Chế tạo và khảo sát hoạt tính kháng nấm của hạt đồng nano được ổn định bằng Chitosan

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

<b>ĐẠI HỌC SÀI GÒN </b> <b>OF SAIGON UNIVERSITY </b>

Số 71 (05/2020) No. 71 (05/2020)

<i>Email: ; Website: />

<b>CHẾ TẠO VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA </b>

<b>HẠT ĐỒNG NANO ĐƯỢC ỔN ĐỊNH BẰNG CHITOSAN </b>

<i><b>Copper nanoparticles stabilized by Chitosan: preparation and antifungal activity </b></i>

ThS. Phạm Thị Giang Anh

(1)

_{, TS. Đặng Xuân Dự}

(2)



(1),(2)_{Trường Đại học Sài Gịn}

<b>TĨM TẮT </b>

Trong nghiên cứu này, kim loại đồng có kích thước nanomet đã được tổng hợp bằng phương pháp hoá
học sử dụng chitosan làm chất ổn định và NaBH4 làm chất khử. Sự hình thành hạt đồng nano được xác
định bằng màu sắc đặc trưng và phổ UV-vis. Hình thái và kích thước hạt được xác định bằng phương
pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Kết quả cho thấy khi với sự hiện diện của chitosan, các hạt
đồng nano đã được chế tạo thành cơng với kích thước hạt khoảng 3,7 nm. Vật liệu thu được thể hiện
hoạt tính kháng nấm tốt. Nấm mốc Aspergillus niger bị ức chế gần như hoàn toàn ở nồng độ đồng nano
50 ppm.

<i><b>Từ khóa: chất ổn định, chitosan, đồng nano, hoạt tính kháng nấm </b></i>
<b>ABSTRACT </b>

In this present paper, copper nanoparticles were prepared by a chemical method using chitosan as a
stabilizer and NaBH4 as a reducing agent. The formation of copper nanoparticles was confirmed by the
characteristic of colour and UV-vis spectra. The morphology and particle size of the material were
determined by transmission electron microscopy (TEM). The results showed that copper nanoparticles
with a particle size of 3,7 nm were successfully prepared in the presence of chitosan. The as-prepared

materials exhibited a good antifungal activity. The Aspergillus niger fungus was almost entirely
inhibited by the copper nanoparticles at the concentration of 50 ppm.

<i><b>Keywords: stabilizer, chitosan, copper nanoparticles, antifungal activity </b></i>

<b>1. Mở đầu </b>

Chế tạo và nghiên cứu hoạt tính của

các hạt nano kim loại với kích thước và

hình dạng khác nhau nhằm khám phá các

tính chất cũng như khả năng ứng dụng của

chúng trong các lĩnh vực khác nhau như y

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GỊN

vì bề mặt dễ bị oxi hóa, sản phẩm dễ lẫn

CuO và Cu2O. Để khắc phục hạn chế này,

các chất chống oxy hoá thường được sử

dụng cho quá trình chế tạo. Một số loại

polymer cũng thường được sử dụng nhằm

ổn định hệ hạt, tránh sự keo tụ và bảo vệ

hạt khỏi bị oxy hố. Những nghiên cứu đó

đều hướng đến mục tiêu chung là tạo ra các

hạt đồng nano có kích thước nhỏ với độ ổn

định cao để khai thác tối đa các ứng dụng

của chúng.

Chitosan là một polymer tự nhiên

được chế tạo bằng q trình đề axetyl hóa

chitin sử dụng kiềm đặc. Chitosan có ưu

điểm nổi bật là phân hủy sinh học, khơng

độc, có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm,

chống oxi hóa.v.v. [3]. Những nghiên cứu

gần đây cho thấy, chitosan có khả năng ổn

định tốt các hạt nano và hạn chế quá trình

oxy hóa [3]. Ngồi ra, loại polymer này tồn

tại khá phong phú trong tự nhiên, dễ tách

chiết ở điều kiện bình thường, vì vậy rất có

triển vọng áp dụng ở quy mô lớn.

Trong nghiên cứu này, đồng nano

được chế tạo bằng cách khử ion Cu

2+

_với

NaBH

4

chất khử, chitosan làm chất ổn

định, cơ chế ổn định các hạt đồng nano

bằng chitosan cũng được thảo luận. Ngoài

ra, sản phẩm tạo thành cũng được kiểm tra

hoạt tính chống nấm ở các nồng độ khác

nhau đối với chủng

<i>Aspergillus niger</i>

.

<b>2. Thực nghiệm </b>

<i><b>2.1. Nguyên liệu và hóa chất </b></i>

Chitosan với khối lượng phân tử 90

kDa được cung cấp bởi công ty Cổ phần

Đầu tư và Công nghệ Hương Nam, Bà Rịa

- Vũng Tàu. NaBH

4

là sản phẩm tinh khiết

của Merck (Đức), CuSO

4

.5H

2

O dạng tinh

khiết của Beijing (Trung Quốc). Các hóa

chất khác như acid acetic, acid ascorbic…

được sử dụng ở dạng tinh khiết phân tích.

Nước cất hai lần được sử dụng cho tồn bộ

thí nghiệm.

<i><b>2.2. Phương pháp thực nghiệm </b></i>

<i>2.2.1. Chế tạo đồng nano ổn định bằng </i>

<i>chitosan </i>

Sơ đồ quy trình chế tạo đồng nano theo

tài liệu [3], chỉ thay đổi khối lượng phân tử

chitosan và nồng độ, được thể hiện trên

Hình 1. Hịa tan 0,25 gam CuSO

4

.5H

2

O

bằng nước cất thu được 40 mL dung dịch

CuSO

4

nồng độ 0,025M, thêm 100 mL acid

acetic 0,1M chứa 1% chitosan theo khối

lượng, khuấy hỗn hợp trên trong vòng 20

phút bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Cho 0,5

mL acid ascorbic 0,5M vào hỗn hợp phản

ứng, tiếp tục khuấy từ trong 20 phút. Nhỏ

0,5 mL NaBH

4

0,4M vào hỗn hợp, tiếp tục

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

<i><b>Hình 1. Sơ đồ quy trình chế tạo đồng nano </b></i>

<i>2.2.2. Đặc trưng đồng nano </i>

Đồng nano sau khi chế tạo được đặc

trưng bằng phương pháp phổ UV-vis trên

thiết bị UV - DR 5000; phương pháp nhiễu

xạ tia X, sử dụng thiết bị đo XRD với bức

xạ CuKα (λ = 0,15406 nm), thế tăng tốc

40kV, 40mA, góc 2θ = 20° – 90°, tốc độ

quét 0,03°/s. Hình thái và kích thước hạt

được xác định bằng kính hiển vi điện tử

truyền qua (TEM) trên thiết bị JEM-1400.

<i>2.2.3. Khảo sát hoạt tính kháng nấm mốc </i>

Dung dịch keo đồng nano sau khi chế

tạo, được khảo sát hoạt tính kháng nấm

mốc

<i>Aspergillus Niger </i>

theo các bước sau:

<i>a) Pha môi trường </i>

<i>Môi trường Crapek (môi trường đối </i>

<i>chứng): </i>

Thành phần gồm Sucrose 15g, NaNO

3

1,5g, K

HPO

0,5g, KCl 0,25g, FeSO

.7H

O

K

2

HPO

4

, KCl, FeSO

4

.7H

2

O, MgSO

4

.7H

2

O

và sucrose vào cốc rồi khuấy từ cho tới khi

tan hết. Tiếp đến, chuyển dung dịch vào

bình định mức rồi thêm nước để thu được

500 mL dung dịch. Đổ dung dịch ra lại cốc

thủy tinh rồi điều chỉnh pH = 6 bằng NaOH

1M hoặc HCl 1M, thêm agar và tiếp tục

khuấy từ trong khoảng 10 phút. Cuối cùng,

đổ môi trường vào 2 bình erlen dung tích

250 ml, đậy kín bằng bơng và bọc bên

ngồi bằng giấy để hấp vô trùng.

<i>Môi trường mẫu </i>

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GỊN

sau khi hấp vô trùng được sấy ở nhiệt độ

120ºC.

<i>c) Đổ môi trường </i>

Pha từ từ dung dịch mơi trường mẫu

có chứa đồng nano và môi trường đối

chứng vào các đĩa petri đã hấp vô trùng.

Giai đoạn này được tiến hành trong tủ cấy.

<i>d) Nuôi cấy </i>

Cấy nấm mốc

<i>Aspergillus Niger </i>

vào

môi trường mẫu và môi trường đối chứng.

Sau 5 ngày nuôi cấy, quan sát kết quả phát

triển nấm mốc trên môi trường mẫu và môi

trường đối chứng để đánh giá hiệu quả

kháng nấm của dung dịch keo đồng nano.

<b>3. Kết quả và thảo luận </b>

<i><b>3.1. Sự hình thành keo đồng nano </b></i>

<i><b>Hình 2. Phổ UV-vis của dung dịch trước và sau phản ứng </b></i>

Sự thay đổi màu sắc của dung dịch

phản ứng được thể hiện trên Hình 2. Trước

phản ứng, dung dịch có màu xanh dương,

là màu đặc trưng của ion Cu

2+

_{. Khi thêm}

NaBH

4

vào hệ phản ứng và khuấy đều,

dung dịch dần chuyển sang màu nâu đen, là

màu đặc trưng của dung dịch đồng nano

[3]. Phản ứng khử ion đồng Cu

2+

bằng

NaBH

4

diễn ra như sau [5]:

CuSO

4

+ 2 NaBH

4

+ 6 H

2

O → Cu +

2H

3

BO

3

+ 7H

2

+ Na

2

SO

4

Usman và cộng sự đã chế tạo đồng

nano sử dụng chitosan làm chất ổn định

[6]. Kết quả dung dịch keo đồng nano thu

được cũng cho màu nâu đen đặc trưng,

tương tự như trong nghiên cứu của chúng

tôi.

Theo các nghiên cứu trước đây, đỉnh

hấp thụ gây ra do hiện tượng plasmom của

dung dịch keo đồng nano được ghi nhận

trên phổ UV-vis trong khoảng bước sóng

từ 500 – 600 nm [1], [7]. Hình 2 cho thấy

trước phản ứng, khi vừa thêm NaBH

4

vào

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

<i><b>Hình 3. Giản đồ XRD của chitosan và đồng nano ổn định bằng chitosan </b></i>

Giản đồ XRD của chitosan và vật liệu

đồng nano ổn định bằng chitosan được thể

hiện lần lượt ở Hình 3a và Hình 3b. Hình

3a cho thấy các đỉnh nhiễu xạ ở 2θ = 9,26°

và 2θ = 19,82°, đây là hai đỉnh nhiễu xạ

đặc trưng của chitosan [3], [8]. Đối với

giản đồ nhiễu xạ của vật liệu đồng nano,

ngoài 2 đỉnh nhiễu xạ của chitosan còn

quan sát được 3 đỉnh có cường độ nhiễu

xạ tương đối cao hoàn toàn trùng hợp với

đỉnh nhiễu xạ chuẩn của kim loại đồng tại

các góc 2θ = 43,35°; 2θ = 50,60° và 2θ =

74,17° tương ứng với các mặt (111), (200)

và (220) thuộc ô mạng Bravais trong cấu

trúc lập phương tâm diện của kim loại

đồng [3], [7].

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

PHẠM THỊ GIANG ANH - ĐẶNG XUÂN DỰ TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GỊN

Hình 4 mơ tả hình thái và kích thước

của những hạt đồng nano. Hình ảnh cho

thấy hạt có dạng hình cầu, phân bố khá

đồng đều, kính thước hạt từ 2 đến 10 nm,

đường kính trung bình vào khoảng 3,7 nm.

Như vậy, sự có mặt của chitosan đóng vai

trò là chất ổn định đã hạn chế được sự phát

triển mầm, do đó kích thước hạt thu được

tương đối nhỏ. Ngoài ra sự có mặt của

chitosan cịn được cho là tác nhân giảm

thiểu sự oxy hoá bề mặt, ngăn cản sự keo

tụ, làm bền cho hệ keo đồng nano [8].

Cơ chế ổn định keo đồng nano của

chitosan đã được một số tác giả đề cập [1],

[6], [8]. Theo đó, khi thêm Cu

2+

_{vào dung}

dịch chitosan, ion Cu

2+

được gắn vào đại

phân tử chitosan bằng tương tác tĩnh điện.

Nguyên tử oxy giàu electron của nhóm

hydroxyl phân cực và của nhóm ether trong

phân tử chitosan tương tác với điện tích

dương của cation kim loại [9]. Nhờ đó,

chitosan đóng vai trị vừa như một chất

điều khiển sự tạo thành hạt nhân keo vừa

như là một chất ổn định [10]. Ngồi ra, nhờ

có nhóm amine và nhóm hydroxyl có ái lực

mạnh với ion kim loại, chitosan được gắn

với kim loại thông qua sự tạo phức bằng

cách chuyển electron. Theo cách đó, chúng

thúc đẩy sự tạo thành hạt nhân keo đồng.

Sự hình thành phức giữa chitosan và Cu

2+

làm cho khả năng khử ion đồng cũng diễn

ra thuận lợi hơn [8].

<i><b>3.3. Khả năng kháng nấm của đồng </b></i>

<i><b>nano ổn định bằng chitosan </b></i>

<i><b>Hình 5. Sự phát triển của nấm mốc Aspergillus niger sau 5 ngày cấy trên đĩa petri</b></i>

Hình 5 là kết quả thử nghiệm hoạt tính

diệt nấm mốc

<i>Aspergillus niger </i>

với các

mẫu của đồng nano được ổn định bằng

chitosan có nồng độ khác nhau. Sau 5 ngày

nuôi cấy mẫu, kết quả cho thấy đối với mẫu

đối chứng - khơng có đồng nano, nấm phát

triển rất mạnh. Đối với các mẫu có chứa

đồng nano khả năng phát triển của nấm

mốc bị ức chế đáng kể sau 5 ngày nuôi cấy.

Ở mẫu chứa đồng nano nồng độ 25 ppm

nấm mốc phát triển tương đối yếu sau 5

ngày nuôi cấy so với mẫu đối chứng. Trong

khi đó, các mẫu có đồng nano ở nồng độ 50

ppm và 100 ppm gần như không quan sát

được sự phát triển của nấm mốc. Từ kết quả

thí nghiệm có thể nhận thấy khả năng phát

triển của nấm mốc

<i>Aspergillus niger</i>

đã bị

ức chế gần như hoàn toàn ở nồng độ đồng

nano là 50 ppm. Pariona và cộng sự (2019)

đã tổng hợp đồng nano và khảo sát khả

năng ức chế một số loại nấm như

<i>Fusarium </i>

<i>solani</i>

,

<i>Neofusicoccum sp</i>

và

<i>Fusarium </i>

<i>oxysporum</i>

[11]. Kết quả cho thấy nồng độ

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

hơn so với trong nghiên cứu của chúng tơi.

Ngồi ra, sự khác biệt về các chủng nấm

trong nghiên cứu của chúng tôi (

<i>Aspergillus </i>

<i>niger</i>

) cũng có thể là nguyên nhân làm

cho nồng độ ức chế nấm tối thiểu tương

đối nhỏ.

Nhìn chung khả năng kháng nấm và

kháng khuẩn của đồng nano phụ thuộc vào

nhiều yếu tố cho đến thời điểm này vẫn

còn là một chủ đề mở cần tiếp tục bàn luận,

đặc biệt khi chúng được ổn định bởi

chitosan là một tác nhân cũng có hiệu ứng

kháng khuẩn. Theo một số nghiên cứu gần

đây, đối với vật liệu đồng được ổng định

bằng chitosan, tốc độ khuếch tán của đồng

nano được phóng thích (release) khỏi môi

trường chitosan là yếu tố quyết định đến

khả năng kháng khuẩn. Và vì vậy, cần chú

ý là khơng phải kích thước hạt nhỏ của vật

liệu sẽ cho hiệu quả kháng vi sinh vật tốt,

vì trong trường hợp đó, khả năng hạt được

bọc bởi một lớp polymer tương đối dày,

dẫn đến tốc độ phóng thích chậm và hiệu

quả kháng vi sinh vật trong trường hợp này

thường không cao. Usman và cộng sự

(2013) đã xem xét khả năng kháng khuẩn

của đồng nano được ổn định bằng chitosan

với các nồng độ khác nhau. Kết quả cho

thấy ở nồng độ chitosan 0,2% cho hiệu quả

kháng vi sinh vật tốt nhất mặc dù kích

thước hạt trung bình tương đối lớn hơn so

với khi đồng nano được ổn định bởi dung

dịch chitosan 0,5% [3]. Nhìn chung, hạt

nano khi được ổn định bởi các loại

polymer sinh học sẽ có thuận lợi trong việc

kéo dài thời gian phóng thích, cải tiến được

tính chất kháng vi sinh vật của chúng. Tuy

vậy, nồng độ chất ổn định tối ưu cho hoạt

động của các hạt nano vẫn là vấn đề cần

được nghiên cứu.

<b>4. Kết luận </b>

Đồng nano đã được chế tạo khá đơn

giản bằng phương pháp khử hoá học sử

dụng chitosan làm chất ổn định. Sự hình

thành pha đồng nano đã được xác định dựa

vào màu sắc đặc trưng và tín hiệu plasmom

trên phổ UV-vis. Kết quả cho thấy các hạt

đồng nano thu được có dạng hình cầu, kích

thước hạt khoảng 3,7 nm. Dung dịch keo

đồng nano thu được có khả năng ức chế tốt

sự phát triển của nấm mốc. Ở nồng độ lớn

hơn 50 ppm, đồng nano đã ức chế gần như

hoàn toàn sự phát triển của nấm mốc sau 5

ngày nuôi cấy. Với phương pháp chế tạo

đơn giản, sản phẩm có hoạt tính kháng nấm

cao, đồng nano rất có triển vọng để chế tạo

với quy mô lớn làm các chế phẩm kháng

nấm ứng dụng trong nông nghiệp.

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO </b>

[1]

Tokarek. K, Hueso. J. L, Kuśtrowski. P, Stochel. G, Kyzioł. A, “Green Synthesis of

Chitosan-Stabilized Copper Nanoparticles”,

<i>European Journal of Inorganic </i>

<i>Chemistry</i>

, 2013 (28), 4940-4947, 2013.

</div>

<!--links-->