SEMINAR xác định dư lượng penicillin g và v trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

Chuyên đề:

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO


Đặt vấn đề

Kết luận

Tính tốn kết quả

Tổng quan penicillin

Phương pháp nghiên
cứu


Đặt vấn đề

Kháng sinh trong chăn nuôi

Tồn dư kháng sinh trong thực
phẩm

•
•
•

•
•

•

Phịng bệnh
Chữa bệnh
Thúc đẩy tăng trưởng

Người sử dụng
Gia súc
Mơi trường


Tổng quan về penicillin

Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với
nhiều loại vi khuẩn.

Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dương

Staphylococcus, Diplococcus... nhưng hầu như không có tác dụng chống vi
khuẩn gram âm và nấm men.

Cấu trúc chung của penicillin.


Tính chất và tác dụng pen G và V

Penicillin G và V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi cấy
nấm penicillium chrysogenum.

Chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: hô hấp, tai mũi họng,

nhiễm khuẩn huyết…

Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng dễ gây dị ứng thuốc, nguy hiểm
nhất là shock phản vệ.

Có thể gây viêm tĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch
cầu.


Tác hại của penicillin đối với con người

Làm đảo lộn công nghệ chế biến.
Gây ra hiện tượng “chọn lọc” vi sinh vật kháng lại chất kháng sinh, đặc biệt hiện
tượng “kháng thuốc chéo”.

Penicillin là kháng sinh thường gây dị ứng nhất: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban.

Nguy hiểm nhất là shock phản vệ, penicillin chiếm đầu bảng với tỷ lệ shock phản
vệ 1/70.000.


Đối tượng nghiên cứu
Dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm.
Mục tiêu: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với
độ nhạy và độ chính xác cao.

PEN G

PEN V

Thiết bị dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detectơ PDA hoặc UV-VIS
- Cột sắc ký C18 (250mmì 4,6mm ì 5àm)
- H chit pha rn
- Cột chiết pha rắn Polymeric (500mg, 6ml)
- Máy cất quay chân không
- Máy lắc vortex
- Máy li tâm, đạt tốc độ 6000 vòng/phút.
- Máy đồng nhất mẫu
- Máy đo pH


Thiết bị dụng cụ

- Bể điều nhiệt
- Cân phân tích điện tử(độ chính xác 0,00001g)
- Cân phân tích(độ chính xác 0,0001g)
- Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g)
- Cốc có mỏ các loại dung tích 50, 100, 250 ml
- Bình định mức thuỷ tinh các loại dung tích 10, 20, 100 ml, 1 lít và 2 lít
- Vial loại 1,8 ml
- Pipetman loại 200, 1000 ml và đầu tuyp.
- Ống li tâm dung tích 50 ml.


Hóa chất
Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích:
- Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G)

- Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V)
- Acetonitril, Methanol, Natritungstat (Na2WO4), Thuỷngân (II) clorid (HgCl2), 1,2,4- triazole
(C2H3N3), Natrithiosulfat (Na2S2O3), Natrihydroxid (NaOH), Natriclorid (NaCl), Kali
dihydrophotphat (KH2PO4), Dikali hydro photphat (K2HPO4), Acid sulfuric (H2SO4).


Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G

•Dung dịch chuẩn gốc Penicillin G 1000mg/l
•Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l
Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V

•Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l
•Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l
Đệm photphat 0,1M pH 6.5:
Cân 7,98 gam K2HPO4.3H2O; 8,84 gam KH2PO4 và 3,89 gam Na2S2O3. Hoà tan hỗn hợp.


Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC
Gồm 3 phần chính:

Phần đầu vào cấp pha động có thành
phần mong muốn và mẫu phân tích.

Phần tách: là phần trung gian của hệ
sắc ký bao gồm cột tách, đơi khi có cột
phụ trợ.

Phần phát hiện và xử lí số liệu


Xử lý mẫu

 Lấy 5g với 20ml nước đồng nhất trong trong ống li tâm.
 Thêm 2ml H2SO4 0,68M, 2ml Natri tungstat 0,68M

rồi lắc vortex, để yên 5p, li tâm 6000

v/ph trong 5p.

 Lọc trong bình nón 50ml (lọc lấy bã và làm lại quy trình như trên).


Xử lý mẫu

 Phần dịch cịn lại cho vào mơi trường có PH = 8-9, NAOH 0,4N

với 5ml đệm phosphat

25mM rửa tạp, 3ml MeOH, 3ml H20 cho vào cột SPE.

 Hút khơ trong vịng 1p, rồi rửa giải với 10ml CAN/bình cất quy, cố quay chúng đến cạn ở
0
40 C.

 Thêm 500 µm đệm photphat 25mM, pH 9, 500µL hỗn hợp dẫn xuất, đưa vào bể điều
0
nhiệt 55 C trong vòng 30p.

CC THễNG S TI U

ãCt Symmestry waters C18 (250mmì4,6mmì5àm)
ãPha ng: chương trình gradient
oA: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
oB: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200

•Detectơ: PDA 323nm
•Nhiệt độ buồng cột: 40oC
•Tốc độ dòng: 1ml/phút


KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ ĐƯỜNG CHUẨN

Phương pháp HPLC có khoảng tuyến tính rõ rệt.
Tất cả hệ số hồi qui tuyến tính đều dao động trong khoảng từ 0,99 đến dưới 1.

Khoảng tuyến tính

Phương trình đường chuẩn

R²

(ng/g)

Pen G

0,1 – 1

y = 114445x – 3235.9

0,9995

Pen V

0,2 – 2

y = 43182x – 2013.7

0,9997


ĐƯỜNG CHUẨN


ĐỘ CHÍNH XÁC

 Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) đối với PEN G = 20ppb, PEN V = 40ppb.
 Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) đối với PEN G = 67ppb, PEN V = 133ppb.
 Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao để phân tích dư lượng kháng
sinh CAP trong thịt.

LOD và LOQ của thiết bị cao hơn so
với giới hạn cho phép nên cần phải
làm giàu mẫu.


ĐỘ LẶP LẠI

Sử dụng nền mẫu trắng, thêm các mức chuẩn ở khoảng đầu, giữa và cuối đường
chuẩn, mỗi mức lặp 3 lần.
Tính độ lệch chuẩn SD và hệ số biến thiên CV:

S là diện tích của pic sắc ký thứ i
i
S

tb

là diện tích trung bình của n lần chạy

n là số lần chạy lặp


ĐỘ LẶP LẠI
MẪU

mc

SD

CV (%)

Mẫu thực

0

1

0,1

643,4

10,7

2

0,4

3178,3

8,9

3

0,6

2939,2

5,3

Bảng: Độ lặp lại của Penicillin G tại các nồng độ khác nhau
MẪU

mc

SD

CV (%)

Mẫu thực

0

1

0,2

493,5

8,9

2

0,6

1611,5

7,9

3

1

1001,9

2,8

Bảng: Độ lặp lại của Penicillin V tại các nồng độ khác nhau


ĐỘ LẶP LẠI

Theo AOAC, CV% cho phép tại 100ppb là 15%, 1ppm là 11%.

Tại nồng độ penicillin thấp, độ dao động của các kết quả lớn.

Tuy nhiên, tại những cấp độ khảo sát, CV% của phương pháp nằm trong khoảng 3
– 10% là phù hợp với yêu cầu của AOAC.


ĐỘ THU HỒI

Tính hiệu suất thu hồi của phương pháp theo các công thức sau :

C:

nồng độ Pen xác định được (µg/g)

C':

nồng độ Pen tính từ đường chuẩn (µg/ml)

V:

thể tích định mức trước khi bơm vào HPLC ( V = 1ml)

m:

khối lượng mẫu (g)

C
:
m+c

nồng độ Pen xác định được trong mẫu thêm chuẩn (µg/g)

C : nồng độ Pen có trong mẫu (µg/g)
m
m : lượng Pen thêm vào (µg)
c



Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Xác định Penicillin G và V trong 3 nhóm đối tượng: nhóm gia súc (thịt, gan, bầu dục
lợn, bị); nhóm gia cầm (thịt gà, thịt ngan, thịt vịt); nhóm thuỷ hải sản (một số loại tơm, cá)
để thẩm định lại qui trình.

Các mẫu được lấy ngẫu nhiên tại một số cửa hàng trên địa bàn nội thành Hà nội.
Chọn mẫu và kĩ thuật lấy mẫu theo TCVN 4833- 1:2002. Mỗi loại mẫu lấy tại 3 cửa
hàng, trộn đều và phân tích.

Trong số 10 loại mẫu khơng có mẫu nào phát hiện có penicillin G và V. Hiệu suất thu
hồi nằm trong khoảng 80 - 93%.