Nghiên cứu xây dựng phương pháp sách định dư lượng clenbuterol trong thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

NGUYỄN THỊ CHÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CLENBUTEROL
TRONG THỊT HEO BẰNG KỸ THUẬT
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2010

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 2

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. TRẦN BÍCH LAM

Cán bộ chấm nhận xét 1:

TS. PHẠM THỊ HUỲNH MAI

Cán bộ chấm nhận xét 2:

PGS.TS. NGÔ MẠNH THẮNG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 24 tháng 08 năm 2010

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 3
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCMCỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------------oOo--Tp. HCM, ngày . . . . . tháng . . . . . năm . . . .
..

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: . NGUYỄN THỊ CHÂN. . . . . . . . . . . . Giới tính : Nam
/ Nữ
Ngày, tháng, năm sinh : . . . . . 22 - 12 - 1977. . . . . . . . . . . . . . . .

Nơi sinh : . .Hà Tĩnh

Chuyên ngành : . .Công nghệ thực phẩm và đồ uống. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Khoá (Năm trúng tuyển) : .2008 . . . . . . . . . .
1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư

lượng Clenbuterol trong thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối
phổ”
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

2.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng Clenbuterol
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ.
2.2. Thẩm định phương pháp phân tích để đánh giá giá trị sử dụng của
phương pháp trong thực tế.
...............................................................
................................................................
................................................................
...............................
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : . . .. . . . . . . 25 – 01 - 2010. . . . . . . . . . .
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : . 02 – 08 - 2010 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị ): . . . . . .
. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .Tiến sĩ Trần Bích Lam . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

Nguyễn Thị Chân


Trang 4

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành gởi lời cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ thực phẩm và đồ uống
– Khoa Kỹ thuật hóa học – Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TPHCM đã
nhiệt tình truyền đạt kiến thức trong suốt q trình học tập.
Đồng thời, tơi cũng gởi lời cảm ơn Ban Giám đốc và các anh chị, các bạn trong phịng
Phân tích Sắc ký thuộc Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm đã giúp đỡ, hỗ trợ tơi
trong thời gian công tác và thực hiện luận văn.
Sau cùng, xin cám ơn gia đình đã động viên, tạo điều kiện giúp tôi học tập và thực hiện
đề tài tốt nghiệp.

Nguyễn Thị Chân

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 5

TÓM TẮT NỘI DUNG
Clenbuterol (4-amino-(-)[t-butylaminomethyl]-3,5-dichlorobenzyl alcohol) là

hợp chất thuộc nhóm -agonist, có tác dụng trong điều trị bệnh về đường hơ hấp
cho gia súc; ngịai ra, clenbuterol cịn có tác dụng kích thích tăng trưởng, gia tăng
q trình chuyển hóa làm tăng thịt nạc và giảm hàm lượng mỡ nên thường bị lạm
dụng trong chăn nuôi gia súc.
Trên thế giới, Clenbuterol được kiểm sóat chặt chẽ trong việc sử dụng và tồn dư
trong các lọai thực phẩm, đặc biệt là thịt gia súc. Theo chỉ thị 96/23/EC của châu
Âu, Clenbuterol được xếp vào nhóm A mục I – các chất có tác dụng chuyển hóa,
bị cấm sử dụng trong chăn nuôi và cần phải kiểm tra dư lượng bằng phương pháp
sắc ký đầu dị khối phổ.
Mục đích của đề tài là nghiên cứu xây dựng phương pháp thích hợp nhằm phân
tích được dư lượng Clenbuterol trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép
khối phổ có cực tiểu phát hiện đáp ứng được giới hạn cho phép hiện nay là 0.1 0.5 g/kg.
Clenbuterol được trích ly và tinh sạch bằng cột kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), phát
hiện và định lượng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực trên nguồn
ion hóa điện tử (ESI) ở chế độ MRM với ion định lượng m/z = 203 và ion xác
nhận m/z = 259. Phương pháp được thẩm định theo quyết định 2002/657/EC của
liên minh châu Âu (EU) với hiệu suất thu hồi đạt 71.6% đến 106.1% (trong
khoảng nồng độ 0.1 – 5ppb), độ lặp lại (RSDr) trong khoảng 8.07 – 12.45%, độ tái
lập (RSDR) trong khỏang 8.74 – 12.79%, giới hạn phát hiện đạt được 0.03g/kg
và giới hạn định lượng 0.09g/kg.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 6

ABSTRACT
Clenbuterol (4-amino-(-)[t-butylaminomethyl]-3,5-dichlorobenzyl alcohol) is a

compound of group -agonists, are effective in treating espiratory disease for
cattle, in addition, clenbuterol also stimulates growth and increases metabolism to
enhance muscle mass and reduce lipid so often misused in cattle feeding.
In almost country, clenbuterol is controlled by official inspection in using to feed
and resiues in meat. In 96/23/EC Directive, clenbuterol was in group A Annex I –
substances have anabolic effect, are prohibited in raising and have to determine
residues by chromatography coupled mass spectrometry method.
The aim of this study is to develop a suitable method to determine clenbuterol
residue in pork meat by liquid chromatography mass spectrometry obtaining limit
of dectection lower maximum residue limit (MRL) 0.1-0.5 g/kg.
Clenbuterol was extracted and cleaned-up by solid extraction phase (SPE),
identified and quantified by liquid chromatography coupled to electrospray
ionization tadem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) operating in positive ion
multiple reaction monitoring (MRM) mode. The method was validated acording to
European Union Commision directive 2002/657/EC, recoveries of method were
range of 71.6% to 106.1% (at 0.1 – 5ppb) with repeatability (RSDr value) between
8.07% and 12.45%, reproducibility (RSDR value) between 8.74 and 12.79%. Limit
of detection (LOD) and limit of quantitation obtained 0.03g/kg and 0.09g/kg,
respectively.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 7

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn

Tóm tắt luận văn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Chương 1: Mở đầu ............................................................................................ 1
1.1. Mở đầu........................................................................................................ 2
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài................................................... 3
Chương 2: Tổng quan ....................................................................................... 5
2.1. Giới thiệu về hợp chất clenbuterol ............................................................ 6
2.2.1. Một số tính chất cơ bản của clenbuterol..................................................... 6
2.2.2. Chuyển hóa sinh học của clenbuterol......................................................... 6
2.2.3. Tác động của clenbuterol trên cơ thể người và động vật ............................ 7
2.1.4. Tình hình sử dụng và ảnh hưởng của dư lượng clenbuterol đến người
tiêu dùng ........................................................................................................... 11
2.2.5. Quy định về giới hạn cho phép của clenbuterol trong thực phẩm ............. 13
2.2.6. Một số phương pháp định lượng clenbuterol đã được công bố................. 14
2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................. 19
2.2.1. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo .................................................................. 20
2.2.2. Pha động trong sắc ký pha đảo ................................................................ 23

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 8

2.2.3. Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký ....................................... 25

2.2.4. Hệ thống sắc ký lỏng ............................................................................... 28
2.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ..................................... 28
2.3.1. Nguyên lý chung ..................................................................................... 28
2.3.2. Các loại máy khối phổ ............................................................................. 30
2.3.3. Đầu dò khối phổ ba tứ cực....................................................................... 31
2.3.4. Phương pháp trích ly, làm giàu mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn ............. 36
Chương 3: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu .................................. 42
3.1. Nguyên liệu và hóa chất .......................................................................... 43
3.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 43
3.1.2. Hóa chất, dụng cụ.................................................................................... 43
3.1.3. Thiết bị phân tích và các thiết bị phụ trợ.................................................. 44
3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 45
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn............................................................................ 45
3.2.2. Khảo sát các điều kiện thiết bị phân tích.................................................. 47
3.2.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .................................................................. 47
3.3. Thẩm định phương pháp ........................................................................ 51
Chương 4: Kết quả và bàn luận .................................................................... 52
4.1. Khảo sát các thơng số đầu dị khối phổ .................................................. 53
4.1.1. Xác định ion mẹ ...................................................................................... 53
4.1.2. Khảo sát điện thế fragmentor................................................................... 54
4.1.3. Khảo sát năng lượng bắn phá .................................................................. 55
4.1.4. Khảo sát độ dao động của các mảnh ion .................................................. 58
4.2. Khảo sát các thông số cho hệ thống sắc ký lỏng...................................... 59
4.3. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ........................................................... 62
Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 9

4.3.1. Khảo sát dung dịch dùng để trích ly......................................................... 62
4.3.2. Khảo sát nồng độ dung dịch trích ly KH2PO4 .......................................... 64
4.3.3. Khảo sát cột chiết pha rắn (SPE) ............................................................. 65
4.4. Thẩm định phương pháp ........................................................................ 67
4.4.1. Khảo sát độ tuyến tính ............................................................................. 67
4.4.2. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp ................................................. 70
4.4.3. Khảo sát hiệu suất thu hồi ....................................................................... 70
4.4.4. Khảo sát độ lặp lại ................................................................................... 72
4.4.5. Khảo sát độ tái lập .................................................................................. 73
..............................................................................................................................
4.4.6. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................ 75
4.5. Ước lượng độ không đảm bảo đo............................................................. 76
4.6. Nghiên cứu hiện tượng khử ion ............................................................... 77
4.7. Kết quả so sánh với các phương pháp khác ............................................ 79
Chương 5: Kết luận ........................................................................................ 81
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 10

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT
TẮT
ACN

Acetonitril

APCI

Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển

APPI

Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển

ESI

Ion hóa tia điện

EU

Cộng đồng châu Âu, liên minh châu Âu

GC/MS

Sắc ký khí ghép khối phổ

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC/MS

Sắc ký lỏng ghép khối phổ

LC/MS/MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần
LC/MSn

Sắc ký lỏng ghép khối phổ n lần

LOD

Giới hạn phát hiện của phương pháp

LOQ

Giới hạn định lượng của phương pháp

MeOH

Methanol

Mp

Pha động

MRL

Giới hạn dư lượng tối đa cho phép

MRPL

Giới hạn yêu cầu tối thiểu mà phương pháp phân tích phải đạt được

MS

Khối phổ

ppb

Một phần tỷ

ppm

Một phần triệu

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

Scan

Quét phổ, ghi phổ

SKPB

Sắc ký phân bố

SKPĐ

Sắc ký pha đảo

SKPT

Sắc ký pha thường

SPE

Chiết pha rắn

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 11

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Một số kết quả phân tích clenbuterol tại TTDVPTTN ........................ 13
Bảng 2.2. Giới hạn dư lượng clenbuterol tối đa cho phép .................................... 14
Bảng 2.3. Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng ................................ 24
Bảng 2.4. Các pha hấp thụ thông thường được sử dụng trong kỹ thuật SPE......... 38
Bảng 2.5. Các pha hấp thụ polymer được sử dụng trong kỹ thuật SPE .................... 39
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát điện thế fragmentor .................................................. 54
Bảng 4.2. Quy định số điểm nhận danh theo từng kỹ thuật khối phổ ................... 56
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát năng lượng bắn phá (Collision Energy) .................... 57
Bảng 4.4. Điều kiện vận hành trên đầu dò khối phổ............................................. 58
Bảng 4.5. Quy định về khoảng dao động tỷ lệ các ion ......................................... 58
Bảng 4.6. Khoảng dao động tỷ lệ ion đối với clenbuterol .................................... 59
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát nồng độ formic trong pha động................................. 61
Bảng 4.8. Kết quả khảo sát dung dịch trích ly ..................................................... 62
Bảng 4.9. Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch KH2PO4 .................................... 64
Bảng 4.10. Kết quả khảo sát cột SPE................................................................... 66
Bảng 4.11. Khảo sát độ tuyến tính của clenbuterol .............................................. 68

Bảng 4.12. Số liệu khảo sát hiệu suất thu hồi và độ lặp lại................................... 71
Bảng 4.13. Tiêu chuẩn về hiệu suất thu hồi, độ lặp lại và độ tái lập ..................... 72
Bảng 4.14. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi ..................................................... 72
Bảng 4.15. Kết quả khảo sát độ lặp lại................................................................. 73
Bảng 4.16. Số liệu khảo sát độ tái lập ................................................................. 74
Bảng 4.17. Kết quả khảo sát độ tái lập ................................................................ 74
Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 12
Bảng 4.18. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .................. 76

Bảng 4.19. Số liệu ước lượng độ không đảm bảo đo............................................ 77
Bảng 4.20. So sánh kết quả phân tích Clenbuterol ............................................... 79

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 13

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 2.1. Cơng thức cấu tạo clenbuterol.............................................................. 6
..............................................................................................................................
Hình 2.2. Sơ đồ chuyển hóa sinh học của clenbuterol.......................................... 7
Hình 2.3. Bề mặt silica đã thủy phân ................................................................. 21

Hình 2.4. Tạo nhánh trên bề mặt silica ............................................................. 21
Hình 2.5. Cấu trúc của cột ODS ....................................................................... 22
Hình 2.6. Cấu trúc cột LC-DB .......................................................................... 22
Hình 2.7. Cấu trúc cột có gốc isopropyl ............................................................ 23
Hình 2.8. Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC .................... 25
Hình 2.9. Thời gian lưu của cấu tử phân tích .................................................... 26
Hình 2.10. Mơ hình hệ thống HPLC................................................................. 28
Hình 2.11. Cấu tạo đầu dò khối phổ Triple Quad Agilent .................................. 33
Hình 2.12. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI............................................... 33
Hình 2.13. Lựa chọn kiểu tạo ion ...................................................................... 35
Hình 2.14. SPE và hệ thống qua cột SPE........................................................... 37
Hình 2.15. Các bước vận hành cột SPE ............................................................. 40
Hình 3.1. Đầu dị khối phổ Triplequad LC/MS/MS 6410 .................................. 44
Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu ...................................................................................... 50
Hình 4.1. Đồ thị khảo sát điện thế fragmentor .................................................. 54
Hình 4.2. Sơ đồ cơ chế phân mảnh của clenbuterol .......................................... 55
Hình 4.3. Đồ thị khảo sát năng lượng bắn phá .................................................. 57
Hình 4.4. Khảo sát nồng độ formic acid trong pha động .................................... 61

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 14

Hình 4.5. Đồ thị khảo sát dung dịch trích ly ...................................................... 63
Hình 4.6. Đồ thị khảo sát nồng độ dung dịch KH2PO4 ....................................... 65
Hình 4.7. Đồ thị khảo sát cột SPE ..................................................................... 66
Hình 4.8. Đường chuẩn clenbuterol 1 ................................................................ 68

Hình 4.9. Sắc ký đồ chuẩn clenbuterol 1ppb ở chế độ ghi phổ MRM ................ 69
Hình 4.10. Đường chuẩn clenbuterol 2 .............................................................. 69
Hình 4.11. Sắc ký đồ mẫu trắng (blank) ............................................................ 70
Hình 4.12. Sắc ký đồ chuẩn 1ppb pha trong dung môi và trên nền mẫu ........... 78

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 15

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 16

1.1. Mở đầu
Khi xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu dinh dưỡng của con người khơng chỉ
dừng lại ở chỗ đủ lượng, đủ chất mà còn phải quan tâm một cách nghiêm túc đến
vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm. Việc sử dụng thuốc thú y trong chăn nuôi hiện
nay được coi là khá tùy tiện và chưa được quản lý chặt chẽ, đặc biệt là đối với các
loại thuốc bổ sung trong thức ăn.
Clenbuterol là một hormone tổng hợp thuộc họ beta-agonist. Trước tiên nó được

dùng như thuốc làm giãn phế quản trong điều trị bệnh suyễn. Khi dùng trên động
vật với liều cao hơn liều điều trị có tác dụng đặc biệt là làm tăng khối cơ và giảm
lượng mỡ dư thừa trong cơ thể.
Tuy nhiên, sự tồn dư của chế phẩm này trong sản phẩm động vật lại gây những
ảnh hưởng nghiêm trọng lên sức khỏe người tiêu dùng. Đã có nhiều vụ ngộ độc
thực phẩm liên quan đến sự tồn dư của clenbuterol trong thực phẩm xảy ra trên thế
giới (FDA, 1998). Do đó, nhiều nước trên thế giới đã cấm sản xuất, kinh doanh và
sử dụng clenbuterol trong chăn nuôi, trong đó có Liên minh Châu Âu, Mỹ và Việt
Nam. Tuy nhiên, hiện nay hợp chất này vẫn được lén lút sử dụng nhằm mục đích
thương mại.
Trước thực trạng sử dụng bừa bãi các chất bổ sung trong chăn ni thì việc tìm
hiểu bản chất và ảnh hưởng của chất tồn dư là rất cần thiết. Đồng thời cần quảng
bá rộng kiến thức này đến các nhà chăn nuôi, giúp họ có ý thức hơn nữa trong việc
sử dụng các chất bổ sung gây độc cho con người. Mặt khác, trong xu hướng tồn
cầu hóa kinh tế và khi nước ta đang trên đường gia nhập vào WTO thì việc tồn dư
thuốc bổ sung trong thức ăn sẽ là rào cản khắc nghiệt đối với các doanh nghiệp
xuất khẩu thịt và sản phẩm động vật.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, chưa có phương pháp chuẩn để kiểm tra hàm lượng beta-agonist trong
thực phẩm nói chung và trong thịt gia súc, gia cầm nói riêng; điều này gây khó
khăn cho các nhà quản lý trong việc giám sát, kiểm tra an toàn thực phẩm; đồng

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 17

thời ảnh hưởng đến quyền lợi lâu dài cuả người tiêu dùng khi sử dụng các thực

phẩm có chứa hàm lượng beta-agonist (điển hình nhất là clenbuterol).
Trên thế giới, các phương pháp phân tích Clenbuterol đang được nghiên cứu bao
gồm cả phương pháp sàng lọc (Elisa), phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ,
phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ... Tuy nhiên, theo yêu cầu của các cơ quan
quản lý thực phẩm ở châu Âu – bắt đầu có hiệu lực từ 01/04/2004 và Mỹ (bắt đầu
có hiệu lực từ 2003), kết quả phân tích dư lượng (vết và siêu vết) thuốc thú y
thuộc nhóm A trong phụ lục I của chỉ thị 96/23/EC trong thực phẩm phải được xác
định bằng phương pháp sắc ký khí hoặc lỏng đầu dị khối phổ.
Xuất phát từ thực tế đó, kết hợp với sự sẵn có hệ thống sắc ký lỏng đầu dị ghép
khối phổ tại cơ quan cơng tác, đề tài ra đời với mục tiêu:
 Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng clenbuterol bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ.
 Thẩm định phương pháp phân tích để đánh giá giá trị sử dụng của phương
pháp trong thực tế.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Do chưa có phương pháp chuẩn xác định hàm lượng clenbuterol trong thực phẩm,
mỗi phịng thí nghiệm tùy theo điều kiện sẵn có của mình mà nghiên cứu phương
pháp phân tích cho phù hợp.
Trước đây, tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, chúng tơi cũng đã nghiên
cứu sử dụng phương pháp sắc ký khí với đầu dị khối phổ (GCMS). Đây là
phương pháp hiện đại có độ chính xác, độ nhạy và độ tin cậy cao. Tuy nhiên,
phương pháp GCMS này có giới hạn phát hiện 0.08ppb gần với tồn dư cho phép,
và giới hạn định lượng 0.24ppb cao hơn nhiều so với dư lượng cho phép (MRL)
gây khó khăn trong việc định lượng các nồng độ gần với MRL.
Kỹ thuật LCMS có những ưu điểm nổi trội hơn trong việc phân tích dư lượng
thuốc thú y nhờ khả năng xác định được hầu hết các hợp chất có khối lượng phân
tử từ trung bình đến lớn, cũng như các hợp chất phân cực, không bay hơi, không
bền nhiệt mà không cần qua giai đoạn tạo dẫn suất như phương pháp sắc ký khí.
Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 18

Cùng với độ nhạy và độ chọn lọc cao, đặc biệt trong kỹ thuật MS/MS (khối phổ
liên tiếp), sắc ký lỏng ghép khối phổ đang được đánh giá là phương pháp thích
hợp nhất để phân tích dư lượng thuốc thú y, trong đó có clenbuterol.
Với những ưu điểm nói trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp xác
định dư lượng clenbuterol trong thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ,
nhằm khắc phục được những nhược điểm của phương pháp GCMS và phương
pháp chỉ có tính sàng lọc là ELISA, đồng thời đa dạng hóa các phương pháp phân
tích, phục vụ kịp thời và phù hợp với mục đích phân tích của khách hàng.
Đối với xã hội, phương pháp góp phần giải quyết được vấn đề về vệ sinh an toàn
thực phẩm cho cả nước, giúp các nhà quản lý kiểm sốt có hiệu quả hơn, đồng
thời giúp người tiêu dùng chọn lựa sản phẩm phù hợp, có lợi cho sức khỏe.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 19

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 20

2.1. GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT CLENBUTEROL
2.1.1. Một số tính chất cơ bản của clenbuterol [23]
Cơng thức phân tử: C12H18Cl2N2O
Cơng thức cấu tạo:

Hình 2.1. Cơng thức cấu tạo Clenbuterol
Tên

quốc

tế:

benzenemethanol;

4-amino-3,-dichloro-α-(((1,1-imethylethyl)amino)methyl)
4-amino-

α

((tert-butylamino)methyl)-3,5-dichlorobenzyl

alcohol;
Tên thương mại: Monores ( Valeas)
Trọng lượng phân tử: 277.19
 Dẫn xuất: Clenbuterol hydrochloride

Tên thương mại: Spiropent, Ventipulmin
Công thức phân tử: C12H18Cl2N2O.HCl
Tính chất: Dạng bột, vi tinh thể khơng màu, nhiệt độ nóng chảy: 174-175,50 C.
Tan tốt trong nước, methanol, ethanol, tan nhẹ trong chloroform. Không tan trong
benzene. LD50 trên chuột, chuột lang (mg/kg): 176; 67.1, bằng đường miệng: 27.6;
12.6. Nhiệt độ nóng chảy: 174-175.50C.
2.1.2. Chuyển hóa sinh học của clenbuterol [19]
Theo các nghiên cứu, sự chuyển hóa sinh học của clenbuterol khá phức tạp. Người
ta nghiên cứu và xác định được năm chất chuyển hóa trong nước tiểu của thỏ,
chuột và khỉ đầu đỏ. Clenbuterol gốc là hợp chất chính được tìm thấy trong chất
thải của những lồi này và một số các chuyển hóa được hình thành, trong đó 4amino-3,5-dichloromandelic acid, 3-amino-3,5-dichlorobenzoic acid và 4-amino3,5-dichlorohippuric acid là các hợp chất chủ yếu. Tương tự, đối với gia súc,
clenbuterol chưa bị chuyển hóa được tìm thấy trong nước tiểu (28-52%) và trong

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 21

gan (50-80%) sau khi cho uống clenbuterol gốc. Trong mơ cơ của gia súc,
clenbuterol gốc cũng được tìm thấy.
Các hướng chuyển hóa đuợc thể hiện trong hình 2.2

Hình 2.2. Sơ đồ chuyển hóa sinh học của Clenbuterol
2.1.3. Tác động của clenbuterol lên cơ thể người và động vật [4] [18]
Clenbuterol là chất kích thích tăng trưởng, biểu hiện trên lâm sàng, giãn phế quản,
trị bệnh đường phổi, dùng số lượng lớn, nhịp mạch đập nhanh và hệ thống thần
kinh bị hưng phấn.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 22

Clenbuterol là chất dùng để điều trị bệnh đường hơ hấp cho trâu, bị, ngựa và dùng
cho trâu bị khi sinh đẻ…Thuốc có thể thải dần theo đường tiểu và một ít qua phân
của gia súc. Thử nghiệm với liều cao trên chuột, thỏ, chó cho thấy độc tính chủ
yếu làm tăng nhịp tim và gây co giật; ở trâu bò nếu tiêm tĩnh mạch liều cao cũng
làm tăng nhịp tim, nhịp hô hấp. Nếu sử dụng ở liều cao kéo dài có thể gây họai tử
cơ tim. Sử dụng clenbuterol với liều uống 100mg/kg/ngày trên chuột cống có thể
gây dị tật bào thai. Cũng theo nghiên cứu này trên một số gia súc cho biết 100%
dư lượng của thuốc này tồn dư ở trong cơ không biến đổi, mất đi qua quá trình nấu
nướng ở nhiệt độ đun sôi 100oC, ngay cả khi nướng, chiên…Tuy nhiên, nếu qua
chiên dầu ở nhiệt độ 260oC trong khỏang năm phút thì clenbuterol có thể mất đi.
Ngồi ra clenbuterol cịn có khả năng điều tiết sinh trưởng động vật. Động vật vỗ
béo thịt sử dụng 5-10 lần liều trị bệnh. Nó thúc đẩy phát triển cơ bắp và tác dụng
phân giải lipit, tăng cao tỷ lệ thịt nạc so với thịt mỡ. Có tác dụng phân phối lượng
năng lượng nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn.
Vì vậy, clenbuterol thường bị lợi dụng làm chất bổ sung tăng tỷ lệ thịt nạc, tăng
khả năng tiêu hóa và chúng là những chất rất dễ tồn dư trong thịt, thường tạo
thành hiện tượng trúng độc cấp tính hoặc mãn tính khi sử dụng thực phẩm còn tồn
dư.
Hầu hết các nghiên cứu về clenbuterol đều được thực hiện trên động vật; tuy
nhiên, cũng có một số báo cáo về hậu quả nghiêm trọng của việc lạm dụng
clenbuterol trên người, bao gồm việc sử dụng quá liều và bệnh tim.
2.1.3.1. Tác dụng điều trị bệnh của clenbuterol [24] [31]
Clenbuterol được dùng trong thuốc cho người đối với bệnh hen suyễn kinh niên

với liều chỉ định là 10-20mg/lần, 2 lần một ngày. Nhiều thử nghiệm lâm sàng
được tiến hành bao gồm sức khỏe cho người tình nguyện và phụ nữ có thai mắc
chứng đẻ non; tác dụng phụ là gây ra hiện tượng mất ngủ, run cơ và tim đập
nhanh.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 23

Clenbuterol được dùng như thuốc dãn phế quản cho ngựa và các gia súc không lấy
sữa với liều dùng 0.8mg/kg cân nặng 2 lần hàng ngày trong 10 ngày, có thể cho
uống, tiêm cơ hoặc tiêm tĩnh mạch.
Clenbuterol cũng được dùng như thuốc chống đẻ non cho gia súc với liều chỉ định
là tiêm 1 mũi duy nhất tương đương 0.8mg/kg cân nặng.
Clenbuterol thật sự là một trong những thuốc tăng hiệu năng xây dựng cơ thể được
hiểu sai lệch nhất. Thật ra, ảnh hưởng của clenbuterol là giúp đốt cháy mỡ trong
cơ thể thông qua việc tăng quá trình đồng hóa. Tác động này được thực hiện bằng
cách làm tăng nhẹ nhiệt độ của cơ thể. Nếu nhiệt độ cơ thể tăng lên 1oC thì cơ thể
sẽ đốt cháy thêm 5% lượng calorie dùng duy trì sự sống. Khi đó, cơ thể sẽ chống
lại bằng cách cắt giảm bớt lượng tyrosin hoạt động trong cơ thể.
Clenbuterol được sử dụng trong chăn ni với mục đích tăng tỉ lệ nạc trên gia súc,
gia cầm thương phẩm. Ngoài ra, clenbuterol còn được cung cấp cho thú triển lãm
để tăng vẻ đẹp của cơ bắp.
2.1.3.2. Nghiên cứu về động lực học trên người [19]
Q trình chuyển hóa sinh học của clenbuterol trong cơ thể người cũng tương tự
như ở động vật.
Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu bằng cách một liều uống duy nhất

20mg 14C-clenbuterol hydrochloride với những người tình nguyện, 67% của liều
uống được thải ra trong nước tiểu; thải qua phân rất ít. Hợp chất chính hiện diện
trong nước tiểu là hợp chất gốc không biến đổi.
Khi một liều duy nhất 20mg 14C-clenbuterol hydrochloride được sử dụng cho
những người tình nguyện uống, mức huyết tương cao nhất là 0.11mg/lit, với tmax
trong 2-3 giờ. Khoảng 87% năng lượng phóng xạ của chất được theo dõi phát hiện
thấy trong nước tiểu; và mức thấp hơn được tìm thấy trong phân.
Khi nghiên cứu liều lượng được lập lại, những người tình nguyện được cho uống
40mg 14C-clenbuterol trong 2 ngày và tiếp theo là 20mg trong 2 ngày tiếp theo,
khoảng 75% lượng được phát hiện trong nước tiểu và thành phần chính là thuốc
gốc khơng biến đổi.
Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 24

Liều lượng uống 80mg clenbuterol hydrochloride cho 12 phụ nữ mang thai đẻ
non. Sau 12 giờ thì uống tiếp bằng 2 liều 40mg, và tiếp theo là duy trì liều 20mg
trong vòng khoảng 12 giờ mỗi lần. Mẫu máu được lấy vào ngày 2, 4, 6, và 8 để
nghiên cứu, 3 giờ sau khi uống liều sáng. Nồng độ trung bình là 0.298mg/lit, min
là 0.28 và max là 0.344mg/lit.
Khơng có dữ liệu về sự hấp thụ qua da của clenbuterol ở người.
2.1.3.3. Nghiên cứu về độc tính của clenbuterol [19] [31]
Dưới sự kiểm soát chặt chẽ các thử nghiệm tiến hành trên súc vật trong khoảng
thời gian dài, các nhà khoa học có thể đưa ra những nguy cơ gây độc thông qua
khả năng phá hủy gan và thận, các biểu hiện của ngộ độc thần kinh và các ảnh
hưởng khác đến hệ thống sinh lý. Những nghiên cứu lâu dài thường để kiểm tra
các ảnh hưởng khi cho súc vật sử dụng thuốc lặp đi lặp lại nhiều lần. Ví dụ như

các nghiên cứu được tiến hành trong từng khoảng 28 ngày (nghiên cứu liều dùng
lặp lại ngắn) hoặc 90 ngày (nghiên cứu bán mãn tính), thỉnh thoảng người ta
nghiên cứu trên chuột lớn trong 24 tháng và chuột nhỏ 18 tháng khi xác định khả
năng gây bệnh mãn tính.
Các nghiên cứu đặc biệt hơn được sử dụng để xem xét khả năng gây bệnh tật cho
con cái trong suốt thời gian mang thai.
Khả năng gây ung thư của thuốc thường được nghiên cứu trong thời gian dài trên
chuột. Tuy nhiên, các kết quả thường cũng rất khó khăn giải thích bởi vì các khối
u rất đặc trưng cho từng lồi, các ảnh hưởng khơng đặc trưng và sự phát sinh các
khối u đơi khi khơng thích hợp với q trình kiểm sốt trên con người. Ngun
nhân gây ra ung thư rất đa dạng, nhưng cái chính vẫn là các vấn đề liên quan đến
gen, bao gồm sự phá hủy DNA, đột biến và sự phá vỡ cấu trúc nhiễm sắc thể.
 Cấp tính:
Sau khi cho uống clenbuterol (400-800mg/kg cân nặng), các dấu hiệu ngộ độc ở
chuột và thỏ gồm có hơn mê, sủi bọt, tăng nhịp tim, động kinh co cứng. Còn khi
tiêm clenbuterol trực tiếp vào tĩnh mạch, cái chết diễn ra ngay trong khi tiêm hoặc
ngay sau khi tiêm.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân


Trang 25

 Bán mãn tính và mãn tính
Khi cho các con vật như chuột, thỏ uống clenbuterol hàng ngày với các liều dùng
khác nhau, một số con chết trong quá trình nghiên cứu, một số khác có dấu hiệu
ngộ độc như sủi bọt, co cứng mặt và mũi, khối lượng cơ thể và khả năng tiêu thụ
thức ăn giảm. Ngoài ra, nghiên cứu phát hiện thấy sự gia tăng đáng kể khối lượng

gan và thiếu máu tim cục bộ, tổn hại tim là đáng lưu ý nhất trong các nghiên cứu.
Gần đây, đã có nghiên cứu về việc sử dụng clenbuterol dài hạn và tác dụng của nó
đến chức năng tim trên ngựa trong quá trình vận động. Nghiên cứu cho rằng, sau 8
tuần dùng clenbuterol, tim ngựa to hơn bình thường, thay đổi cấu trúc rất nhiều,
dẫn đến việc nó làm việc kém hiệu quả và dễ gặp vấn đề về tim hơn.
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của clenbuterol đến vấn đề sinh sản, khả năng gây
ra quái thai, dị tật cũng đã được tiến hành trên chuột và cho thấy rằng clenbuterol
là tác nhân gây quái thai hoặc dị tật cơ thể.
Để nghiên cứu khả năng gây ung thư, clenbuterol được hòa tan trong nước và cho
chuột uống trong 2 năm với mức 0, 0.1, 1.0 và 25mg/kg cân nặng mỗi ngày, các
dấu hiệu về tỷ lệ mắc khối u được kiểm sốt nhưng chưa thấy có bằng chứng về
khả năng gây ung thư của loại hợp chất này. Tuy vậy, đây vẫn còn là vấn đề đang
được tranh cãi và tiếp tục nghiên cứu thêm.
2.1.4. Tình hình sử dụng và ảnh hưởng của dư lượng clenbuterol đến người
tiêu dùng
2.1.4.1. Ảnh hưởng của clenbuterol đến chất lượng thịt [24]
Hầu hết các thuốc thú y được sử dụng với mục đích tăng trưởng đếu có ảnh hưởng
ít nhiều đến chất lượng thịt. Thịt có huynh hướng chắc, dai hơn do có sự gia tăng
sản lượng mơ kết nối và tỷ lệ liên kết collagen cao hơn cũng như sự gia tăng phần
phần khơng hịa tan của collagen trong mô. Một yếu tố khác nữa là các chất này có
khả năng ức chế hoạt động của protease – enzyme có nhiệm vụ phá vỡ các liên kết
của protein ở thịt động vật sau khi mổ thịt. Ví dụ, sự phân mảnh protein sợi cơ bị
giảm khi động vật được xử lý bằng β-agonist có thể do chúng có khả năng ức chế
các calpain.

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Chân