SEMINAR XÁC ĐỊNH dư LƯỢNG β AGONIST TRONG THỊT HEO (dược PHÂN TÍCH)

XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG β-AGONIST
TRONG THỊT HEO
GVHD:
DANH SÁCH NHÓM


TỔNG QUAN VỀ β-agonist
Họ β-agonist là một trong những hợp chất được đưa vào chăn nuôi, đặc biệt là
chăn nuôi heo để kích thích heo tăng trưởng và cho thịt siêu nạc. Tuy nhiên loại
dược liêu này là những chất kích thích mạnh gây hại cho gia suc và ngươi nêu
ăn phai thịt vât nuôi được nuôi băng thưc ăn co trôn cac loại dược li êu trên.


I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Clenbuterol là loại chất kích thích tuyến thượng thận, điều tiết sinh trưởng
động vật, thúc đẩy quá trình phát triển cơ bắp, làm tăng lượng thịt nạc và đẩy
nhanh việc phân giải mỡ, giảm tối đa lượng mỡ hình thành trong cơ thể, chỉ để
lại một lớp rất mỏng. Clenbuterol trộn vào thức ăn gia súc nhằm tạo ra vật nuôi
siêu nạc, mau lớn. Đối với gia súc như heo, khi ăn phải chất này chỉ có thể tồn
tại được quá nửa tháng là phải giết mổ.
Tuy nghiên, nếu dùng Clenbuterol quá liều sẽ trở thành chất độc. Việc ăn
phải thịt lợn chứa chất Clenbuterol về lâu dài có thể gây nguy hiểm đối với sức
khoẻ con người, có nguy cơ gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, bị ảnh
hưởng xấu lên tim mạch, làm cho tim đập nhanh, tăng huyết áp, run cơ, gây
biến chứng ung thư, ngộ độc cấp, rối loạn tiêu hóa, chống váng… và có thể
dẫn đến tử vong.


I.1 Tình hình nhiễm clenbuterol trên thế giới
Clenbuterol là chất phổ biên nhất trong nhom β-agonist, bị cấm sử dụng
trong thưc ăn gia suc tại nhiều nước:

. Năm 1988 ở cac nước châu Âu và năm 1991 ở Mỹ đã cấm đưa
clenbuterol vào thưc ăn chăn nuôi.
. Năm 1990, tại Tây Ban Nha co 135 ngươi bị ngộ độc clenbuterol sau
khi ăn gan bị.
. Ở Hồng Kơng từ năm 1998 đên 2001, mỗi năm trung bình co 15 vụ
ngộ độc thực phẩm được xac nhận co liên quan đên thịt nhiễm độc
clenbuterol.
. Ngày 31 thang 12 năm 2001 clenbuterol bị cấm sử dụng trong thưc ăn
gia suc


I.2 Tình hình nhiễm clenbuterol ở Việt Nam
- Ở Việt Nam, từ năm 2002, Bộ Nông nghiệp đã co Quyêt định số 54/QĐBNN cấm san xuất, nhập khẩu và lưu thông một số khang sinh, hoa chất sử
dụng trong thưc ăn chăn nuôi, trong đo co clenbuterol.
- Năm 2005, Chi cục Thu y TP.HCM đã mở rộng kiểm tra và phat hiện một
số mẫu thịt lợn bày ban trên thị trương co chất Clenbuterol
- Một năm sau, trong một cuộc hội thao về hormone tăng trưởng do Viện
KHKT Nông nghiệp miền Nam và Hiệp hội thưc ăn chăn nuôi tổ chưc, Cục
Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT) đã công bố kêt qua kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006),
cơ quan chưc năng đã phat hiện 47/428 mẫu dương tính với Clenbuterol
(chiêm gần 11%).
- Năm 2011, trong số gần 500 mẫu thịt lợn đang bày ban tại cac chợ
TP.HCM, co gần 30% mẫu dương tính với Clenbuterol. Đang lo là khi co kêt
qua xét nghiệm này thì tồn bộ số thịt heo trên đã được tiêu thụ hêt.
- Hiện nay, tuy tại cac tỉnh miền Nam, tình trạng lợn nhiễm độc
Clenbuterol đang lan tràn trên diện rộng, nhưng hiện thị trường miền Bắc
chưa phát hiện thịt lợn nhiễm Clenbuterol.


II.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1 Đối tượng
-Thí nghiệm được thực hiện trên mẫu thịt heo và gan heo được lấy trực tiếp
từ các lò giết mổ.

II.2 Phương pháp
-Sử dụng phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Đây là phương
pháp tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, mẫu chất thu lại dễ dàng.

2.1 Dấu hiệu nhận biết:
-Tính chất lý hóa của Clenbuterol:
• Dạng tinh thể khơng màu, mịn.
• Phân tử gam: 277,19
• Nhiệt độ nóng chảy: 174-175,5 oC
• Nhiệt độ sơi: 404,9oC
• Clenbuterol tan nhiều trong nước, aceton, methanon, ethanon, ít tan trong
chloroform, khơng tan trong benzen.
-Thịt lợn có chứa clenbuterol thường có màu đỏ tươi khác thường, lớp mỡ
mỏng, lỏng lẽo, thịt chạm vào có cảm giác như bị ứ nước, da xuất hiện đốm đỏ.


2.2 Dụng cụ và thiết bị hóa chất
2.2.1 Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC
Máy sắc ký lỏng cao áp gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất
(pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò
(detector) và phần điều khiển và xử lý số liệu (data processor).


2.2.2 Thiết bị và hóa chất
- Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm:
• Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động

• Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn
ion hóa ESI và APCI
• Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích
cỡ hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)
• Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký
- Hóa chất và dung dịch thử
• Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure
analysis); HCOOH loại HPLC và K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử
K2HPO4 0,1M
• Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H2O (0,1% HCOOH)
(v/v) .
2.2.3. Chất chuẩn và nội chuẩn
• Clenbuterol hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl)
• Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C12H9D9Cl2ON2).


2.3 Điều kiện và quy trình thực hiện
2.3.1. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
a. Khao sat chọn bước song thích hợp: khao sat để lựa chọn bước song thích
hợp cho viêc phat hiên Clenbuterol.
b. Lựa chọn cơt:
c. Lựa chọn đêm: lựa chọn đêm co pH để peak clenbuterol tach tốt, cân
xưng và không làm giam tuổi thọ côt.
d. Lựa chọn pha đông: khao sat lựa chọn pha đông sao cho peak gọn, cân
xưng và hê số bất đối thấp nhất.
e. Lựa chọn tốc đơ dịng: sao cho peak cân đối, thơi gian chạy săc ky phu
hợp
2.3.2. Quy trinh thưc hiên
- Lựa chọn điều kiện sắc ký
- Xây dựng phương pháp định lượng: - Khảo sát sự thích hợp của hệ thống

- Xây dựng phương pháp định lượng
- Tính kết quả
- Định lượng Clen bằng p.pháp mới xây dựng
- Đánh giá tuyến tính
- Đánh giá p.pháp định lượng:
- Đánh giá tính chính xác
- Đánh giá tính đúng
2.4 Tiến hành phân tích trên máy - Đánh giá tính đặc hiệu


III. TÍNH TOÁN VÀ KẾT QUẢ:
Bảng 1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong q
trình phân tích:

Nhận xét: Kết quả từ bảng 1 cho thấy các diện tích peak của mỗi ion lần
lượt trong dd chuẩn và dung dịch chuẩn thêm vào nền mẫu sau xử lý tương tự
nhau, điều này chứng tỏ khơng có hiệu ứng nền trong giai đoạn tạo ion ở đầu
dò khối phổ.


Kết quả xây dựng đường chuẩn Clen trên nền thịt
70 Y = 0,663x-0084
Clen (Nền thịt)
60 R2= 1
50
40
30
20
10
Co (μg/L)

0
20 40 60 80 100

Đường chuẩn Clen nền thịt
Kết quả xác định hiệu suất thu hồi
Đường chuẩn để xác định hiệu suất thu hồi được xây dựng trên dung dịch
và trên các nền mẫu thịt, gan.
Hiệu suất thu hồi của Clen trên thịt heo được xác định dựa trên đường
chuẩn của tỉ lệ diện tích ion chuẩn và nội chuẩn theo nồng độ của Clen trên các
nền mẫu. Hiệu suất thu hồi của phương pháp (H PP ), với việc sử dụng nội chuẩn
đồng vị phải đạt khoảng 100%. Có thể ước tính hiệu suất thu hồi thực (H T )
trong tách chiết bằng cách dựa trên đường chuẩn xây dựng từ các dung dịch
chuẩn. Kết quả được trình bày trong bảng 2:


Bảng 2: Hiệu suất thu hồi của Clen trên nền thịt:

Nhận xét: Hiệu suất thu hồi của
p.pháp đạt khoảng 100% như đã
dự đoán và hiệu suất thu hồi thực
trên nền các mẫu khảo sát đạt
các kết quả như sau: mẫu có
nồng độ 0,05-50μg/Kg, hiệu suất
thu hồi đạt 68,5-86,78%


Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Bảng 3: Giá trị LOD và LOQ của Clen:
Nền mẫu

Cmẫu
(μg/Kg)

Co
(μg/Kg)

Thịt (2g)

0,0991

0,0495

LOD (RSD%)
(μg/Kg)
n=6
0,017 (14,14)

LOQ (μg/Kg) (RSD
%)
0,051 (14,14)

Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị LOD, LOQ của Clen rất nhỏ đáp ứng
được tiêu chuẩn của Châu Âu, Codex và phù hợp với quy định của VN.
Bảng 4: Kết quả điều tra hàm lượng Clenbuterol trong thịt heo:
Loại mẫu

Tổng số mẫu

Nhiễm
Clenbuterol

Thịt

28

5 (1,36-6,12)


IV. KẾT LUẬN
Các kết quả trên đã đề xuất được phương pháp phân tích hiện đại để định
lượng Clenbuterol bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực có sử
dụng nội chuẩn đồng vị (Clenbuterol-d9) cho kết quả chính xác, độ tin cậy cao.
Quy trình đạt tiêu chuẩn phân tích theo yêu cầu của châu Âu, với các giá trị
đạt được như sau:
- Hiệu suất thu hồi của phương pháp (HPP %) khoảng 100% và quy trình
được sử dụng để định lượng chính xác nồng độ của clenbuterol trong thịt và gan
heo.
- Hiệu suất thu hồi thực (HT %) từ tách chiết:
Mẫu có nồng độ 0,05 – 50 (μg/Kg), HT%: 68,5 – 86,78%
- Giới hạn phát hiện (LOD) khá thấp cho clenbuterol:
LODClen = 0,017 ( μg/Kg)
Các trị số LODClen cho thịt (LOD 1/5 MRL) phù hợp với giá trị tối đa cho
phép MRL theo cả tiêu chuẩn châu Âu và Codex


V. TÀI LIỆU THAM KHẢO:
Luận án Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol và
salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật
sắc ký lỏng ghép khối phổ của Nguyễn Thị Thu Thủy.
[ />Đồ án tốt nghiệp Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin

băng phương phap HPLC.
[ />