Nghiên cứu phân lập phân loại bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực vườn bách thảo hà nội
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.63 MB, 88 trang )
1
..
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI V TI NGUYấN SINH VT
NGUYN VN BC
Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản
một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza
v xenlulaza gặp trong môi trờng đất
khu vực vờn bách thảo - H Nội
LUN VN THC S SINH HC
Chuyờn ngành: Vi sinh vật học
Mã số:
60 42 40
Người hướng dẫn : TS. Lại Văn Hịa
Hà Nội - 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng
tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lại Văn Hịa. Các số liệu và
kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực có
nguồn gốc rõ ràng.
Tác giả luận văn
Nguyễn Văn Bắc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
MụC LụC
ặt vấn đề.................................................................................................................
Chơng 1: Tổng quan tài liệu ......................................................................
1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới........................................................
1.2. Tính đa dạng của vi nấm................................................................
1.3. Vi nấm trong đất............................................................................
1.4. Vai trò của vi nấm trong công nghiệp ...........................................
1.5. Đặc tính đặc trng của vi nấm.......................................................
1.6. Hệ thống phân loại vi nấm.............................................................
1.6.1. Hệ thống phân loại của Robert Shaffer (1969)...........................
1.6.2. Hệ thống của Ainsworth & Bisby (1995)...................................
1.7. Những vấn đề chung về cơ chế sinh hoá và sự phá huỷ sinh học
do vi nấm gây nên.........................................................................
1.7.1. Đặc điểm phá huỷ sinh học do vi nấm .......................................
1.7.2. Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực của sợi nấm - các loại
enzym và các axít hữu cơ .............................................................
1.8. Các phơng pháp bảo quản vi nấm................................................
1.8.1. Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển ......................
1.8.2. Nhóm phơng pháp làm khô ......................................................
1.8.3. Nhóm phơng pháp làm đình chỉ trao đổi chất ..........................
1.9. Lựa chọn các phơng pháp bảo quản ............................................
1.10. Những nghiên cứu về phân loại và bảo quản vi nấm ở Việt Nam....
Chơng 2: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu .........
2.1. Đối tợng nghiên cứu ....................................................................
2.2. Vật liệu nghiên cứu........................................................................
2.2.1. Dụng cụ, thit b .........................................................................
2.2.2. Môi trờng nuôi cấy ...................................................................
2.2.3. Hoá chất và các cơ chất sinh học................................................
2.3. Phơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu.............................................
2.3.1. Phơng pháp lấy mẫu .................................................................
2.3.2. Phơng pháp phân lập.................................................................
2.3.3. Phơng pháp phân loại vi nấm ...................................................
S hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
3
3
4
5
7
8
9
9
10
12
12
13
16
19
20
22
25
26
28
28
28
28
29
29
30
30
30
30
4
2.3.4. Phơng pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi nấm
2.3.5. Phơng pháp bảo quản các chủng nấm sợi.................................
2.3.6. Phơng pháp phục hồi ................................................................
Chơng 3: Kết quả nghiên cứu.....................................................................
3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng
đất khu vực vờn Bách Thảo ........................................................
3.1.1. Thnh phn chng loi vi nấm trong đất vờn Bách Thảo .........
3.1.2. Đặc điểm phân loại hình thái của các chi vi nấm phân lập đợc
3.2. Lựa chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân hủy cơ
chất gelatin và xenluloza phân lập từ môi trờng khu vực vờn
Bách Thảo đa vào bảo quản........................................................
3.3. Kết quả phục hồi của các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân
lập từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Hà Nội sau khi
bảo quản trong glyxerin 10%, -200C và trên silicagel .................
3.4. Khả sinh enzym phân huỷ cơ chất sinh học của các chủng nấm sợi
phân lập đợc từ môi trờng đất vờn Bách Thảo sau bảo quản 18
tháng..............................................................................................
Chơng 4: Bàn Luận ...........................................................................................
4.1. Phân lập, phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực
vờn Bách Thảo ............................................................................
4.2. Lựa chọn các chủng vi nấm có hoạt tính enzym phân huỷ 2 cơ
chất sinh học (xenluloza, gelatin) để đa vào bảo quản...............
4.3. Bảo quản các chủng vi nấm có hoạt tính enzym đà đợc chọn bằng
hai phơng pháp: lạnh sâu (glyxerin 10% ở -200C) và trên silicagel.
4.4. Khả năng sinh enzym phân huỷ các cơ chắt sinh học của các
chủng nấm sợi phục hồi sau bảo quản..........................................
Chơng 5: Kết luận và kiến nghị................................................................
TàI LIệU THAM KHảO ...........................................................................................
S hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33
34
35
36
36
36
40
57
59
66
73
73
75
76
77
79
81
5
Các chữ viết tắt
ATCC
American Type Culture Colletion
CCRC
Culture Collection Research Center
IMI
International Mycological Institute
LS
Lạnh sâu
SLC
Silicagel
TBQ
Trước bảo quản
SBQG
Sau bảo quản glyxerin
SBQS
Sau bảo quản Silicagel
DMSO
Dimethyl sulfoxide
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
Đặt vấn đề
Nm (Fungi) là mt gii sinh vt ph bin trong t nhiờn. Chúng có thể
sinh trởng và phát triển ở khắp mọi nơi, trên mọi loại cơ chất với tốc độ phát
triển nhanh, mạnh. Đa phn cỏc nm đều khơng thể nhìn thấy được bằng mắt
thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh
hoặc kí sinh trên cơ thể động thực vật và nấm khác. Một số lồi nấm có thể nhận
thấy được khi ở dạng thể quả, như nấm lớn và nấm mốc.
Người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài, khoảng 70.000 loài
nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện và miêu tả, tuy nhiên tính đa dạng
của giới Nấm vẫn cịn là điều bí ẩn [29]. Các lồi nấm hoại sinh đóng vai trị
quan trọng trong chu trình tuần hồn vật chất và năng lượng trong tự nhiên. Nấm
có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản, đặc biệt là các
chất khó phân giải như xenluloza, ligin thành chất vơ cơ. Do đó, nó là yếu tố
quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất. Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong
đời sống của con người, chúng có vai trị thực tiễn trong kinh tế, khoa học và các
chu trình vật chất, năng lượng trong tự nhiên [30]. Nhiều lồi nấm được sử dụng
trong cơng nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc các sản phẩm của quá trình
lên men... Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích to lớn đó, nhiều loại nấm lại gây bệnh
cho người, động thực vật [32]. Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về khu hệ vi nấm
trong môi trường không khí tự nhiên, trên các sản phẩm cơng-nơng nghiệp khác
nhau, trong dược phẩm, trong đất,... nhưng với số lượng chưa nhiều.
Ở nước ta, khí hậu nhiệt đới ẩm rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều
loại vi nấm, chúng phong phú cả về số lượng và thành phần chủng loại. Để góp
phần khảo sát sự đa dạng về thành phần chủng loại, đặc tính sinh học và tìm
kiếm các chủng vi nấm mới chưa được phát hiện ở Việt Nam nói chung và ở mơi
trường đất nói riêng, trong lun vn ny chúng tôi tin hnh Nghiên cứu phân
lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và
xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vùc V−ên Bách thảo-Hà Nội’’.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
Mục tiêu của chúng tôi đưa ra là:
1. Phân lập, phân loại một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelainaza và
xenlulaza gặp trong môi trường đất khu vực Vườn Bỏch tho-H Ni
2. Bảo quản các chủng vi nấm đà phân lập đợc bằng một số phơng pháp
bảo quản hiện nay
3. Góp phần xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym
phục vụ cho các nghiên cứu và vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống chuẩn
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập các chủng nấm sợi từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo
2. Phân loại xác định đến chi, loài các chủng nấm sợi đà phân lập đợc.
3. Xác định hoạt tính enzym phân huỷ một số cơ chất sinh học nh
gelatin, xenluloza của các chủng nấm sợi đà phân lập và phân loại.
4. Bảo quản các loài nấm sợi có hoạt tính enzym cao bằng phơng pháp
silicagel và bảo quản trong glyxerin 10% ở nhiệt độ -200C.
5. Phục hồi các chủng vi nấm đà bảo quản sau 18 tháng, kiểm tra độ
thuần khiết, độ sống sót, độ ổn định về hình thái và khả năng sinh enzym
phân huỷ cơ chất sinh học của chúng.
6. Xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ
cho các nghiên cứu và góp phần vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống
chuẩn Việt Nam.
S húa bi Trung tõm Hc liệu – Đại học Thái Nguyên
3
Chơng 1
Tổng quan ti liệu
1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới
Trớc đây, nấm đợc xếp vào một ngành (Mycota) cđa d−íi giíi thùc
vËt bËc thÊp. HiƯn nay nÊm kh«ng còn đợc xem là một ngành của dới giới
thực vật bậc thấp, mà nấm là một giới riêng biệt trong thế giới sinh vật. Theo
Takhtajan (1973): Không có cơ sở nào đáng kể để xếp nấm vào thực vật. Vi
nấm có hàng loạt các đặc điểm riêng biệt sau õy:
- Dinh dỡng: Nấm không dinh dỡng theo kiểu quang hợp nh thực
vật hoặc bằng kiểu nuốt thức ăn nh động vật. Nấm dị dỡng bằng cách hấp
thụ hay thẩm thấu. NÊm hÊp phơ c¸c chÊt dinh d−ìng b»ng c¸ch tiÕt ra ngoài
môi trờng cỏc enzym để phân giải các chất có cấu trúc phức tạp thành nhng
chất có cấu trúc đơn giản sau đó hấp phụ qua màng.
- Cấu trúc tế bào: Các nấm thật (Eumycota) có thành phần hoá học của
vách tế bào là kitin (thực vật có vách tế bào là xenluloza).
- Sinh hoá: Chất dự trữ của nấm là glycogen giống nh ở động vật cũn
thực vật có chất dự trữ là tinh bột. Ngoài ra, nấm còn hình thành các sản phẩm
giống với động vật nh các axớt amin.
- Phơng thức sống: Nấm dị dỡng bằng cách hấp thụ, động vật dị
dỡng bằng cách nuốt thức ăn, thực vật dị dỡng bằng cách quang hợp.
- Cá thể phát sinh: Trong quá trình phát triển cá thể các nấm tiến hoá
cao thì có giai đoạn song hạch ( nm tỳi và nm m), giai đoạn song hạch
không có ở các sinh vật khác.
- Cơ thể dinh dỡng: Sợi phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm, nhng
thực vật có cơ thể dinh dỡng dạng cây có rễ, thân, lá.
- Sinh sản: Nấm sinh sản và phát tán bằng bào tử.
S húa bi Trung tõm Hc liu – Đại học Thái Nguyên
4
Nhờ những thành tựu nghiên cứu v cấu trúc nhân, màng tế bào, ty thể,
cấu trúc phân tử ARN riboxom; thành phần sinh hoá; phơng thức dinh
dỡng thì gianh giới giữa động vật và thực vật bị mờ đi, mà rõ nét là gianh
giới giữa sinh vật không nhân và sinh vật có nhân.
Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau về việc xếp các ngành nấm
vào các giới sinh vËt. Theo hƯ thèng 5 giíi cđa Whittaker (1978) th× các ngành
nấm đợc xếp vào 2 giới khác nhau: Các ngành nấm nhầy tế bào
(Acrasiomycota), nấm nhầy thật (Myxomycota), nấm trứng (Oomycota) và
nấm cổ (Chytridiomycota) đợc xếp vào giới Protoctista; các ngành nấm tiếp
hợp (Zygomycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota), nấm bất
toàn (Deuteromycota) và địa y (Lichenomycota) đợc xếp vµo giíi nÊm. Theo
Whittaker giíi nÊm chØ gåm 2 ngµnh nấm tiếp hợp (Zygomycota) và ngành
nấm thật (Eumycota), trong dó ngành nấm thật bao gồm 4 phân ngành: nấm
túi
(Ascomycotina),
nấm
đảm
(Basidiomycotina),
nấm
bất
toàn
(Deuteromycotina) và địa y ( Lichenes).
Ngoài ra còn có một số hệ thèng kh¸c nh− hƯ thèng 6 giíi cđa Lucile
Mc Cook (năm 2004), hệ thống 7 giới của Bryce Kendrick (2001).
1.2. Tính đa dạng của vi nấm
Vi nấm có khả năng phát triển ở hầu hết các dạng sinh thái, có thể sử
dụng hầu hết các sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm do con ngời làm ra.
Chúng là sinh vật đầu tiên và lý tởng sinh trởng ở vùng hoang dÃ, vì chúng
có khả năng thay đổi để thích nghi với điều kiện sống. Ví dụ, các loài của chi
Aureobasidium có thể sinh trởng ở nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) trên
các hòn đá ở nhiệt độ từ -100 ®Õn -200, cã thĨ chèng chÞu ë nhiƯt ®é thÊp từ 700C đến -800C. Nhng chi này cũng có những loài có thể sinh trởng ở vùng
nhiệt đới. Phần lớn các vi nấm là hiếu khí và sinh trởng ở mụi trng cú hoạt
độ nớc cao. Nhng ngời ta đà phát hiện đợc vi nấm kỵ khí ở dạ cỏ của cừu
(Yarlett và CS, 1986) và cũng đà phát hiện đợc nhiều loài sinh trởng đợc ở
S húa bi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
các cơ chất có hoạt độ nớc thấp (aw <1). Một nhóm lồi nấm mốc đặc trưng,
đáng chú ý là nhóm lồi nấm mốc ưa khơ, gồm các lồi có khả năng tăng
trưởng trên sản phẩm có hoạt độ nước thấp, chúng phát triển được trong các
điều kiện môi trường khô lạnh, trên các sản phẩm sấy khô, cô đặc hoặc ướp
muối, ướp đường. Nhóm lồi nấm mốc đặc trưng này gồm một số loài thuộc
các chi Nấm bất toàn ( Deuteromycotina, Fungi imperfecti) như Aspergillus,
Chrysosporium, Cladosporium,... và Nấm túi như Eurotium, Eremascus,...
Các loài A. Restrictus, E. Rubrum, E. Amstelodami, Wallemia sebi,...gặp được
ở các phịng bảo quản có nhiệt độ 16 ± 10C và độ ẩm tương đối của không khớ
70 2% [1]. Năm 1991, Viện nấm quốc tế (IMI) đà đa ra danh sách các vật
chủ và cơ chÊt cã thĨ ph©n lËp nÊm. Chóng ta cã thĨ phân lập nấm sống ký
sinh, cộng sinh hoặc gây bệnh cho tảo, rêu, thực vật và các loài nấm khác (bao
gồm cả địa y), động vật chân đốt, các động vật không xơng sống và có xơng
sống. Không khí, đất, nớc, phân, thức ăn, các sản phẩm thực vật, dầu khí và
mt s dợc phẩm cũng là nguồn phân lập c vi nấm.
1.3. Vi nấm trong đất
Vi nấm là thành phÇn nhiỊu nhÊt trong sinh khèi cđa hƯ vi sinh vật
trong đất, mặc dù số lợng của chúng trong các đĩa môi trờng pha loÃng khi
phân lập thấp hơn vi khuÈn. Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống của
con người, chúng có vai trị thực tiễn trong nền kinh tế, khoa học và các chu
trình vật chất, năng lượng trong tự nhiên. Vi nÊm lµ vi sinh vật gây mục nát
chính trong đất, đặc biệt là đất rõng, chúng phân giải các chất hữu cơ, các
cành lá khơ của thực vật thành chất mùn, chất khống. Nã tham gia phân huỷ
xenluloza, kitin và licnin trong lớp đất bỊ mỈt, do đó là yếu tố quan trọng làm
tăng phỡ nhiờu ca t. Nấm đất bao gồm các loµi thc líp: Zygomycetes,
Ascomycetes, Deutermycetes, Basidiomycetes vµ mét vµi loµi thuộc họ
Pythiaceae của lớp Oomycetes. Hầu hết chúng sống hoại sinh, mét sè sèng ký
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
sinh hoặc bán kí sinh trên rễ cây. Nhiều loài Basidiomycetes dạng sợi sống ở
trong đất rất khó phân lập bằng các kỹ thuật cơ bản. Chúng sống cộng sinh
đặc hiệu với cây rừng (nấm rễ - ectomycorrhizal), hoặc sống hoại sinh phân
huỷ gỗ, rác. Một số vi nấm có bào tử động thờng sống trong nớc có thể có
mặt trong đất, chúng đợc nghiên cứu bằng các kỹ thuật đặc biệt.
Nấm tồn tại trong đất ở dạng sợi, bào tử (vô tính hoặc hữu tính), bào tử
áo hoặc các thể hạch nấm. Chỉ có giai đoạn sợi mới có các hoạt động trao đổi
chất đáng kể, các giai đoạn sau là giai đoạn ngủ phục hồi cấu trúc, khi ú hoạt
động trao đổi chất ít và có tầm quan trọng hạn chế trong việc chuyển hoá đất.
Nấm sống trong đất hầu hết ở trạng thái ngủ. Để phân tích nấm đất cần có các
hiểu biết về sinh thái học để phân biệt giữa dạng sợi và trạng thái nghỉ của chúng.
Kỹ thuật phân lập nm trong đất bao gồm: Kỹ thuật không đặc hiệu và
kỹ thuật đặc hiệu. Các kỹ thuật này đợc Kjoler và Struwe (1982), Jensen et al
(1986) và Gams (1998) tổng hợp và giới thiệu nh− sau [16]:
Kü thuËt cÊy ®Üa pha lo·ng (Koch’s ches PlattenguBverfahren):
Kỹ thuật này đợc sử dụng nhiều nhất để xác định số lợng các vi
nấm phát sinh bào tử. Đối với vi nấm ít bào tử dùng phơng pháp này
không chính xác.
Kỹ thuật đĩa đất của Warcup (1950)
Trong k thut pha loÃng, một lợng đất lớn hơn có xu hớng lắng
nhanh trong hỗn dịch và mất đi trong quá trình hoà tan, do đó các chủng nấm
trong các phức hợp đất hạt to ít khi phân lập đợc. Kỹ thuật Warcup khắc
phục đợc nhợc điểm này.
Kỹ thuật rửa đất (Parkinsons & Williams 1961, Gams và Domsch 1967)
Hai kỹ thuật đầu đợc sử dụng để phân lập các vi nấm tồn tại ở các
dạng bào tử. Để phân lập các vi nấm từ các mảnh dạng sợi phải dùng phơng
pháp rửa đất. Trong phơng pháp này hầu hết các bào tử đợc loại bỏ. Các
mẫu đất đợc rửa kết hợp với rây, nhờ đó các mảnh nhỏ với các kích thớc
S hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
nhất định đợc phân chia ra và khuấy trong nớc cất vô trùng, rồi chuyển
chúng vào một mảnh giấy lọc, sau cùng đặt các mảnh giấy cha nấm đó vào
đĩa thạch nuôi cấy.
1.4. Vai trò của vi nấm trong công nghiệp
Vi nấm có vai trò to lớn trong công nghệ sinh häc. Con ng−êi sư dơng
nÊm theo nhiỊu c¸ch kh¸c nhau và hiện nay đang phát triển nhanh chóng.
Việc sử dụng nấm lớn nh nấm rơm, nấm sò, nấm hơng làm thức ăn là phổ
biến, nhng hiện nay hệ sợi của các loài Fusarium đợc chế biến thành một
loại protein nÊm thay thÕ cho thÞt (Quorn mycoprotein, Trinci 1992). NÊm
sinh ra một số enzym và đà đợc sản xuất với mục đích thơng mại ví dụ:
A.niger là nguồn thu c -amilaza, Trichoderma cho xenlulaza.
Vi nm còn là nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất hoá chất công
nghiệp: axớt xitric vµ axít gluconic được sản xuất tõ A.niger, axít itaconic từ
A.terreus. Sản phẩm rợu, bia sản xuất từ sự lên men của Saccharomyces là
một ngành công nghiệp lớn.
Đặc biệt là nấm có thể sinh ra các sản phẩm tự nhiên có ích cho sức
khoẻ của con ngời nh các chÊt kh¸ng sinh, c¸c chÊt chèng ung th−, c¸c chÊt
øc chế miễn dịch để chống nhiễm trùng chữa u bớu và ngăn chăn sự đào thải
các mảnh ghép cho các bệnh nhân phải cấy ghép tng. Griseofulvin là chất
chống nấm đợc tạo từ P.griseofulvum, thuốc ức chế miễn dịch cyclosporin được
sản xuất tõ nÊm Tolypocladium inflatum [27]. Kh¸ng sinh cryptocandin có khả
năng kháng các nấm gây bệnh da ở ngời đợc lấy ra từ loài nấm nội sinh thực
vật (Endophyte) Cryptosporiopsis quercina phân lập từ cây Tripterigem
wilfordii, kháng sinh này còn có khả năng kháng 1 số nấm gây bệnh thực vật.
Axớt colletotric là sản phẩm trao đổi chất của loài Colletotrichum
gloeosporiloides, chất này có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.
Paclitaxel và một số dẫn xuất của nó đại diện cho nhóm các chất chống
ung th do các nấm nội sinh thực vật sinh ra. Paclitaxel là sản phÈm trao ®ỉi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
chất của loài Pestalotiopsis microspora nội sinh trờn cây thông Taxus
wallichiana v loài Taxomyces andreanae nội sinh trong cây thông Taxus
brevifolia. Paclitaxel là loại thuốc chống ung th đầu tiên đem lại nhiều lợi,
nó còn đợc dùng điều trị bệnh tăng sinh mô ở ngời.
Axớt torreyanic cũng là một chất chống ung th đợc lấy từ chủng
Pestalotiopsis microspora nội sinh ở cây thông Taxus taxifolia.
Trong nông nghiệp, những vi nấm gây bệnh cho côn trùng nh
Beauveria bassana & Metarhizium anisoliae đợc dùng nh những tác nhân
sinh học diệt côn trùng, còn nấm gỉ đợc sử dụng để trừ cỏ dại. Loài
Nodulisporium sp. phân lập từ cây Bontia daphnoides đà sinh ra hoạt chất
nodulisporic là một loại indol mới có đặc tính diệt côn trùng rất cao (diệt ấu
trùng nhặng). Loài Muscodor vitigenus phân lập từ một loại cây dây leo
(Paullina paulliniloides) sinh ra naphthalene là thành phần trong băng phiến
đợc dùng rộng rÃi để đuổi côn trùng [10].
1.5. Đặc tính đặc trng của vi nấm
Đặc tính đặc trng của một chủng là rất quan trọng cho mục đích phân
loại và lµ cơ sở để nghiên cứu ứng dụng cho những lnh vc khỏc nhau ca
i sng. Sự đa dạng, phong phỳ của vi nấm không chỉ ở sự khác biệt về hình
thái mà còn ở các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chúng. Qua các đặc điểm của
chúng, ta biết đợc sự phức tạp của quá trình trao đổi chất và khả năng thích
nghi của chúng đối với các điều kiện sống khác nhau. Những đặc tính sinh lý,
sinh hoá của vi nấm ngày càng đợc sử dụng nhiều với mục đích xác định
những nhóm phân loại chung và các quần thể riêng biệt trong phạm vi loài
(Bridge và Hawksworth, 1990). ViƯc sư dơng s¾c ký líp máng cho ta rÊt nhiỊu
sè liƯu vỊ c¸c chÊt chun ho¸ cđa nấm (Paterson, 1986), (Frisvad, 1989). Kỹ
thuật điện di đợc sử dụng để kiểm tra các isoenzym và kỹ thuật DNA cũng
đợc sử dụng để xác định các đặc điểm đặc trng của vi nấm. Khi phân loại vi
nấm tốt nhất là kết hợp tất cả các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá. Các
S húa bi Trung tõm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
thông tin đó của một chủng nấm là rất quan trọng, vì chúng có thể đợc sử
dụng trong công nghệ sinh học (Bridge, 1983).
Vi nấm có khả năng sống và phát triển trong môi trờng có các chất ức
chế, dới ®iỊu kiƯn nhiƯt ®é, ®é Èm kh¸c nhau. Vi nÊm có khả năng đặc biệt
đối với việc đồng hoá cacbon, nitơ và sinh tổng hợp rất nhiều enzym có hoạt
tính cao. HiƯn nay ng−êi ta sư dơng réng r·i hƯ thống kiểm tra APIZYM
(Biomerieux, Pháp) để xác định các đặc tính đặc trng của vi nấm một cách
nhanh chóng. Tổng hợp tất cả nhng đặc điểm hình thái và các ®Ỉc ®iĨm ®Ỉc
tr−ng cđa chđng vi nÊm đã cho phép phân loại chớnh xỏc các loài thuộc chi
Aspergillus, Beauveria, Fusarium, Penicillium, Rhizopus [27].
1.6. Hệ thống phân loại vi nấm
Hiện nay có nhiều hệ thống phân loại vi nấm của 1 số tác giả đà công
bố. Nhìn chung các hệ thống phân loại này khác nhau về quan điểm xếp các
đơn vị phân loại (taxon) ở bậc, ngành, lớp.
1.6.1. Hệ thống phân loại của Robert Shaffer (1969)
Giới nấm thật (Eumyceteae) gồm 3 ngành
Ngành nấm cổ ( Chytridiomycota):
Lớp Chytridiomycetes;
Ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota):
Lớp Zygomycetes;
Ngành nấm song hạch (Dicaryomycota):
Lớp Ascomycetes;
Lớp Basidiomycetes.
Giới nấm thật (Eumyceteae) theo Robert Shaffer chØ bao gåm c¸c nÊm
chÝnh cã vách tế bào bằng kitin, các nấm khác có vách tế bào bằng xenluloza
nh nấm nhầy, nấm trứng không đợc xếp vào giới nấm, chúng đợc xếp vào
giới ng vt nguyên sinh (Protozoa) vµ giới Chromista (cã nghÜa lµ mµu sắc,
gồm một số nấm cú bo t ng và tảo).
S hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
1.6.2. HƯ thèng cđa Ainsworth & Bisby (1995)
HƯ thèng ph©n loi ny dựa vào những đặc điểm về hình thái, sinh hoá
và cấu trúc phân tử để xếp các ngành nấm vào các giới khác nhau.
Tất cả những nấm mà từ trớc đến nay đợc xếp vào giới nấm
(Kingdom Fungi) thì hiện tại đợc xếp vào 3 giới khác nhau lµ:
- Giíi động vật ngun sinh (Protoza) gåm 4 ngµnh: chúng đợc gọi là
Protozoan Fungi.
- Giới Chromista gồm ba ngành, đợc gọi là Chromistan Fungi.
- Giới nm (Fungi) gồm 5 ngành nấm thật: Ngành nấm cổ
(Chytridiomycota), Ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota), Ngµnh nấm túi
(Ascomycota), Ngµnh nấm đảm (Basidiomycota), Ngµnh nÊm bất toàn
(Mitosporic Fungi), chúng đợc gọi là nấm thật (Eumycotan Fungi) [8],[31].
+ Ngành nấm cổ (Chytridiomycota) là loại vi nấm có bào tử động với
màng kitin. Bo t ng tản ra hoặc đợc thu gọn thành một nang bào tử kín
với rễ giả hoặc có thể phình rộng thành các sợi nấm dài hơn hoặc ngắn nhng
không có vách ngăn. Các bào tử động đợc tạo thành trong các nang bào tử
kín hình cầu hoặc elip. Sinh sản hữu tính đợc hỡnh thnh giữa các giao tử
hoặc bởi sự kết hợp của một noÃn bào (trứng cha thụ tinh) với một giao tử
đực. Ngành này chỉ có 1 lớp nấm cổ (Chytridiomycetes), có thể phân lập
chúng từ hạt gai, hạt phấn thông, cánh côn trùng.
+ Ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota): Các sợi nấm có màng kitin và
không bao giờ có vách ngăn. Các bào tử kín đợc tạo thành trong các nang
bào tử kín (Sporangia & Sporangiola). Sinh sản hữu tính xảy ra do sự kết hợp
của các nhánh sợi từ cùng một sợi nấm (homothalic) hoặc từ các sợi nấm khác
nhau (heterothalic). Các nhánh phồng lên, hoà lẫn nhau tạo thành một bào tử
tiếp hợp (Zygospore), các bào tử tiếp hợp có màng dày và bề mặt khác nhau.
Các loài nấm tiếp hợp phổ biến trong đất, phân và các chất hữu cơ khác.
S húa bi Trung tõm Hc liệu – Đại học Thái Nguyên
11
+ Ngành nấm túi (Ascomycota): ây là nhóm nấm rất đa dạng, chúng
hoặc tăng trởng theo phơng thức giống nấm men và không có thể quả, hoặc
có hệ sợi và thể quả gọi là các Ascomata (các loại thể quả chứa các túi bào tử).
Đặc điểm chung của Ascomata là có màng tế bào không phân lớp, lỗ vách đơn
giản, sinh ra các bào tử đơn bội trong các nang bào tử (Ascus).
+ Ngành nấm đảm (Basidiomycota): Có đặc điểm đặc trng là hệ sợi
nấm nhân kép, có vách ngăn, có mấu liên kết. Sinh sản hữu tính bằng đảm
(Basidia) với 2, 4 hoặc 8 bào tử đảm (Basidiospore). Khoảng 40% các loài
nấm thuộc ngành này.
+ Ngành nấm bất toàn Deuteromycota (Mitosporic Fungi)
Đặc điểm đặc trng là hệ sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng bào tử
trần. Tuy vậy ngời ta phát hiện ở một số loài có sinh sản hữu tính
(Teleomorph) bằng bào tử túi hoặc bào tử đảm. Hiện nay các nhà nấm học cho
rằng nấm bất toàn là giai đoạn sinh sản vô tính của nấm túi, nấm đảm
[2],[4],[16],[21].
Theo hệ thống phân loại của Hughes (1953), căn cứ vào đặc điểm phát
sinh bào tử trần lớp nấm bất toàn đợc chia làm 3 nhóm:
Nhóm Hyphomycetes: gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa
giá. Giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó
sợi, bó giá (synema, corenia).
Nhóm Coelomycetes: gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá bào
tử trần hình thành trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata;
Nhóm Agonomycetes: gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần [5],[21].
Phân loại vi nấm dựa vào các đặc điểm đặc trng về hình thái và cu
trỳc. Các đặc điểm đặc trng của các cơ quan sinh bào tử, thành tế bào, sự
phát sinh và kiểu tiên mao đợc dùng để phân loại các nhóm vi nấm chính.
Một số các đặc điểm khác nh các chi tiết về cấu trúc và sự phát triển của thể
quả, màu sắc, vách ngăn, bề mặt và kích thớc của bào tử là những đặc điểm
quan trọng để phân loại vi nấm đến bé, hä, chi, loµi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
Hiện nay, nhiều nhóm vi nấm khác nhau đà đợc phân loại và có tên
trong danh mục của hệ thống phân loại. Chúng ta cần phân loại chính xác một
chủng khi s dng chủng loài đó để nghiên cứu hoặc sản xuất vì nếu phân loại
sai có thể dẫn tới những kết luận sai trong nghiên cứu và có thể bỏ phí những
nguồn giống có giá trị [27].
1.7. Những vấn đề chung về cơ chế sinh hoá và sự phá huỷ
sinh học do vi nấm gây nên
1.7.1. Đặc điểm phá hủ sinh häc do vi nÊm
Vai trß nỉi tréi cđa vi nÊm so víi c¸c vi sinh vËt trong qu¸ trình phá huỷ
sinh học là do đặc điểm trao đổi chất của chúng rất đa dạng và phong phú. Vi
nấm tiÕt ra c¸c enzym amilaza, proteaza, lipaza, oxydaza, katalaza,
xenlulaza,... Tỉ hợp enzym của vi nấm phong phú hơn so với các vi sinh vật
khác. Nhờ sự tác động của tổ hợp enzym đó mà vi nấm có sự biến đổi hoá học
đa dạng trên những cơ chất phức tạp mà những vi sinh vật khác không xâm
nhập vào đợc. Chính vì thế vi nấm có khả năng làm h hại bất kỳ các sản
phẩm công nghiệp nào. Đặc điểm chung của vi nấm là nó có thể phát triển ở
trên tất cả các cơ chất khác nhau, đó chính là nguyên nhân gây h hỏng các
vật liệu tự nhiên cũng nh nhân tạo. Ngy nay, đó là vấn đề chúng ta rất quan
tâm trong lĩnh vực bảo quản.
Sự nguy hiểm của vi nấm đối với nhiều loại vật liệu cũn do những sản
phẩm trao đổi chất khác nhau của vi nấm, đặc biệt là những axớt hữu cơ.
Những thùng bằng nhôm trên máy bay cú th bị phá huỷ do các axớt đợc sinh
ra từ loài vi nấm Cladosporium resinae (axớt xitric, axớt lactic, axớt oxalic...).
Vi nấm có khả năng phát triển trên các cơ chất rắn. Những loài vi nấm
a khô nh Aspergillus penicilloides, A.glaucus, Tomophilus, có thể làm h
hại các thiết bị quang học. Trong những điều kiện bình thờng những loài vi
nấm này không cạnh tranh đợc với những loài phát triển nhanh, tuy nhiên ở
trị số giá trị hoạt độ nớc thấp thì những loài vi nÊm nµy chiÕm −u thÕ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Vi nấm có thể tồn tại trong môi trờng có điều kiện sinh thái khắc
nghiệt. Một số loài vi nấm chỉ cần một hàm lợng chất dinh dỡng rất thấp.
Đây là một đặc điểm u việt của các loài vi nấm khi nó c trú trên các vật chất
nghèo dinh dỡng, nh các tác phẩm hội hoạ.... Các loài vi nấm ny phát triển
chậm hơn nhiều so với các loài khác, chỳng có khả năng sống ở những điều
kiện rất khắc nghiệt l do tiết ra các chất sinh học nh các enzym phân huỷ cơ
chất sinh học, các chất hữu cơ (axít hữu cơ, axít vô cơ...) để biến cơ chất môi
trờng thành thức ăn cho chúng. Vì vậy, chúng phá huỷ các cơ chất sinh học
và gây ra những thiệt hại không nhỏ.
Hệ vi nấm (chủng loài) ở 1 khu vực nào đó có thể không ổn dịnh do sự
thay đổi ca điều kiện môi trờng. Trên cựng một cơ chất nhng ở các nhiệt
độ khác nhau hoặc độ ẩm môi trờng cao hoặc thp hơn, thì một số loài vi
nấm sẽ bị chết, còn một số loài khác thì sẽ phát triển tốt hơn.
Vi nấm là một nhóm vi sinh vật rất hay biến dị và không ổn định. Một
trong những cơ chế của tính biến dị ở vi nấm là tính dị nhân. Tuỳ theo điều
kiện môi trờng, số nhân của loài này hay loài khác có thể thay đổi trong sợi
vi nấm để đảm bảo cho vi nấm thích nghi với các điều kiện mới xuất hiện.
Đặc tính đó của vi nấm có ý nghĩa rất quan trọng khi thiên nhiên và con ngời
không ngừng tạo ra các vật liệu mới và xuất hiện các sinh cảnh mới.
1.7.2. Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực của sợi nấm - các loại
enzym và các axít hữu cơ.
Trong số các vi sinh vật gây hại cho các loại vật liệu và sản phẩm thì vi
nấm chiếm vị trí số 1, vì hệ sợi nấm phát triển rÊt nhanh vµ hƯ thèng enzym
cđa chóng rÊt phong phó, rất mạnh và không ổn định khiến chúng có thể sử
dụng đợc nhiều loại nguyên liệu thiên nhiên cũng nh nguyên liệu nhân tạo.
Ngày nay, các nguyên liệu công nghiệp rất đa dạng và phong phú.
Những nguyªn liƯu đó đều có thể bị phá hủy do mét nhãm vi nÊm có đặc tính
sinh thái đặc biệt. Sự phá huỷ sinh học do các loại vi nấm gây ra cho các vËt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
liệu và sản phẩm là sự phá huỷ cơ học do do các sợi nấm phát triển nhanh, do
độ bẩn sinh học tạo nên và chủ yếu là do tác động của các loại enzym và axít
hữu cơ của vi nÊm tiÕt ra. Sù ph¸ hủ c¸c vËt liƯu d−íi ảnh hởng của các
enzym bắt đầu bng tác động của các phản ứng hoá học khác nhau, nh sự
oxy hoá khử, khử cacboxyl, este hoá, thuỷ phân... Trong các vi nấm, ngời ta
đà tìm thấy tất cả 6 loi enzym trong bảng phân loại quốc tế hiện nay:
1. Oxydoreductaza - xúc tác phản ứng oxy hoá khử;
2. Transferaza - xúc tác phản ứng chuyển vị trí một số nhóm từ chất này
sang chất khác;
3. Hydrolaza - xúc tác phản ứng thuỷ phân các chất;
4. Liaza - xúc tác phản ứng tách nhóm ra khỏi cơ chất ;
5. Isomeraza - xúc tác phản ứng đồng phân hoá;
6. Ligaza - xúc tác phửn ứng kết hợp 2 phân tử nh liên kết cao năng
trong phân tử ATP.
Các enzym vi nm tổng hợp có thể xúc tác cho những phản ứng chuyển
hoá vật chất bên trong tế bào (enzym nội bào) hoặc tiết ra môi trờng bên
ngoài để phân huỷ cơ chất thành nguồn dinh dỡng trong quá trình hoạt động
của chúng (enzym ngoại bào). Enzym của vi sinh vật chủ yếu là enzym ngoại
bào, hoạt động của chúng trên cơ chất hữu cơ của vật liệu là nguyên nhân
chính gây ra sự huỷ hoại vật liệu đó khi bị vi sinh vật xâm nhiễm.
Trong số các enzym oxy hoá khử thì các oxygenaza đóng vai trò đặc
biệt quan trọng trong việc các vi sinh vật huỷ hoại vật liệu công nghiệp. Điều
này trớc hết liên quan đến sự phá huỷ sinh học của các chất kỵ nớc, không
phõn cực kiểu hydrocacbon, cũng nh các vật liệu đợc cấu tạo bởi các hợp
chất mạch vòng.
Các enzym khác thuộc lớp enzym oxy hoá khử nh: dihydrogenaza và
oxydaza cũng có ý nghĩa lớn trong quá trình phá huỷ sinh học. Các
dihydrogenaza xúc tác các phản ứng chuyển hydro từ hợp chất này sang hợp
S húa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
chất khác. Trong loi enzym oxy hoá khử, peroxydaza và catalaza có sự khác
biệt về tính chất tác động. Đại diện của các chi nấm có hoạt tính peroxydaza
là các chi Penicillium, Aspergillus, Verticillium, Fusarium, Geotrichum. Các
catalaza làm tăng nhanh phản ứng phân huỷ peroxyt hydro thành nớc và oxy
phân tư. Mét sè loµi vi nÊm thc chi Penicillium cã thể sinh catatlaza. Khi
nghiên cứu hoạt tính của catalaza, peroxydaza, polyphenoloxydaza và các
dehydrogenaza do các loài vi nấm Aspergillus niger, A. flavus,
P.chrysogenum, Paecilomyces varioti, Trichoderma viride, ngời ta đà xác
định đợc rằng A. niger và T. viride có tất cả các enzym nêu trên và có hoạt
tính mạnh.
Các enzym thuộc líp hydrolaza cã vÞ trÝ quan träng trong viƯc hủ hoại
sinh học các vật liệu công nghiệp, bởi vì nhiều enzym trong số này là những
enzym ngoại bào tham gia vào việc chuẩn bị sơ bộ để tách và biến đổi chất
nuôi dỡng.
Các enzym thuộc nhóm glycozidaza tham gia tích cực vào việc phá huỷ
các vật liệu công nghiệp chứa xenluloza, các hydrocacbon khác và các dẫn
xuất của chúng. Các vi nấm
thuộc các chi Alternaria, Trichoderma,
Chaetomium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium... là những chi thể hiện
rõ nhất khả năng tổng hợp các enzym xenlulaza. Các vi nấm có khả năng phát
triển và sinh enzym xenlulaza chỉ ở trong những giới hạn nhiệt độ nhất định,
thông thờng là ở nhiệt độ 28 - 300C.
Các loài vi nm có khả năng sinh enzym proteinaza ngoại bào phân bố
rất rộng, có ở khắp mọi nơi; trong đất, nớc và ngay cả trong môi trờng
không khí tự nhiên, nên rất dễ dàng ô nhiễm lên các vật thể tồn tại ở đây.
Nhiu enzym ca vi nm đã được sử dụng rộng rãi trong các ngành
kinh tế khác nhau như trong ngành công nghiệp thực phẩm và cơng nghiệp
dược phẩm. ë ngành thực phẩm, các lồi Aspergillus niger, A. oryzae,... được
sử dụng để sản xuất bia, rượu, làm bánh mỳ,... nhờ các enzym thủy phân tinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
bột của chúng. Để phân hủy các nguồn protein khác nhau, người ta sử dụng
chế phẩm proteinaza để thủy phân các protein đến mức độ cần thiết, ngồi ra
proteinaza cịn được sử dụng để tẩy lông ở da xúc vật khi thuc da [9], [11].
1.8. Các phơng pháp bảo quản vi nấm
Nghiên cứu vi nấm là bao gồm cả quá trình nghiên cứu và sử dụng
những chủng vi nấm ú. Chúng cần đợc giữ tồn tại ít nhất là trong suốt thời
gian thực hiện nghiên cứu hay làm thực nghiệm và nếu chúng chứng minh
đợc sự quan trọng của mình, chúng có thể đợc bảo quản để thực hiện các
công việc khác trong tơng lai và đợc đa vào trong một bảo tàng nguồn vi
sinh vật để đảm bảo sự ổn định của chúng. Không phải tất cả các phòng thí
nghiệm đều có thể thực hiện đợc những phơng pháp bảo quản phức tạp, rất
nhiều ngời đến tham quan Viện NÊm häc quèc tÕ (International Mycological
Institute) ®· tá ra quan tâm đến những phơng pháp n gin ớt tn kộm
nhng hiu qu cao.
Mục tiêu đầu tiên của việc duy trỡ một bảo tàng các nguồn nấm là phải
nuôi dỡng các chủng nấm trong trạng thái sống không thay đổi về mặt hình
thái, sinh lý hay cu trỳc gen tới khi chúng đợc dùng cho những công việc
trong tơng lai. Mc ớch là gi c khả năng n nh và tính chất của vi
nm đều đợc đảm bảo, đặc biệt trong những nghiên cứu và kỹ thuật quan
trọng. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học và công nghệ sinh học, sự duy
trì tính ổn định và hữu dụng đang trở nên ngày càng quan trọng.
Các kỹ thuật bảo quản tính bắt đầu từ kỹ thuật tiếp tục duy trì sự phát
triển thông qua biện pháp làm giảm sự trao đổi chất của vi nm tạm thời bị
ngng trệ. Thực tế thì các hoạt động trao đổi chất không bao giờ ngừng trệ
trong bất kỳ kỹ thuật bảo quản nào nhng chúng có thể bị hạ thấp đến mức mà
làm cho tất cả các kết quả thực nghiệm đều đợc coi nh đà bị dừng lại.
Vi nấm khó đợc bảo quản trong trạng thái sống, thuần khiết và ổn
định. Điều kiện nuôi cấy và kỹ thuật bảo quản phù hợp đợc sử dụng để đảm
S húa bi Trung tõm Hc liệu – Đại học Thái Nguyên
17
bảo sự ổn định của quần thể vi nấm trong nghiên cứu, ứng dụng là rất quan
trọng. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học và kỹ thuật sinh học thì
việc giữ đợc tất cả các đặc điểm đặc trng của vi nấm trong quá trình bảo
quản là rất quan trọng. Rất nhiều loài nấm sợi mọc trên môi trờng nuôi cấy
có thể tồn tại đợc bằng cách cấy chuyển theo kỳ. Tuy nhiên những đặc điểm
của vi nấm trong nuôi cấy có thể không đợc ổn định do sự mất mát của các
plasmid, trải qua những sự đột biến liên tiếp hay sự tổ hợp của các gen do sự
có mặt của các thể dị nhân, và chu trình cận giới tính hay những hoạt động
giới tính bình thờng khác (Smith, 1986). Những sự kiện này đà dẫn đến sự
thay đổi trong đặc tính của các chủng. Vì thế các điều kiện bảo quản phải
đợc lựa chọn kỹ lỡng để làm giảm tối đa mức rủi ro của những thay đổi
trên. Cơ sở của các kỹ thuật bảo quản giống là: sự sinh trởng tiếp diễn, sự
giảm trao đổi chất và trao đổi chất gián đoạn. Trao đổi chất gián đoạn là kỹ
thuật mà cho phép giảm mức độ trao đổi chất đến mức tạm dừng hoặc gần nh
vậy (Smith và Onion, 1983).
Từ năm 1945, Raper và Alexander đà đa ra phơng pháp đông khô
(Freeze drying) để bảo quản các loài Penicillium. Buell & Weston (1947) đÃ
bảo quản vi nấm trong dầu khoáng. Castellani (1939, 1967) đà bảo quản vi
nấm trong nớc. Gordon (1952) Both (1953) đà bảo quản vi nấm trong đất.
Perkin (1962) đa ra phơng pháp bảo quản trên silicagel. Năm 1971, 1977,
Onions đà đa ra phơng pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng
(Cryopreservation). Không có phơng pháp bảo quản nào là tốt cho tất cả các
loài vi nấm, mặc dù phơng pháp bảo quản trong nitơ lỏng là lý tởng nhất.
Các loài nấm sợi sinh nhiều bào tử thì bảo quản trên silicagel là tốt, các loài
có bảo tử màng mỏng, hàm lợng nớc cao thì bảo quản bằng phơng pháp
này độ sống sót kém. Các loài Oomycetes thuộc ngành phụ Mastigomycotina
tồn tại đợc lâu khi bảo quản trong dầu khoáng, nớc hoặc cấy chuyển nhng
lại không tồn tại khi bảo quản trờn silicagel hoặc đông khô. Một số loài thuộc
S húa bi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
lớp nấm đảm (Basidiomycetes) không sinh bào tử chỉ bảo quản đợc trong
lạnh sâu (David Smith & cs 1996). Các bảo tàng giống lớn trên thế giới nh
ATCC (Mỹ), IMI (Anh), DSM (Đức), CCRC (Đài Loan), VKM (Nga)...
thờng sử dụng 3 phơng pháp. Bảo quản trên silicagel, đông khô, lạnh sâu và
đà rất thành công. Viện nấm Quốc tế Anh (IMI) đà bảo quản trên 7.000
chủng bằng phơng pháp đông khô từ 7 - 20 năm, kết quả phục hồi cho thấy
ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota) có tỷ lệ sống sãt lµ 92%, ngµnh nÊm tói
(Ascomycota) tû lƯ sèng sãt 50 - 100%, ngành nấm đảm 0 - 79%, ngành nÊm
bÊt toµn (Deuteromycota) tû lƯ sèng sãt lµ 91- 95%. Bảo quản trên silicagel từ
8 - 11 năm, sau khi phục hồi kết quả thy ngành Zygomycota sống sót là 59%,
Ascomycota sèng sãt lµ 25 -100%, Basidiomycota 52%, Deuteromycota 75 81%...[28].
Hầu hết các vi nấm có thể tồn tại đợc khi đông lạnh với nitơ lỏng. Việc
bảo quản trong nitơ lỏng là một phơng pháp làm tăng khả năng bảo quản các
vi nấm không mọc đợc khi nuôi cấy. Ví dụ ngời ta bảo quản các nấm bệnh
trong những tế bào bị nhiễm bệnh trong nitơ lỏng, hỗn hợp các vi sinh vật này
sẽ tồn tại đợc. Phơng pháp đông khô cho phép những bào tử cứng cáp hơn
tồn tại. Các hạch nấm và các giai đoạn nghỉ ngơi khác kể cả những hệ sợi nấm
bất thụ cũng tồn tại đợc bằng phơng pháp bảo quản đông khô. Những
nghiên cứu tại IMI cho thấy đối với một số vi sinh vật, thời gian sống đợc
trong bảo quản là rất ngắn. Việc sử dụng các phơng pháp tốt nhất để có thể
bảo quản và duy trì ổn định gen của những chủng rất khó phân lập là rất cần
thiết. Nhiều bộ su tập vi nấm khác cũng đợc bảo quản thành công bằng
cách cấy chuyển thờng xuyên, trong dầu khoáng, trong đất hoặc nớc (Smith
và Onion, 1983).
Entomophthorales sẽ sống đợc trong nitơ lỏng, trong dầu hoặc đất.
Nấm gỉ thờng không mọc đợc trong môi trờng nuôi cấy, nhng những bộ
su tập sống có thể đợc bảo quản tốt trong nitơ lỏng, mặc dù cũng có thể bảo
S húa bi Trung tõm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
quản chúng bằng cách khác nh lấy bào tử từ vật chủ nhiễm bệnh đem đông
khô. Có những chi nh Fusarium thờng thay đổi hay bị phá hủy rất nhanh
khi cấy chuyển thờng xuyên. Những vi nấm này nên giữ bằng cách cấy
chuyển hàng loạt, bảo quản trờn silicagel, bảo quản trong đất và nớc nếu nh
phòng thí nghiệm không có điều kiện làm đông khô hoặc nitơ lỏng [27].
Có nhiều phơng pháp đợc dùng để bảo quản các chủng nấm, ngời ta
chia ra thành 3 nhóm:
- Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển;
- Nhóm phơng pháp làm khô;
- Nhóm phơng pháp đình chỉ sự trao đổi chất.
1.8.1. Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển
Kỹ thuật tiếp tục duy trì sự phát triển bao gồm phơng pháp cấy chuyển
định kỳ (định kỳ cấy chuyển chủng nấm từ môi trờng đà hết chất dinh dỡng
tới môi trờng mới có nhiều chất dinh dỡng hơn) và phơng pháp làm giảm
nhu cầu của nấm về môi trờng nuôi cấy. Nhóm biện pháp này bao gồm cả
phơng pháp nuôi cấy trong môi trờng lạnh nhiệt độ từ -200C đến -100C dới
lớp dầu hoặc trong nớc. Cụ thể có 3 phơng pháp sau đây:
1.8.1.1. Phơng pháp cấy chuyển định kỳ
Cấy chuyển các chủng nấm từ môi trờng cũ (đặc hoặc lỏng) sang môi
trờng mới và lu giữ ở điều kiện thích hợp nhất cho từng chủng riêng biệt.
Trong quá trình cấy chuyển cn chọn phần phát triển tốt trong ống
nghiệm chứa môi trờng cũ để cấy chuyển và phải đảm bảo rằng chủng ống
gốc phải thật thuần khiết, không bị lẫn một loại vi sinh vật nào khác.
1.8.1.2. Bảo quản dới dầu khoáng
Là phơng pháp giữ chủng vi nấm bảo quản trên thạch nghiêng khoảng
300 trong ng nghim 30ml dới lớp dầu khoáng nhằm ngăn ngừa sự mất nớc
và làm giảm hoạt động chuyển hoá và phát triển qua việc giảm nồng độ oxy.
S húa bi Trung tõm Hc liệu – Đại học Thái Nguyên
20
Saprolegniaceae và một vài vi nấm a nớc khác sống sót đợc từ 12 30 tháng trong dầu, trong khi bình thờng chúng chỉ tồn tại đợc 1- 6 tháng
khi nuôi cấy trên thạch hay trong nớc. Các chủng nhạy cảm với các phơng
pháp kỹ thuật khác có thể bảo quản thành công trong dầu, nh Cercospora,
Arthrobotrys, Colletotrichum, Conidiobolus, Corticium, Nodulisporium và
lớp nấm sợi Basidiomyces, tất cả cần đợc cấy chuyển sau một thời gian trung
bình là 2 năm, đặc biệt một vài chủng thuộc Phytophthora và các loài Pythium
đà sống sót tới 40 năm. Những chủng bị thoái hoá khi bảo quản dới dầu
khoáng cần đợc cấy chuyển hợp lý để làm giảm tỷ lệ này.
1.8.1.3. Bảo quản trong n−íc
Là phương pháp giữ các chủng vi nấm trong n−íc cất ó khử trùng trong
chai McCartney và vặn chặt nắp lọ, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 20 - 250C.
Phục hồi bằng cách chuyển phần có nấm đặt trên mặt một môi trờng
thích hợp với sự phát triển của loài.
Có thể thực hiện với các loài Phytophthora và Pythium trong thời gian
2-3 năm trớc khi chủng nấm có biểu hiện mất bất kỳ tính chất nào. Những
chủng trên biểu hiện thoái hoá về khả năng gây bệnh nhng phần lớn vẫn có
thể gây nhiễm trên vật chủ tơng thích. Việc mất khả năng của chủng dần
xuất hiện sau 2 năm và 42% các chủng trên bị chết sau 5 năm bảo quản.
1.8.2. Nhóm phơng pháp làm khô
Nhóm phơng pháp này thờng áp dụng với trạng thái không hoạt động
(trạng thái nghỉ) của vi nm, nh bào tử hoặc thể cứng (hạch nấm, ), có thể
sử dụng làm khô tự nhiên trong không khí trong hay trên silicagel, trong đất
hoặc sử dụng phơng pháp đông khô.
1.8.2.1. Bảo quản trong silicagel
Silicagel l một chất vơ cơ, bền, khơng độc, có cấu trúc rỗng, được
dùng làm chất hút ẩm nhờ hiện tượng mao dẫn ở hàng triệu khoang rỗng li ti
của nó. Nhờ những tính năng đó mà người ta sử dụng Silicagel làm chất bảo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
