Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân tử và sinh học của sán lá gan lớn fasciola spp ở việt nam

..

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
---***---

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,
PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN
FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC
Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
---***---

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,

PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN
FASCIOLA SPP. Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC
Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Ngọc Doanh

Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




Lời cảm ơn
Để hồn thành được cơng trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn đối tới
ban lãnh đạo Viện sốt rét – ký sinh trùng và côn trùng ương, Khoa sinh học
phân tử thuộc viện Sốt rét, phòng Ký sinh trùng, phòng Sau đại học cùng với
ban lãnh đạo viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tơi
trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Ngọc Doanh,
người thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tơi trong
quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này!
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em thuộc khoa Sinh học phân tử
- Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương và phòng Ký sinh trùng
viện Sinh thái và tài ngun Sinh vật đã giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện

đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi.
Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy/cơ trong Hội đồng chấm luận văn
đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của tơi được hồn thiện.
Tơi xin chân thành cảm ơn, người thân, bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ
tôi và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn đến 2 bên Cha, Mẹ
đã vất vả sinh thành, nuôi dưỡng cũng như tạo điều kiện để tơi có được kết
quả như ngày hôm nay. Cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chồng và
con tôi! Những người luôn sát cánh bên tôi và luôn là chỗ dựa tinh thần để
tơi có thể hồn thành tốt nhất luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 Năm 2014

Nguyễn Thị Thu Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu này là do chính tơi thực hiện.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chưa từng cơng
bố trong bất kỳ cơng trình khoa học nào khác.Tơi xin hồn tồn chịu trách
nhiệm về tính trung thực và khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Tác giả

Nguyễn Thị Thu Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Mục Lục
Lời cảm ơn
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá
gan lớn Fasciola spp. ........................................................................................ 4
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn ..................... 4
1.2. Vịng đời phát triển của sán lá gan lớn..................................................... 5
1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới................................. 6
1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn ..................................... 6
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người ............................. 7
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn .................................................... 9
1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam. .................................. 11
1.3.1. Mầm bệnh .............................................................................................. 11
1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bị............................................. 12
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam ..................... 12
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn .......... 13
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam. .......... 15
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 15
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 15

2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 15
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15
2.4.1. Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò: .......................... 15
2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò ......................................................... 16
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn............................... 16
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử ......................................................... 16
2.4.5. Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớn ............................................... 17
2.4.6. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium: ............ 17
2.4.7. Phương pháp gây nhiễm miracidium cho ốc ........................................ 17
2.4.8. Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria 18
2.4.9. Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPPS. ...... 18
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 19
3.1. Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam ................ 19
3.1. 1. Đặc điểm hình thái sán lá gan Fasciola spp. ở Việt Nam.................... 19
3.1.2. Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa
trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 ................................................................ 21
3.1.3. Thảo luận ............................................................................................... 26
3.2. Đặc điểm sinh học của sán lá gan F. gigantica........................................ 30
3.2.1. Sự phát triển của trứng sán lá gan F. gigantica ................................... 30
3.2.2. Đặc điểm sinh học của miracidium ....................................................... 34
KẾT LUẬN .................................................................................................... 51
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành ................................................ 4
Hình 1.2. Vịng đời phát triển của sán lá gan lớn. ............................................ 6
Hình 3.1. Hình thái chung của sán lá gan có ruột và tinh hồn phân nhánh......... 19
Hình 3.2. Các dạng hình thái của sán lá gan lớn thu từ bị ............................. 20
Hình 3.3. Trình tự của TN3-Tây Ninh thể hiện một số vị trí có 2 đỉnh.......... 24
Hình 3.4. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các lồi Fasciola spp. ............... 25
Hình 3.5. Trứng sán lá gan trong nước cất (a) và dung dịch muối 0,85% (b) ...... 31
Hình 3.6. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở nhiệt độ 25-340C ................... 32
Hình 3.7. Miracidium của sán lá gan F. gigantica.......................................... 32
Hình 3.8. Ba lồi ốc Lymnaea ở Việt Nam ..................................................... 39
Hình 3.9. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng sán lá gan ............................ 44
Hình 3.10. Metacercaria sống (a) và chết ở nước muối 1,5% sau 15 phút (b) ..... 48
Hình 3.11. Ảnh hưởng của các nồng độ muối 3 và 5% lên rau dấp cá, rau diếp
và rau ngổ sau thời gian ngâm 15 phút ........................................................... 49
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nước muối 2% đến các loại rau sau khi ngâm 15
phút .................................................................................................................. 50
Hình 3.13. Một muỗng canh muối 20 gram pha trong 1 lít nước để rửa rau
sống ................................................................................................................. 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nước và vùng địa lý ...... 10
Bảng 3.1. Kích thước sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiện cứu ............ 20
Bảng 3.2. So sánh kích thước của các nhóm sán lá gan có hình dạng cơ thể
khác nhau......................................................................................................... 21
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu ................ 22
Bảng 3.4. So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 lồi sán lá gan .................. 23
Bảng 3.5. Sự phát triển của trứng sán lá gan ở các điều kiện khác nhau........ 31
Bảng 3.6. Sự phát triển của trứng sán ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau .... 33
Bảng 3.7. Thời điểm trứng sán nở trong ngày ................................................ 35
Bảng 3.8. Khả năng sống của miracidium ở điều kiện 26-280C ..................... 36
Bảng 3.9. Độ sâu ưa thích của miracidium ..................................................... 38
Bảng 3.10. Kết quả gây nhiễm miracidium sán lá gan cho các loài ốc .......... 40
Bảng 3.11. Thời gian cercaria thoát khỏi ốc và hóa nang............................... 45
Bảng 3.12. Sức sống của nang sán trong các nồng độ muối khác nhau ......... 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




CHỮ VIẾT TẮT
ADN

: Axit deoxyribonucleic

BL

: Body length (chiều dài cơ thể)

PBS

: Phosphate-buffered Saline

BW

: Body width (chiều rộng cơ thể)

CO1

: Cytochrome c oxidase subunit 1

CS

: Cộng sự

CT

: Côn trùng

CW

: Cone width (chiều rộng đầu sán)

ITS

: Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen)

KST

: Ký sinh trùng

NaCl

: Natri clorua

NAD1

: Nicotinamide dehydrogenase subunit 1

PCR

: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase)

SR

: Sốt rét

WHO

: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của đề tài
Bệnh sán lá gan lớn gây nên bởi các loài sán lá Fasciola spp., phổ biến

là 2 loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 và Fasciola gigantica Cobbold,
1855, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và gây thiệt hại cho
ngành chăn nuôi. Hơn thế nữa, sán lá gan còn gây bệnh cho người. Theo tổ
chức Y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn là một trong những vấn đề y tế
quan trọng và luôn được quan tâm nghiên cứu. Người và động vật nhiễm
bệnh sán lá gan lớn do ăn phải rau, cỏ hoặc uống nước lã có chứa ấu trùng
cảm nhiễm metacercaria. Sán trưởng thành ký sinh ở gan vật chủ, gây tổn
thương chủ yếu ở gan, nhưng cũng có thể gây tổn thương ngồi gan khi ký
sinh lạc chỗ (Dalton 1999).
Trong vòng đời phát triển của sán lá gan lớn, trứng được thải ở gan vật
chủ, theo ống dẫn mật xuống ruột và ra môi trường cùng với phân. Gặp điều
kiện thuận lợi, trứng phát triển và nở ra thành ấu trùng miracidium.
Miracidium bơi trong nước, tìm vật chủ trung gian thích hợp để xâm nhập và
phát triển thành các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và cercaria. Cercaria
trưởng thành thốt khỏi ốc, rụng đi hố nang bám vào thực vật thuỷ sinh
hoặc trôi nổi trong nước. Khi vật chủ chính ăn phải thực vật thuỷ sinh hoặc
uống nước có chứa metacercaria của sán lá gan lớn thì chúng phát triển thành
con trưởng thành ký sinh ở gan. Vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan
lớn là ốc nước ngọt, thường là ốc thuộc họ Lymnaeidae. Tuy nhiên, ốc vật chủ
trung gian của các loài sán lá gan lớn, thậm chí của cùng một lồi ở các vùng
địa lý khác nhau có thể là những lồi ốc khác nhau (Dalton 1999). Vì vậy,
việc xác định chính xác vật chủ trung gian của sán lá gan lớn rất quan trọng
trong việc phòng chống bệnh sán lá gan lớn cho gia súc và người.
Ở Việt Nam, số ca bệnh mắc sán lá gan lớn ở người trong những năm
gần đây tăng đáng kể, đặc biệt là ở miền Trung và miền Nam (Trần Vinh
1


Hiển và CS. 2006; Triệu Nguyên Trung và CS. 2012). Vì vậy, sán lá gan lớn
và bệnh sán lá gan lớn ở nước ta được đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Tuy

nhiên, nhiều vấn đề về định loại hình thái, phân tử và vật chủ trung gian chưa
thống nhất. Các thông báo trước đây cho rằng ở Việt Nam tồn tại cả 2 loài sán
lá gan lớn, trong khi những nghiên cứu về phân tử gần đây chỉ phát hiện một
lồi F. gigatica và dạng lai (Lê Thanh Hịa và cs. 2002; Nguyễn Văn Đề
2003; Lê Quang Hưng và cs. 2003; Đặng Tất Thế và cs. 2003; Nguyễn Văn
Khá 2005; Trần Vinh Hiển và cs. 2006; Nguyễn Văn Đề và cs. 2006; Le et al.
2007; Periago et al. 2006; Nguyen et al. 2009; Nguyen et al. 2012). Một số
nghiên cứu cho thấy 2 loài ốc Lymnaea viridis và Lymnaea swinhoei là vật
chủ trung gian của sán lá gan lớn (Phan Địch Lân 1985; Nguyễn Trọng Kim
1997; Nguyễn Trọng Kim và cs. 1997; Lê Hữu Khương và cs. 2001; Vũ Sĩ
Nhàn và cs. 1989; Hồ Thị Nhuận và Nguyễn Ngọc Phương 1987), trong khi
một số tác giả khác chỉ tìm thấy ấu trùng sán lá gan lớn ở ốc L. viridis (Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê 2005; Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung
et al. 2013). Để làm sáng tỏ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn
Fasciola spp. ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài: Làm sáng tỏ đặc điểm phân loại và sinh học của sán
lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
- Cung cấp dẫn liệu chính xác về phân loại và đặc điểm sinh học của sán lá
gan lớn ở Việt Nam.
- Tạo cơ sở khoa học cho cơng tác phịng chống sán lá gan lớn một cách hiệu
quả, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
4. Những điểm mới của luận văn
-

Xác định chính xác sán lá gan lớn ở Việt Nam là loài F. gigantica và có

các cá thể lai hoặc chuyển gen giữa 2 lồi F. gigantica và F. hepatica.
2

- Xác định khả năng sống của trứng sán lá gan trong các dung dịch nồng độ
muối khác nhau, điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Xác định thời điểm nở trong ngày, đặc điểm bơi, độ sâu ưa thích và thời
gian sống của miracidium.
- Khẳng định chỉ có lồi ốc A. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn F.
gigantica (= L. viridis) ở Việt Nam, cịn lồi R. auricularia (= L. swinhoei)
không bị nhiễm.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sức sống của metacercaria, đưa
ra nồng độ muối thích hợp nhất để rửa sau sống an toàn là 2% ngâm trong 15
phút.

3


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vịng đời phát triển của
sán lá gan lớn Fasciola spp.
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn
Vị trí phân loại của sán lá gan lớn như sau:
Ngành (Phylum):

Platyhelminthes Schneider, 173

Lớp (Class):

Trematoda Rudolphi, 1808

Bộ (Order):

Fasciolida Skrjabin et Schulz, 1935

Họ (family):

Fasciolidae Railliet, 1895

Giống (Genus):

Fasciola Linnaeus, 1758

Loài (species):

F. hepatica, F. gigantica

Sán trưởng thành có kích thước lớn, hình lá dẹt (hình 1.1). Khi còn sống cơ
thể màu nâu đỏ. Phần đầu có dạng hình nón, có giác miệng, tiếp theo là hầu,
ruột phân nhánh chạy dọc từ trước ra sau cơ thể. Hai tinh hoàn phân nhánh và
nằm ở phần giữa cơ thể. Buồng trứng phân nhánh, nằm ngay phía trước tinh
hoàn. Tử cung đổ vào lỗ sinh dục nằm ở vùng giác bụng.

Hình 1.1. Hình thể sán lá gan lớn trƣởng thành
( A: F. gigantica

B: F. hepatica)

Hai loài sán lá gan F. hepatica và F. gigantica khác nhau về kích thước
và hình dạng cơ thể. Lồi F. hepatica ngắn hơn và rộng hơn, trong khi loài F.
4

gigantica dài hơn và hẹp hơn. Ngoài ra loài F. hepatica có phần đầu rộng
hơn, làm thành bờ vai, cịn lồi F. gigantica thn hơn (Dalton et al. 1999;
hình 1.1). Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 lồi này về
mặt hình thái.
1.1.2. Vịng đời phát triển của sán lá gan lớn
Trong vòng đời phát triển, sán lá gan lớn trải qua 5 giai đoạn (hình 1.2),
bao gồm:
 Giai đoạn trứng được thải khỏi vật chủ ra mơi trường ngồi: Trứng sán lá
gan lớn được bài tiết theo phân vật chủ ra ngồi mơi trường. Trong mơi
trường nước, trứng phát triển thành ấu trùng miracidium.
 Giai đoạn miracidium tìm kiếm và xâm nhập vào vật chủ trung gian: Trong
mơi trường nước, miracidium tìm kiếm vật chủ ốc thích hợp để xâm nhập vào
vật chủ, chủ yếu là ốc Lymnaea.
 Giai đoạn phát triển và tăng sinh số lượng trong cơ thể ốc: Trong cơ thể ốc,
ấu trùng sán phát triển qua các giai đoạn sporocyt, redia mẹ, redia con, và
cuối cùng là cercaria.
 Giai đoạn cercaria thoát khỏi ốc và hoá nang: Sau khi rời khỏi ốc, cercaria
bơi trong nước và hóa nang thành metacercaria bám vào bề mặt thực vật thuỷ
sinh. Một số metacercaria không bám được vào thực vật thuỷ sinh mà trôi nổi
tự do trong nước.
 Giai đoạn metacercaria được vật chủ cuối cùng ăn và phát triển thành sán
trưởng thành.
Con người và động vật khi ăn thức ăn (rau thuỷ sinh đối với con người và cỏ
đối với động vật) chứa ấu trùng giai đoạn lây nhiễm hoặc uống phải nước có
chứa mầm bệnh thì ấu trùng thốt khỏi vỏ nang trong đường ruột, xuyên qua
niêm mạc ruột vào khoang khúc mạc và sau đó di chuyển tới gan, đường mật.
Ở nhu mơ gan thì quá trình hấp thu dinh dưỡng bắt đầu và gây tổn thương cho

5

gan, gây ỉa chảy, thiếu máu. Sán di chuyển đến mô gan trong thời gian từ 5-6
tuần và cuối cùng đến các ống mật. Sau 3- 4 tháng, sán phát triển thành con
trưởng thành và đẻ trứng. Ở động vật, một cá thể sán trưởng thành có thể đẻ
đến 25.000-50.000 trứng/ngày. Sán trưởng thành có thể sống từ 9-14 năm
trong vật chủ (Boray 1982).

Hình 1.2. Vịng đời phát triển của sán lá gan lớn.
Qua chu trình phát triển trên có thể thấy sự phát triển của sán lá gan
phụ thuộc vào nhiều yếu tố, vật chủ và mơi trường. Vì vậy, nghiên cứu các
yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của sán lá gan sẽ cung cấp cơ sở khoa học
cho việc phịng bệnh thích hợp.
1.2. Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới
1.2.1. Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn
Các nghiên cứu đã cung cấp những bằng chứng cho thấy tính hiệu lực của
2 lồi F. hepatica và F. gigantica, chúng khác nhau về hình thái, vật chủ

6


chính và vật chủ trung gian là ốc ở các vùng địa lý với đặc điểm mơi
trường khác nhau.
Lồi F. hepatica phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu
Âu, Bắc, Trung và Nam Mỹ; Bắc và Trung Á; châu Đại Dương; Bắc, Đông và
Nam Phi; và cả ở các quần đảo lớn như New Zealand, Tasmania, Iceland,
Cyprus, Corsica, Sardinia, Sicily, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippine
và một số đảo của Caribbean. Loài F. gigantica giới hạn ở vùng nhiệt đới và
có mặt ở châu Phi, châu Á, Viễn Đông, Đông Âu. Mặc dù nhiều sách cho
rằng F. gigantica có ở cả phía Nam nước Mỹ và Hawaii, nhưng khơng có

bằng chứng để chứng minh lồi này trên nước Mỹ. Một số vùng có sự phân
bố của cả 2 loài (Dalton 1999). Ở những vùng có sự chồng chéo của 2 lồi
xuất hiện dạng trung gian khó có thể kết luận là lồi nào. Ở châu Á và châu
Phi, có nhiều dạng trung gian đã được phát hiện, một số giống F. hepatica, số
khác giống F. gigantica, và một số dạng trung gian. Sự lai và chuyển gen giữa
2 loài sán lá gan, F. hepatica và F. gigantica đã được thông báo ở các nước
châu Á, như Hàn Quốc (Agatsuma et al. 2000; Choe et al. 2011), Nhật Bản
(Itagaki et al. 2005), Iran (Ashrafi et al. 2006; Amor et al. 2011), Trung
Quốc (Peng et al. 2009; Ai et al. 2011) và Việt Nam (Le et al. 2008) cũng như
các nước châu Phi (Periago et al. 2008; Amer et al. 2011).
Một nghiên cứu hình thái tỷ mỉ và chính xác đã thực hiện để xem liệu có phân
biệt 2 lồi F. hepatica và F. gigantica khơng. Tác giả kết luận rằng các chỉ số
chiều dài/rộng cơ thể (BL/BW) và khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút
cuối cơ thể có ý nghĩa phân biệt 2 lồi (Periago et al. 2006).
1.2.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người
Trâu, bò, cừu là động vật nuôi bị nhiễm sán lá gan lớn nặng nhất. Mặc
dù, dê, ngựa, lợn, hươu và nhiều loài động vật khác cũng có thể bị nhiễm,
nhưng ít quan trọng hơn ở những động vật này. Nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ
nhiễm hai loài được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. Tỷ lệ nhiễm dao
7


động lớn từ 1-81,4%, tuỳ thuộc vào loài gia súc và địa điểm nghiên cứu
(Dalton 1999).
Bệnh sán lá gan lớn ở người là một vấn đề sức khoẻ quan trọng ở nhiều quốc
gia trên thế giới (Dalton 1999). Bệnh sán lá gan lớn ở người thông báo từ
châu Âu, châu Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Đại Dương. Một phân tích tồn
cầu cho thấy mặc dù số ca bệnh sán lá gan lớn ở người không hiếm ở những
nơi có động vặt ăn cỏ bị nhiễm bệnh, tỷ lệ nhiễm cao/thấp ở người không liên
quan đến tỷ lệ nhiễm cao/thấp ở động vật. Tỷ lệ nhiễm cao ở người khơng

nhất thiết phải tìm thấy ở nơi có tỷ lệ nhiễm cao ở gia súc. Ví dụ, ở Bolivia và
Peru tỷ lệ nhiễm ở người cao, trong khi tình hình nhiễm ở gia súc ít quan
trọng hơn so với các nước như Uruguay, Argentina và Chile, nơi mà bệnh sán
lá gan ở người lại ít gặp (Dalton 1999).
Ở châu Âu, bệnh công bố ở 19 nước, chủ yếu từ Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào
Nha và Liên Xô (cũ). Pháp được coi là khu vực dịch tễ quan trọng với gần
6.000 ca bệnh được phát hiện từ 9 bệnh viện trong thời gian 1970-1982. Bệnh
cũng được cho là quan trọng ở Portugal với hơn 1.000 ca mắc trong thời kỳ
1970–1992.
Ở Bắc Mỹ, bệnh xuất hiện rải rác ở Mỹ và Canada. Ở Trung Mỹ, bệnh sán lá
gan lớn là vấn đề lớn ở đảo Caribbean, đặc biệt là của Puerto Rico và Cuba. Ở
Nam Mỹ, bệnh nghiêm trọng ở Bolivia và Peru, và có thể ở cả Ecuador. Ở
Bolivia, vùng dịch tễ cao thấy ở Altiplano, với tỷ lệ nhiễm tới 100%, số người
có nguy cơ nhiễm lên tới 2,5 triệu (Dalton 1999).
Ở châu Á, các ca bệnh được công bố ở một vài quốc gia, trong đó Iran là đáng quan
tâm nhất, ước tính hơn 10.000 ca nhiễm và khoảng 6 triệu có nguy cơ nhiễm.
Ở châu Phi, một số ít ca bệnh nhiễm sán lá gan lớn được thơng báo. Một số
vùng có sự chồng chéo giữa 2 loài F. hepatica và F. gigantica. Loài F.
hepatica phân bố ở các nước bắc Phi (như Morocco, Algeria and Tunisia,
Zimbabwe) và Nam Phi, Kenya và Ethiopia. Loài F. gigantica xuất hiện ở
8


khắp lục địa châu Phi. Đa số các trường hợp cơng bố từ Ai Cập, nơi mà lồi
Fasciola vẫn chưa được xác định ở hầu hết các trường hợp, mặc dù đôi khi F.
hepatica được cho là nguyên nhân gây bệnh.
Ở châu Đại Dương, chỉ có ít ca bệnh nhiễm từ Australia.
Người khơng phải là vật chủ thích hợp của sán lá gan, đa số sán bị giữ ở nhu
mô gan và chết, không đến được ống dẫn mật (Dalton 1999); tuy nhiên, ở
vùng dịch tễ cao sán lá gan lớn thích nghi tốt hơn với vật chủ người. Thời

gian nhiễm ở người chưa biết rõ, nhưng ước tính rằng chúng có thể sống tới
13,5 năm (Dalton 1999).
1.2.3. Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn
Sán lá gan không có mặt ở những vùng mà điều kiện khơng thuận lợi cho sự
phát triển của ốc - vật chủ trung gian, thường là ốc thuộc họ Lymnaeidae. Ốc
Lymnaeidae rất đa dạng về hình thái và thành phần lồi, vì thế hệ thống phân
loại của chúng rất phức tạp, vị trí phân loại của nhiều lồi và giống có sự thay
đổi. Ốc đóng vai trị là vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan khác nhau
tùy thuộc vào loài sán và vùng địa lý.
Vật chủ trung gian của F. hepatica
Ốc điển hình liên quan đến truyền bệnh do F. hepatica là Lymnaea
truncatula. Ốc L. truncatula có khả năng thích nghi với nhiều môi trường
sống như độ cao (>4000m) ở Bolivian Altiplano. Ngồi ra, cịn các lồi ốc
khác. Dưới đây là danh sách các lồi ốc đóng vai trị là vật chủ trung gian của
F. hepatica ở các nước và vùng địa lý (Boray 1985).

9


Bảng 1.1. Vật chủ trung gian của F. hepatica ở các nƣớc và vùng địa lý
Loài ốc

Nƣớc

L. bulimoides

Australia, USA

L. columella

Bắc và Nam Mỹ

L. cousin

Nam Mỹ

L. (Fossaria) cubensis

Bắc và Trung Mỹ, Caribbean

L. ferruginea

Nam Mỹ

L. humilis

Nam Mỹ

L. mweruensis

Kenya

L. ollula (= L. viridis?)

Nhật Bản, châu Âu

L. palustris

châu Âu, Mỹ

L. peregra ovata

châu Âu

L. peregra peregra

châu Âu

L. stagnalis

châu Âu, Mỹ

L. traskii

Nam Mỹ

L. tomentosa

Úc

L. truncatula

Châu Âu

L. (Fossaria) viatrix

Nam Mỹ

L. proxima proxima

Mỹ

L. modicella

Mỹ

Stagnicola montanensis

Mỹ

F. (Galba) bulimoides

Nam Mỹ

G. bulimoides techella

Nam Mỹ

Vật chủ trung gian của F. gigantica
Ốc điển hình liên quan đến truyền sán lá gan F. gigantica là lồi
Lymnaea auricularia. Kendall (1954, 1965) kết luận rằng khơng dễ dàng phân
biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái của các dịng ốc thuộc lồi L. auricularia.
10


Tác giả cho rằng các dòng ốc vật chủ trung gian của sán lá gan ở nam, tây và
đông châu Phi là L. a. natalensis; ở Ấn Độ, Bangladesh và Pakistan là L. a.
rufescens; ốc vật chủ ở Đông Nam Á là L. a. rubiginosa. Một loài ốc tương
tự, L. ollula, là vật chủ của F. gigantica ở Nhật Bản (Uneno and Yoshihara
1974) và Hawaii (Alicata 1938).

Vai trị chính của L. auricularia là vật chủ trung gian của F. gigantica
(Kendall 1954). Tuy nhiên, một số loài ốc khác cũng bị nhiễm F. gigantica.
Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trị là vật chủ trung gian của F.
gigantica ở các nước và vùng địa lý (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Vật chủ trung gian của F. gigantica ở các nƣớc và vùng địa lý
Loài ốc

Nước

L. auricularia/natalensis

Châu Phi, châu Á

L. gedrosiana

Iraq

L. ollula

Nhật Bản

L. peregra

Châu Âu

L. stagnalis

Châu Âu

L. tomentosa

Úc

Biomphalaria alexandrina

Ai cập

1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam.
1.3.1. Mầm bệnh
Một số tác giả cho rằng cả 2 loài sán lá gan lớn đều lưu hành ở Việt Nam
(Phan Địch Lân 1985; Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương 1987; Lê Hữu
Khương và cs. 2001). Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây phân tích phân tử
cho thấy rằng chỉ có lồi F. gigantica và một số cá thể lai giữa lồi F.
hepatica và F. gigantica (Lê Thanh Hịa và cs. 2002; Nguyễn Văn Đề 2003;
Lê Quang Hưng và cs. 2003; Đặng Tất Thế và cs. 2003; Nguyễn Văn Khá
2005; Trần Vinh Hiển và cs. 2006; Nguyễn Văn Đề và cs. 2006; Le et al.
2007; Periago et al. 2006; Nguyen et al. 2009; Nguyen et al. 2012).

11


1.3.2. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bị.
Trước đây, ở nước ta có nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ nhiễm sán lá gan.
Phan Địch Lân (1985) tổng kết tình hình nhiễm sán lá gan ở trâu bò cho thấy
tỷ lệ nhiễm tăng theo lứa tuổi và tăng dần từ miền biển đến miền núi, trung du
và đồng bằng; tỷ lệ nhiễm giao động từ 13,7 - 61,3%. Hồ Thị Nhuận và
Nguyễn Ngọc Phương (1987) điều tra ở các tỉnh miền Nam cho thấy tỷ lệ trâu
bò nhiễm sán lá gan từ 1,4-36,2%. Vũ Sĩ Nhàn và cs. (1989) cơng bố tỷ lệ
trâu bị nhiễm sán lá gan ở ở đồng bằng (44,5%) cao hơn so với ở miền biển
(4,1%). Nguyễn Trọng Kim và Phạm Ngọc Vĩnh (1997) công bố tỷ lệ nhiễm

sán lá gan lớn ở trâu bò tại Hà Bắc (cũ) là 49,95%; ở Nghệ An từ 25,27 –
32,65%; tỷ lệ nhiễm chung ở miền Bắc là 43,56%. Kết quả nghiên cứu của Lê
Hữu Khương và cs. (2001) cho thấy tỷ lệ nhiễm trung bình trên cả nước ở trâu
là 46,23%, dao động từ 8,74 – 61,09%, ở bò là 30,64%, tỷ lệ nhiễm tăng dần
từ miền Nam ra miền Bắc.
Những năm gần đây, Đỗ Đức Ngái và cs. (2006) thông báo tỷ lệ nhiễm sán lá
gan ở Đăk Lăk từ 34,2-62,6%. Nguyễn Khắc Lực và cs. (2010) nghiên cứu tại
Quảng Nam, đã xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên 245 trâu bị cho thấy
tỷ lệ nhiễm chung là 40,8%. Có thể nói, tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu
bị tại một số địa điểm ở nước ta vẫn còn cao.
1.3.3. Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam
Những ca bệnh sán lá gan lớn ở người ở Việt Nam đã được chẩn đoán từ lâu.
Gần đây, số bệnh nhân sán lá gan ngày càng tăng, đặc biệt là ở miền Trung và
Nam (Lê Quang Hưng và cs. 2003; Trần Vinh Hiển và cs. 2006). Riêng tại
phòng khám Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn đã khám và
điều trị cho khoảng 2.600 bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn. Số ca bệnh cao
nhất tại các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt các tỉnh Quảng Nam,
Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Gia Lai (Nguyễn Văn Chương và cs.
2009). Điều tra cắt ngang tại cộng đồng ở Quảng Nam, Quảng Bình, Bình
12


Định, Phú Yên và Gia Lai cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn từ 0,2-2,1%
bằng xét nghiệm phân và 2,4-9,5% bằng ELISA (Lê Quang Hưng và cs.
2003; Đỗ Ngọc Ánh và cs. 2011). Tại các tỉnh miền Bắc, theo số liệu của
Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương trong gần 3 năm (20092011) số ca bệnh sán lá gan lớn đến khám và điều trị tại Viện chiếm 4,6-8,0%
tổng số bệnh nhân nhiễm giun sán đều trị tại Viện, tuy nhiên bệnh nhân chủ
yếu đến từ Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh.
Một số trường hợp bệnh nhân được phát hiện với dấu hiệu sán ký sinh lạc chỗ
trên người, dưới da vùng bụng ở một phụ nữ 40 tuổi tỉnh Gia Lai (Xuan et al.

2005), đầu gối của một bé gái 11 tuổi ở Hà Tây và từ tuyến vú ở phụ nữ 48
tuổi từ tỉnh Quảng Bình (Nguyễn Văn Đề và cs. 2006).
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn
Trước đây, vật chủ trung gian của sán lá gan lớn tại Việt Nam được thơng báo
là 2 lồi ốc L. viridis và L. swinhoei (Phan Địch Lân 1985). Ở Việt Nam có ít
tài liệu về ốc Lymnaea. Duy nhất trong cuốn sách “Định loại động vật không
xương sống nước ngọt Bắc Việt Nam” của Đặng Ngọc Thanh và cs. (1980)
mơ tả 2 lồi L. viridis và L. swinhoei ở miền Bắc Việt Nam. Mặt khác, có rất
ít nghiên cứu về sinh thái của 2 lồi ốc này. Duy nhất có cơng trình của Phan
Địch Lân (1985) cho thấy ốc L. viridis phân bố rộng ở tất cả các vùng, ở vùng
núi chiếm 75% trong số 2 lồi ốc Lymnaea, cịn ở vùng trung du chiếm
66,5%, ven biển chiếm 51,5% và vùng đồng bằng là 42,0%. Loài L. swinhoei
phân bố hẹp hơn, tập trung chủ yếu ở đồng bằng và ven biển, ở vùng núi và
trung du ít hơn, đặc biệt ở miền núi rất ít, có nhiều nơi khơng có. Cũng theo
Phan Địch Lân (1985), trứng ốc có thể nở được quanh năm với tỷ lệ rất cao,
từ 89,1-100% và thời gian nở rất nhanh, mùa hè cần 5,5 ngày, mùa đông xuân
là 8,5 ngày. Về hình thái, có thể phân biệt cá thể trưởng thành của 2 loài ốc
này, tuy nhiên với những cá thể cịn non thì việc phân biệt 2 lồi này không
phải dễ dàng (Đặng Ngọc Thanh và cs. 1980; Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn
13


Thị Lê 2005; Phạm Ngọc Doanh và cs. 2012; Dung et al. 2013). Vì vậy, cịn
có những thơng báo khác nhau về vai trò vật chủ trung gian truyền bệnh sán
lá gan của 2 loài ốc này.
Phan Địch Lân (1985) thơng báo cả 2 lồi ốc L. viridis và L. swinhoei
đóng vai trị là vật chủ trung gian của sán lá gan. Nguyễn Trọng Kim và Phạm
Ngọc Vĩnh (1997) cũng thơng báo cả 2 lồi ốc Lymnaea đều bị nhiễm ấu trùng
sán lá gan với tỷ lệ nhiễm rất cao 43,1-62,1% ở tỉnh Hà Bắc (cũ). Cũng theo
Nguyễn Trọng Kim (1997) cơng bố tỷ lệ nhiễm trung bình ở các tỉnh miền Bắc

ở ốc L. swinhoei là 20,8% và ở ốc L. viridis là 19,6%. Vũ Sĩ Nhàn và cs. (1989)
cũng cho thấy ốc L. swinhoei ở Đak lak nhiễm ấu trùng sán lá gan với tỷ lệ là
40,0-50,0 %. Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương (1987) cũng công bố cả
2 loài ốc ở các tỉnh miền Nam đều là vật chủ trung gian của sán lá gan, nhưng
tỷ lệ nhiễm nhiễm rất thấp (1,1%). Trong khi đó, Nguyễn Thị Lê và cs. (1995)
khơng tìm thấy ấu trùng sán lá gan từ hơn 1.000 ốc Lymnaea ở tỉnh Hà Tây
(cũ). Gần đây, Dang and Nawa (2005) công bố 1,2-2,1% ốc Lymnaea ở tỉnh
Bình Định bị nhiễm ấu trùng sán lá gan; Đỗ Đức Ngái và cs. (2006) thông báo
tỷ lệ nhiễm ở ốc L. swinhoei ở Đak Lak là 0,45%. Kết quả điều tra của Phạm
Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005) cho thấy chỉ 0,06% và 1% ốc L. viridis
ở Đông Anh và Phú Xuyên, Hà Nội bị nhiễm ấu trùng sán lá gan. Phạm Ngọc
Doanh và cs. (2012) điều tra trên toàn quốc chỉ phát hiện ấu trùng sán lá gan ở
ốc L. viridis với tỷ lệ thấp từ 0,6-4,0%. Dung et al. (2013) cũng chỉ phát hiện
ốc L. viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan.
Như vậy, có thể nói vấn đề định loại sán lá gan lớn Fasciola spp. và ốc
vật chủ trung gian của chúng ở Việt Nam chưa được thống nhất giữa các
nghiên cứu. Xác định chính xác những vấn đề này rất quan trọng đối với khoa
học và thực tiễn, giúp cho cơng tác phân loại, tiến hóa và phịng chống bệnh
sán lá gan ở người và động vật, và cần được làm sang tỏ.

14


CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp. ở Việt Nam.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu tại thực địa: Thu mẫu sán lá gan lớn ở bò tại lò mổ của 3 tỉnh
thành đại diện cho 3 miền: Bắc, Trung, Nam là Hà Nội, Nghệ An và Tây

Ninh.
- Phân tích phịng thí nghiệm:
+ Khoa Sinh học Phân tử - Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn Trùng
Trung ương.
+ Phòng Ký sinh trùng – Viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/ 2013 – 12/2014.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Đặc điểm hình thái sán lá gan lớn thu từ bị tại lò mổ ở Hà Nội, Nghệ
An và Tây Ninh.
2.3.2. Đặc điểm phân tử trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 của sán lá gan lớn.
2.3.3. Sự phát triển của trứng sán lá gan lớn và đặc điểm sinh học của
miracidium.
2.3.4. Tính mẫn cảm của ốc Lymnaeidae với ấu trùng sán lá gan lớn qua gây
nhiễm thực nghiệm.
2.3.5. Sức sống của metacercaria sán lá gan lớn ở các nồng độ muối.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò:
-

Mua gan, túi mật của bò từ các lò mổ tại địa điểm nghiên cứu. Dùng

dao rạch ống dẫn mật ở gan và túi mật để thu sán trưởng thành, rửa sạch sán
bằng nước muối 0,85%. Các mẫu sán dùng cho nghiên cứu hình thái được đặt

15


giữa 2 lam kính (nhưng khơng dùng lực ép) trong dung dịch Bouine trong 30
phút, sau đó bảo quản trong cồn 70%.
- Các mẫu dùng để nghiên cứu phân tử được bảo quản trong cồn tuyệt đố.

2.4.2. Phương pháp thu trứng sán từ bò
- Lấy chất dịch từ túi mật bò bị nhiễm sán lá gan lớn lọc bằng nước cất đến
khi sạch để theo dõi sự phát triển của trứng.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn
- Chọn 55 mẫu sán trưởng thành (có trứng ở tử cung) ở mỗi địa điểm nghiên
cứu, gồm các mẫu sán có hình thái và kích thước khác nhau, làm tiêu bản cố
định bằng cách nhuộm carmine alumine. (Periago et al 2006)
- Sán được đo kích thước chiều dài và chiều rộng cơ thể, từ đó tính tỷ lệ chiều
dài/rộng (BL/BW) và đo khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút cuối cơ thể.
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu phân tử
- Chọn đoạn ITS1-5.8S-ITS2 của gen nhân để phân tích.
- Mẫu nghiên cứu gồm: các mẫu sán lá trưởng thành có hình thái khác nhau
tại 3 địa điểm nghiên cứu.
- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu bằng DNeasy kit (QIAgen).
- Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi BD1: 5’GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3’

và

BD2:

5’-TATGCTTAAATT

CAGCGGGT-3’ (Oskouei et al. 2001). Kiểm tra sản phẩm PCR bằng gel
Agarose 2%. Tinh chế sản phẩm PCR bằng bộ hóa chất QIAquick PCR
purification kit.
- Phản ứng giải trình tự được tiến hành với bộ kit Big-Dye terminator cycle
sequencing kit v3.1 (ABI). Trình tự được đọc trực tiếp bằng máy tự động ABI
3100. Đối chiếu các trình tự thu được với các trình tự trong ngân hàng gen
bằng chương trình BLAST. Sử dụng chương trình phần mềm MEGA6
(Tamura et al. 2013) để xử lý, phân tích số liệu, xây dựng cây phát sinh chủng

loại và đánh giá mối quan hệ tiến hóa.
16