Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (manihot esculenta crantz) tại một số tỉnh đông nam bộ luận án tiến sĩ bảo vệ thực vật 62 62 01 12

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN ĐỨC THÀNH

NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN
(Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ

Chuyên ngành:

Bảo vệ thực vật

Mã số:

62 62 01 12

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Hà Viết Cường
2. TS. Trịnh Xuân Hoạt

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án
là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn,
các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Đức Thành

i


LỜI CẢM ƠN
Luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ
bệnh chổi rồng và bệnh thán thư hại sắn” do Bộ Nơng nghiệp và PTNT cấp kinh phí
thực hiện cho TS. Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài và đã được cho phép sử dụng
trong luận án.
Để hoàn thành bản luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được
rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của q thầy, q cơ và người thân.
Tơi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Hà Viết Cường và TS. Trịnh
Xuân Hoạt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện và hồn thành
luận án này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi xin cảm
ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo,
Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực
nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các
vấn đề, giải pháp, trong q trình thực hiện đề tài và hồn thành bản luận án.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ kỹ thuật và bà con nông dân tại nhiều nơi đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tơi xin gửi

lời tri ân tới tất cả người thân trong gia đình, những người luôn bên cạnh động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Đức Thành

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt .................................................................................... vi
Danh mục bảng .............................................................................................................. viii
Danh mục hình ...................................................................................................................x
Trích yếu luận án ............................................................................................................ xii
Thesis abstract................................................................................................................ xiv
Phần 1. Mở đầu ................................................................................................................1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................1

1.2.

Mục tiêu của đề tài...............................................................................................2

1.3.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................2

1.4.

Những đóng góp mới của đề tài...........................................................................3

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................3

Phần 2. Tổng quan tài liệu ..............................................................................................5
2.1.

Cây sắn ................................................................................................................5

2.1.1.

Lược sử nguồn gốc và phân loại cây sắn .............................................................5

2.1.2.

Giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng...................................................................5

2.1.3.

Tình hình sản xuất sắn trên thế giới.....................................................................5

2.1.4.

Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam ...................................................................6

2.2.

Phytoplasma hại thực vật .....................................................................................7

2.2.1.

Lịch sử phát hiện phytoplasma ............................................................................7

2.2.2.

Phân loại phytoplasma .........................................................................................7

2.2.3.

Tầm quan trọng của phytoplasma ......................................................................12

2.2.4.

Đặc điểm hình thái phytoplasma .......................................................................13

2.2.5.

Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra..........................................................14

2.2.6.

Cơ chế gây bệnh của phytoplasma ....................................................................14

2.2.7.

Sự đa dạng của phytoplasma .............................................................................15

2.2.8.

Lan truyền của phytoplasma ..............................................................................16

2.2.9.

Phương pháp chẩn đoán phytoplasma ...............................................................20

iii


2.2.10. Biện pháp phòng chống..................................................................................... 26
2.3.

Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn ............................................. 27

2.4.

Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam ....................... 32

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 36
3.1.

Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................... 36

3.1.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 36

3.1.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 37

3.2.

Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 37

3.2.1.

Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn ............................... 37

3.2.2.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR........ 37

3.2.3.

Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn ........................... 38

3.2.4.

Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII

hại sắn ......................................................................................................................... 38

3.2.5.

Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do
phytoplasma gây ra ........................................................................................... 38

3.3.

Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 39

3.3.1.

Phương pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn ................ 39

3.3.2.

Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử,
nhuộm mô và PCR ............................................................................................ 40

3.3.3.

Phương pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ ....................................... 44

3.3.4.

Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII
hại sắn ............................................................................................................... 46

3.3.5.

Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ
hại sắn do phytoplasma gây ra .......................................................................... 47

3.4.

Phương pháp tính và xử lý số liệu..................................................................... 50

Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận ................................................................... 51
4.1.

Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ
hại sắn ............................................................................................................... 51

4.1.1.

Mô tả triệu chứng bệnh ..................................................................................... 51

4.1.2.

Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn ............................................. 53

4.2.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mơ và PCR ..... 54

4.2.1.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử ................................. 54

iv


4.2.2.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô................................................57

4.2.3.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR ...........................................59

4.3.

Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn ............................65

4.3.1.

Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR ........................................65

4.3.2.

Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP ............................................................75

4.3.3.

Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide ......................84

4.3.4.

Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide...............................86

4.4.

Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII
hại sắn ................................................................................................................94

4.4.1.

Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII .................................94

4.4.2.

Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP .........................99

4.5.

Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do
phytoplasma gây ra ..........................................................................................102

4.5.1.

Ảnh hưởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh .............102

4.5.2.

Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây ................106

4.5.3.

Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng ..................107

4.5.4.

Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số lồi cơn trùng .....110

Phần 5. Kết luận và kiến nghị.....................................................................................118
5.1.

Kết luận............................................................................................................118

5.2.

Kiến nghị .........................................................................................................119

Danh mục các cơng trình cơng bố .................................................................................120
Tài liệu tham khảo .........................................................................................................121
Phụ lục .........................................................................................................................138

v


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu, chữ viết tắt

Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh

CT

Cơng thức

µl

Microliter

A. laidlawii

Acholeplasma laidlawii

BIP

Backward internal primer (Mồi ngược dòng bên trong)

BLAST

Basic local alignment search tool
(Cơng cụ tìm kiếm chuỗi tương đồng cơ bản cục bộ)

bp

Base pair (Cặp bazơ)

Ca. Phytoplasma

Candidatus Phytoplasma

CRD

Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên)

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

DAPI

4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride

DNA

Deoxy nucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EtOH

Ethanol

FAO

Food and agriculture organization
(Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp Quốc)

FIP

Forward internal primer (Mồi xi dịng bên trong)

IRPCM

International research project for comparative mycoplasmology
(Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma)

kb

Kilo base

LAMP-PCR

Loop mediated isothermal amplification - PCR
(Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt)

M. esculenta

Manihot esculenta

ml

Mililiter

nm

Nanometer

nts

Nucleotides

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

vi


RFLP

Restriction fragment length polymorphism
(Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn)

rRNA

ribosomal ribonucleic acid

TAE

Tris-acetate acid EDTA

TEM

Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua)

UPGMA

Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phương pháp
ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng)

vii

DANH MỤC BẢNG
TT

Tên bảng

Trang

2.1.

Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome ................... 8

2.2.

Thành phần các nhóm cơn trùng bộ Hemiptera là môi giới truyền
phytoplasma ...................................................................................................... 17

2.3.

Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã được công bố ............................... 23

2.4.

Danh sách các nhóm phytoplasma hại sắn đã được xác định dựa vào phân
tích phân tử ........................................................................................................ 32

3.1.

Các cặp mồi được sử dụng để phát hiện phytoplasma trên cây sắn .................. 42

4.1.

Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại các điểm điều tra ở
một số tỉnh (năm 2011) ..................................................................................... 53

4.2.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử ................................. 55

4.3.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm DAPI (năm 2014) ....................... 57

4.4.

Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7R16F2n/R16R2 ................................................................................................. 60

4.5.

Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 ............................................................................................. 63

4.6.

Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi
R16F2n/R16R2 ................................................................................................. 66

4.7.

Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc được của sản phẩm PCR lồng
dùng cặp mồi R16F2n/R16R2........................................................................... 67

4.8.

Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi
R16mF2/R16mR1 ............................................................................................. 70

4.9.

Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc được của sản phẩm PCR lồng
dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 ...................................................................... 71

4.10.

Danh sách các mẫu phytoplasma hại sắn đã được đăng ký trên Ngân
hàng Gen ........................................................................................................... 74

4.11.

Danh sách các mẫu dùng trong phân tích RFLP mô phỏng .............................. 77

4.12.

Mức tương đồng di truyền dựa trên mơ hình cắt RFLP mơ phỏng vùng
gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn ................. 83

4.13.

So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome
của các mẫu phytoplasma hại sắn ..................................................................... 85

viii

4.14.

Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại
Việt Nam............................................................................................................92

4.15.

Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết
kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII ...........................................97

4.16.

Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII..............98

4.17.

Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số
chiết từ cây.........................................................................................................99

4.18.

Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR
tinh sạch ...........................................................................................................100

4.19.

Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn khác nhau bị
bệnh chổi phù thuỷ ..........................................................................................101

4.20.

Ảnh hưởng của đất trồng và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh
chổi phù thuỷ hại sắn (Đồng Nai, năm 2012) ..................................................103

4.21.

Ảnh hưởng của nguồn vật liệu hom giống đến tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ
(Đồng Nai, năm 2013) .....................................................................................105

4.22.

Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua phương pháp
ghép (Đồng Nai, năm 2012) ............................................................................106

4.23.

Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng
Nai, năm 2012) ................................................................................................108

4.24.

Kết quả bẫy đèn thu thập một số loài rầy trên vùng trồng sắn bị nhiễm
bệnh chổi phù thuỷ (Đồng Nai, năm 2012) .....................................................111

4.25.

Xác định khả năng lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn của cơn trùng
thí nghiệm ........................................................................................................114

ix


DANH MỤC HÌNH
TT
2.1.

Tên hình

Trang

Hình thái và kích thước phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch
phloem được chụp dưới kính hiển vi điện tử .................................................... 13

2.2.

Minh họa sự phân bố của phytoplasma trong cơ thể côn trùng môi giới
lan truyền bệnh .................................................................................................. 18

2.3.

Sơ đồ các mồi được sử dụng trong phản ứng LAMP-PCR............................... 24

2.4.

Sơ đồ nguyên lý phản ứng LAMP-PCR............................................................ 25

2.5.

Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ........................................................................ 29

2.6a.

Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ ở vùng São Paulo, Brazil; ................................ 29

2.6b.

Cây sắn bị bệnh biến vàng ở vùng Kuwanda, Uganda ..................................... 29

2.7.

Bệnh da cóc hại sắn ......................................................................................... 29

2.8.

Một số hình ảnh xác định phytoplasma bằng phương pháp hiển vi điện tử
tại Việt Nam ...................................................................................................... 34

3.1.

Lược đồ cụm gen rDNA của phytoplasma, vị trí của các mồi và kích
thước sản phẩm PCR ......................................................................................... 42

4.1.

Triệu chứng bệnh chổi phù thuỷ hại sắn trên đồng ........................................... 52

4.2.

Xác định phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 1, năm 2011) ........ 56

4.3.

Xác định phyttoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử (đợt 2, năm 2011) ....... 56

4.4.

Kết quả thí nghiệm nhuộm DAPI ..................................................................... 58

4.5.

Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7R16F2n/R16R2 ................................................................................................. 62

4.6.

Minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR lồng dùng 2 cặp mồi P1/P7R16mF2/R16mR1 ............................................................................................. 64

4.7.

Phân tích sản phẩm PCR bằng kỹ thuật RFLP.................................................. 75

4.8.

Phân tích đa hình mơ phỏng trình tự nucleotide bằng pDRAW32 ................... 81

4.9.

Phân tích cụm dựa trên số liệu RFLP mơ phỏng vùng gen mã hóa 16S
RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn ở Việt Nam ........................ 82

4.10.

Cây phả hệ xác định nhóm phytoplasma hại sắn được vẽ theo phương
pháp Neighbor-Joining ...................................................................................... 87

4.11.

Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrI.......... 89

4.12.

Cây phả hệ xác định nhóm phụ của phytoplasma hại sắn thuộc nhóm 16SrII ........ 91

x


4.13.

Minh họa một phần vùng gen 16S RNA ribosome chứa các trình tự
phytoplasma nhóm 16SrII với các nhóm cịn lại ...............................................95

4.14.

Vị trí các trình tự trên vùng gen mục tiêu và các mồi tương ứng trong kỹ
thuật LAMP cải tiến ..........................................................................................96

4.15.

Tám đoạn trình tự được lựa chọn để thiết các mồi LAMP cải tiến đặc

hiệu nhóm 16SrII ...............................................................................................96

4.16.

Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ
DNA tổng số chiết từ cây ..................................................................................99

4.17.

Kết quả điện di sản phẩm LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ
sản phẩm PCR tinh sạch ..................................................................................100

4.18.

Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn bị bệnh chổi
phù thuỷ khác nhau ..........................................................................................101

4.19.

Ảnh thí nghiệm ảnh hưởng của đất trồng đến khả năng lan truyền của
bệnh chổi phù thuỷ sắn trong thí nghiệm nhà lưới (năm 2012).......................104

4.20.

Ảnh thí nghiệm xác định khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại
sắn qua phương pháp ghép ..............................................................................107

4.21.

Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng ..................108

4.22.

Một số loài rầy thu thập trên vùng trồng sắn có cây bị bệnh chổi phù thuỷ
tại Đồng Nai (năm 2012) .................................................................................112

xi


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Đức Thành
Tên luận án: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại
một số tỉnh Đông Nam Bộ.
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số: 62 62 01 12

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Chẩn đoán và phân loại được phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh
Đông Nam Bộ; đánh giá được một số đặc điểm sinh học chính như tính gây bệnh và khả
năng lan truyền của chúng.
Phương pháp nghiên cứu
* Vật liệu: Hom sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ được
lấy từ ruộng sản xuất của hộ nông dân. Hom sắn giống KM94 khoẻ.
* Nội dung nghiên cứu:
- Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn.
- Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mơ và PCR.
- Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn.

- Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn.
- Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do
phytoplasma gây ra.
* Phương pháp nghiên cứu:
- Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy
JEOL 1010 và nhuộm với DAPI.
- DNA tổng số được tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả của Doyle and
Doyle (1990). Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được thực hiện theo tài liệu của Deng
and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).
- Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Phân tích RFLP thực hiện mơ phỏng bằng chương trình pDRAW32.
- Sử dụng các phần mềm tin sinh học như ClustalW2, BioEdit 7.0. Cây phả hệ
được xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining trong MEGA 5.0.

xii


- Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai
bằng chương trình IRRISTAT 4.0.
Kết quả chính và kết luận
- Xác định được phytoplasma hại sắn tại Đơng Nam Bộ thuộc ít nhất 2 nhóm gồm
16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A).
- Thiết kế và thử nghiệm được bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho phytoplasma
nhóm 16SrII nhằm chẩn đốn bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ.
- Xác định được một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do
phytoplasma gây ra, trong đó bệnh lan truyền chủ yếu qua việc sử dụng hom giống đã bị
nhiễm bệnh.

xiii

THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Nguyen Duc Thanh
Thesis title: Study on phytoplasma disease on cassava (Manihot esculenta Crantz) in
South-eastern provinces.
Major: Plant Protection

Code: 62 62 01 12

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA).
Research objectives
Diagnosis and identification of phytoplasma disease on cassava in South-eastern
provinces; evaluation of some biological characteristics including the pathogenicity and
transmission ability of identified phytoplasma.
Materials and Methods
* Materials: Cassava varieties KM94, KM419 and SM937-26.
* Research content:
- Investigation of the prevalence of witches’ broom disease on the cassava fields
in south of Vietnam.
- Detection of phytoplasma in cassava tissues by transmission electron microscopy
and DAPI staining technique.
- Molecular identification and phylogenetic analysis of the phytoplasma on
cassava Vietnam.
- Application of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for
detection of the phytoplasma 16SrII group on cassava.
- Evaluation of biological characteristics of phytoplasma disease on cassava under
screen house conditions.
* Methods:
- The presence of phytoplasma in cassava tissues was identified by transmission

electron microscopy and DAPI staining technique.
- Total DNAs were extracted by CTAB method as previously described by Doyle
and Doyle (1990). Polymerase chain reactions were followed the methods of Deng and
Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).
- PCR products from agarose gel were purified by QIAquick gel extraction kit
(Qiagen) according to manufacturer’s instructions.

xiv


- Virtual-restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA gene
was conducted by pDRAW32 program.
- Phylogenetic trees were constructed by Neighbor-Joining method in MEGA 5.0
software.
- Statistical analysis was conducted by IRRISTAT 4.0 software.
Main findings and conclusions
- The study identified two different phytoplasma groups belonging to the 16SrI
(subgroup B) and the 16SrII (subgroup A) from witches’ broom cassava plants grown in
south-eastern provinces of Vietnam.
- The study designed loop mediated isothermal amplification (LAMP) primers
based on the 16S ribosomal RNA gene. LAMP-PCR using these primers demonstrated
to be efficient to detect the phytoplasma 16SrII group on cassava.
- The study provided new scientific data on biological characteristics of
phytoplasma disease on cassava. This disease is mainly transmitted by cutting through
vegetative propagation using diseased cassava plants.

xv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) được trồng rộng khắp ở các tỉnh trong
cả nước với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho người dân,
góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn là cây lương thực, đồng thời
cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm
nguyên liệu sinh học. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nơng sản xuất khẩu
quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây
trồng được ưu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
Ở nước ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh
mới được gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu
chứng đặc trưng do bị nhiễm phytoplasma, như cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn
và phần thân chính, lá biến vàng. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn được ghi nhận xuất
hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng
Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số
tỉnh Đông Nam Bộ như Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai.
Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10-30%, hàm lượng tinh bột
giảm 20-30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay trồng
mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện, gây
quan ngại cho nơng dân và chính quyền địa phương. Do ngun nhân gây bệnh
chưa được xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở một
số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm để
xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên, các
biện pháp này đều khơng có hiệu quả phịng chống bệnh.
Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma.
Bệnh phytoplasma hại sắn đã được ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế
giới như quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nước thuộc châu Mỹ và
châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định được liên quan đến bệnh biến
vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn

thuộc phía đơng bắc nước này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85%
và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm
sút đến 90% cũng đã được ghi nhận (Lozano, 1992).

1


Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Phytoplasma
không thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài
do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh. Con đường lan truyền của phytoplasma
ngoài tự nhiên là qua nhân giống vơ tính và qua cơn trùng mơi giới. Do
phytoplasma khơng nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo nên chẩn đốn và
phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng
gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014).
Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác
nhau và số lượng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm
(Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma
trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trước đây đều chưa phát
hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và
chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã được
xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Hai bệnh này đã gây
thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam.
Phịng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác
nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt
tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đơng Nam Bộ.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Chẩn đoán và phân loại được phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số
tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá được một số đặc điểm sinh học chính như tính gây

bệnh và khả năng lan truyền của chúng.
1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân
loại và một số đặc điểm sinh học.
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ,
xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn. Nghiên cứu
biện pháp chẩn đoán, xác định và phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy
hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu
vại trong nhà lưới.
2


1.3.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu
Điều tra trên đồng, thu thập mẫu được thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam
Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh và
một số tỉnh khác, bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi, Kon Tum.
Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học được thực hiện tại
Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nơng nghiệp Hưng Lộc; nghiên cứu chẩn
đốn, phân loại phytoplasma hại sắn được thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và
Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.
Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài đã xác định được bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do
phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI
(nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). Riêng mẫu phytoplasma hại
sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhưng nằm trong nhóm
phụ hồn tồn mới, chưa được cơng bố.
Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát hiện

phytoplasma hại sắn tại Việt Nam.
Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma
nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ. Đề xuất được quy trình chẩn đốn
phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đơng Nam Bộ.
Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù
thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. Xác định được con đường lan truyền chính
của bệnh là qua nhân giống vơ tính đã bị nhiễm bệnh.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đã xác định được phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại
sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại được phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc 2
nhóm 16SrI và 16SrII. Đã ứng dụng thành cơng các kỹ thuật để chẩn đốn, phân
loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn như kính hiển vi điện tử, kỹ
thuật nhuộm mô cây bằng DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP và kỹ thuật
LAMP-PCR. Xác định được con đường lan truyền của phytoplasma gây bệnh
chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vơ tính.

3


1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Xác định được phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn, cũng như xác
định được con đường lan truyền chủ yếu của phytoplasma hại sắn đã góp phần
đưa ra biện pháp quản lý bệnh chổi phù thuỷ một cách có hiệu quả trong điều
kiện sản xuất tại một số tỉnh Đông Nam Bộ. Biện pháp quan trọng nhất để quản
lý bệnh là phát hiện bệnh sớm và sử dụng giống sạch bệnh.

4

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. CÂY SẮN
2.1.1. Lược sử nguồn gốc và phân loại cây sắn
Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới của châu Mỹ và được trồng cách đây
5.000-7.000 năm trước Công nguyên (Allem, 2002). Cây sắn được người Bồ Đào
Nha đưa đến châu Phi vào khoảng giữa thế kỷ XVI, nhưng việc trồng và tiêu thụ
sắn ở châu Phi mới thực sự phát triển từ cuối thế kỷ XIX (FAO, 2005).
Ở vùng Ấn Độ Dương, sắn được du nhập vào các đảo thuộc trong vùng này,
từ đó sắn được đưa sang Sri Lanka và một số nước phía Đơng thuộc châu Phi. Ở
châu Á, sắn được du nhập vào từ vùng Ấn Độ Dương do người Tây Ban Nha, Bồ
Đào Nha đưa vào trồng. Sự phát triển nghề trồng sắn ở châu Á chỉ trở lên quan
trọng từ cuối thế kỷ XIX. Ở châu Đại Dương, sắn được đem trồng ở Ốt-xtrây-li-a
từ thế kỷ XX. Ở châu Âu hầu như không phát triển nghề trồng sắn (Howeler et
al., 2013).
Về phân loại, cây sắn có tên khoa học là Manihot esculenta Crantz, thuộc
chi Manihot, họ Euphorbiaceae (Howeler et al., 2013).
2.1.2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng
Tuy có nhiều quan điểm khác nhau về giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng,
nhưng sắn vẫn là cây trồng được quan tâm phát triển.
Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và
lương thực - thực phẩm. Củ sắn chứa nhiều tinh bột nên thường được chế biến
thành bột sắn khô. Trong củ sắn tươi có chứa đến 80% hàm lượng carbonhydrate,
canxi (50 mg/100 g), phốtpho (40 mg/100 g), vitamin (25 mg/100 g) và các chất
dinh dưỡng khác. Lá sắn là một nguồn cung cấp protein, có chứa nhiều axít amin
cần thiết nhưng thiếu lysine, methionine và tryptophan (Ravindran, 1992). Ở
nhiều nước, việc nghiên cứu, đánh giá sử dụng sắn như là một nguyên liệu nhiên
liệu sinh học ethanol đang được chú ý (Howeler et al., 2013).
2.1.3. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới
Sắn được trồng ở nhiều nước có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới. Sắn là

nguồn thực phẩm của hơn 800 triệu người, là một trong những cây lương thực

5


quan trọng và chiếm diện tích lớn nhất trong sản xuất nơng nghiệp của lồi
người. Ở nhiều nước có khí hậu nhiệt đới ẩm, sắn là cây lương thực có vị trí hàng
đầu (Howeler et al., 2013).
Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lương thế giới (Food and
agriculture organization, FAO), diện tích, năng suất và sản lượng sắn của toàn
thế giới trong giai đoạn 10 năm từ năm 1999 đến năm 2009 đều tăng, các chỉ số
này vào năm 1999 lần lượt là 16,85 triệu ha; 10,09 tấn/ha và 170,01 triệu tấn, đến
năm 2009 các chỉ số này lần lượt là 18,92 triệu ha; 12,36 tấn/ha và 233,80 triệu
tấn (FAOSTAT, 2014). Vào năm 2009, diện tích trồng sắn của thế giới tập trung
chủ yếu ở các nước châu Phi với 12,26 triệu ha và sản lượng đạt 11,89 triệu tấn.
Các chỉ số này ở châu Á lần lượt là 4,05 triệu ha và 8,16 triệu tấn; ở châu Mỹ
Latinh là 2,59 triệu ha và 3,32 triệu tấn. Các nước thuộc châu Đại Dương cũng có
trồng sắn rải rác nhưng khơng đáng kể. Nigeria là nước có diện tích trồng sắn lớn
nhất thế giới với hơn 3,12 triệu ha và sản lượng đạt 36,80 triệu tấn vào năm 2009
(FAOSTAT, 2014).
Năng suất sắn củ tươi bình quân của thế giới đạt 12,38 tấn/ha vào năm
2009. Ấn Độ là nước có năng suất sắn củ tươi đạt cao nhất thế giới (34,36
tấn/ha), kế tiếp là Thái Lan (22,68 tấn/ha) và Indonesia (18,74 tấn/ha). Thái Lan
là nước xuất khẩu sắn khô lớn nhất, chiếm 77% sản lượng xuất khẩu của thế giới
trong năm 2005. Nước xuất khẩu sắn khô lớn thứ hai là Việt Nam (13,6%), tiếp
theo là In-đô-nê-xi-a (5,8%) và Costa Rica (2,1%) (FAOSTAT, 2014).
2.1.4. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam
Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2015), diện tích cây sắn ở Việt Nam
vào năm 1995 có khoảng 277,4 nghìn ha với sản lượng là 2211,5 nghìn tấn; các
chỉ số này đến năm 2014 lần lượt là 551,9 nghìn ha và 10.255,3 nghìn tấn. Năm

2011, diện tích trồng sắn là cao nhất (558,4 nghìn ha), với sản lượng cũng đạt cao
nhất (9897,9 nghìn tấn). Diện tích và sản lượng sắn tăng lên do nhu cầu của một
số ngành thực phẩm và công nghiệp chế biến. Các vùng gồm Trung du và miền
núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, vùng Đông Nam Bộ
là những vùng trồng sắn chủ lực và có sản lượng sắn đạt cao nhất của cả nước.
Vùng đồng bằng sông Hồng và vùng đồng bằng sơng Cửu Long có diện tích
trồng sắn và sản lượng sắn thấp hơn cả.

6


2.2. PHYTOPLASMA HẠI THỰC VẬT
2.2.1. Lịch sử phát hiện phytoplasma
Năm 1967, phytoplasma gây hại thực vật lần đầu tiên được phát hiện ở
Nhật Bản với hiện tượng cây trồng bị bệnh biến vàng. Lúc đó, phytoplasma được
phát hiện trong tế bào ống rây của mạch phloem cây bệnh có tên gọi là vi sinh
vật giống mycoplasma (mycoplasma like organisms, MLOs) (Doi et al., 1967).
Từ năm 1967-1993, tên gọi MLOs được sử dụng để nghiên cứu tác nhân của
nhiều bệnh biến vàng cây trồng. Đến năm 1994, tên gọi phytoplasma được công
nhận, thay cho tên gọi MLOs tại Hội nghị các Tổ chức Quốc tế ngành
Mycoplasma học (Lee et al., 2000). Cho đến năm 2007, trên thế giới đã phát hiện
hơn 300 loại bệnh khác nhau do phytoplasma gây ra ở hàng trăm loài cây trồng
quan trọng khác nhau (Hoshi et al., 2007).
2.2.2. Phân loại phytoplasma
Việc nghiên cứu tìm hiểu về phytoplasma được bắt đầu vào những năm
cuối thập niên 80 và đầu thập niên 90 của thế kỷ XX. Đầu tiên các phân tích phả
hệ dựa trên các chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome (16S ribosomal ribonucleic
acid gene) và gen mã hóa protein ribosome (ribosomal protein gene) đã xác định
chính xác phytoplasma là thành viên của lớp dịch khuẩn bào (Mollicutes).
Hiện nay, về phân loại, tất cả phytoplasma được xếp vào chi ‘Candidatus

Phytoplasma’ (‘Ca. Phytoplasma’), bộ Acholeplasmatales, lớp Mollicutes, ngành
Firmucutes (IRPCM, 2004; Hogenhout et al., 2008). Dựa trên cơ sở so sánh
chuỗi gen mã hóa 16S RNA ribosome, các lồi thuộc chi ‘Ca. Phytoplasma’
được xếp vào 33 nhóm phả hệ khác nhau (ký hiệu từ 16SrI đến 16SrXXXIII) với
hơn 116 nhóm phụ như trình bày ở bảng 2.1 (Lee et al., 1998; Lee et al., 2004;
Arocha et al., 2005; Al-Saady et al., 2008; Bertaccini and Duduk, 2009;
Bertaccini et al., 2014).
Theo Nhóm nghiên cứu phân loại phytoplasma của Dự án Nghiên cứu
Quốc tế về Mycoplasma (International Research Project for Comparative
Mycoplasmology, IRPCM), một loài phytoplasma được coi là một loài mới thuộc
‘Ca. Phytoplasma’ khi so sánh dựa trên trình tự vùng gen mã hóa 16S
RNA ribosome (trình tự nucleotide  1,2 kb) có mức đồng nhất trình tự
nucleotide thấp hơn 97,5% so với các lồi ‘Ca. Phytoplasma’ đã được cơng bố
trước đó (IRPCM, 2004).

7