Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm chitosan phối hợp với vật liệu nano bạc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
-----------------------------------------------------

TRỊNH VĂN CHÂU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CHẾ
PHẨM CHITOSAN PHỐI HỢP VỚI VẬT LIỆU NANO BẠC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGHÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS: HỒ PHÚ HÀ

Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa học Thạc sĩ của mình, tơi vơ cùng biết ơn Tập thể các thầy
cơ giáo trong Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học
Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tơi trong q trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS. Hồ Phú Hà và thầy giáo
PGS.TS. Mai Anh Tuấn - ĐH Bách Khoa Hà Nội, người đã tận tình chỉ bảo, hướng
dẫn tơi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn của mình.
Cuối cùng tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động
viên, khuyến khích tơi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 15/2/2014

Trịnh Văn Châu

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, luận văn này là kết quả nghiên cứu và làm việc của tôi,
các nội dung nghiên cứu kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, rõ ràng. Nếu
có bất kỳ vấn đề gì xảy ra, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 02 năm 2014
Tác giả luận văn

Trịnh Văn Châu

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vi
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. viii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN ............................................................3
1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan ...................................................3
1.1.2. Tính chất cơ bản của chitosan ..........................................................................4

1.1.3. Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan ...........................................................6
1.1.4. Các ứng dụng của chitosan trong cuộc sống ....................................................7
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NANO BẠC ............................................................8
1.2.1. Giới thiệu về cơng nghệ nano ...........................................................................8
1.2.2. Tính chất hạt nano bạc ....................................................................................10
1.2.3. Tính kháng khuẩn của nano bạc .....................................................................13
1.2.4. Ứng dụng của nano bạc trong cuộc sống .......................................................14
1.3. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN ..........................................................................15
1.3.1. Khái niệm chung về vi khuẩn ..........................................................................15
1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus .....................................................................16
1.3.3. Vi khuẩn Escherichia coli ...............................................................................17
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................19
2.1. VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ SỬ DỤNG ...............................................19
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................19
2.1.2. Trang thiết bị sử dụng .....................................................................................19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................20
2.2.1. Chuẩn bị vi sinh vật.........................................................................................20
2.2.2. Phương pháp chuẩn bị dung dịch chitosan.....................................................22
2.2.3. Chuẩn bị nano bạc ..........................................................................................26

iii


2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chitosan kết hợp nano bạc
...................................................................................................................................30
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................33
3.1. HẠT NANO BẠC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN ...................................33
3.1.1. Xác định đặc tính hạt nano bạc ......................................................................33
3.1.2. Xác định tốc độ nhỏ dịch trong chế tạo hạt nano bạc và khả năng kháng vi
khuẩn .........................................................................................................................36

3.1.3. Khả năng kháng khuẩn của dung dịch nano bạc ............................................38
3.2. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN ....................40
3.2.1. So sánh hoạt tính kháng E.coli của chitosan tinh sạch bằng hai phương pháp
khác nhau. .................................................................................................................40
3.2.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chitosan ................................................43
3.3. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA PHỨC HỢP
CHITOSAN/NANO BẠC .........................................................................................45
3.3.1. Xác định khả năng kháng E.coli của phức chất chitosan/nano bạc ...............45
3.3.2. Xác định khả năng kháng S.aureus của phức hợp chitosan/nano bạc ...........47
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN ....................................................................................50
HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52
PHỤ LỤC .................................................................................................................56
1. Phương trình đường chuẩn vi khuẩn .................................................................56
1.1. Đường chuẩn mật độ tế bào E.coli ....................................................................56
1.2. Đường chuẩn mật độ tế bào S.aureus ................................................................56
2. Phương trình đường chuẩn dung dịch nano bạc ...............................................57
3. Kết quả đo phổ hấp thụ UV-vis............................................................................57

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano bạc .............................12
Bảng 2.1: Nồng độ pha loãng chitosan .....................................................................25
Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch nano bạc pha loãng ...................................................29
Bảng 2.3: Phương pháp phối hợp chitosan/nano bạc ................................................31
Bảng 3.1: Kết quả kháng E.coli của các nồng độ nano bạc ......................................39
Bảng 3.2: Kết quả kháng S.aureus của các nồng độ nano bạc .................................40
Bảng 3.3: Kết quả hai loại chitosan sau tinh sạch .....................................................40

Bảng 3.4: Khả năng kháng E.coli của chitosan tinh sạch bằng các phương pháp khác
nhau ...........................................................................................................................42
Bảng 3.5: Kết quả kháng E.coli của chitosan CA2 ...................................................43
Bảng 3.6: Kết quả kháng S.aureus của chitosan CA2 ..............................................44
Bảng 3.7: Kết quả kháng E.coli của phức hợp chitosan/nano bạc ............................46
Bảng 3.8: Kết quả kháng S.aureus của phức hợp chitosan/nano bạc .......................48

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Chitosan....................................................................4
Hình 1.2: Hiện tượng cộng hưởng plasmon của hạt hình cầu...................................10
Hình 1.3: Ion bạc vơ hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn .......................13
Hình 1.4: Vi khuẩn Staphylococcus aureus ..............................................................16
Hình 1.5: Vi khuẩn E.coli .........................................................................................17
Hình 2.1: Quy trình tinh sạch ....................................................................................23
Hình 2.2: Quy trình tinh sạch ....................................................................................23
Hình 2.3: Phương pháp đánh giá hoạt tính của chitosan...........................................26
Hình 2.4: Q trình tổng hợp dung dịch hạt nano bạc .............................................27
Hình 2.5: Sơ đồ đánh giá hoạt tính kháng VSV của nano bạc ..................................30
Hình 2.6: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng VSV của nano bạc/chitosan .............32
Hình 3.1: Nồng độ khác nhau của dung dịch hạt nano bạc .......................................33
Hình 3.2: Phổ UV-vis của dung dịch hạt nano bạc ...................................................34
Hình 3.3: Ảnh chụp SEM của nano bạc ....................................................................35
Hình 3.4: Ảnh chụp TEM của nano bạc ....................................................................35
Hình 3.5: Nano bạc nhỏ TSC 10 phút .......................................................................36
Hình 3.6: Nano bạc nhỏ TSC 45 phút .......................................................................36
Hình 3.7: Nano bạc nhỏ TSC 10 phút kháng E.coli ..................................................37
Hình 3.8: Nano bạc nhỏ TSC 45 phút kháng E.coli .................................................37

Hình 3.9: Khả năng kháng E.coli của các nồng độ nano bạc khác nhau .................38
Hình 3.10: MIC nano bạc với S.aureus.....................................................................39
Hình 3.11a: Khả năng kháng E.coli của

chitosan CA1 ..........................................41
vi


Hình 3.11b: Khả năng kháng E.coli của chitosan CA2 ............................................41
Hình 3.12: Khả năng kháng E.coli của chitosan CA2 ..............................................43
Hình 3.13: Khả năng kháng S.aureus của chitosan sấy thường ................................44
Hình 3.14: Khả năng kháng E.coli của phức hợp chitosan/nano bạc .......................45
Hình 3.15: Đánh giá ảnh hưởng của phức hợp chitosan/nano bạc đối với E.coli ...46
Hình 3.16: Khả năng kháng S.aureus của phức chất ................................................48

vii


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Danh từ viết tắt

Nghĩa tiếng việt

DD (Degree of deacetylation)

Độ đeacetyl hóa

SEM

Kính hiển vi điện tử qt

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu

TSC (Trisodium Citrate)

Tri-natri citrate

CA1

Phương pháp sấy đơng khơ

CA2

Phương pháp sấy thường

UV-Vis

Quang phổ hấp thụ

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua

viii


LỜI MỞ ĐẦU
Chitosan là chế phẩm sinh học, được hình thành từ q trình deacetyl hóa

chitin, có nhiều ở các lồi giáp xác. Sản xuất Chitosan khơng những góp phần làm
giảm ảnh hưởng đến môi trường từ các phế liệu thủy sản mà còn tạo giá trị kinh tế
lớn hơn. Chitosan có các tính chất quan trọng, như là chất phụ gia thực phẩm, tạo
màng bao gói, khả năng kháng khuẩn, làm giảm q trình thốt hơi nước của sản
phẩm ở mọi điều kiện trong bảo quản và đặc biệt khơng gây ảnh hưởng đến sức
khỏe người sử dụng, vì thế Chitosan đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Bạc được biết đến như một nguyên tố có khả năng khử trùng mạnh nhất tồn
tại trong tự nhiên. Các đây 200 năm các nhà khoa học đã xem huyết thanh người
như là một dịch keo, vì vậy keo bạc đã được sử dụng làm chất kháng khuẩn ngay
trong cơ thể con người. Kể từ đó keo bạc được sử dụng rộng rãi để chữa các bệnh
nấm trên da, điều trị các vết thương, vết bỏng, các bệnh răng miệng, làm thuốc nhỏ
mắt. Tuy nhiên, sau khi thuốc kháng sinh được phát minh (giữa thế kỉ 20) với hiệu
lực khử trùng mạnh hơn, keo bạc đã bị thay thế dần. Nhưng chỉ 30 năm sau đó
người ta đã nhận ra rằng có rất nhiều lồi vi khuẩn có khả năng chống lại những tác
dụng của thuốc kháng sinh và vấn đề này ngày càng trở nên đáng lo ngại. Lúc này
tính năng kháng khuẩn của bạc lại được chú ý do có phổ tác dụng rộng và khơng bị
hạn chế bởi hiệu ứng kháng thuốc [36, 23]. Ngày nay, việc tạo ra các vật thể kích
thước nano đã trở nên phổ biến, ở kích thước này các hạt vật chất thể hiện nhiều
tính chất lý-hóa khác thường so với khi vật chất đó ở trạng thái khối, khả năng
kháng khuẩn của nó cao hơn 20-60 ngàn lần so với ion Ag+ [10] . Các hạt nano bạc
với năng lượng bề mặt lớn có khả năng giải phóng từ từ các ion bạc vào trong dung
dịch, nhờ vậy nano bạc có hiệu lực khử khuẩn mạnh hơn rất nhiều lần và kéo dài
hơn so với các bạc ở dạng keo, dạng ion hay dạng rắn [36, 37]. Chính những tính
chất lượng tử đặc biệt này nên nano bạc sẽ bị biến thể trong gian bảo quản, để ổn
định được nó cần phải có một phương pháp chế tạo đặc biệt giúp cho khả năng sử
dụng được triệt để hơn.
1


Dựa vào đặc tính quý giá trên, ý tưởng kết hợp hai loại vật liệu đã được hình

thành. Chitosan loại chế phẩm có khả năng kháng khuẩn, khơng gây độc và có khả
năng tạo thành lớp màng mỏng bao quanh thực phẩm. Nano bạc, là vật liệu có khả
năng kháng khuẩn cực mạnh chỉ với nồng độ rất nhỏ, , nhưng lại dễ bị oxi hóa. Khi
sử dụng kết hợp với nhau sẽ cho ra 1 hỗn hợp dung dịch bền vững có hoạt tính
mạnh để ứng dụng rộng rãi trong sản xuất.
Vi khuẩn Escherichia coli (Gram âm) và Staphylococcus aureus (Gram
dương) là hai loài vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên (Đất, nước, cơ thể
người, động vật …), loài vi khuẩn tồn tại rất phổ biến trong nông sản và thực phẩm.
Chúng là những tác nhân gây ra các vụ ngộ độc trong thực phẩm trên khắp cả nước
trong thời gian qua. Chính vì sự phổ biến và tác hại nguy hiểm của nó đối với con
người nên tơi đã tập trung tồn bộ thời gian làm khóa luận của mình “Nghiên cứu
khả năng kháng Vi sinh vật của chế phẩm chitosan phối hợp với vật liệu Nano
Bạc”.
Vì vậy, trong tồn bộ khóa luận này, tơi tập trung vào những mục đích như sau:
-

Đưa ra quy trình chế tạo hạt nano bạc có tính ổn định, hoạt tính kháng khuẩn
cao.

-

Đưa ra quy trình tinh sạch chitosan hợp lý, hoạt tính kháng khuẩn cao.

-

Xác định MIC của nano bạc và chitosan lên vi khuẩn: E.coli, S. aureus.

-

Xác định tỷ lệ phối trộn tối ưu giữa chitosan/nano bạc cho khả năng kháng vi

khuẩn: E.coli, S.aureus.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN
1.1.1. Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan
1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và nguồn gốc của chitosan
Năm 1811, giáo sư Braconnot thuộc khoa Lịch sử Tự nhiên kiêm giám đốc
vườn thực vật Viện Hàn Lâm Khoa Học Nacy-Pháp đã tìm thấy Chitin lần đầu tiên
ở nấm, ơng đặt tên cho chất này là “Fungine”. Năm 1823, Odier phân lập được một
số chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là “chitin”, và kết luận có dạng cơng thức giống
cellulose. Năm 1843, Lassaige đã chứng minh rằng trong thành phần của chitin có
chưa nitơ, từ đây mở ra những nghiên cứu và ứng dụng hợp chất này với các dẫn
xuất của nó [18].
Ở động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số
động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn. Ở động
vật bậc cao, monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho sự
tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Ở thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm,
các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo,…[9].
Chitin có cấu trúc là dạng polysaccharide, ở dạng rắn. Chitosan là sản phẩm
deacetyl hóa từ chitin, là chất rắn, xốp, nhẹ, tồn tại ở các kích thước rắn khác nhau.
Chitosan, một polymer tự nhiên quan trọng, trong tự nhiên nó nhiều thứ hai sau
cellulose.
Trong các loài thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitinchitosan chiếm khá cao, dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khơ. Vì thế vỏ
tơm, cua, ghẹ là nguồn ngun liệu chính để sản xuất chitin - chitonsan [12].
1.1.1.2. Cấu trúc hóa học của chitosan
Chitosan thu được từ q trình deacetyl hóa chitin, thay thế nhóm N-acetyl
thành nhóm amin ở vị trí C2.

3


Do q trình khử acetyl xảy ra khơng hồn tồn nên người ta qui ước nếu độ
deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50%
gọi là chitin [9].
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các

đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D-

glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit.
Cơng thức cấu tạo của chitosan:

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Chitosan
Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose.
Cơng thức phân tử: [C6H11O4N]n
Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n
Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều
sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp.
1.1.2. Tính chất cơ bản của chitosan
1.1.2.1. Tính chất lý, hóa học của chitosan
Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng
vảy, khơng mùi, khơng vị, nhiệt độ nóng chảy 309-3110C[8].
Chitosan có tính kiềm nhẹ, khơng tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan
được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…,
tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch axit
acetic 1-1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit lỗng liên quan đến kích
thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung
của tất cả các dung dịch polyme) [5].

4


1.1.2.2. Tính chất sinh học và độc tính của chitosan
a. Tính chất sinh học của chitosan
Chitosan khơng độc, dùng an tồn cho người [35]. Chúng có tính hồ hợp
sinh học cao với cơ thể [30], có khả năng tự phân huỷ sinh học [28].
Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính
kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của
tế bào, có khả năng ni dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng
cầm máu, chống sưng u [26].
Ngồi ra, chitosan cịn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ
huyết áp [32], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [20].
Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc tiết
ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều
công trình đã cơng bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống
miễn dịch cơ thể, khơi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư,
HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [39].
b. Độc tính của chitosan
Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc,
chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và
người, không gây độc tính trường diễn [33].
Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch,
khơng thấy có tích luỹ ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ
sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng
qua thận và nước tiểu, chitosan khơng phân bố tới gan và lá lách[12].
Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt,
khơng độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hịa hợp sinh học khơng
những đối với động vật mà cịn đối với các mơ thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm
mau liền vết thương [22].

5


1.1.3. Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan
1.1.3.1. Khả năng kháng virus, kháng nấm
a. Khả năng kháng virus
Chitosan ức chế hệ thống sinh sản của virus thực vật đã được nghiên cứu
[25], mức độ ngăn cản sự truyền nhiễm virus khác nhau theo trọng lượng phân tử
của chitosan, có nhiều nghiên cứu kết luận rằng chitosan có khả năng kháng lại
virus khoai tây, thuốc lá, dưa chuột,… [16].
b. Khả năng kháng nấm
Hoạt tính kháng nấm của chitosan được chứng minh qua các nghiên cứu với
nhiều loại nấm khác nhau: Saccharomycodes ludwigii, Pseudomonas fragi,
Candida, zygosaccharomyces bailii, Pyricularia grisea,…
Sự ức chế và làm ngưng hoạt động của nấm men, nấm mốc phụ thuộc vào
nồng độ chitosan, pH, nhiệt độ, đặc điểm dinh dưỡng [17].
1.1.3.2. Khả năng kháng vi khuẩn
Chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của rất nhiều vi khuẩn như E.coli,
Samonella, Vibiro parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus,…
Ngoài ra các thí nghiệm cũng cho thấy có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh
hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như: K+, Na+, Mg2+, Ca2+…
Nói chung các kết luận cơ chế chính xác về hoạt động kháng khuẩn của
chitosan vẫn chưa được nghiên công bố rõ ràng, những cơ chế chính đã được đề
xuất như sau[21]:
-

Tương tác giữa các ion tích điện dương trên các phân tử chitosan và các điện
tích âm trên màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi trong cấu trúc màng tế

bào, thay đổi khả năng thẩm thấu gây rò rỉ protein và các thành phần khác
trong tế bào, làm giảm chức năng sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn dẫn đến
mất khả năng bảo vệ, trao đổi chất của tế bào.

-

Chitosan đóng vai trị như chất chọn lọc liên kết với các ion kim loại, sau đó
ức chế các chất độc và sự phát triển của vi khuẩn.
6


-

Chitosan liên kết với nước, ức chế các enzyme khác nhau.

-

Chitosan thâm nhập vào bào tương của các vi khuẩn và thông qua các liên
kết với DNA, ngăn cản sự tổng hợp ARN và protein.

-

Chitosan tạo thành một lớp cao phân tử không thấm nước trên bề mặt tế bào
làm thay đổi tính thấm của tế bào bà ngăn các chất dinh dưỡng vào tế bào.

-

Chitosan có liên kết với các điện tích âm trong tế bào, làm chúng kết dính
thành từng mảng, gây nhiễu loạn các hoạt động sinh lý của các vi sinh vật
dẫn đến phá hủy tế bào.

1.1.4. Các ứng dụng của chitosan trong cuộc sống
Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau:
Trong mỹ phẩm: Dùng làm phụ gia để tăng độ bám dính, tăng độ hịa hợp
sinh học với da, chống tia cực tím, làm mềm da, làm kem lột mặt…Trong công
nghiệp: Các kỹ nghệ làm giấy, chế biến gỗ, điện tử, mực in, phim ảnh: chitosan
dùng làm phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm. Trong xử lý nước: Chitosan
dùng để xử lý nước thải công nghiệp (tạo phức với các kim loại nặng độc hại) để lọc
trong nước sạch tiêu dùng. Trong nông nghiệp: Chitosan chống lại các nấm và vi
khuẩn gây bệnh của môi trường xung quang, để bảo vệ thực vật, cịn dùng làm chất
kích thích sinh trưởng cây trịng, thuốc chống bệnh đạo ơn, khơ vằn cho lúa. Trong
công nghiệp thực phẩm: Để bảo quản đóng gói thức ăn, bảo quản thực phẩm, hoa
quả, rau tươi… Vì nó tạo màng sinh học khơng độc. Người ta đã tạo màng chitosan
trên quả tươi để bảo quản quả đào, quả lê, quả kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây,
cà chua, quả vải, xoài, nho… dùng để lọc trong các loại nước ép quả, bia, rượu
vang, nước giải khát …[15]. Trong công nghệ sinh học: Dùng để cố định enzyme
và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc ký chọn lọc. Trong y tế:
Đây là ứng dụng quan trọng nhất, mang lại hiệu quả kinh tế cao của chitosan như
làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm (Tá dược độn, tá dược dính, tá dược
dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…), làm chất mang sinh học
để gắn thuốc, tạo ra thuốc polyme tác dụng chậm kéo dài. Ngoài ra còn làm hoạt

7


chất chính để chữa bệnh như: thuốc điều trị liền vết thương, vết bỏng, vết mổ vô
trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể: hạ lipid và cholesterol máu, thuốc chữa đau dạ dày…
Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ (USEPA) đã cho phép chitosan không
những được dùng làm thành phần thức ăn, mà còn dùng cả trong việc tinh chế nước
uống. Còn ngay từ năm 1983 Bộ Thuốc và Thực phẩm Mỹ (USFDA) đã chấp nhận

chitosan được dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm và dược phẩm [15].
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NANO BẠC
1.2.1. Giới thiệu về công nghệ nano
1.2.1.1. Vật liệu nano
Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thước cỡ nano
mét (1nm = 10-9 m). Đây là đối tượng nghiên cứu của khoa học nano và cơng nghệ
nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Tính chất của vật liệu nano bắt nguồn
từ kích thước của chúng, vào cỡ nanơmét, đạt tới kích thước tới hạn của nhiều tính
chất hóa lý của vật liệu thơng thường. Kích thước của vật liệu nano trải một khoảng
từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật liệu và tính chất cần nghiên
cứu.
1.2.1.2. Phân loại vật liệu nano
Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano. Sau đây là một cách phân loại dựa
vào hình dáng vật liệu [6]:
- Vật liệu không chiều là vật liệu mà ba chiều đều có kích thước nano, ví dụ: chấm
lượng tử...
- Vật liệu một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví dụ: dây
nano,ống nano,…
- Vật liệu hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví dụ: màng
mỏng,…(Chiều ở đây có nghĩa là chiều chuyển động khơng bị hạn chế bởi kích
thước của phần tử tải điện).
Ngồi ra cịn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có
một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có các phần khơng
chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau.
8


1.2.1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ nano
Công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính [27]:
a. Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử:

Khác với vật liệu khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử được
thể hiện rất rõ ràng. Vì vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần tính tới các
thăng giáng ngẫu nhiên. Càng ở kích thước nhỏ thì các tính chất lượng tử càng thể
hiện một cách rõ ràng hơn. Ví dụ một chấm lượng tử có thể được coi như một đại
nguyên tử, nó có các mức năng lượng giống như một nguyên tử.
b. Hiệu ứng bề mặt:
Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano chúng có diện tích bề mặt
lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối. Điều này, có ý nghĩa rất quan trọng
trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả năng tiếp xúc bề mặt của
vật liệu, như trong các ứng dụng vật liệu nano làm chất diệt khuẩn. Đây là một tính
chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu có kích thước nanomet so với vật
liệu ở dạng khối [4].
c. Kích thước tới hạn:
Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ ngun các tính chất về vật
lý, hóa học khi ở dạng khối. Nếu kích thước vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì
tính chất của nó hồn tồn bị thay đổi. Nếu ta giảm kích thước của vật liệu đến kích
cỡ nhỏ hơn bước sóng của vùng ánh sáng thấy được (400-700 nm), theo Mie hiện
tượng "cộng hưởng plasmon bề mặt" xảy ra và ánh sáng quan sát được sẽ thay đổi
phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng xảy ra hiện tượng cộng hưởng. Hay như tính dẫn
điện của vật liệu khi tới kích thước tới hạn thì khơng tuân theo định luật Ohm nữa.
Mà lúc này điện trở của chúng sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử. Mỗi vật liệu đều
có những kích thước tới hạn khác nhau và bạn thân trong một vật liệu cũng có nhiều
kích thước tới hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng. Bởi vậy khi nghiên
cứu vật liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì. Chính nhờ
những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên cơng nghệ nano có ý
nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu.
9


1.2.2. Tính chất lý học của hạt nano bạc

1.2.2.1. Tính chất quang
a. Phổ hấp thụ của hạt nano bạc
Phổ hấp thụ của hạt nano bạc nằm trong khoảng từ 400 - 460 nm[29]. Phổ
hấp thụ của hạt nano bạc phụ thuộc vào kích thước của hạt nano bạc. Khi kích thước
hạt tăng thì cường độ đỉnh tăng và dịch về phía bước sóng dài. Kích thước hạt nano
bạc phụ thuộc vào các yếu tố trong quá trình chế tạo hạt nano bạc.
Với cùng một điều kiện, phương pháp chế tạo khác nhau thì đỉnh hấp thụ
của hạt nano bạc cũng khác nhau.
Với cùng một phương pháp, khi thay đổi điều kiện phản ứng như nồng độ
chất tham gia phản ứng, tỉ lệ chất bao phủ, thời gian phản ứng và nhiệt độ phản ứng
thì phổ hấp thụ cũng có sự thay đổi.
b. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt
Tính chất quang học của hạt nano bạc trong thủy tinh làm cho các sản phẩm
từ thủy tinh có các màu sắc khác nhau. Các hiện tượng đó bắt nguồn từ hiện tượng
cộng hưởng Plasmon bề mặt (surface plasmon resonance) là hiện tượng khi hạt ở
kích thước nano, các điện tử tự do trong hạt nano bạc tương tác với trường điện từ
ngồi dẫn đến sự hình thành các dao động đồng pha với một tần số cộng hưởng nhất
định. Các hạt nano bạc sẽ hấp thụ mạnh photon tới ở đúng tần số cộng hưởng này.

Hình 1.2: Hiện tượng cộng hưởng plasmon của hạt hình cầu
Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dưới tác
dụng của điện từ trường bên ngoài như ánh sáng. Thông thường các dao động bị
dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể
10


trong kim loại khi quãng đường tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thước.
Nhưng khi kích thước của hạt nano bạc nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình thì
hiện tượng dập tắt khơng cịn nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hưởng với ánh sáng
kích thích. Do vậy, tính chất quang của hạt nano bạc có được do sự dao động tập thể

của các điện tử dẫn đến từ quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao
động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano bạc làm cho hạt nano bạc bị
phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng
hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt
nano bạc và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất.
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM_transmission electron
microcope) để quan sát hình dạng và kích thước hạt nano bạc và sử dụng thiết bị đo
phổ hấp thụ UV-VIS để quan sát hiệu ứng cộng hưởng plasmon của hạt nano bạc.
Ngoài ra, mật độ hạt nano bạc cũng ảnh hưởng đến tính chất quang. Nếu mật
độ lỗng thì có thể coi như gần đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến
ảnh hưởng của q trình tương tác giữa các hạt.
1.2.2.2. Tính chất điện
Bạc là một kim loại dẫn điện tốt nhất trong các kim loại. Bạc có mật độ điện
tử tự do cao nên điện trở của bạc rất nhỏ.
Đối với vật liệu bạc ở dạng khối, các lý thuyết về độ dẫn được tính tốn dựa
trên cấu trúc vùng năng lượng của chất rắn. Điện trở của kim loại do tán xạ của điện
tử lên các sai hỏng trong mạng tinh thể và tán xạ với dao động nhiệt của nút mạng
(phonon). Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại (dịng điện I) dưới tác
dụng của điện trường (U) có liên hệ với nhau thông qua định luật Ohm: U = IR,
trong đó R là điện trở của kim loại. Định luật Ohm cho thấy đường I-U là một
đường tuyến tính.
Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm
rời rạc hóa cấu trúc vùng năng lượng. Hệ quả của quá trình lượng tử hóa này đối với
hạt nano bạc là I-U khơng cịn tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu
ứng chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I - U bị nhảy bậc với giá trị
11


mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C đối với U và e/RC đối với I. Trong đó e là
điện tích của điện tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện

cực.
1.2.2.3. Tính chất nhiệt
Nhiệt độ nóng chảy Tm của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các
nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các
nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị. Các nguyên tử trên bề mặt vật
liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn số phối vị của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có
thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể ở trạng thái khác hơn. Như vậy, khi kích thước của
hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm.
1.2.2.4. Hiệu ứng bề mặt
Khi hạt bạc có kích thước nanomet, các số nguyên tử nằm trên bề mặt sẽ
chiếm tỉ phần đáng kể so với tổng số nguyên tử. Chính vì vậy các hiệu ứng có liên
quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở nên quan trọng làm cho tính chất
của vật liệu có kích thước nm khác biệt so với vật liệu bạc ở dạng khối. Sự tăng
cường khả năng diệt khuẩn bạc là một ví dụ của hiệu ứng bề mặt.
Hiệu ứng bề mặt ln có tác dụng với tất cả các giá trị của kích thước, hạt
càng bé thì hiệu ứng càng lớn và ngược lại. Vật liệu ở bất cứ kích thước nào cũng
có hiệu ứng bề mặt, ngay cả vật liệu khối truyền thống cũng có hiệu ứng bề mặt, chỉ
có điều hiệu ứng này nhỏ thường bị bỏ qua [6].
Bảng 1.1: Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano bạc
Đường kính hạt nano (nm)
Số nguyên tử
Tỉ số nguyên tử bề mặt (%)
Năng lượng
(erg/mol)

bề

10

5

2

1

30.000

4.000

250

30

20

40

80

90

4,08×1011

8,16×1011

2,04×1012

9,23×1012

7.6

14,3

35,3

82,2

mặt

Năng lượng bề mặt/Năng
lượng tổng (%)

12


1.2.3. Tính kháng khuẩn của nano bạc
1.2.3.1. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
Nano bạc được nghiên cứu ứng dụng vào việc kháng khuẩn vì bạc là kháng
sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ. Nano bạc không gây phản ứng phụ, không
gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn
(khoảng nồng độ <100ppm) [38].
Tuy nhiên cho tới nay, cơ chế kháng vi sinh vật của nano bạc vẫn chưa được
hiểu biết rõ ràng. Có giả thiết cho rằng sự tương tác mạnh của ion Ag+ với
peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả
năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Sau đó sẽ đi
vào bên trong tế bào vi khuẩn tác động lên S và P, chìa khóa cho khả năng diệt
khuẩn của nó [31, 19]. Vì S và P xuất hiện nhiều trong màng tế bào nên khi hạt
nano bạc tương tác với S chứa trong protein bên trong hoặc bên ngoài màng tế bào
thì có thể biến đổi chức năng của tế bào. Đồng thời các hạt bạc có kích thước nhỏ
chui vào trong tế bào, kết hợp với các enzym hay DNA có chứa nhóm sunfuahydrin

– SH hặc phốt phát gây bất hoạt enzym hay DNA dẫn đến gấy chết tế bào [34].

Hình 1.3: Ion bạc vơ hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn
Trước sự gia tăng của dịng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh điển hình là
Staphylococcus aureus hay các loại vi nấm gây bệnh thực vật thiếu thuốc đặc trị thì
việc lựa chọn các chế phẩm chứa nano bạc đang rất được quan tâm.
Thông thường nồng độ bạc sử dụng cho việc kháng khuẩn và sát trùng rất
thấp, ví dụ như khoảng 5ppm cho việc diệt vi khuẩn Esherichia Coli hiệu quả đến
999% và khuẩn Staphylococcus aureus là hơn 99%.
13


1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của nano bạc
Kích thước, hình dạng hạt, nồng độ và sự phân bố là các yếu tố ảnh hưởng
trực tiếp đến tính kháng khuẩn của keo nano bạc.
a. Kích thước hạt nano bạc
Yếu tố quan trọng quyết định khả năng diệt khuẩn của chúng. Hạt nano bạc
có kích thước càng nhỏ thì khả năng diệt khuẩn của chúng càng mạnh, vì khi ở kích
thước càng nhỏ thì tỉ số giữa diện tích bề mặt và thể tích càng lớn và hạt cũng có thể
dễ dàng tương tác với vi khuẩn hơn. Tuy nhiên các hạt có kích thước nhỏ lại có
khuynh hướng liên kết với nhau trong q trình lưu trữ tạo thành các hạt lớn hơn
gây ảnh hưởng tới khả năng diệt khuẩn và bảo quản keo nano bạc. Do đó trong q
trình chế tạo chúng ta phải tìm ra các phương pháp vừa tạo ra hạt nano bạc có kích
thước nhỏ vừa bền vững.
b. Hình dạng
Các hạt nano có thể có rất nhiều hình dạng khác nhau như hình que, hình
cầu, hình tam giác,… Và sự thể hiện của các hạt nano bạc với cùng nồng độ, sự
phân bố nhưng với các hình dạng khác nhau là khơng giống nhau. Các hạt nano bạc
có hình tam giác cụt tính kháng khuẩn cao hơn các hạt hình cầu và các hạt nano
que có tính kháng khuẩn thấp nhất.

c. Nồng độ
Keo nano bạc có nồng độ càng cao và sự phân bố đều thì khả năng diệt
khuẩn càng tốt. Tuy nhiên khi nồng độ quá cao, do năng lượng bề mặt hạt nano lớn,
nên các hạt nano bạc sẽ va chạm vào nhau và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy chúng ta
cũng cần tìm nồng độ thích hợp để các hạt phân bố đồng đều, và tránh kết tủa.
1.2.4. Ứng dụng của nano bạc trong cuộc sống
Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm
chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩm chứa hạt nano
bạc như:
Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng bằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc
có tác dụng khử trùng. Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi
14


khuẩn. Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và
khử mùi. Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3 - 4 lớp gồm 2 lớp vải, một
lớp vật liệu tẩm nano bạc và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả
năng diệt khuẩn, diệt virus, lọc khơng khí rất tốt. Lớp vải tẩm nano bạc có chức
năng diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng
khử mùi. Màng hơ hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước
qua nhưng khơng thể cho chất lỏng đi qua, có vơ số những lỗ khí nhỏ tồn tại
trong tấm film. Các hạt nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin
với đặc tính kháng khuẩn rất tốt. Sơn kháng khuẩn: Bột nano bạc được trộn với
sơn và phủ lên các phím điện thoại di động, tường nhà và các bề mặt cần được
bảo vệ. Với khả năng kháng khuẩn tuyệt vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không
bị nhiễm khuẩn cũng như tiêu diệt nấm mốc làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ
cơng trình. Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu ứng dụng
nano bạc để sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu cầu ngày càng cao của người
tiêu dùng. Các thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ nano sẽ có kích thước nhỏ
gọn hơn nhưng lại có tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn các thiết bị sử dụng các

công nghệ truyền thống.
1.3. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN
1.3.1. Khái niệm chung về vi khuẩn
Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào, có cấu trúc tế bào đơn giản khơng có
nhân (Prokaryote – sinh vật nhân sơ). Vi khuẩn hiện diện ở khắp mọi nơi trong đất,
nước, khơng khí, kể cả những nơi có điều kiện sống khắc nghiệt như trên miệng núi
lửa hay trên băng tuyết.v.v. Có rất nhiều chủng vi khuẩn, và mỗi chủng vi khuẩn
đều có sự khác nhau về đặc tính và hình thái.
Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau và được gọi với tên gọi theo hình
dạng của chúng như trực khuẩn (bacillus), hình cầu, xoắn khuẩn (spirillum), hình
que, cầu khuẩn (coccus)… hình dáng vi khuẩn là một đặc điểm quan trọng để nhận
dạng các chi được đặt tên theo hình dạng.

15


Vi khuẩn có ích hoặc có hại cho mơi trường, thực vật và động vật bao gồm
cả con người. Một só tác nhân gây bệnh như bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn
(typhoid fover), giang mai (syphilis), tả (cholera), lao (tuberculosis)…
1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
1.3.2.1. Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Chi: Staphylococcus
Lồi: S. aureus

Hình 1.4: Vi khuẩn Staphylococcus aureus

1.3.2.2. Đặc điểm hình thái
S.aureus hay tụ cầu vàng là vi khuẩn hình cầu, có đường kính từ 0.8 – 1.0
µm, tế bào thường tập trung thành từng chùm như những chùm nho, bắt màu Gram
dương [3], không tạo bào tử, yếm khí khơng bắt buộc, khơng di động. Sinh
coagulaza làm đông huyết tương. Tồn tại ở pH từ 4-9, nhưng phát triển mạnh ở pH
từ 6-7.

16