---------------------------------------------------- 62


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tính chất vật lý của glyphosat ------------------------------------------ 4
Bảng 1.2. Sử dụng glyphosat trung bình (kg glyphosat/ha) theo cây trồng tại
một số nước Đông Nam Á ------------------------------------------------------------ 5
Bảng 1.3. Giới hạn cho phép của glyphosat ở Việt Nam ------------------------- 9
Bảng 1.4. Giới hạn glyphosat của các nước trên thế giới ------------------------ 10
Bảng 1.5. Thành phần chính (%) trong trà xanh, trà đen và nước trà ---------- 12
Bảng 1.6. Bảng tổng hợp các tiêu chuẩn quốc gia xác định glyphosat --------- 13
Bảng 1.7. Tổng hợp một số nghiên cứu xác định glyphosat trên thế giới ----- 14
Bảng 1.8. Ứng dụng phương pháp CE – C4D trong phân tích ------------------ 24
Bảng 1.9. Phân loại cột SPE -------------------------------------------------------- 28
Bảng 2.1: Đặc tính cột chiết Oasis - WAX ---------------------------------------- 33
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ tái lặp trên thiết bị CE – C4D --- 51
Bảng 3.2. Kết quả phân tích đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích --- 51
Bảng 1. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ GLY --------------------------- 62
Bảng 2. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ GLY --------------------------- 63


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc của glyphosat --------------------------------------------------- 3
Hình 1.2. Q trình ion hóa của glyphosat ---------------------------------------- 4
Hình 1.3. Sự chuyển hóa của glyphosat thành axit aminometyl-photphonic
(AMPA)-------------------- ------------------------------------------------------------- 7
Hình 1.4. Các loại trà trên thị trường --------------------------------------------- 11
Hình 1.5. Cấu tạo chung của một hệ thiết bị điện di mao quản ---------------- 20
Hình 1.6: Sự hình thành của dịng điện di thẩm thấu ---------------------------- 21

Hình 1.7. Các bước tiến hành kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) -------------------- 27
Hình 2.1. Hệ thiết bị điện di mao quản CE – C4D -------------------------------- 30
Hình 3.1: Điện di đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần BGE ------ 37
Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện tín hiệu glyphosat trong các dung dịch đệm ------ 37
Hình 3.3. Điện di đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ histidin ------------ 39
Hình 3.4. Điện di đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH----------------------- 40
Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện tín hiệu glyphosat tại các pH khác nhau của BGE--------------------- ---------------------------------------------------------------------- 41
Hình 3.6. Điện di đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách ----------- 42
Hình 3.7: Biểu đồ so sánh tín hiệu glyphosat khi thay đổi điện thế tách ------ 42
Hình 3.8. Điện di đồ kết quả khảo sát ảnh hưởng của kỹ thuật bơm mẫu ----- 43
Hình 3.9: Biểu đồ so sánh tín hiệu glyphosat với các kỹ thuật bơm mẫu ------ 44
Hình 3.10. Điện di đồ kết quả khảo sát quá trình chiết và làm giàu glyphosat
trên cột Oasis –WAX ----------------------------------------------------------------- 45
Hình 3.11: Biểu đồ cột kết quả hiệu suất chiết glyphosat ----------------------- 46
Hình 3.12: Biểu đồ cột kết quả hiệu suất chiết glyphosat khi thay đổi thể tích
dung mơi rửa giải -------------------------------------------------------------------- 47
Hình 3.13: Quy trình chiết và làm giàu glyphosat bằng phương pháp chiết pha
rắn----------------------- --------------------------------------------------------------- 48
Hình 3.14. Đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích vào nồng độ glyphosat------------------------------ ---------------------------------------------------------------- 50


Hình 3.15. Đường chuẩn glyphosat ------------------------------------------------ 50
Hình 1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của glyphosat --------------------- 62


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Tên viết tắt
Ace

Axit axetic

ACN

Acetonitril

AMPA

Axit Aminometylphotphoric

BVTV

Bảo vệ thực vật

C4D

Detector độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

CE

Phương pháp điện di mao quản

EPA

Cơ quan bảo vệ mơi trường Hoa Kỳ

EOF

Dịng điện di thẩm thấu

EtOH

Etanol

EU

Liên minh Châu Âu

GC

Sắc ký khí

GLY

Glyphosat

His

Histidin

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC

Sắc ký ion

LC

Sắc ký lỏng

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MeOH

Metanol

MLR

Giới hạn tồn dư cho phép

SD

Độ lệch chuẩn

SPE

Chiết pha rắn

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

MỞ ĐẦU
Glyphosat (GLY) được biết đến là một loại thuốc diệt cỏ thuộc nhóm cơ
photpho, có thể diệt được hầu hết các loại cỏ dại cạnh tranh chất dinh dưỡng với cây
trồng. Glyphosat được nhà hóa học John E. Franz của hãng Monsanto (nay là
Bayer) tổng hợp vào năm 1970 và năm 1974, được công ty Monsanto mang ra thị
trường dưới tên thương mại là Roundup. GLY được sử dụng rộng rãi để kiểm soát
cỏ dại tại khu vực Châu Á và rất ít hoạt chất khác có thể thay thế để trừ cỏ với hiệu
quả và tính năng tương tự. Năm 1982, công ty Monsanto phát triển loại cây trồng
biến đổi gen kháng GLY, chính vì vậy mà mức độ sử dụng thuốc diệt cỏ GLY tăng
vọt, trở thành loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất lịch sử. Một
trong những lý do khác để GLY được sử dụng rộng rãi là vì những báo cáo trước
đấy về GLY cho thấy độ an toàn của chúng đối với môi trường và sức khỏe của con
người, động vật. Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy cần đánh giá lại độc
tính của glyphosat.
GLY trở thành tâm điểm của dư luận thế giới từ tháng 3/2015, khi Cơ quan
Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) trực thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)
công bố kết luận phân loại cho glyphosat là nhóm 2A, tức nhóm có khả năng gây
ung thư cao ở người [43]. Đầu tháng 4 năm 2019, Cục Bảo vệ thực vật (BVTV) Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT) đã công bố Quyết định
1186/QĐ-BNN-BVTV về việc loại thuốc BVTV chứa hoạt chất GLY ra khỏi danh
mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam. Từ ngày 9/6/2019, Việt Nam
chính thức cấm nhập khẩu và sử dụng các loại thuốc BVTV chứa hoạt chất
glyphosat.
Tuy nhiên, việc glyphosat được sử dụng rộng rãi để diệt cỏ cho nhiều loại
cây trồng bao gồm ngô, hạt đậu nành, hạt cải dầu, lúa mì, lúa mạch và các loại đậu
ăn được…. có thể dẫn đến dư lượng GLY và chất chuyển hóa chính của nó là axit
aminometyl- photphonic (AMPA) trong cây trồng lúc thu hoạch, cũng như trong
thực phẩm chế biến. Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Vương quốc Anh (FSA) đã

1


tiến hành kiểm tra và phát hiện dư lượng glyphosat trong một số mẫu thực phẩm
[43].
Đồng thời việc sử dụng GLY vào cuối vụ trong hỗ trợ thu hoạch là một lý do
góp phần làm tăng tần suất và mức dư lượng trong một số sản phẩm thực phẩm làm
từ ngũ cốc. Việc sử dụng vào cuối vụ như vậy thường dẫn đến mức dư lượng cao
hơn nhiều trong các sản phẩm thu hoạch. Vì vậy để đảm bảo an toàn cho sức khỏe
người tiêu dùng, hiện nay cần quan tâm đến việc xác định dư lượng GLY trong
những thực phẩm, đồ uống được chế biến từ những sản phẩm liên quan [43].
Do tính chất phân cực cao, tan tốt trong nước và ít tan trong các dung mơi
hữu cơ thơng thường nên GLY là một hoạt chất khó xác định. Hiện nay, trong Tiêu
Chuẩn Việt Nam (TCVN) đã có quy trình hướng dẫn xác định GLY và chất chuyển
hóa chính AMPA bằng phương pháp sắc ký khí (GC) kết hợp với detector khối phổ
(MS) xác định glyphosat trong mẫu thực phẩm [9]. Một phương pháp khác cũng
khá phù hợp và phổ biến để xác định GLY là phương pháp sắc ký lỏng (LC hoặc
HPLC), sử dụng detector tử ngoại (UV) hoặc khối phổ (MS) hoặc hai lần khối phổ
(MS/MS) [47]. GLY cũng có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký ion (IC),
detector UV; điện di mao quản (CE) với detector UV – Vis [22, 27, 36], huỳnh
quang và MS. Trong những năm gần đây, phương pháp điện di mao quản (CE) là
một trong những phương pháp phổ biến được sử dụng để xác định GLY trong mẫu
thực phẩm, với các ưu điểm nổi trội như thiết bị nhỏ gọn, hoạt động đơn giản, lượng
mẫu và các dung mơi hóa chất ít, chi phí đầu tư và vận hành thấp, từ đó cho chi phí
phân tích mẫu thấp hơn so với các phương pháp phân tích hiện đại khác. Đặc biệt
khi kết hợp CE với detector độ dẫn khơng tiếp xúc C4D, cho phép xác định GLY
nhanh chóng, trực tiếp, khơng cần dẫn xuất hóa. Tuy nhiên, tính đến nay, các
nghiên cứu về việc sử dụng phương pháp CE - C4D để xác định GLY tại Việt Nam
còn rất hạn chế. Vì những lý do trên, tơi đã lựa chọn đề tài “Phát triển quy trình
xác định dư lượng glyphosat trong mẫu đồ uống bằng phương pháp điện di mao

quản”

2


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.

Thuốc diệt cỏ glyphosat

1.1.1. Lịch sử sử dụng glyphosat
Glyphosat được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1950 bởi nhà hóa học Henri
Martin của cơng ty dược phẩm Cilag Thụy sĩ [45, 52]. Tuy nhiên, hoạt tính diệt cỏ
của glyphosat chỉ được khám phá ra cho đến tháng 5 năm 1970 bởi tiến sĩ John
Franz của công ty Monsanto (Mỹ) [45]. Glyphosat được đưa ra thị trường lần đầu
tiên dưới tên thương mại là Roundup vào giữa năm 1974 [52]. Ban đầu, loại thuốc
diệt cỏ này được nông dân và chủ trang trại phun chủ yếu để diệt cỏ dại trước khi
trồng, để kiểm soát cỏ dại trên đồng cỏ và các khu vực không trồng trọt. Các nghiên
cứu thời điểm bấy giờ cho thấy tính an tồn của glyphosat đối với sức khỏe con
người và mơi trường cùng với hiệu quả diệt cỏ nên lượng sử dụng glyphosat tăng
nhanh chóng. Đến năm 1996, cơng ty Monsanto phát triển loại cây trồng kháng
glyphosat, chính vì vậy, glyphosat đã vươn lên vị trí dẫn đầu trên thị trường thuốc
trừ sâu và trở thành hoạt chất diệt cỏ được bán trên thị trường nhiều nhất vào những
năm 90 [52].
1.1.2. Cấu tạo và tính chất hóa lý của glyphosat
Glyphosat là một chất rắn kết tinh màu trắng có cơng thức phân tử là
C3H8NO5P tồn tại dưới dạng ion lưỡng cực (zwitterion). Glyphosat có khả năng hịa
tan tốt trong nước và hịa tan được trong một số dung mơi hữu cơ như metanol,
etanol, aceton. Cấu trúc phân tử glyphosat được thể hiện ở hình 1.1 và các tính chất
vật lý khác của glyphosat được trình bày ở bảng 1.1[28].

Hình 1.1. Cấu trúc của glyphosat

3


Bảng 1.1. Tính chất vật lý của glyphosat
Danh pháp IUPAC

N-(phosphonomethyl)glycin

Cơng thức phân tử

C3H8NO5P

Khối lƣợng phân tử

169,07 g/mol

Áp suất hơi

<10-5 Pa ở 25oC

Điểm nóng chảy

185oC (phân hủy ở 199oC)

Độ hịa tan trong nƣớc

10,1 g/L ở 20oC

Khối lƣợng riêng

1,70 g/cm3

Glyphosat là một phân tử phân cực, lưỡng tính được đặc trưng bởi ba
nhóm chức chính là photphonometyl, amin và cacboxymetyl. GLY là một axit
hữu cơ yếu với bốn giá trị pKa (pKa 1 = 0,80; pKa2 = 2,60; pKa3 = 5,60; pKa4 =
10,6), có nghĩa là đặc điểm của phân tử phụ thuộc vào giá trị pH của dung dịch.

Hình 1.2. Quá trình ion hóa của glyphosat
Glyphosat có khả năng phản ứng điển hình của nhiều α-amino axit bậc hai,
nhưng khả năng hịa tan thấp trong dung dịch nước và dung mơi hữu cơ làm cho
một số chuyển đổi khá khó khăn. Các phản ứng quan trọng nhất của glyphosat là
phản ứng este hóa, khử nước, N-alkyl hóa, N-acyl hóa, N-sulfonyl hóa và sự hình
thành các halogenua acyl và photphonyl.

4


1.1.3. Tình hình sử dụng thuốc diệt cỏ glyphosat trên thế giới và tại Việt Nam
Glyphosat được đăng ký vào năm 1974 tại Mỹ. Năm 1995, nơng dân trên
tồn thế giới đã sử dụng khoảng 51,3 nghìn tấn glyphosat. Năm 1996, năm đầu tiên
cây trồng biến đổi gen, cây trồng kháng glyphosat được trồng đại trà ở Mỹ,
glyphosat chiếm 3,80 % tổng khối lượng hoạt chất diệt cỏ được ứng dụng trong
nông nghiệp [52], đồng thời lượng sử dụng glyphosat trên tồn thế giới cũng thay
đổi nhanh chóng, ước tính có khoảng 747 nghìn tấn glyphosat được sử dụng vào
năm 2014 [23]. Dự báo sử dụng glyphosat toàn cầu trong tồn ngành được thực
hiện trong vịng 20 năm từ năm 1994–2014 trong bảng 1.2. Có thể thấy kể từ khi
cây trồng biến đổi gen được giới thiệu vào năm 1996, việc sử dụng glyphosat đã

tăng gấp 15 lần trên toàn thế giới vào năm 2014 [23].
Hoạt chất glyphosat được sử dụng ở Việt Nam từ năm 1994. Trong những
năm qua, lượng glyphosat sử dụng ở Việt Nam rất lớn, mỗi năm khoảng 30.000 tấn,
chiếm 30 % lượng thuốc bảo vệ thực vật nói chung và chiếm 60 % trong nhóm
thuốc trừ cỏ [13]. Glyphosat được sử dụng rộng rãi để phịng trừ cỏ dại cho các lồi
cây chủ lực như cà phê, cao su, chè, mía, lúa, trái cây, ngơ... Bảng 1.2 thống kê
lượng glyphosat trung bình sử dụng cho các loại cây trồng phổ biến tại một số nước
Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam [25].
Bảng 1.2. Sử dụng glyphosat trung bình (kg glyphosat/ha) theo cây trồng tại một số
nước Đông Nam Á
Indonesia

Philipin

Thái lan

Việt Nam

Chuối

3,92

2,82

N/r

2,88

Gạo

0,11

0,71

0,43

0,95

Ngô

1,41

1,41

2,16

1,44

Cây ăn quả

2,82

1,86

3,84

2,88

Rau

3,18

1,80

3,36

2,42

Trà

3,28

N/r

N/r

2,70

Cà phê

0,60

0,95

N/r

2,78

Nguồn: trích xuất từ Kieffmann and Kynetec [25]

5


Nhìn vào bảng 1.2, có thể thấy Việt Nam là một trong những nước sử dụng
thuốc diệt cỏ có chứa hoạt chất glyphosat cho hầu hết các loại cây trồng chủ lực với
lượng lớn. Các sản phẩm từ các loại cây trồng này được sử dụng hầu như hàng
ngày. Chính vì vậy, việc sử dụng một lượng lớn glyphosat có thể dẫn đến sự tồn dư
trong các mẫu thực phẩm và đồ uống, trong đó có trà. Trà là một loại đồ uống khá
phổ biến và được ưa chuộng tại Việt Nam, theo thống kê trong bảng 1.2, trà là một
trong những cây trồng được sử dụng glyphosat nhiều nhất tại Việt Nam cũng như
các nước khác.
1.1.4. Độc tính của glyphosat
Glyphosat là một chất diệt cỏ hòa tan trong nước, vì vậy nó được tích tụ
trong hệ thống nước và đất, đi vào chuỗi thức ăn. Mức độ phơi nhiễm được cho là
an toàn với con người trong một thời gian dài được gọi là ADI. Nó đã được đặt ở
mức 0,30 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày (bw/ngày) ở EU và Canada và 1,75
mg/kg thể trọng ở Hoa Kỳ [14]. Liều gây chết trung bình, LD50 (liều lượng gây tử
vong ở 50 % số cá thể thử nghiệm), của glyphosat theo đường uống ở chuột lớn hơn
4320 mg/kg trọng lượng cơ thể. Độc tính cấp tính qua da (LD50 qua da) ở thỏ lớn
hơn 2000 mg/kg trọng lượng cơ thể. Vì vậy, thuốc diệt cỏ glyphosat được xếp vào
nhóm Độc tính loại III (Thận trọng) [28]. Năm 2015, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư
quốc tế IARC (International Agency for Research on Cancer) thuộc Tổ chức Y tế
thế giới (WHO) công bố kết quả đánh giá khả năng gây ung thư nhóm 2A đối với
thuốc BVTV chứa hoạt chất glyphosat có nguy cơ cao gây các bệnh ung thư máu,
phổi, tiền liệt tuyến [43]. Ủy ban chung của WHO và FAO đã ban hành một báo cáo
vào năm 2016 xác nhận rằng việc sử dụng các công thức glyphosat không gây nguy
hiểm cho sức khoẻ và cũng cho phép các giới hạn ăn vào hàng ngày được chấp nhận
cho độc tính mãn tính. Cơ quan Hóa chất châu Âu (ECHA) duy trì phân loại
glyphosat hiện tại của họ như là một chất gây tổn hại mắt nghiêm trọng và là một
chất độc hại cho sinh vật thủy sinh, nhưng khơng tìm thấy bằng chứng liên quan đến

chất gây ung thư, đột biến, độc hại đối với sinh sản, đến các cơ quan cụ thể. Sau đó,
vào năm 2017, Cơ quan đăng ký các chất độc hại và dịch bệnh, một bộ phận của Bộ

6


Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Hoa Kỳ, đã công bố một nghiên cứu khẳng định và củng
cố nghiên cứu của cơ quan ung thư quốc tế.
Tính đến hiện tại, độc tính của glyphosat vẫn cịn là một vấn đề gây ra tranh
cãi, chưa có sự đồng thuận, thống nhất giữa các nhà nghiên cứu cũng như các nước
trên thế giới. Tuy nhiên, hiện nay, trên 40 nước, bang trên thế giới đều đã ban hành
các quy định pháp lý nhằm điều chỉnh quản lý việc sử dụng glyphosat: Từ không
tiếp tục gia hạn; hạn chế sử dụng; cấm sử dụng theo mục đích phi nơng nghiệp hoặc
từng khu vực đến cấm sử dụng hoàn toàn thuốc trừ cỏ chứa glyphosat [43]. Tại Việt
Nam, các loại thuốc BVTV chứa hoạt chất glyphosat đã chính thức bị cấm nhập
khẩu và sử dụng từ ngày 9/6/2019.
1.1.5. Sự tồn tại của glyphosat trong mơi trƣờng
1.1.5.1.

Trong đất
Điều kiện đất đai và khí hậu ảnh hưởng đến sự tồn tại của glyphosat trong

đất. Các nghiên cứu chỉ ra thời gian bán hủy trung bình của glyphosat trong đất từ 2
đến 197 ngày, trung bình là 47 ngày. Glyphosat tương đối bền với sự phân hủy hóa
học. Con đường chính của q trình phân hủy glyphosat là do hoạt động của vi sinh
vật trong đất, tạo ra AMPA và axit glyoxylic, quá trình phân hủy được biểu diễn
trong hình 1.3. Cả hai sản phẩm này sau đó đều bị phân huỷ thành carbon dioxit
[32].

Hình 1.3.Sự chuyển hóa của glyphosat thành axit aminometyl-photphonic (AMPA)

1.1.5.2.

Trong nước

Trong nước, sự phân hủy glyphosat là không đáng kể dưới điều kiện ánh
sáng tự nhiên ở pH 5; 7 và 9. Thời gian bán hủy trung bình của glyphosat trong

7


nước thay đổi từ vài ngày đến 91 ngày. Glyphosat ở dạng sản phẩm Roundup®
thường được sử dụng cho cây thủy sinh ở vùng nước ngọt và nước lợ. Các nghiên
cứu cho thấy rằng sau đó, nồng độ glyphosat đều giảm nhanh chóng. Glyphosat có
khả năng ơ nhiễm nước mặt khi sử dụng, tuy nhiên ít gây ơ nhiễm nước ngầm thấp
do tính chất hấp phụ mạnh của nó [32].
1.1.5.3.

Trong khơng khí

Glyphosat và tất cả các muối của nó rất ít bay hơi với áp suất hơi dao động
từ 1,84 x 10 -7 mmHg đến 6,75 x 10 -8 mmHg ở 25°C. Khi ở trong khơng khí,
glyphosat khá bền [32].
1.1.5.4.

Trong thực vật

Glyphosat được hấp thụ bởi lá cây và được vận chuyển khắp các bộ phận của
cây. Sự hấp thụ glyphosat qua lớp biểu bì là vừa phải và vận chuyển qua màng tế
bào chậm hơn so với hầu hết các loại thuốc diệt cỏ khác. Do glyphosat liên kết với
đất, cây hấp thụ glyphosat từ đất là không đáng kể. Glyphosat thường tích tụ trong

mơ phân sinh, lá non và mô ngầm. Một nghiên cứu cho thấy xà lách, cà rốt và lúa
mạch chứa dư lượng glyphosat cho đến một năm sau khi sử dụng 1,67 kg glyphosat
trên một mẫu đất. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng glyphosat có thời gian bán hủy
trung bình từ 8 đến 9 ngày trong lớp lá của cây nho đỏ và cây dâu tây được phun
Roundup® [32].
1.1.6. Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép (MLR)
Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép (Maximum Residue Level: (MRL) là
hàm lượng tối đa được cho phép hoặc có thể chấp nhận được trong nơng sản, thức
ăn, mẫu môi trường mà không gây hại cho người sử dụng và vật nuôi khi sử dụng.
Việc quy định MRL ở mỗi quốc gia đối với glyphosat là khác nhau do quan
điểm về độc tính của glyphosat vẫn còn là vấn đề gây tranh cãi giữa các nước. Hiện
tại, Việt Nam đã có tiêu chuẩn quy định giới hạn tồn dư cho phép của glyphosat đối
với một số loại thực phẩm được trình bày ở bảng 1.3 [5]. Và ở bảng 1.4 là giá trị
MLR tại một số nước trên thế giới [14, 19, 37].

8


Bảng 1.3. Giới hạn cho phép của glyphosat ở Việt Nam
Loại

MLR (mg/kg)

Chuối

0,05

Đậu (khô)

2

Hạt ngũ cốc

30

Hạt cây bông

40

Nội tạng ăn được của động vật có vú

5

Trứng

0,05

Đậu lăng (khơ)

5

Ngơ

5

Thịt động vật có vú, trừ động vật có vú ở biển

0,05

Sữa nguyên liệu

0,05

Các loại đậu (khô)

5

Nội tạng ăn được của lợn

0,5

Thịt gia cầm

0,05

Nội tạng ăn được của gia cầm

0,5

Hạt cải dầu

30

Đậu tương (khô)

20

Củ cải đường

15

Mía

2

Mật mía

10

Hạt hướng dương

7

Cám lúa mì

20

Nội tạng ăn được của lợn

0,5

Ngô ngọt (nguyên bắp)

3

9


Bảng 1.4. Giới hạn glyphosat của các nước trên thế giới
Giới hạn tồn

Quốc gia

dƣ trong thực
phẩm

1.2.

Giới hạn tồn

Giới hạn tồn dƣ

dƣ trong chè

trong nƣớc

EU

0,1 mg/kg

2 mg/kg

0,1 µg/L

Canada

-

-

280 µg/L

Mỹ

0,2 mg/kg

-

700 µg/L

Brazil

10 mg/kg

-

500 µg/L

Đức

-

2 mg/kg

-

Nhật Bản

-

1 mg/kg

-

Trung Quốc

-

1 mg/kg

-

Tổng quan về trà
Trà (hay chè) là thức uống phổ biến thứ 2 trên thế giới, chỉ sau nước và là

một loại đồ uống có nguồn gốc từ thiên nhiên. Tất cả các loại trà trên thế giới đều
được làm từ một loại cây, gọi là cây trà (Cemellia Senensis). Hiện nay, trà được bày
bán trên thị trường với nhiều dạng khác nhau: trà tươi, trà khô, trà túi lọc, trà pha
sẵn.
Trà tươi được pha trực tiếp từ lá trà tươi. Trà khô là trà đã được sấy khơ, tùy
vào quy trình chế biến mà được phân ra làm 3 nhóm chính là: trà xanh, trà ô long,
trà đen. Trà túi lọc là dạng trà nguyên chất được nghiền nhỏ ra đóng trong túi lọc
thành những tép trà. Trà đóng chai là trà đã được ủ và đóng chai trước khi bán và
tiêu thụ. Trong ngành công nghiệp trà và công nghiệp thực phẩm, những sản phẩm
này được gọi là trà pha sẵn.

10


a)

b)

c)

d)
Hình 1.4. Các loại trà trên thị trường
a) Trà tươi b) Trà khô

c) Trà túi lọc

d) Trà pha sẵn

Thành phần hóa học của trà xanh rất phức tạp: protein (15–20 % trọng lượng
khơ) mà các enzym của nó chiếm một phần quan trọng; các axit amin (1–4 % trọng
lượng khô) như teqnin hoặc 5-Netylglutamin, axit glutamic, tryptophan, glycin,
serin, axit aspartic, tyrosin, valin, leucin, threonin, arginin, lysin; carbohydrat (5–7
% trọng lượng khô) như cellulos, pectins, glucose, fructose, sucrose; chất béo như
axit linoleic và -linolenic; sterol như stigmasterol; vitamin (B, C, E); xanthic bazơ
như caffein và theophyllin; sắc tố như chất diệp lục và carotenoid; các hợp chất dễ
bay hơi như aldehyd, rượu, este, lacton, hydrocacbon, v.v.; khoáng chất và các
nguyên tố vi lượng (5 % khối lượng khô) như Ca, Mg, Cr, Mn, Fe, Cu, Zn, Mo, Se,
Na, P, Co, Sr, Ni, K, F và Al. Trà xanh được coi là một nguồn thực phẩm quan
trọng của polyphenol, đặc biệt là flavonoid. Flavonoid là các dẫn xuất phenol được
tổng hợp với số lượng đáng kể (0,5–1,5 %). Các flavonoid chính có trong trà xanh
bao gồm catechin (flavan-3-ols). Trà xanh cũng chứa axit gallic (GA) và các axit
phenolic khác như axit chlorogenic và axit caffeic và các flavonols như kaempferol,
myricetin và quercetin. Một số thành phần chính trung bình của chúng trà và nước
trà được pha từ trà đen được liệt kê trong bảng 1.5. Có thể thấy rằng hàm lượng các

11

thành phần trong trà xanh hay trà đen đều không có sự khác biệt nhiều, hầu hết đều
thơi ra nước trà khi pha với nước sôi với hàm lượng thu được nhỏ hơn [26].
Bảng 1.5. Thành phần chính (%) trong trà xanh, trà đen và nước trà
Hợp chất

Trà xanh

Trà đen

Nƣớc trà

Proteins

15

15

Lượng vết

Axit amin

4

4

3,5

Chất xơ

26

26

0

Carbohydrat khác

7

7

4

Chất béo

7

7

Lượng vết

Sắc tố

2

2

Lượng vết

Chất khoáng

5

5

4,5

Hợp chất phenolic

30

5

4,5

Các hợp chất phenolic bị oxy hóa

0

25

4,5

Trà là một trong những loại cây chủ lực tại Việt, diện tích lớn nhất ở hai
tỉnh Phú Thọ và Quảng Nam. Tính đến năm 1960, Việt Nam xuất cảng 2000 tấn trà
mỗi năm. Đến năm 2007 thì sản lượng trà của Việt Nam đã vượt một triệu tấn, canh
tác trên 125000 hecta. Việt Nam cũng là nước xuất cảng trà đứng thứ năm trên thế
giới. Trong quá trình trồng trọt và chăm sóc, việc nơng dân sử dụng thuốc diệt cỏ

khơng thể tránh khỏi. Theo như bảng số liệu 1.2, trung bình người dân sử dụng
khoảng 2,70 kg glyphosat/ha trồng trà. Là một trong những đồ uống phổ biến nhất
tại Việt Nam cũng như trên thế giới, việc kiểm soát và đánh giá dư lượng thuốc bảo
vệ thực vật nói chung và dư lượng glyphosat nói riêng là khá quan trọng. Nhiều
nước trên thế giới cũng đã đưa ra giới hạn tồn dư cho phép của glyphosat trong trà
được liệt kê trong bảng 1.5.
1.3.

Một số phƣơng pháp xác định glyphosat

1.3.1. Các phƣơng pháp xác định glyphosat
Glyphosat là một hợp chất phân cực mạnh, trong thành phần hóa học khơng
có nhóm mang màu, tan tốt trong nước và ít tan trong các dung môi hữu cơ thông

12


thường nên GLY là một hoạt chất khó xác định. Nhiều phương pháp sắc ký đã được
phát triển cho việc phân tích glyphosat như sắc ký khí (GC), điện di mao quản (CE),
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hiện tại, Việt Nam cũng đã ban hành các
TCVN quy định các phương pháp tiêu chuẩn để xác định glyphosat trong nước ăn
uống cũng như các mẫu thực phẩm. Các phương pháp này được trình bày trong
bảng 1.6.
Bảng 1.6. Bảng tổng hợp các tiêu chuẩn quốc gia xác định glyphosat
Giới hạn
Nền mẫu

Phƣơng

phát hiện/

Nguyên tắc

pháp

Phạm vi áp
dụng

TCVN

Thực

11492:2016

phẩm có

GC – MS

nguồn gốc
thực vật

Tạo dẫn xuất trực tiếp
bằng

hỗn

hợp

của

trifluoroaxetic anhydrid
và

0,050 mg/kg
đến 2,0
mg/kg [9]

heptafluorobutanol.

Các nhóm chức amin
được tạo dẫn xuất để
hình thành các dẫn xuất
tương

trifluoroacetyl

ứng. Các nhóm chức axit
carboxylic

và

axit

phosphonic được tạo dẫn
xuất

để

hình

thành

heptafluorobutyl

este

tương ứng.
TCVN

Thuốc bảo HPLC

12473: 2018 vệ

– Xác định trực tiếp

thực UV

vật

13

[10]


TCVN 2019

Nước

ăn HPLC

uống

– Tạo dẫn xuất sau cột

LOD = 0,3

Mẫu thử được được phân µg/L [11]

FLD

tách trực tiếp bởi cột
HPLC trao đổi cation,
sau đó được oxy hóa
bằng canxi hypochlorit.
Sản phẩm (glycin) sau đó
được kết cặp với phức
chất o-phthalaldehyd-2mercaptoethanol.
TCVN:

Nơng sản LC

2020

có nguồn MS/MS
gốc

– Xác định trực tiếp

LOQ = 0,05
mg/kg [6]

thực

vật
Ngoài những phương pháp tiêu chuẩn được quy định tại Việt Nam, nhiều
phương pháp tiếp cận để phát hiện dư lượng glyphosat (GLY) như sắc ký lỏng (LC)
hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC) và sắc ký ion (IC) kết hợp
với các detector như UV – Vis, MS, huỳnh quang đối với các phương pháp sắc ký
hay detector quang hóa ngọn lửa (GC/FPD) [35], detector ion hóa ngọn lửa
(GC/FID) [39] và detector nitơ - photpho (GC/NPD) [33] đối với phương pháp GC
đã được nghiên cứu và phát triển bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới. Các nghiên
cứu này được trình bày trong bảng 1.7.
Bảng 1.7. Tổng hợp một số nghiên cứu xác định glyphosat trên thế giới
S
T

Tác giả

T
1

Dana
Pupke

Nền

Phƣơng

Phƣơng pháp

mẫu

pháp

xử lý mẫu

Nước
và biển

Xác định

LC-

Chiết tách và xác định trực

MS/MS

làm

giàu tiếp

14

Các kết quả
thu đƣợc

LOD = 4 µg/L


cộng

sự

glyphosat bằng
2 cột trao đổi

[47]

ion (Chelex và
AG 1-X8)
2

Chiết và làm

Độ nhạy cao,

giàu qua cột

Yasushi
NAGATO
MI

và

cộng

sự

[44]

Bia, trà

SPE

và

LC-

nguyên

MS/MS

Inertsep

SAX
500mg/6cc và

liệu

với LOQ là 10
Xác định trực mg/kg.
tiếp

H%

Oasis MCX

đối

với

glyphosat

từ

89,2 % - 97,5 %
3

T.VNedelk Nước

HPLC

oska

FLD

và

– Lọc mẫu qua Tạo dẫn xuất H% = 94 %
màng lọc 0,45 trước cột với RSD% = 5,4

G.K-C

µm, thêm Natri FMOC-Cl

MDL

Low [46]

thiosulfate

0,16 μg/L

để trong 30 phút

=

phân hủy Clnếu cần.
4

Elisabet

Đất và GC - MS

Glyphosat

Borjesson

nước

được chiết tách với

và cộng sự ngầm

và

[24]

qua

làm

Tạo dẫn xuất LOQ = 0,1 µg/L
(nước ngầm)

sạch trifluoroacetic

µg/g (đất)

cột anhydride

Chelex-100 và (TFAA)
cột AG 1-X8

LOQ = 0,006

and

trifluoroethano
l (TFE).

5

Hong

Nước

Heng

See uống

và

cộng

CE – C4D

Làm giàu mẫu xác định trực Với LVSS: làm
trực tiếp bằng tiếp

giàu

2 kỹ thuật: Xếp

lần.

15

được

53