Luận văn tốt nghiệp về việc sử dụng kit thu nhanh trong phân tích urea

i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT THỬ NHANH
TRONG PHÂN TÍCH UREA
SVTH : TRỊNH THỊ THANH TÂM
MSSV : 60302440
CBHD : TS. TRẦN BÍCH LAM
BỘ MÔN KỸ THUẬT THỰC PHẨM
TP Hồ Chí Minh, 01/2008
N
N
H
H
A
A
Ä
Ä
N
N
X
X
E
E
Ù
Ù
T
T
C

C
U
U
Û
Û
A
A
G
G
I
I
A
A
Ù
Ù
O
O
V
V
I
I
E
E
Â
Â
N
N
H
H
Ö

Ö
Ô
Ô
Ù
Ù
N
N
G
G
D
D
A
A
Ã
Ã
N
N
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
N
N

H
H
A
A
Ä
Ä
N
N
X
X
E
E
Ù
Ù
T
T
C
C
U
U
Û
Û
A
A
G
G
I
I
A
A

Ù
Ù
O
O
V
V
I
I
E
E
Â
Â
N
N
P
P
H
H
A
A
Û
Û
N
N
B
B
I
I
E
E

Ä
Ä
N
N
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................
LỜI CÁM ƠN GVHD: TS. Trần Bích Lam
ii
L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
I
C
C
A
A
Û

Û
M
M
Ơ
Ơ
N
N

Trước hết, em xin gởi lời cám ơn đến thầy cô trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt là
các thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu cho chúng em trong suốt gần năm năm ngồi trên ghế giảng đường đại học.
Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cô Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
em rất nhiều để em có thể hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn các bạn lớp HCTP03 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian
làm luận văn. Chúc các bạn luôn vui vẻ và thành công trong cuộc sống.
S
S
i
i
n
n
h
h
v
v
i
i
e
e
â

â
n
n
T
T
r
r
ò
ò
n
n
h
h
T
T
h
h
ò
ò
T
T
h
h
a
a
n
n
h
h
T

T
a
a
â
â
m
m
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
iii
M
M
U
U
Ï
Ï
C
C
L
L
U
U
Ï
Ï
C
C
Đ
Đ
E
E
À

À
M
M
U
U
Ï
Ï
C
C
:
:
T
T
r
r
a
a
n
n
g
g
T
T
R
R
A
A
N
N
G

G
B
B
Ì
Ì
A
A ................................................................................................................ i
L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
I
C
C
A
A
Û
Û
M
M
Ơ
Ơ
N
N ................................................................................................................................ ii
M
M
U

U
Ï
Ï
C
C
L
L
U
U
Ï
Ï
C
C.....................................................................................................................................iii
D
D
A
A
N
N
H
H
S
S
A
A
Ù
Ù
C
C
H

H
H
H
Ì
Ì
N
N
H
H
V
V
E
E
Õ
Õ ........................................................................................................... vii
D
D
A
A
N
N
H
H
S
S
A
A
Ù
Ù
C

C
H
H
B
B
A
A
Û
Û
N
N
G
G
B
B
I
I
E
E
Å
Å
U
U....................................................................................................... ix
L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I

I
M
M
Ơ
Ơ
Û
Û
Đ
Đ
A
A
À
À
U
U ................................................................................................................................ 1
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
1
1 ................................................................................................................................... 2
1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5)................................................................................................ 3

1.1.1. Danh pháp quốc tế và phân loại .................................................................................. 3
1.1.2. Tính chất vật lý của enzyme urease ............................................................................ 3
1.1.3. Tính chất hóa lý của enzyme urease ........................................................................... 6
1.1.4. Trung tâm hoạt động .................................................................................................... 6
1.1.5. Cơ chế xúc tác .............................................................................................................. 9
1.1.6. Cơ chất của urease...................................................................................................... 10
1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease......................................... 12
1.2. Các phương pháp thu nhận urease .................................................................................... 23
1.2.1. Nguồn thu nhận........................................................................................................... 23
1.2.2. Một số phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme................................................. 26
1.3. Các phương pháp xác đònh hoạt tính urease..................................................................... 27
1.3.1. Xác đònh hoạt tính urease dựa trên việc đònh lượng NH
3
được giải phóng.............. 29
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
iv
1.3.2. Xác đònh hoạt tính urease bằng cách đònh lượng CO
2
được giải phóng................... 30
1.4. Ứng dụng của enzyme urease........................................................................................... 31
1.4.1. Trong nông nghiệp...................................................................................................... 31
1.4.2. Trong thực phẩm......................................................................................................... 31
1.4.3. Trong phân tích hóa sinh ............................................................................................ 31
1.4.4. Trong công nghệ môi trường...................................................................................... 32
1.4.5. Trong y học ................................................................................................................. 32
1.5. Tổng quan về urea............................................................................................................. 32
1.5.1. Cấu tạo hóa học của urea........................................................................................... 32
1.5.2. Phát hiện ..................................................................................................................... 33
1.5.3. Công dụng................................................................................................................... 34
1.5.4. Mức độ nguy hiểm...................................................................................................... 35

1.5.5. Các nguồn phát sinh urea........................................................................................... 35
1.5.6. Các phương pháp xác đònh urea................................................................................. 39
1.6. Kit thử nhanh trong phân tích urea.................................................................................... 46
1.6.1. Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam [52]..................................................... 46
1.6.2. Các loại kit phân tích urea ......................................................................................... 47
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
2
2 ................................................................................................................................. 50
2.1. Nguyên liệu........................................................................................................................ 51
2.1.1. Hóa chất...................................................................................................................... 51
2.1.2. Dụng cụ....................................................................................................................... 51
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................... 52
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................................ 52
2.2.2. Phương pháp tìm chất chỉ thò màu tối ưu ................................................................... 52
2.2.3. Phương pháp xác đònh lượng chất chỉ thò thích hợp cho lên kit................................. 54
2.2.4. Phương pháp chọn dung môi thích hợp dùng để pha urease..................................... 54
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
v
2.2.5. Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp................................................... 58

2.2.6. Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme urease thích hợp cho lên kit ..................... 59
2.2.7. Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán đònh
lượng urea và đường chuẩn pH........................................................................................ 60
2.2.8. Phương pháp xác đònh thời gian hiện màu của kit .................................................... 60
2.2.9. Phương pháp xác đònh thời gian sử dụng của kit....................................................... 60
2.2.10. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực.............................................. 61
2.2.11. Các phương pháp xử lý số liệu................................................................................. 61
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
3
3 ................................................................................................................................. 62
3.1. Khảo sát các loại chất chỉ thò màu.................................................................................... 63
3.2. Khảo sát lượng chất chỉ thò thích hợp cho lên kit ............................................................. 65
3.3. Khảo sát dung môi pha urease.......................................................................................... 68
3.3.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme urease theo phương pháp Nessler.......................... 68
3.3.2. Khảo sát dung môi dùng để pha urease .................................................................... 70
3.4. Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit .................................................................. 72
3.4.1. Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit.............................................................. 72
3.4.2. Khảo sát nồng độ dung dòch enzyme urease cho lên kit............................................... 72
3.5. Khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán đònh lượng urea và đường

chuẩn

pH.............................................................................................................................. 76
3.5.1. Xác đònh khả năng phát hiện của kit ......................................................................... 76
3.5.2. Xây dựng thang màu bán đònh lượng urea................................................................. 77
3.5.3. Xây dựng đường chuẩn pH để đònh lượng urea .................................................... 78
3.6. Khảo sát thời gian hiện màu của kit ................................................................................. 83
3.7. Khảo sát thời gian sử dụng của kit.................................................................................... 85
3.8. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực...................................................... 87
3.8.1. Sữa............................................................................................................................... 87
MỤC LỤC GVHD: TS. Trần Bích Lam
vi
3.8.2. Nước mắm................................................................................................................... 89
3.8.3. Thủy sản...................................................................................................................... 90
C
C
H
H
Ư
Ư
Ơ
Ơ
N
N
G
G
4
4 ................................................................................................................................. 95
4.1. Kết luận.............................................................................................................................. 96
4.2. Kiến nghò:........................................................................................................................... 97

T
T
A
A
Ø
Ø
I
I
L
L
I
I
E
E
Ä
Ä
U
U
T
T
H
H
A
A
M
M
K
K
H
H

A
A
Û
Û
O
O............................................................................................................ 98
DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích Lam
vii
D
D
A
A
N
N
H
H
S
S
A
A
Ù
Ù
C
C
H
H
H
H
Ì
Ì

N
N
H
H
V
V
E
E
Õ
Õ
Chương 1: TỔNG QUAN
Hình 1.1: Tinh thể urease được J.B.Summer chiết tách và kết tinh............................................... 4
Hình 1.2: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m .................................. 4
Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease........................................................................................... 6
Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease.................................................................................... 8
Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii............................................................. 8
Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme............................................................................................. 9
Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease............................................................................................ 10
Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease .............................. 11
Hình 1.9: Đồ thò biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất............................................ 12
Hình 1.10: Đồ thò hoạt tính urease theo pH trong 3 loại đệm nồng độ M/8 ............................... 14
Hình 1.11: Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh................................ 16
Hình 1.12: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease......................................................... 17
Hình 1.13: Công thức hóa học của các α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20)... 19
Hình 1.14: Ảnh hưởng của các hợp chất thiols, urea và acid boric tới khả năng ức chế urease
của dòch chiết tỏi trước khi ủ........................................................................................................ 21
Hình 1.15: Động học của sự ức chế urease bởi dòch chiết tỏi ở các nồng độ khác nhau........... 21
Hình 1.16: Cấu trúc phân tử urease của Helicobacter Pylori..................................................... 23
Hình 1.17: Các loại đậu chứa enzyme urease.............................................................................. 25
Hình 1.18: Cấu trúc phân tử của urea ......................................................................................... 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Hình 3.1: Màu sắc của chỉ thò trong nước cất (pH = 6.5) ........................................................... 64
Hình 3.2: Màu sắc của chỉ thò trong nước máy (pH = 6.8) ......................................................... 64
Hình 3.3: Vò trí chất chỉ thò và enzyme urease trên kit ................................................................ 66
DANH SÁCH HÌNH VẼ GVHD: TS. Trần Bích Lam
viii
Hình 3.4: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau trước khi nhúng dung dòch urea........ 66
Hình 3.5: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò PR trên kit sau khi nhúng urea................................. 66
Hình 3.6: Kit thử với các nồng độ phenol red khác nhau sau khi nhúng dung dòch urea 2% .... 67
Hình 3.7: Kit thử sau khi dung dòch urea chạy hết kit ................................................................. 67
Hình 3.8: Kit thử trắng sau khi dung dòch urea chạy hết kit........................................................ 68
Hình 3.9: Đồ thò NH
3
chuẩn dùng để xác đònh hoạt tính urease ................................................. 69
Hình 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt tính urease trong các loại dung môi....................................... 71
Hình 3.11: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 30µl urease 4% trong dung dòch urea ở
các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm................................................ 74
Hình 3.12: Khảo sát khả năng phát hiện của kit chấm 60µl urease 4% trong dung dòch urea ở
các nồng độ: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 –
100ppm, 8 – 50ppm....................................................................................................................... 75
Hình 3.13: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea ở các nồng
độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm................ 76
Hình 3.14: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea ở các nồng
độ: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 –
1000ppm ........................................................................................................................................ 77
Hình 3.15: Sự thay đổi màu sắc của chỉ thò trên kit sau khi nhúng dung dòch urea 0.5% và 1%78
Hình 3.16: Các bước đònh tính sự có mặt urea trong mẫu thử .................................................... 78
Hình 3.17: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước... 80
Hình 3.18: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong nước
mắm ............................................................................................................................................... 81

Hình 3.19: Đồ thò đường chuẩn biểu diễn sự thay đổi của pH theo nồng độ urea trong sữa..... 83
Hình 3.20: Đồ thò biễu diễn hoạt tính urease trên kit theo thời gian .......................................... 86
Hình 3.21: Sử dụng kit để phát hiện urea trong sữa.................................................................... 88
Hình 3.22: Sử dụng kit để phát hiện urea trong nước mắm......................................................... 89
Hình 3.23: Cách sử dụng kit thử để phát hiện urea trong mẫu nước đá ướp thủy sản và mẫu cá
....................................................................................................................................................... 92
DANH SÁCH BẢNG BIỂU GVHD: TS. Trần Bích Lam
ix
D
D
A
A
N
N
H
H
S
S
A
A
Ù
Ù
C
C
H
H
B
B
A
A

Û
Û
N
N
G
G
B
B
I
I
E
E
Å
Å
U
U
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Bảng 1.1: Thành phần amino acid của urease đậu nành và đậu rựa ........................................... 5
Bảng 1.2: K
m
và v
max
của enzyme urease...................................................................................... 13
Bảng 1.3: Giá trò pH
opt
ở các loại đệm ........................................................................................ 14
Bảng 1.4: Ảnh hưởng của các ion lên hoạt tính urease............................................................... 18
Bảng 1.6: Hàm lượng urease trong các loại đậu......................................................................... 25
Bảng 1.7: Các phương pháp để xác đònh hoạt tính enzyme......................................................... 28
Bảng 1.8: Tính chất hóa lý của urea............................................................................................ 33

Bảng 1.9: Thành phần hóa học của sữa bò tươi và sữa tổng hợp............................................... 36
Bảng 1.10: Xác đònh hàm lượng urea theo phương pháp Rappoport.......................................... 43
Bảng 1.11: Xác đònh hàm lượng urea theo phương pháp Perkins ............................................... 45
Bảng 1.12: Các loại kit thử nhanh chế tạo bởi Tổng cục Kỹ thuật (Bộ Công an)....................... 47
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1: Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thò................................................ 53
Bảng 2.2: Khảo sát phản ứng hiện màu trong dung dòch NH
4
OH .............................................. 53
Bảng 2.3: Khảo sát nồng độ chất chỉ thò thích hợp cho lên kit ................................................... 54
Bảng 2.4: Phương pháp lập đường NH
3
chuẩn............................................................................ 57
Bảng 2.5: Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp ..................................................... 59
Bảng 2.6: Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme thích hợp cho lên kit.................................... 59
Bảng 2.7: Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit ...................................................... 60
Bảng 2.8: Phương pháp xác đònh thời gian sử dụng của kit........................................................ 61
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Bảng 3.1: Khoảng chuyển màu và màu sắc của các chất chỉ thò................................................ 65
DANH SÁCH BẢNG BIỂU GVHD: TS. Trần Bích Lam
x
Bảng 3.2: Xây dựng đường chuẩn NH
3
......................................................................................... 68
Bảng 3.3: Kết quả đo hoạt tính enzyme urease............................................................................ 69
Bảng 3.4: Hoạt tính của urease trong các dung môi khác nhau ................................................. 70
Bảng 3.5: Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit ............................................................ 72
Bảng 3.6: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dòch urea ở các nồng độ khác nhau
....................................................................................................................................................... 73
Bảng 3.7: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong dung dòch urea ở các nồng độ khác nhau

khi tăng số lần chấm urease lên kit.............................................................................................. 74
Bảng 3.8: Khảo sát khả năng phát hiện của kit khi thay đổi lượng urease/kit ........................... 75
Bảng 3.9: Các thông số chế tạo của kit ....................................................................................... 76
Bảng 3.10: Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong các dung dòch urea có nồng độ thấp ... 77
Bảng 3.11: Khảo sát sự thay đổi pH của dung dòch urea trước và sau khi cho urease .............. 79
Bảng 3.12: Khảo sát sự thay đổi pH của nước mắm chứa urea trước và sau khi cho urease .... 80
Bảng 3.14: Khảo sát sự thay đổi pH của sữa chứa urea trước và sau khi cho urease ............... 82
Bảng 3.15: Khảo sát thời gian hiện màu của kit.......................................................................... 84
Bảng 3.16: Khảo sát hoạt tính của urease trên kit theo thời gian .............................................. 86
Bảng 3.17: Khảo sát sự có mặt của urea trong sữa..................................................................... 88
Bảng 3.18: Khảo sát sự thay đổi pH của các mẫu nước mắm .................................................... 90
Bảng 3.19: Khảo sát khả năng phát hiện urea của kit trong thủy sản ....................................... 93
LỜI MỞ ĐẦU GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 1
L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
I
M
M
Ơ
Ơ
Û
Û
Đ
Đ

A
A
À
À
U
U
“Ăn ngon mặc đẹp” là nhu cầu không thể thiếu của con người. Thực phẩm hiện nay đòi
hỏi không chỉ ngon mà còn phải bắt mắt, thu hút người tiêu dùng, do đó mà ngành công nghệ
sau thu hoạch ra đời với mục đích tạo ra giá trò cho thực phẩm như bảo toàn giá trò dinh dưỡng,
tăng giá trò cảm quan, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, tiện dụng…Các giá trò này không
tách rời nhau; có tác động tăng hay bù trừ nhau nhưng tổng thể phải tạo ra giá trò gia tăng cho
sản phẩm. Tuy nhiên, ở một số loại thực phẩm mà giá trò cảm quan hay dinh dưỡng đóng vai
trò quan trọng thì người bán đã sử dụng những thủ thuật không được phép sử dụng như phun
hóa chất để làm bóng trái cây, ngâm thòt gia súc hay gia cầm trong dung dòch hàn the, ướp
urea cho thủy sản để nhìn bề ngoài trông tươi lâu hơn, cho urea vào trong nước mắm để làm
tăng độ đạm…Những thủ thuật “hàng chợ” này không chỉ đánh lừa người tiêu dùng trong việc
mua các sản phẩm thực phẩm không còn tươi ngon, không đủ chất dinh dưỡng mà còn có nguy
cơ ảnh hưởng tới sức khỏe.
Hiện nay, công tác kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm còn nhiều bất cập, thiếu phương
tiện, chưa được tiến hành rộng rãi, vì vậy người tiêu dùng cần chủ động tránh mua thực phẩm
kém chất lượng, không an toàn. Một biện pháp dễ thực hiện dành cho mọi người là sử dụng kit
thử nhanh để kiểm tra sự có mặt của một hóa chất độc hại trong thực phẩm ngay khi vừa mua
về vì đơn giản, dễ sử dụng, giá thành rẻ và thời gian phát hiện ngắn. Kit thử nhanh cũng là
phương tiện giúp cho công tác kiểm tra nhanh chất lượng thực phẩm ở cấp cơ sở.
Hiện nay, trên thò trường có bán nhiều loại kit thử nhanh nhưng đa phần là các kit ngoại
chưa phù hợp lắm với điều kiện của Việt Nam, khi sử dụng phải đong, đo hóa chất từ các lọ
nhỏ đóng sẵn, vì vậy không loại trừ được sai số chủ quan do người sử dụng gây ra. Trong số
các kit nội bán trên thò trường chưa có loại kit dùng để phân tích urea trong thực phẩm. Với lý
do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh dùng trong phân tích urea trong
khuôn khổ bài luận văn này.

Nội dung nghiên cứu gồm 2 phần chính:
 Chế tạo kit thử nhanh dùng để phân tích urea dựa trên nguyên tắc sử dụng enzyme
urease để thủy phân đặc hiệu urea.
 Ứng dụng kit thử để phân tích urea trong các mẫu thực.
CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam
Trang 2
C
C
H
H
Ö
Ö
Ô
Ô
N
N
G
G
1
1
TOÅNG QUAN
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 3
1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5)
1.1.1. Danh pháp quốc tế và phân loại [2]
 Danh pháp:
Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase tức là enzyme xúc tác cho quá trình
thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic theo phương trình phản ứng sau:
 Phân loại:
Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong

đó:
 Số 3: chỉ nhóm chính là nhóm hydrolase (nhóm các enzyme thủy phân như esterase,
carbohydrase, peptidase, amidase…)
 Số 5: chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C–N, khác liên kết peptid
(asparaginase, glutaminase, urease…)
 Số 1: chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase).
 Số 5: chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ.
1.1.2. Tính chất vật lý của enzyme urease
Urease là enzyme lần đầu tiên được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack
bean – Canavalia ensiformis) vào năm 1926 [37]. Và chính công trình nghiên cứu này đã đoạt
giải Nobel vào năm 1946 đồng thời cũng đăït nền tảng đầu tiên cho các công trình nghiên cứu
về urease sau này.
Urease là các tinh thể có 8 cạnh, không màu, trong suốt, quan sát được qua kính hiển vi và
có đường kính d = 4 – 30µm tùy theo phương pháp chiết tách.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 4
Hình 1.1: Tinh thể urease được J.B.Summer chiết tách và kết tinh [37]
Khối lượng phân tử của urease được 2 nhà nghiên cứu Joseph và Evelyn xác đònh bằng
phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m đối với urease đậu rựa và đậu nành Brasil và so
sánh với các protein đã biết trước khối lượng phân tử [17]. Kết quả cho thấy urease từ đậu
nành có 2 peak ứng với 2 phân tử lượng khác nhau đó là 540.000 Da và 420.000 Da, trong khi
đó urease từ đậu rựa chỉ xuất hiện 1 peak duy nhất với phân tử lượng là 480.000 Da.
Hình 1.2: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m [17]
Như vậy, urease từ những nguồn khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau và ngay cả
trong cùng một nguồn là đậu nành, có tới 2 loại urease. Hai loại urease này khác nhau ở thành
phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không thay đổi. Các apoenzyme là những
chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acid amin. Thành phần các acid amin này không
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 5
giống nhau ở những nguồn khác nhau đã giải thích cho sự khác nhau về khối lượng phân tử

như đã nói ở trên.
Bảng 1.1: Thành phần amino acid của urease đậu nành và đậu rựa [17]
a – Dữ liệu do Joseph và Evelyn khảo sát
b – Dữ liệu để so sánh (do Staples và Reithel khảo sát).
Enzyme urease có cấu trúc bậc 4. Theo nghiên cứu của Kunio TAKISHIMA, Tatsuko
SUGA, Gunji MAMIYA (1988), enzyme urease đậu rựa có 840 acid amine. Khối lượng phân
tử tương đối của 1 tiểu đơn vò protein là 90770 Da, từ đó suy ra phân tử urease gồm có 6 tiểu
đơn vò. Có 13 trong số 25 histidine nằm tập trung trong vùng acid amine 479 đến 607 do đó
vùng này có thể chứa nikel. Cys-592, acid amine cần thiết cho hoạt tính của enzyme cũng
nằm trong vùng giàu histidine này. [23]
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 6
Hình 1.3: Cấu trúc của enzyme urease
1.1.3. Tính chất hóa lý của enzyme urease
Theo Sumner, các tinh thể urease hòa tan dễ dàng trong dung dòch ammonia loãng và
dung dòch kiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dòch muối loãng và acid hữu cơ
tùy thuộc nồng độ acid. [37]
Sumner và Hand đã xác đònh được điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng pH =
5.0 – 5.1. Tại điểm đẳng điện, độ hòa tan của urease là cực nhỏ.
Urease cũng mang những đặc tính của protein như:
 Tan trong nước và dung dòch muối loãng.
 Không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thước phân tử lớn.
 Tan khi có lớp áo nước và tích điện, tủa khi mất lớp áo nước và trung tính.
 Bò biến tính dưới tác dụng của các yếu tố như acid, kiềm đặc, các ion kim loại nặng và
nhiệt độ cao…Khi đó, urease mất tính xúc tác sinh học, mất khả năng hòa tan trong
nước, mất khả năng kết tinh và các tính chất hóa lý khác nhau (độ nhớt, sức căng bề
mặt…), biến đổi hình dạng và kích thước, dễ bò phân hủy bởi protease.
 Dễ bò tủa thuận nghòch trong các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone…hoặc muối
ammonium sulfate, sodium chloride.
 Tính chất hóa lý của enzyme có thể thay đổi khi kết hợp với một số chất như cơ chất,

coenzyme, ion kim loại hoặc một số chất hữu cơ đặc hiệu khác.
 Phân tử enzyme có thể tồn tại ở các trạng thái ion như anion, cation hoặc trung hòa
tùy theo pH của môi trường.
1.1.4. Trung tâm hoạt động
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 7
Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm các amino acid có nhóm hóa học hoạt động
mạnh. Các nhóm hóa học hoạt động này có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất
enzyme – cơ chất. Các gốc amino acid thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi polypeptide
nhưng do thực tế chuỗi polypeptide tồn tại ở trạng thái không gian (cấu trúc cấp ba và bốn)
nên các amino acid thường tồn tại gần nhau. Ngoài ra trong trung tâm hoạt động còn có mặt
của ion kim loại. Các ion kim loại có vai trò xúc tác rất lớn, có tác dụng liên kết giữa enzyme
và cơ chất hoặc apoenzyme và coenzyme hoặc tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử. [2]
Đặc điểm chung của các hydrolase là không có nhóm ngoại nên tâm hoạt động của chúng
phải có các gốc acid amin đặc hiệu. Tâm hoạt động của hydrolase thường chứa vòng imidazol
của histidine và nhóm hydroxyl của serine. Do cấu trúc bậc 3 của enzyme/protein mà vòng
imidazol và nhóm hydroxyl này gần nhau hình thành nên liên kết hydro như hình vẽ sau:
Sumner chứng minh rằng urease là enzyme không có bất cứ cofactor hữu cơ nào mà cũng
không có sắt, manganese hay phosphorus [37]. Theo E. Jabri, M.B. Carr, R.P. Hausinger, P.A.
Karplus thì trung tâm hoạt động của urease có chứa 2 nguyên tử Ni. Urease có độ tinh khiết
cao có khoảng 2g nguyên tử Ni trên 1 tiểu đơn vò. Hai nguyên tử Ni liên kết với nhau thông
qua cầu nối carbamate. Mỗi nguyên tử Ni được nối với 2 nguyên tử N trong vòng imidazole và
1 nhóm carboxylate, 1 phân tử H
2
O (hình 1.4). Và chính 2 nguyên tử Ni này đóng vai trò rất
quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease. Đó cũng chính là lí do mà urease còn được
gọi là “Nikel dependent enzyme”. [12]
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 8
Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease (Ni: 2 quả cầu màu xanh) [9][39]

Tuy nhiên urease có các nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩn Bacillus pasteurii
trong trung tâm hoạt động chứa ion kim loại Zn
2+
[31], còn ở Klebsiella aerogenes có cofactor
là Cu
2+
[36] như hình bên dưới:
Hình 1.5: Urease từ K.aerogenes và từ Bacillus pasterrii
Ở pH trung tính, EDTA có thể được sử dụng để bảo vệ enzyme khỏi các kim loại tạp trong
quá trình tinh sạch. Tuy nhiên, ở pH thấp (3.6 – 4.0), EDTA có thể không những thúc đẩy sự
mất Ni mà còn ức chế không thuận nghòch hoạt tính của enzyme. [11]
Ngoài ra, trong trung tâm hoạt động của urease còn chứa nhóm –SH, bằng chứng là hoạt
tính urease bò ức chế khi các nhóm –SH bò khóa.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 9
1.1.5. Cơ chế xúc tác
Năm 1913, hai nhà khoa học Leonom Michaelis và Maud Menten đưa ra mô hình động
học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme. Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ
kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Phức hợp ES sẽ lại được chuyển
hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E). Enzyme được giải phóng lại
thực hiện những phản ứng mới. [2]
Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme có liên quan đến cơ chất
và quan điểm được nhiều nhà khoa học chấp nhận là thuyết trung tâm hoạt động của
Koshland. Theo thuyết này, trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác
động cảm ứng của cơ chất, đònh hướng thích hợp để cơ chất gắn chính xác vào và thực hiện
quá trình xúc tác.
Hình 1.6: Cơ chế xúc tác của enzyme
Đối với enzyme urease, cơ chế của quá trình xúc tác phản ứng theo phương trình:
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 10

Cụ thể xảy ra ở trung tâm hoạt động như sau:
Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease
Theo sơ đồ trên ta thấy: ban đầu phân tử urea sẽ tấn công và tạo liên kết với 2 nguyên tử
Ni đồng thời có 2 phân tử H
2
O được giải phóng ra. Tiếp theo là sự sắp xếp lại của các điện tử,
hình thành những mối liên kết mới tại trung tâm hoạt động. Cuối cùng là sự tái cấu trúc ở
trung tâm hoạt động của urease với sự tham gia của 2 phân tử nước, đẩy gốc carbamate ra
ngoài đồng thời giải phóng 1 phân tử NH
3
. Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni là rất quan
trọng trong việc tạo liên kết giữa enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian.
Đây chính là một cofactor của urease.
Một số tác giả cho rằng vai trò của 2 nguyên tử Ni khác nhau. Một nguyên tử Ni giữ
nhiệm vụ liên kết và hoạt hóa phân tử urea, nguyên tử Ni còn lại giữ nhiệm vụ liên kết và
hoạt hóa phân tử nước ái nhân. [6]
1.1.6. Cơ chất của urease
Việc khám phá ra dãy cơ chất của enzyme urease khá quan trọng trong việc mô tả vai
trò của trung tâm hoạt động Ni
2+
trong quá trình xúc tác.
Một số cơ chất được biết đến của enzyme urease là: [6]
 Urea
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 11
 Semicarbazide
 Formamide
 Acetamide
 N – Methylurea
 N – Hydroxyurea

 Dihydroxyurea
 N – Benzoylphosphoric triamide
 Phosphoramidate (hình 1.a)
 Diamidophosphate (hình 1.b)
 Phosphoric triamide (hình 1.c)
 Phenyl phosphorodiamidate (Ar = Ph, PPD) (hình 1.d)
 N-(3-methyl-2-butenyl)phosphoric triamide (Alk = (H
3
C)2C=CH, MBPT) (hình 1.e)
Trong đó urea là cơ chất đặc hiệu của urease với năng lượng hoạt hóa là 8700 hoặc
11700 calories/g.mol ở 25
o
C còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thì
vận tốc nhỏ hơn 120 lần. Phân tử urea rất bền. Trong khoảng pH = 2 – 12, sự phân hủy urea
không enzyme trong dung dòch không phụ thuộc pH và có chu kỳ bán hủy là 3.6 năm ở 38
o
C.
Người ta chứng minh rằng phản ứng này là phản ứng khử mà sản phẩm duy nhất là ammonia
và acid cyanic. Tốc độ khử tăng khi pH > 12 và giảm khi pH < 2. Nếu có sự tham gia của
enzyme, enzyme sẽ chuyển phản ứng khử thành phản ứng thủy phân và điều này nói lên vai
trò quan trọng của Ni
2+
như 1 acid Lewis trong tính chất hóa học của urease. Hay nói cách
khác enzyme đã chống lại sự phân hủy và tạo điều kiện cho urea bò nước hay ion OH
–
tấn
công để tạo ra carbamate.
Hình 1.8: Công thức cấu tạo của một số cơ chất chứa phospho của urease
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 12

1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease
1.1.7.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: [1][37]
Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng
độ enzyme: V = k . [E], V: vận tốc phản ứng, [E]: nồng độ enzyme.
Tuy nhiên, dung dòch enzyme urease loãng dễ bò mất hoạt tính hơn dung dòch có nồng độ
cao với điều kiện là enzyme phải được bảo quản lạnh. Cũng có trường hợp khi nồng độ
enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm.
1.1.7.2. nh hưởng của nồng độ cơ chất, mô hình Michaelis_Menten: [1][53]
Phương trình Michaelis_Menten:
]S[K
]S[v
v
m
max



Trong đó: K
m
: hằng số Michaelis, là hằng số ái lực của enzyme đối với cơ chất hay nồng
độ cơ chất đủ làm cho tốc độ phản ứng đạt đến ½ tốc độ cực đại, đặc trưng của
mỗi loại enzyme đối với mỗi loại cơ chất.
v
max
: vận tốc phản ứng đạt cực đại.
[S]: nồng độ cơ chất
Hình 1.9: Đồ thò biểu diễn vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất
Từ phương trình ta có thể xét đến 3 trường hợp:
 Nếu [S] << Km thì:
m

max
K
]S[v
v

 . Như vậy, ở nồng độ cơ chất thấp, v phụ thuộc tuyến
tính vào [S].
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN GVHD: TS. Trần Bích Lam
Trang 13
 Nếu [S] >> K
m
thì: v = v
max
: tức vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc [S].
Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v cũng không tăng theo.
 Nếu [S] = K
m
thì v = v
max
/2: vận tốc phản ứng bằng nửa vận tốc cực đại. Hoặc ta cũng
có thể xác đònh K
m
và V
max
theo phương trình được viết lại từ phương trình trên như
sau:
]S[
1
v
K

v
1
v
1
max
m
maxi

Từ đó ta sẽ biểu diễn sự phụ thuộc của 1/v
i
theo 1/[S] bằng một phương trình đường
thẳng và xác đònh K
m
, V
max
.
Một số giá trò K
m
và v
max
của urease trong các nghiên cứu được cho bảng sau:
Bảng 1.2: K
m
và v
max
của enzyme urease [53]
Nguồn gốc pH Nhiệt độ (
o
C) Dung dòch đệm K
m

(mol/l) v
max
Đậu nành
7.0 25 Phosphate 19×10
-3
10.5×10
-6
(mol/l/s)
Đậu nành
7.0 25 Sulfite 476×10
-3
37×10
-6
(mol/l/s)
Đậu nành
7.0 25 Thiosulfate 56×10
-3
17.2×10
-6
(mol/l/s)
1.1.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Giống như phản ứng hóa học, khi nhiệt độ tăng, vận tốc chuyển động của các phân tử
tăng, sự tiếp xúc giữa các phân tử cũng tăng nên vận tốc phản ứng tăng. Tuy nhiên do bản
chất enzyme là protein nên nhiệt độ cao sẽ làm biến tính protein, enzyme mất hoạt tính [1].
Do đó, mỗi enzyme sẽ tồn tại một nhiệt độ mà ở đó hoạt tính cao nhất, gọi là nhiệt độ tối thích
t
opt
. Theo các nghiên cứu từ đậu rựa (jack bean) thì nhiệt độ t
opt
vào khoảng 45-50

o
C, khi nhiệt
độ vượt quá 65
o
C thì hoạt tính urease bò giảm và có thể mất hẳn khi nhiệt độ đạt 85
o
C [17].
Tuy nhiên nhiệt độ t
opt
của urease không cố đònh, mà nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:
nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng…
Người ta đã thấy rằng độ bền nhiệt của urease tăng khi có mặt cơ chất hoặc chất ổn đònh,
chất hoạt hóa như L_cysteine, 2_mercaptoethanol...Urease ở dung dòch loãng không có cơ chất
thường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [9]. Ở nhiệt độ
thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng không bò biến tính.
1.1.7.4. Ảnh hưởng của pH và dung dòch đệm: [1][16]