SEMINAR xác định hàm lượng ure trong nước mắm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG UREA TRONG
NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU CAO NĂNG


NỘI DUNG
I. Đặt vấn đề
II. Đối tượng và phương pháp
1. Đối tượng
2. Phương pháp
2.1. Dấu hiệu nhận biết
2.2. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
2.3. Điều kiện quy trình và q trình
thực hiện
2.4. Tiến hành phân tích trên máy
III. Tính tốn kết quả
IV. Kết luận
V. Tài liệu tham khảo


I.

Đặt vấn đề

• Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự sinh tồn của
lồi người
• Nhu cầu về một thực phẩm đáp ứng không những về dinh
dưỡng mà cịn về tính an tồn và khơng gây hại cho sức khỏe
đối với người tiêu dùng là cần thiết.
• Nước nắm là một loại thực phẩm được sử dụng phổ biến ở
nước ta, là loại gia vị thường xuyên hiện diện trong các bữa ăn

của người Việt.
• Việc xác đinh hàm lượng urea có trong nước mắm cũng là một
vấn đề được người tiêu dùng quan tâm.


Tình hình nhiễm urea trong nước mắm ở nước ta
• Theo chemical codex đề nghị mức cho phép urea trong
nước mắm là 50mg/l
• Theo một kết quả nghiên cứu của Viện Pasteur Nha Trang
công bố, trong 45 mẫu nước mắm chọn ngẫu nhiên trên thị
trường Khánh Hịa thì mẫu có Hàm lượng urea lớn hơn
0,1g/l, có mẫu lên đến 2,1g/l. Trong khi đó, urea hồn tồn
khơng có trong danh mục các chất phụ gia thực phẩm do bộ
Y tế ban hành.


II. Đối tượng và phương pháp
1. Đối tượng: ure trong nước mắm


2. Phương pháp
2.1. Dấu hiệu nhận biết
2.1.1. Tính chất lý hóa
 Cơng thức phân tử và tính chất vật lý
 Dạng tinh thể hoặc bột màu trắng
 Phân tử lượng: 60,1
 Khối lượng riêng: 1,34g/cm3
 Nhiệt độ nóng chảy: 132-1350C
 pH (dung dịch 10%): 7,2

2.1.2. Tác hại của urea đến sức khỏe
 NH4+ trong máu tăng cao, làm giảm pH máu, ngăn cản quá
trình vận chuyển oxy, da và niêm mạc bị tím lại, có thể dẫn
đến hơn mê, chết.
 Nitrate khi đến ruột thì chuyển hóa thành nitrite (NO 2-) gây
Methaemoglobinemia.
 Nếu lượng urea quá mức có thể gây giảm hoạt động của
tuyến giáp, rối loạn máu ác tính, rối loạn thần kinh, nếu kéo
dài có thể làm da chuyển sang màu xám.


2.2. Nguyên lý của phương pháp
Phương pháp: xác định urea bằng sắc khí lỏng hiệu năng cao- đầu
dị huỳnh quang
 Cho urea tạo dẫn xuất với thuốc thử xanthydrol tạo thành hợp
chất N-9H-xanthen-9-ylurea và được đo bằng đầu dò huỳnh quang
(λex=213nm; λem=308nm) sau khi tách bằng cột sắt khí pha đảo
(C18) trên thiết bị HPLC.
 Phản ứng giữa thuốc thử Xanthydrol với urea: Sử dụng hệ phản
ứng tự động phân tích carbamate để tạo dẫn xuất urea với
xanthydrol trong mơi trường có thêm 1 lượng nhỏ acid HCl 1,5M.
Dưới điều kiện trên sau 5 phút thì chất tạo dẫn xuất được tách
trên thiết bị HPLC và đo trên đầu dò huỳnh quang λ ex=213nm;
λem=308nm. Ở điều kiện này, urea phản ứng với xanthydrol tạo
thành hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea.


2.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
2.3.1. Thiết bị

Thiết bị chính là máy sắc ký lỏng hiệu cao năng ( HPLC) của hãng
Perkin Elmer – đầu dò huỳnh quang , bước sóng λ ex = 213 nm,
λem = 308 nm. Máy được trang bị bộ tiêm mẫu tự động và hệ
thống máy tính nối với phần mềm để thu nhận dữ liệu.


2.3.2. Dụng cụ, hóa chất

 Bình định mức: 10ml, 100ml, 1000ml
 Micropipet: 10 - 100µl và 100 - 1000µl
- Ethanol tuyệt đối, Propanol – 1, HCl 37%, Acetronitril dùng cho HPLC,
Chuẩn urea ≥ 99% – Merck
- Xanhthydrol – Fluka
- Dung dịch xanthydrol 0,07M
- Dung dịch acid HCl 1,5M
- Dung dịch ZnSO4 2N
- Dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15%
- Dung dịch Ethanol 75%


Dung dịch chuẩn:

• Chuẩn 100ppm: cân 100mg chuẩn gốc urea >99% pha thành
100ml bằng dung dịch nước cất
• Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 10ppm: lấy 10ml dung
dịch chuẩn 100ppm pha thành 100ml bằng nước cất
• Pha điểm chuẩn có nồng độ lần lượt là: 0.1; 0.4; 0.6; 0,8; 1.0
ppm bằng cách hút lần lượt vào 1.0; 4.0; 6.0; 8.0; 10.0ml dung
dịch chuẩn trung gian rồi định mức thành 100ml bằng dung
dịch cồn 75%.

2.4. Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện
2.4.1. Điều kiện quy trình
 Pha động
- Dung mơi A: Axetonitril
- Dung môi B: Axetonitril và dung dịch natri axetat (pH = 7,2) với tỷ lệ
36 : 64 (% thể tích)
- Lọc các dung môi pha động qua màng lọc và loại bỏ khí hịa tan
bằng cách để trong thiết bị siêu âm khoảng 10 min trước khi sử dụng.
 Bước sóng kích hoạt: 213nm, bước sóng phát xạ 308nm.
 Thể tích mẫu bơm: 20 l
 Chương trình gradient pha động


2.4.2. Quá trình thực hiện
a. Các nội dung khảo sát


b.

Quy trình xác định urea trong nước mắm

V ml dung dịch mẫu vào
bình định mức 100ml

- Thêm 1g than hoạt tính
- Thêm 20ml nước

Định mức thành 100ml

Lọc
- Lấy V1 l dung dịch xanthyldrol

- Thêm V ml dung dịch ZnSO4 2N
- Thêm V ml dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15%

0,02M vào vial
- Thêm V2 l dung dịch HCl 1,5M
- Thêm V3 l dung dịch mẫu, lắc đều
Để 5 phút
Định lượng trên HPLC
đầu dò huỳnh quang


2.5. Tiến hành phân tích trên máy

 Thiết lập phương pháp chạy máy
• Các thơng số bao gồm thơng số cho hệ thống bơm, chương trình
cho autosampler, chương trình gradient pha động, bước sóng
kích thích và bước sóng phát xạ cho đầu dị huỳnh quang.
• Sau khi tất cả các yếu tố đạt yêu cầu, mẫu chuẩn và mẫu thật sẽ
được tiêm vào máy dùng hệ thống tiêm mẫu tự động
autosampler.
• Kết quả thu được sẽ được tiến hành định tính và định lượng
dựa vào phần mềm TCNAV của hãng Perkin Elmer.


III.

Tính tốn kết quả

1. Kết quả khảo sát và định danh phức N-9H-xanthen-9-ylurea
Dựa trên thời gian lưu, tỷ lệ tương ứng theo nồng độ (0,1; 0,2; 0,3
ppm ). Sắc kí đồ thu được:

 Nhận xét: ở ba nồng độ trên có tR trùng nhau sau 3 lần chạy, chiều cao
peak tỷ lệ với nồng độ của chất cần phân tích
ứng với hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea .

peak có t R 12 phút


2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn
C (mg/l)
Diệnchuẩn
tích có nồng độ 0,074; 0,147; 0,295; 0,591; 1,033; 1,47
•STTXây
dựng dãy
1
0,074
825589
thu được:
2 ppm.
0,148Kết quả
1564745
3
0,295
2979736
4
0,591

6111304
5
1,034
9911857
6
1,470
11630994

 Nhận xét: ở nồng độ (0,074 -1,033 ppm) hệ số tương quan tốt theo hàm
bậc 1: y= ax +b với R2 = 0,998. Nồng độ (0,074 - 1,47 ppm ) hệ số tương
quan không theo hàm bậc 1: y = ax + b với R2 = 0,977. Khi nồng độ ure
tạo dẫn xuất lớn hơn 1 ppm thì tín hiệu thu được vượt khỏi thang dị
của đầu dị, tín hiệu khơng cịn tuyến tính theo hàm y = ax + b.


3. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và định lượng của phương
pháp
 Giới hạn phát hiện: LOD = Diện tích peak trung bình của mẫu
trắng + 3SD diện tích mẫu trắng.
 Giới hạn định lượng: LOQ = LOD*10/3
 Giới hạn phát hiện của phương pháp là: 0,58 mg/L
 Giới hạn định lượng của phương pháp là: 1,92 mg/L
 Nhận xét: phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng
ure trong mẫu ở nồng độ thấp ( những mẫu nước mắm có hàm
lượng từ 1,92 ppm trở lên ).


4. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi

• Thực hiện phân

tích các mẫu nướcKýmắm
có độ đạm
lầnthu
lượt
Tên mẫu
hiệu mẫu
Hiệu suất
hồilà:
(%)10; 20;
M1 + C1
10N)
25; 30; 35; M1
40 (vànước
mẫumắm
nước
mắm trên
có thêm chuẩn.87,64
Kết quả thu được

như sau:

M2 (nước mắm 20N)
M3 ( nước mắm 25N)
M4 (nước mắm 30N)
M5 (nước mắm 35N)
M6 (nước mắm 40N)

M1 + C2

100,45

M2 + C1

91,86

M2 + C2

100,67

M3 + C1

113,41

M3 + C2

99,35

M4 + C1

79,57

M4 + C2

97,16

M5 + C1

111,21

M5 + C2

113,58

M6 + C1

86,18

M6 + C2

105,46

• Qua bảng số liệu cho thấy hiệu suất thu hồi khá tốt ( hiệu suất thu hồi >
80% ),
phương pháp phù hợp cho việc định lượng ure trong nước
mắm.


5. Cơng thức tính nồng độ urea có trong mẫu

 Phương pháp định tính: dựa trên thơng số thời gian lưu t R
 Phương pháp định lượng:
Cc * V * k
X=
M
Trong đó:
• X: là nồng độ ure có trong mẫu, mg/L
• V: thể tích định mức mẫu, mL
• M: thể tích mẫu, mL
• k: hệ số pha lỗng

IV.

Kết luận

 Đề xuất được phương pháp phân tích hiện đại xác định hàm lượng
ure trong nước mắm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu nặng caođầu dị huỳnh quang cho kết quả chính xác, độ tin cậy cao.
 Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích : 　　　　　
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp (HPP %) xấp xỉ 100% trong một
khoảng nồng độ khá rộng của Ure. Phương pháp tin cậy xét về
phương diện độ chọn lọc, độ đúng và độ chính xác.
- Giới hạn phát hiện (LODphương pháp) khá thấp cho ure:
　　　　　 LODure = 0,58( mg/L)
- Giới hạn định lượng ( LOQ phương pháp ): LOQure = 1,92 (mg/L)


V.

Tài liệu tham khảo

1. Lê Thị Lợi, Dương Trọng Phi, Đào Thị Vân Khánh và cộng tác viên. Nguyên
cứu xác định hàm lượng ure hình thành tự nhiên trong quá trình sản xuất
nước mắm. Viện Pasteur Nha Trang, Y học TP.Hồ Chí Minh.
2.AOAC Official Method 941.04 (2006), Ure and ammonical nitrogen in
animal feed urease method.
3. AOAC Official Method 983.01 (2006), Ure and methyleneureas ( water soluble ) in fertilizers liquid chromatographic method.
4. Patricia A.Wright (1998), Ure production and transport in Teleoost fishes,
University of Guelph, Ontario, Canada.
5. Shona Clark, Paul S.Francis (2007), Determination of ure using high performance liquid chromatography with fluorescence detection after
automated derivatisation with xanthydrol, Deakin University, Australia.

6. />