Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có kháng thể kháng sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

NGUYỄN LÂM ĐỨC VŨ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM
HÚT THANH CĨ KHÁNG THỂ KHÁNG SÁN LÁ LỚN Ở GAN
SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------

NGUYỄN LÂM ĐỨC VŨ
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM
HÚT THANH CĨ KHÁNG THỂ KHÁNG SÁN LÁ LỚN Ở GAN
SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM
Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ QUANG HUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

.


.

i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tác Giả

Nguyễn Lâm Đức Vũ

.

.

MỤC LỤC
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1. Đại cương về xét nghiệm miễn dịch huyết thanh học ........................... 3
1.2. Đại cương về Sán lá lớn ở gan Fasciola hepatica và Fasciola gigantica
.................................................................................................................... 11
1.3. Hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm ............................................ 13
1.4. Chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm ............................... 15
1.5. Mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng
trong ngoại kiểm ......................................................................................... 21
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 26
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 26
2.2. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................. 26
2.3. Dân số mục tiêu ................................................................................... 26
2.4. Dân số chọn mẫu ................................................................................. 26
2.5. Cỡ mẫu ................................................................................................ 27
2.6. Kỹ thuật chọn mẫu .............................................................................. 27
2.7. Tiêu chuẩn chọn mẫu .......................................................................... 28
2.8. Phương pháp thu thập mẫu .................................................................. 28
2.9. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................. 29
2.10. Thiết bị - Dụng cụ ............................................................................. 30
2.11. Hoá chất sử dụng ............................................................................... 30
2.12. Kỹ thuật xét nghiệm phân tích KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn
ở gan ........................................................................................................... 30
2.13. Quy trình sản xuất bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN
sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm ................................................ 51

.

.

2.14. Kiểm soát sai lệch.............................................................................. 59
KẾT QUẢ ................................................................................ 61
3.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng kháng nguyên sán lá lớn ở gan
có trong mẫu huyết thanh ngoại kiểm ........................................................ 61
3.2. Sản xuất và đánh giá chất lượng của bộ mẫu huyết thanh ngoại kiểm có
KT IgG kháng KN sán lá lớn ở gan .......................................................... . 65
3.3. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có KT
kháng sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm...................................... 82
BÀN LUẬN ............................................................................. 84
4.1. Kháng thể IgG đặc hiệu kháng kháng nguyên sán lá lớn ở gan trong huyết
thanh ngoại kiểm ........................................................................................ 84
4.2. Đánh giá chất lượng của bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng
KN của sán lá lớn ở gan ............................................................................. 88
4.3. Quy trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng
sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm ................................................ 90

.


.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ tiếng Việt
ATSH

An toàn sinh học

CS

Cộng sự

HT

Huyết thanh

KDa

Kilodalton

KN

Kháng nguyên

KST

Ký sinh trùng

KT

Kháng thể

MD

Miễn dịch

SLLOG

Sán lá lớn ở gan

Từ tiếng Anh
ECLIA

Electrochemiluminescence Immunoassay

CMIA

Chemiluminescent microparticle immunoassay

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

EQA

External Quality Assessment

EQAS

External Quality Assessment schemes

IVD

In vitro diagnostic

OD

Optical density

RIA

Radioimmunoassay

.


.

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các epitopes trên kháng ngun . ............................................ 4
Hình 1.2 Cấu trúc phân tử IgG ............................................................... 6
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử IgM ............................................................... 8
Hình 1.4 Cấu trúc phân tử IgA ............................................................... 8
Hình 1.5 Tỷ lệ nhiễm SLLOG theo vùng tại Việt Nam ....................... 11
Hình 1.6 Sán lá lớn ở gan ..................................................................... 12
Hình 1.7 Chu trình phát triển của sán lá lớn ......................................... 13
Hình 1.8 Hệ thống quản lý chất lượng.................................................. 14
Hình 1.9 Thiết bị đơng khơ mẫu EYELA FDU-2100 .......................... 25
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ................................................................... 29
Hình 3.1 Kết quả kỹ thuật western blot xác định tính đặc hiệu của mẫu
huyết thanh ............................................................................................ 64
Hình 3.2 Sơ đồ sản xuất bộ mẫu ........................................................... 66
Hình 3.3 Mẫu huyết thanh đơng khơ ĐK 1 .......................................... 67
Hình 3.4 Mẫu huyết thanh đơng lạnh ĐL 1 .......................................... 69

Hình 3.5 Kết quả theo dõi độ ổn định bộ mẫu ĐL1 ............................. 77
Hình 3.6 Kết quả theo dõi độ ổn định bộ mẫu ĐK 1 ............................ 78
Hình 3.7 Kết quả theo dõi độ ổn định của bộ mẫu ĐK 3 ..................... 80
Hình 3.8 Kết quả theo dõi độ ổn định của bộ mẫu ĐL 3 ...................... 81
Hình 3.9 Kết quả theo dõi độ ổn định bộ mẫu ĐL 3 và ĐK 3 .............. 82

.


.

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thiết bị - Dụng cụ ................................................................. 30
Bảng 2.2 Hoá chất - Sinh Phẩm ............................................................ 30
Bảng 2.3 Hoá chất xét nghiệm Western blot ........................................ 32
Bảng 2.4 Hoá chất xét nghiệm ELISA ................................................. 43
Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc các bệnh truyền nhiễm trong mẫu huyết thanh
thu thập .................................................................................................. 61
Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc KT IgG kháng KN SLLOG trong mẫu huyết
thanh ...................................................................................................... 63
Bảng 3.3 Kết quả xác định tính đặc hiệu của các mẫu huyết thanh nguyên
liệu ......................................................................................................... 64
Bảng 3.4 Kết quả tiền phân tích của bộ mẫu ĐK 1 .............................. 67
Bảng 3.5 Kết quả tiền phân tích của bộ mẫu ĐL 1 ............................... 68
Bảng 3.6 Kết quả tiền phân tích của bộ mẫu ĐL 3 và ĐK 3 ................ 70
Bảng 3.7 Bảng kết quả tiền phân tích bộ mẫu âm tính ĐL 2................ 71
Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu ĐK 1 .............. 73

Bảng 3.9 Kết quả dánh giá tính đồng nhất cảu bộ mẫu ĐL 1 ............... 74
Bảng 3.10 Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu ĐK 3 và ĐL 3
............................................................................................................... 75
Bảng 3.11 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐL 1 ........... 78
Bảng 3.12 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐK 1........... 79
Bảng 3.13 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐK 3.......... 80
Bảng 3.14 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐL 3 ........... 81

.


.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm là yêu cầu không thể thiếu trong đảm
bảo chất lượng kết quả xét nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 15189:2012[28], đồng
thời cũng là tiêu chí đánh giá mức chất lượng phịng xét nghiệm y học theo
quyết định số 2429/QĐ-BYT của Bộ Y Tế[1]. Ngoại kiểm chất lượng xét
nghiệm sẽ giúp cho phòng xét nghiệm phát hiện các vấn đề khơng phù hợp có
thể dẫn đến sai sót hay làm giảm chính xác kết quả xét nghiệm, từ đó giúp cho
các nhà quản lý đề ra các giải pháp can thiệp, xử lý khắc phục kịp thời và từng
bước cải tiến nâng cao chất lượng xét nghiệm. Tham gia ngoại kiểm chất lượng
xét nghiệm, cho thấy thái độ trách nhiệm về các vấn đề chất lượng được các
nhà quản lý đặt lên hàng đầu và lấy chất lượng làm cơ sở để liên thông kết quả
xét nghiệm giữa các phòng xét nghệm với nhau [31]. Ngoại kiểm chất lượng
xét nghiệm còn cung cấp bằng chứng khách quan về độ tin cậy và tính chính
xác kết quả xét nghiệm cho tất cả các khách hàng sử dụng các dịch vụ xét
nghiệm[2]

Chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm sán lá lớn ở gan được
thiết kế nhằm nâng cao chất lượng của xét nghiệm sàng lọc, chẩn đoán bệnh
sán lá lớn ở gan, đồng thời là cở sở để kiểm soát và đánh giá chất lượng của các
phịng xét nghiệm tham gia thơng qua so sánh kết quả liên phòng. Tham gia
ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm sán lá lớn ở gan trở thành nhu cầu thực tế
khơng thể thiếu đối với các phịng xét nghiệm[3]. Tuy nhiên tại Việt Nam cho
tới thời điểm hiện tại chưa có bài báo hay cơng trình nghiên cứu sản xuất bộ
mẫu ngoại kiểm dùng trong chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm
huyết thanh học sán lá lớn ở gan được cơng bố. Vì vậy việc "nghiên cứu quy
trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có kháng thể IgG kháng sán lá lớn ở gan
sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm " là rất cần thiết.

.


.

2

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU
Bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử
dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm, sản xuất tại Trung Tâm Kiểm
Chuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, có
đạt tính đồng nhất, độ ổn định và đáp ứng được các yêu cầu trong ngoại kiểm
chất lượng xét nghiệm hay không?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu cụ thể
1.Dùng kỹ thuật Western blot xác định KT IgG đặc hiệu kháng KN sán
lá lớn ở gan có trong mẫu huyết thanh thu thập để sản xuất bộ mẫu huyết thanh

ngoại kiểm.
2. Đánh giá chất lượng của bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu
kháng KN sán lá lớn ở gan dựa vào tiêu chí đánh giá tính đồng nhất và độ ổn
định.
3. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm bộ mẫu huyết thanh có KT
IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng
xét nghiệm.

.


.

3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về xét nghiệm miễn dịch huyết thanh học
Hiện nay, xét nghiệm miễn dịch huyết thanh học được ứng dụng rất nhiều
trong các cơng trình nghiên cứu, chẩn đoán y khoa với rất nhiều kỹ thuật được
áp dụng như: Western blot, Dot-blot, miễn dịch liên kết hấp thụ men (ELISA),
miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA), miễn dịch vi từ phát quang
(CMIA)[11],[13],[29],[30],[36]…Trong đó kỹ thuật ELISA rất có giá trị trong
tầm sốt các bệnh nhiễm ký sinh trùng[7],[8],[22] và được áp dụng hầu hết
trong các khoa, phòng xét nghiệm cũng như các trung tâm nghiên cứu tại Việt
Nam, kỹ thuật này dựa trên phản ứng kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu.
Kháng nguyên
1.1.1.1. Định nghĩa
Kháng nguyên là một vật lạ đối với cơ thể, mà khi tiếp xúc với hệ miễn
dịch của cơ thể đó sẽ kích thích tạo nên miễn dịch đặc hiệu chống lại kháng
nguyên.[5]

1.1.1.2. Tính đặc hiệu
Đối với sán lá lớn ở gan do kích thước cơ thể lớn, dài từ 3cm – 5cm nên
có rất nhiều thành phần kháng nguyên nằm ở vách cơ thể, đồng thời các enzym,
các chất giống hormone, các độc tố, các chất thải trong quá trình chuyển
hóa[10],[11],[19] đã tạo nên thảm kháng nguyên rất phong phú. Tuy nhiên việc
đa dạng kháng nguyên trong khảm kháng nguyên làm cho các phản ứng huyết
thanh học có độ đặc hiệu không cao và thường xảy ra phản ứng chéo.
Hiện nay với sự phát triển trình độ khoa học kỹ thuật cao, các kháng
nguyên của sán lá lớn được chiết tách và tinh chế tạo ra các kháng nguyên tinh

.


.

4

khiết, đặc hiệu rất có giá trị trong chẩn đoán nhiễm sán lá lớn gan trên người
[11],[19],[26],[36]như băng protein kháng nguyên có trọng lượng 17 kDa (P
17), băng protein có trọng lượng 23 kDa (P 23) và băng protein có trọng lượng
27 - 28 kDa (P 27-28) của Fasciola Hepatica cho phản ứng dương tính với độ
nhạy 95,5%, độ đặc hiệu 100%, giá trị tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán
âm 95,71%.Với băng kháng nguyên P 27-28 tinh chế từ các sản phẩm bài
tiết/dịch tiết của Fasciola gigantica cho phản ứng dương tính với độ nhạy 100%
và độ đặc hiệu 97,6% trong kỹ thuật ELISA. Trong đó các băng kháng nguyên
P 27-28 không cho phản ứng chéo với các ký sinh trùng khác
Tính đặc hiệu của kháng nguyên do các epitope nằm trên bề mặt kháng
nguyên tạo thành. Một kháng nguyên có thể có nhiều loại epitope và như vậy
có thể có nhiều loại miễn dịch đặc hiệu chống lại nó[5].

Hình 1.1 Các epitopes trên kháng ngun .
1.1.1.3. Tính sinh miễn dịch
Tính sinh miễn dịch của một phân tử kháng nguyên mạnh hay yếu phụ
thuộc vào các yếu tố sau:
Trọng lượng phân tử
Trọng lượng phân tử càng lớn, tính sinh miễn dịch càng mạnh. Một phân

.


.

5

tử kháng nguyên muốn sinh được miễn dịch phải có trọng lượng tối thiểu ≥ 10
kDa.
Cấu trúc phân tử
Cấu trúc phân tử càng phức tạp bao nhiêu, tính sinh miễn dịch càng mạnh
bấy nhiêu. Vì vậy, xếp theo tính sinh miễn dịch mạnh đến yếu, ta thấy mạnh
nhất là protein, rồi đến các kháng nguyên có protein như glucoprotein,
lipoprotein, nucleoprotein, sinh miễn dịch kém nhất là polysaccharide.
Về mặt cấu trúc, kháng nguyên có hai phần. Phần đặc hiệu là phần kích
thích sinh kháng thể đặc hiệu và phản ứng với kháng thể đó. Phần này mang
đặc hiệu kháng nguyên. Phần mang tính kháng ngun, phần này có khả năng
kích thích cơ thể đáp ứng mạnh hay yếu còn gọi là phần mang tính kháng
nguyên
Tính lạ đối với cơ thể
Một kháng nguyên muốn sinh miễn dịch đối với cơ thể thì ít nhất kháng
nguyên đó phải mang một epitope lạ đối với cơ thể
 Kháng nguyên cùng cơ thể

 Kháng nguyên đồng chủng
 Kháng nguyên đồng loài
 Kháng nguyên khác loài
 Kháng nguyên không tiếp xúc
Kháng thể
1.1.2.1. Cấu trúc kháng thể
Kháng thể có bản chất hóa học là globulin, còn được gọi là globulin miễn
dịch. Cấu trúc cơ bản của kháng thể gồm 2 chuỗi nặng (H, heavy chain) và 2
chuỗi nhẹ (L, light chain) có trọng lượng phân tử là 50.000Da và 25.000Da, nối

.


.

6

với nhau bằng cầu nối di-sulfur. Kháng thể có hai đầu, Một đầu gọi là Fab kết
hợp được một cách đặc hiệu với một epitope kháng nguyên, một đầu gọi là F c
là thành phần có thể tinh thể hóa được và đóng góp vai trò trong phản ứng
opsonin hóa, cũng như điểm gắn bổ thể.
Đầu gắn kháng nguyên trên ch̃i nặng H và ch̃i nhẹ L lại có hai vùng
khác nhau:
 Vùng có các acid amin ở đây cực kỳ thay đổi, ký hiệu V
 Vùng có các acid amin rất ít thay đổi, ký hiệu là C

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử IgG
1.1.2.2. Các loại kháng thể
Sán lá lớn ở gan là loại ký sinh trùng kém thích nghi với người và thường
tạo ra các kháng thể dịch thể là các globulin miễn dịch loại IgG, IgM, IgA và

IgE thường có hiệu giá kháng thể rất cao trong giai đoạn sán ký sinh trong mô
gan.
Kháng thể IgG
Kháng thể IgG có thời gian bán hủy rất dài đóng vai trò chủ yếu trong
miễn dịch dịch thể rất có giá trị trong các xét nghiệm huyết thanh học sàng lọc
nhiễm ký sinh trùng nói chung và sán lá lớn ở gan nói riêng, trong q trình

.


.

7

nhiễm sán lá lớn ở gan các kháng nguyên tiết (dịch tiết hay sản phẩm bài tiết)
của của ký sinh trùng này đều có những tác động liên quan đến quá trình tạo ra
kháng thể IgG cũng như các phân lớp của IgG[10],[20],[35].
Kháng thể IgG có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, chiếm khoảng
80% tổng lượng globulin miễn dịch trong huyết thanh. Có 4 lớp nhỏ IgG ở
người được đánh dấu theo nồng độ giảm dần của chúng trong huyết thanh:
IgG1, IgG2, IgG3, và IgG4. Đặc trưng cấu trúc để phân biệt lớp nhỏ này với
lớp nhỏ khác là kích thước của vùng bản lề, số lượng cũng như vị trí của các
cầu di-sulfur liên ch̃i nối các ch̃i nặng. Sự khác biệt về acid amin giữa các
lớp nhỏ của IgG đã làm cho hoạt tính sinh học của phân tử có những khác nhau.
IgG1, IgG3 và IgG4 có thể chuyển vận dễ dàng qua nhau thai và đóng vai trò
trong việc bảo vệ thai phát triển. Một số lớp nhỏ IgG có thể hoạt hố bổ thể
mặc dù hiệu quả của chúng khác nhau. Lớp nhỏ IgG3 hoạt hoá bổ thể hiệu quả
nhất, tiếp theo là IgG1 rồi đến IgG2 cịn IgG4 thì khơng có khả năng hoạt hoá
bổ thể. IgG cũng hoạt động như một kháng thể opsonin do chúng có thể gắn
vào thụ thể dành cho Fc có trên bề mặt đại thực bào, nhưng chức năng này cũng

thay đổi tuỳ theo lớp nhỏ: IgG1 và IgG3 có ái lực cao với thụ thể dành cho Fc,
trong khi IgG4 có ái lực yếu hơn và IgG2 có ái lực rất yếu.
1.1.2.3. Kháng thể IgM
IgM là lớp globulin miễn dịch đầu tiên xuất hiện trong đáp ứng lần đầu
với một kháng nguyên, có trọng lượng phân tử lớn khơng qua được nhau thai,
IgM có cấu trúc phân tử gồm 5 phân tử cơ bản nối lại với nhau nhờ chuỗi J.

.


.

8

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử IgM
1.1.2.4. Kháng thể IgA
IgA có hai loại: IgA huyết thanh, có 2 lớp dưới IgAα1và IgAα2 và IgA
tiết là kháng thể chịu trách nhiệm chính trong miễn dịch chống lại vi khuẩn
xâm nhập vào cơ thể qua đường niêm mạc. Cấu trúc phân tử IgA tiết gồm hai
phân tử cơ bản kết nối với nhau nhờ chuỗi J và được bảo vệ khỏi sự phân hủy
của pH acid và các men thủy giải của dịch tiết nhờ một cấu trúc có tên là thành
phần tiết.

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử IgA
1.1.2.5. Kháng thể IgE
IgE có ái lực cao với tế bào mast thơng qua một thụ thể với thành phần
Fc của kháng thể, IgE có trách nhiệm trong miễn dịch chống ký sinh trùng cũng
như trong phản ứng quá mẫn.

.

.

9

Xét nghiệm ELISA
Kỹ thuật miễn dịch hấp thụ liên kết men (ELISA) được phát triển độc
lập và đồng thời bởi nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall tại Đại
học Stockholm ở Thụy Điển và nhóm nghiên cứu của Anton Schuurs và Bauke
van Weemen ở Hà Lan từ năm 1970. Kỹ thuật này phát triển dựa trên nền tảng
kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay – RIA) do Solomon Berson
và Rosalyn Yalow mô tả vào năm 1960 [32]. Ngày nay, kỹ thuật ELISA được
sử dụng trong rất nhiều trong các cơng trình nghiên cứu khoa học, chẩn đoán
bệnh nhiễm ký trùng đăc biệt đươc ứng dụng nhiều trong xét nghiệm huyết
thanh học chẩn đoán nhiễm sán lá lớn ở gan [18],[26],[30],[32],[38],[40].
1.1.3.1. Nguyên lí cơ bản
Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỡi một kháng ngun
(antigen) có nhiều yếu tố kháng ngun (epitope), mỡi một epitope có khả năng
kết hợp với một kháng thể (antibody) tương ứng với nó. Hầu hết các kháng
nguyên đều có một hoặc nhiều epitope đặc trưng cho nó, dựa trên đó mà người
ta có thể xác định được kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của kháng
nguyên trong cơ thể, sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đặc hiệu để chống lại
kháng ngun đó. Thơng qua việc xác định kháng thể này người ta cũng có thể
gián tiếp xác định kháng nguyên trong cơ thể.
Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm xác định sự hiện
diện của kháng nguyên hay kháng thể có trong huyết thanh. Để xác định một
yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên hay kháng thể) người ta sử dụng một hoặc
nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể, kháng nguyên, bổ thể) có phản ứng miễn
dịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Yếu tố phát hiện liên kết với phức hợp

men, phức hợp men sẽ phân giải cơ chất thích hợp trong phản úng KN-KT tạo
sự thay đổi màu sắc của cơ chất, qua sự đổi màu của cơ chất chứng tỏ đã xảy

.


.

10

ra phản ứng đặc hiệu KN-KT.
1.1.3.2. Các biến thể của ELISA
Hiện nay, kỹ thuật này không ngừng được phát triển và cải tiến nhằm
nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu cũng như rút ngắn thời gian thực hiện. Qua
đó, có nhiều biến thể của kỹ thuật ELISA được xây dựng và phát triển như:
 ELISA trực tiếp (Direct ELISA)
 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
 ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA)
 ELISA kẹp chả (Sandwich ELISA)
Xét nghiệm Western blot
Xét nghiệm Western blot được áp dụng từ năm 1981, đây là kỹ thuật xét
nghiệm định tính chẩn đoán xác định kháng thể IgG có trong huyết thanh đặc
hiệu với các băng protein kháng nguyên. Kỹ thuật Western blot được sử dụng
nhiều trong các xét nghiệm chẩn đoán xác định các tác nhân gây bệnh trong y
học. Trong chẩn đoán bệnh sán lá lớn ở gan, kỹ thuật này được ứng dụng rất
nhiều để phát hiện KN đặc hiệu trên từng loài sán lá lớn Fasciola hepatica,
Fasciola gigantica. Kỹ thuật này giúp hạn chế tối đa những sai sót thường xảy
ra trong các xét nghiệm huyết thanh học sàng lọc nhiễm ký trùng do phản ứng
chéo giữa các loại ký sinh trùng với nhau.
1.1.4.1. Ứng dụng xét nghiệm Western blot trong chẩn đoán sán lá lớn ở

gan
Hiện nay kỹ thuật Western blot được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực phân
tích phát hiện các băng protein kháng nguyên đặc hiệu của sán lá lớn ở gan
[11],[12],[13],[16],[21],[25],[26],[29],[40] qua đó có thể ly trích, phân tích các
kháng nguyên này để tổng hợp các kháng nguyên tương ứng để sản xuất các bộ

.


.

11

thuốc thử có độ đăc hiệu và chính xác cao, qua đó làm tăng hiệu quả trong cơng
tác khám chữa bệnh và quản lý vùng lưu hành bệnh tốt hơn.
1.2. Đại cương về Sán lá lớn ở gan Fasciola hepatica và Fasciola gigantica
Bệnh sán lá lớn ở gan trên người thường do hai loài Fasciola hepatica
và Fasciola gigantica gây ra, trong đó Fasciola gigantica là tác nhân chính
gây bệnh tại Việt Nam, khu vực miền Trung và Tây Nguyên nước ta là
những vùng miền có tỷ lệ nhiễm sán lá lớn ở gan cao [4], [22],[39], do có khi
hậu nhiệt đới gió mùa là điều kiện phát triển thuận lợi cho các vật chủ trung
gian của sán lá lớn (như các thực vật thuỷ sinh và các loài ốc thuộc họ
Lymnae sp), cùng với việc phát triển số lượng đàn gia súc (trâu, bò) chăn thả
ngày một tăng. Cùng thói quen ăn sống các loại rau thủy sinh ô nhiễm mầm
bệnh, đặc biệt là các ấu trùng giai đoạn nhiễm Metacercarie của sán lá lớn
Fasciola gigantica và Fasciola hepatica dính trên các loại rau thủy sinh và
nguồn nước không an toàn đã làm gia tăng số lượng người nhiễm bệnh ngày
cao.

Hình 1.5 Tỷ lệ nhiễm SLLOG theo vùng tại Việt Nam

.


.

12

Hình thể
1.2.1.1. Sán trưởng thành
Fasciola gigantica dài khoảng 5 cm, Fasciola hepatica dài khoảng 3cm,
sán lá có thân dày hình như một chiếc lá, có thể hình nón ở đầu. Phần thân trước
rộng hơn phần thân sau. Sán có đĩa hút bụng và đĩa hút miệng. Thực quản tương
đối ngắn. Ruột dài đến tận phần cuối thân, phân nhiều nhánh nhỏ. Cơ quan sinh
dục đực có tinh hoàn phân nhánh, ở phần thân sau thân sán. Lỗ sinh dục ở phần
phía trước đĩa hút bụng.

Hình 1.6 Sán lá lớn ở gan
Chu trình phát triển
Sán lá lớn trưởng thành sống trong ống dẫn mật của người, trâu, bò, cừu.
Tại đây sán đẻ trứng, trứng theo đường dẫn mật xuống ruột và theo phân bài
tiết ra ngoài.
Khi được rơi xuống nước trứng tăng trưởng đủ độ sau 9-15 ngày, trứng
sán nở ra ấu trùng lơng (miracidium), nhiệt độ thích hợp để trứng phát triển
thành ấu trùng lông là 15-250 C. Ấu trùng lông tìm đến và ký sinh ở ốc thuộc
họ Lymnae sp. để phát triển thành ấu trùng đuôi (cercaria) ở nhiệt độ thích hợp
là 20-250 C trong thời gian 6-7 tuần. Sau đó, ấu trùng đi rời ốc, bám vào thực

.

.

13

vật thủy sinh hoặc bơi trong nước để phát triển thành nang trùng
(metacercaria).
Người ăn sống các thực vật thủy sinh hoặc uống nước khơng đun sơi có
chứa nang trùng sẽ bị nhiễm sán. Sau khi ăn vào, nang trùng sẽ thoát kén và
xuyên qua thành ruột, sau 2 giờ xuất hiện trong ổ bụng, chúng tiếp tục xuyên
qua bao gan để ký sinh ở gan. Tại gan, sán ăn tổ chức gan và máu, sau đó di
chuyển đến ống mật tại đó chúng có thể phát triển thành con trưởng thành với
thời gian khoảng 12 tuần[10].

Hình 1.7 Chu trình phát triển của sán lá lớn
1.3. Hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm
Là hệ thống để định hướng và kiểm sốt một tổ chức về mặt chất lượng,
nó bao gồm một ch̃i các q trình liên tục theo một tiêu chuẩn chất mong
muốn đạt được. Một hệ thống chất lượng thường bao gồm 12 thành tố cơ bản
nó bao phủ tồn bộ mọi hoạt động diễn ra trong q trình xét nghiệm [15].

.


.

14

Hình 1.8 Hệ thống quản lý chất lượng
Mọi hoạt hoạt động diễn ra đều có liên quan lẫn nhau hoặc tương tác để

biến đổi đầu vào thành đầu ra, tạo thành các quá trình xét nghiệm và đồng
thời diễn ra theo một luồng công việc nhất định nhằm đem lại hiệu quả hoạt
động cao nhất và luôn đảm bảo hiệu suất công việc cao cũng như chất lượng
xét nghiệm đạt mức tốt nhất và đồng thời hạn chế tối đa những sai sót có thể
xảy ra, luồng cơng việc trong khoa xét nghiệm thường bao gồm:

 Trước xét nghiệm (preexamination processes)
Bao gồm các bước bắt đầu từ yêu cầu của bác sĩ lâm sàng bao gồm xét

.


.

15

nghiệm chỉ định, chuẩn bị cho bệnh nhân, lấy mẫu bệnh phẩm, vận chuyển mẫu
đến phòng xét nghiệm và kết thúc khi quy trình xét nghiệm bắt đầu thực hiện.
 Trong xét nghiệm (Examination processes)
Là các hoạt động hoặc các bước để thực hiện các xét nghiệm, phân tích
xét nghiệm.
 Sau xét nghiệm (Postexamination processes)
Là giai đoạn sau phân tích, bao gồm xem xét, diễn giải, thẩm quyền ký
trả kết quả, báo cáo, trả kết quả và lưu giữ mẫu xét nghiệm.
1.4. Chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm
Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng (External Quality Assessment
schemes - EQAS) là một chương trình đánh giá chất lượng phòng xét nghiệm
một cách khách quan, thông qua việc so sánh kết quả liên phòng xét nghiệm.
Các chương trình ngoại kiểm thường được triển khai bởi các trung tâm kiểm
chuẩn chất lượng xét ngiệm y học với mục đích đánh giá và giám sát liên tục

chất lượng các phòng xét nghiệm tham gia, thơng qua đó xác định những yếu
tố nguy cơ tiềm ẩn có thể ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm và đưa ra giải
pháp phòng ngừa, cải tiến kịp thời từng bước cải thiện và nâng cao chất lượng
xét nghiệm.
Chương trình ngoại kiểm trên thế giới
Trên thế giới, công tác giám sát và đánh giá chất lượng xét nghiệm được
triển khai áp dụng từ rất sớm từ năm 1993, các chương trình ngoại kiểm huyết
học, hoá sinh, vi sinh, miễn dịch, đã được lên kế hoạch triển khai một cách hài
hoà giữa các nước trong khối cộng đồng Châu Âu như Áo, Bỉ, Đan Mạch, Phần
Lan, Pháp, Đức, Hà Lan, Vương quốc Anh[31],[37],[41].
Năm 1996 các chương trình đánh giá thử nghiệm thành thạo độ cấp quốc

.


.

16

gia (National Proficiency Testing Scheme - NPTS) bao gồm huyết học, hóa học
lâm sàng, miễn dịch lâm sàng, vi sinh học lâm sàng và ngân hàng máu được
triển khai tại Thái Lan.
Tuy nhiên, việc thực hiện ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyết
thanh học ký sinh trùng lại triển khai có phần muộn hơn so với các chương trình
ngoại kiểm khác [23],[31],[43], tại Vương Quốc Anh từ năm 2001-2003 thực
hiện thử nghiệm chương trình ngoại kiểm huyết thanh học ký sinh trùng với ba
bộ huyết thanh mẫu ngoại kiểm, tới năm 2005 mới triển khai chương trình chính
thức với năm bộ huyết thanh mẫu ngoại kiểm cùng với 32 phòng xét nghiệm
tham gia từ các quốc gia như Anh, Ý, Đức, Hà Lan, Đan Mạch,…Tại Trung
Quốc chương trình ngoại kiểm huyết thanh học đánh giá chất lượng xét nghiệm

sàng lọc Toxoplasma bằng kỹ thuật ELISA triển khai từ 2003 đến 2014 nhằm
đánh giá các vấn đề liên quan đến độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật sàng
lọc nhiễm Toxoplasma mà có những cải tiến, khắc phục để nâng cao chất lượng
xét nghiệm của các phòng xét nghiệm.
Chương trình ngoại kiểm trong nước
Tại Việt Nam các chương trình ngoại kiểm đã được triển khai bao phủ
khắp cả nước, tuy nhiên các phòng xét nghiệm tham gia vẫn chưa thực hiện đầy
đủ tất cả các chương trình ngoại kiểm so với các xét nghiệm thực tế được thực
hiện tại phịng xét nghiệm, theo tiêu chí đánh giá mức chất lượng phịng xét
nghiệm y học thì tất cả các xét nghiệm triển khai tại phòng xét nghiệm đều phải
thực hiện ngoại kiểm và nội kiểm. Đây cũng là mục tiêu cần tiến đến của các
trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học, nhằm kiểm soát, hổ trợ và
đánh giá chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm một cách toàn diện
và liên tục.
Hiện nay các chương trình ngoại kiểm do Trung tâm kiểm chuẩn xét

.


.

17

nghiệm y học Đại học y dược TP. Hồ Chí Minh triển khai bao gồm hầu như tất
cả các lĩnh vực của xét nghiệm như huyết học, sinh hoá, miễn dịch đông máu,
vi sinh, ký sinh và các xét nghiệm chuyên sâu PCR -HCV, PCR-HPV…Số
lượng các chương trình ngoại kiểm được triển khai ngày càng tăng về chiều
rộng lẫn chiều sâu, từ 02 chương trình ngoại kiểm sinh hoá, miễn dịch được
triển khai từ năm 2012 với khoãng 86 đơn vị phòng xét nghiệm tham gia [2],[3]
đến giữa tháng 07 năm 2017 đã có hơn 20 chương trình ngoại kiểm được triển

khai với hơn 287 đơn vị tham gia. (Hội nghị báo cáo tổng kết thường niên tháng
07/2017 của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học Đại học y
dược TP. Hồ Chí Minh).
Các phương thức ngoại kiểm
Có 3 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất lượng: Thử
nghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT), kiểm tra lại/phân tích lại
(Rechecking/Retesting) và đánh giá tại chỡ (on – site evaluation).

Ngoại kiểm
EQA
Thử nghiệm
thành thạo

Kiểm tra lại /
phân tích lại

Đánh giá tại
chỗ

 Thử nghiệm thành thạo
Đơn vị triển khai ngoại kiểm sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm cho
các phòng xét nghiệm tham gia. Các phịng xét nghiệm phân tích mẫu
ngoại kiểm và gửi kết quả về đơn vị triển khai để phân tích thống kế,

.