Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 3

CHệễNG 3: NGUYEN LIEU VAỉ PHệễNG PHAP NGHIEN CệU
36
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu
3.1.1.Nguồn carbon và cách xử lý
3.1.1.1.Bã mía
Rửa sạch, phơi khô 2-3 ngày. Sau đó cắt nhỏ, xay, cho qua rây 0,1 và 0,05 lấy
phần trên rây 0,05mm.
3.1.1.2.Rơm
Xử lý giống như bã mía.
3.1.1.3.Mùn cưa
Do kích thước mùn cưa nhỏ nên ta chỉ cần phơi khô và rây để lựa chọn kích
thước hợp lý.
Nguyên liệu sau khi rây được ngâm trong dung dòch NaOH 1% với tỉ lệ 1:10
trong 2 giờ. Sau đó hấp tiệt trùng ở 121
0
C, 1at trong 15 phút. Lọc rửa nguyên liệu
bằng nước cất đến khi dung dòch rửa trung tính (pH=7). Kế đến ta vắt kiệt và sấy khô
ở 60-70
0
C.
3.1.2.Hóa chất sử dụng
o NaOH 1% dùng để xử lý nguyên liệu.
o NaOH 1N chỉnh pH
o HCl 1N chỉnh pH
o DNS
o NaCl 1%
o NaNO
3
o KCl
o FeSO

4
.7H
2
O
o MgSO
4
.7H
2
O
o K
2
HPO
4
.3H
2
O
37
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
o Pepton
o Agar
o Saccharose
o Conggo đỏ
o Dung dòch đệm photphat 0.5 M
3.1.3.Dụng cụ thí nghiệm
o Máy đo pH
o Máy so màu
o Máy lắc
o Cân
o Tủ sấy, tủ ấm và tủ lạnh.
o Bể điều nhiệt

3.1.4.Các loại môi trường sử dụng
3.1.4.1Môi trường carrot-potato:
Thành phần môi trường:
o Khoai tây: 2%
o Cà rốt: 2%
o Agar: 2%
o CMC: 1%
o Nước cất
Đầu tiên khoai tây và cà rốt lát mỏng sau đó nấu 1 giờ trong ½ lượng nước cất,
lọc lấy dòch lọc. Các thành phần khác được nấu trong lượng nước cất còn lại đến khi
tan hoàn toàn. Trộn 2 thành phần lại và tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
Môi trường carrot-potato được dùng để giữ giống nấm mốc.
38
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.4.2Môi trường Czapek (Dox) (CZ)
- Czapek stock solution A 50ml
- Czapek stock solution B 50ml
- Nước cất: 900ml
Thành phần A: NaNO
3
40g
KCl 10g
MgSO
4
.7H
2
O 10g
FeSO

4
.7H
2
O 0.2g
Nước cất: 1000ml
Thành phần B: K
2
HPO
4
20g
Nước cất: 1000ml
Môi trường A và B được trữ lạnh.
Môi trường CZ dùng để nuôi cấy nấm mốc trong môi trường lỏng.
3.1.4.3Môi trường malt
Môi trường này được sử dụng làm môi trường để nấm mốc sinh trưởng và phát
triển tạo bào tử. Từ đó ta có thể lấy bào tử để nuôi cấy trong môi trường lỏng thu
nhận enzym.
3.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống
Môi trường được chuẩn bò đổ vào ống nghiệm (khoảng ¼ ống nghiệm), tiệt
trùng ở 121
0
C trong 15 phút. Sau đó để nghiêng 45
0
cho đến khi thạch đông.
Dùng que cấy nhọn cấy nấm mốc từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng.
Để ở 30-40
0
C trong tủ ấm từ 5 ngày. Sau đó bảo quản lạnh <4
0
C.

39
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc tạo enzym
Môi trường sử dụng ở đây là môi trường CZ. Cho 100ml môi trường vào erlen
250 ml, sau đó đem tiệt trùng.
Dùng 10ml nước cất vô khuẩn cho vào ống giống trưởng thành. Sau đó lắc để
rơi bào tử nấm mốc. Hút 1ml cho vào môi trường nuôi cấy.
Sau đó môi trường nuôi cấy được để trên máy lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ môi
trường. đây ta nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm nên việc lắc được tiến
hành liên tục nhằm mục đích hòa tan oxy vào môi trường tạo điều kiện cho nấm mốc
phát triển.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Trình tự tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase với hoạt tính cao
nhất. Ta khảo sát 9 loài: A.Niger, A.awamori, A.aculactum, A oryzae, T.konigii,
T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus sp.
Bước 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp
enzym cellulase của nấm mốc.
Bước 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp
enzym cellulase của nấm mốc.
Bước 4: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh
tổng hợp enzym của nấm mốc.
Bước 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym cellulase.
Bước 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym cellulase.
Bước 7: Thử ứng dụng enzym cellulase thủy phân cơ chất rơm.
3.4.2 Thuyết minh quá trình thí nghiệm
3.4.2.1Bước 1: Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase với hoạt tính cao
nhất
40