Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn quốc gia cúc phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
……………………

Đào Thị Lương

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ PHÂN LOẠI CỦA NẤM MEN
SINH BÀO TỬ BẮN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY
Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62.42.40.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Cơng trình được hồn thành tại:
- Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà
Nhật
–JCM, RIKEN, Nhật Bản.
NộiBản
- 2008


- Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:
1.

GS.TS. Phạm Văn Ty

2.

GS.TS. Nguyễn Lân Dũng

Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Đình Quyến
Phản biện 2: PGS. TS. Lê Gia Hy
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Xuân Thành

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng cấp Nhà nước chấm luận án tiến
sĩ họp tại Phòng 418, nhà T1, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Vào hồi 9 giờ 00 ngày 24 tháng 5 năm 2008

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin- Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội.


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

iii

Danh mục các bảng

iv

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

vi

Mục lục

viii
1

MỞ ĐẦU

3

Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật

3

1.1.1. Đa dạng sinh học

3

1.1.2. Đa dạng vi sinh vật

4

1.1.3. Nghiên cứu đa dạng nấm men và nấm men sinh bào tử bắn

5

1.1.3. 1. Nghiên cứu nấm men ở Thái Lan

6

1.1.3.2. Nghiên cứu nấm men Indonesia

7

1.1.3.3. Nấm men trong rừng ở Đài Loan

8

1.1.3.4. Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Trung Quốc

8

1.1.3.5. Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Nhật Bản

8

1.1.3.6. Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở một số nước khác

9

1.1.3.7. Nghiên cứu nấm men ở Việt Nam

9
10

1.2. Đại cương về nấm men
1.2.1. Định nghĩa về nấm men

10

1.2.2. Hình thái và cấu trúc của nấm men

10

1.2.2.1. Hình thái tế bào nấm men

10

1.2.2.2. Cấu trúc tế bào

12

1.2.3. Phương thức sinh sản ở nấm men

15

1.2.3.1. Sinh sản vơ tính

15

1.2.3.2. Sinh sản hữu tính

18
22

1.2.4. Phân loại nấm men
1.2.4.1. Các nấm men túi

22

1.2.4.2. Các nấm men đảm

23
ix


1.3. ứng dụng của nấm men trong đời sống

24

1.3.1. Nấm men trong lên men etylic

24

1.3.2. Các nấm men là các nhà sản xuất protein đơn bào

25

1.3.3. Các nấm men như nguồn sản xuất các sản phẩm công nghiệp

25

khác
1.3.4. Nấm men dùng làm tác nhân probiotic và các liệu pháp sinh

27

học trị liệu
1.3.5. Sử dụng nấm men để hạn chế bệnh sau thu hoạch ở trái cây và

27

ngũ
1.3.6. Nấm men là các tác nhân phục hồi sinh học

27

1.3.7. Cải biến nấm men bằng đột biến, lai thể nguyên sinh và kĩ

28

thuật ADN tái tổ hợp
1.3.8. Dùng nấm men làm sinh vật biểu hiện ADN tái tổ hợp
1.4. Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men
1.4.1. Các nghiên cứu được dùng trong phân loại nấm men

28
29
29

1.4.1.1. Các đặc điểm hình thái và ni cấy

29

1.4.1.2. Các đặc điểm sinh lý sinh hoá

29

1.4.1.3. Các đặc điểm hoá phân loại và sinh học phân tử

30
30

1.4.2. Các bước định danh
1.4.2.1. Phương pháp phân loại thông thường

31

1.4.2.2. Phương pháp sử dụng số liệu về trình tự ADNr

31

1.4.3. Các chỉ tiêu dùng trong phân loại hiện đại

32

1.4.3.1. Hoá phân loại

32

1.4.3.2. Sinh học phân tử

33

1.5. Nấm men sinh bào tử bắn

39

1.5.1. Đặc điểm nấm men sinh bào tử bắn

39

1.5.2. Lịch sử nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn

40

1.5.3. Vị trí nấm men sinh bào tử bắn trong cây phả hệ

42

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

48
48

2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu thu thập

48

2.1.2. Vi sinh vật

48
x


2.1.2.1. Các vi sinh vật kiểm định

48

2.1.2.2. Các chủng nấm men chuẩn dùng trong lai ADN genom

48

2.1.3. Thiết bị và máy móc

48

2.1.4. Các loại mơi trường

49

2.1.4.1. Mơi trường phân lập và nuôi nấm men sinh bào tử bắn

49

2.1.4.2. Môi trường phân loại

49

2.1.4.3. Môi trường nuôi vi sinh vật kiểm định

51

2.1.4.4. Mơi trường xác định hoạt tính enzym

51

2.1.4.5. Mơi trường cho sinh tổng hợp enzym

51
51

2.2. Phương pháp
2.2.1. Phương pháp phân lập

51

2.2.2. Phương pháp phân loại nấm men

52

2.2.2.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái

52

2.2.2.2. Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá

52

2.2.2.3. Hoá phân loại

55

2.2.2.4. Phân loại dựa vào sinh học phân tử

59

2.2.3. Xác định hoạt tính enzym

65

2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh

65

2.2.5. Xác định sinh khối

65

2.2.6. Xác định pH

66

2.2.7. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho q trình

66

sinh tổng hợp enzym của dịch ni nấm men

2.2.7.1. Lựa chọn mơi trường thích hợp

66

2.2.7.2. Lựa chọn pH ni cấy thích hợp

66

2.2.7.3. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp

66

2.2.7.4. Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp

66
67

Chương 3. Kết quả và thảo luận

67

3.1. Phân lập nấm men
3.1.1. Địa điểm thu thập mẫu

67

3.1.2. Phân lập

67

3.2. Phân loại nấm men sinh bào tử bắn

69
69

3.2.1. Phân loại đến chi
3.2.1.1. Hệ thống ubiquinon chủ yếu
xi

69


3.2.1.2. Xác định xyloza trong tế bào

70

3.2.1.3. Phân loại đến cấp độ chi

70

3.2.2. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

72

chi Bullera
3.2.2.1. Xác định và phân tích trình tự ADNr 18S

72

3.2.2.2. Xác định và phân tích trình tự ADNr ITS

74

3.2.2.3. Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2

76

3.2.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men

84

sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera
3.2.2.5. Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Bullera đến lồi

90

3.2.2.6. Mơ tả lồi mới

96

3.2.3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

97

chi Kockovaella
3.2.3.1. Xác định và phân tích trình tự ADNr 18S

97

3.2.3.2. Xác định và phân tích trình tự ADNr các vùng ITS

98

3.2.3.3. Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2

100

3.2.3.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men sinh

102

bào tử bắn thuộc chi Kockovaella.
3.2.3.5. Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Kockovaella đến

105

lồi
3.2.3.6. Mơ tả lồi mới

106

3.3. Sự đa dạng của nấm men sinh bào tử bắn ở Vườn quốc gia Cúc
107

Phương
3.4. Hoạt tính sinh học của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc
chi Bullera

115

3.4.1. Khả năng sinh enzym ngoại bào

115

3.4.2. Khả năng đối kháng với các vi sinh vật khiểm định của các

116

chủng nấm men
3.4.3. Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp enzym ngoại

117

bào
3.4.3.1. Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp

117

3.4.3.2. Lựa chọn pH ni cấy thích hợp

118

3.4.3.3. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp

119

xii


3.4.3.4. Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp

119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

121

DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN

123

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

125

PHẦN PHỤ LỤC

137

Phụ lục 1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử của các chủng

137

nấm men phân lập
Phơ lơc 2. HƯ thèng ubiquinon của các chủng nấm 148
men nghiên cứu
Ph lc 3. Mơ tả các lồi mới của chi Bullera

151

Phơ lơc 4. Mô tả các loài mới của chi

189

Kockovaella
Ph lc 5. Mt số hình ảnh minh họa

xiii

201


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Nấm men sinh bào tử bắn là một nhóm nấm men lớn, tồn tại
trong tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lượng loài chiếm hơn
1/10 tổng số loài nấm men đã biết (khoảng 80 lồi). Đây là nhóm vi
sinh vật rất phong phú, hiện hữu trong thiên nhiên nhưng từ trước đến
nay ít được biết đến. Là nhóm nấm men có tiềm năng sinh hàng loạt
enzym nên cần phải được nghiên cứu để phát hiện các enzym có tính
năng mới. Đây là miền đất trống, nếu nghiên cứu sẽ có khả năng phát
hiện nhiều lồi mới cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục loài
của thế giới.
Việt Nam nằm trong khu vực có khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện
thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển. Việt Nam được đánh giá là
một trong các quốc gia có đa dạng sinh học phong phú. Ở Việt Nam,
sự nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, để góp phần
vào cơng cuộc tìm kiếm các nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm
cách ứng dụng và lưu giữ chúng cho các thế hệ sau, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm
men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc
Phương”.
Mục đích của đề tài
- Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- một nhóm vi sinh vật
phong phú cư trú trên nhiều loại lá cây mà từ trước đến nay chưa hề
biết đến ở Việt Nam- khởi nguồn cho một nhánh nghiên cứu mới về
đa dạng sinh học.


- Tìm kiếm và phát hiện các lồi mới cho khoa học, bổ sung vào
danh mục loài của thế giới.
- Bước đầu tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học
(các loại enzym ngoại bào) của nhóm nấm men này.
Những đóng góp mới của luận án:
- Là cơng trình nghiên cứu đầu tiên về đa dạng sinh học của nấm men
sinh bào tử bắn ở Việt Nam.
- Đã phát hiện được 16 lồi mới được quốc tế cơng nhận: 12 loài
thuộc chi Bullera và 4 loài thuộc chi Kockovaella. Đưa địa danh Việt
Nam vào danh mục loài của thế giới.
- Cơng trình đầu tiên tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh
học của nhóm nấm men này.
Bố cục luận án:
Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tượng và phương
pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và kiến nghị, danh mục
công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục. Luận án có 25 bảng, 46 hình, 108
tài liệu tham khảo.
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật

1.2. Đại cương về nấm men
1.3. Ứng dụng của nấm men trong đời sống
1.4. Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men
1.5.

Nấm men sinh bào tử bắn


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn được phân
lập theo phương pháp của Nakase và Takashima (1993).
2. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố: Chủ yếu theo mơ tả của
Yarrow (1998). Khả năng đồng hố nitơ được xác định theo phương
pháp của Nakase và Suzuki(1986). Vitamin đòi hỏi bắt buộc được xác
định theo Komagata và Nakase (1967).
3. Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh
sạch và xác định ubiquinon theo phương pháp của Nakase và Suzuki
(1986). Xyloza trong tế bào được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng hoặc
sắc ký lỏng cao áp theo Nakase và cộng sự (1976).
4. Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trình tự của ADNr
18S, ITS bao gồm 5,8S và D1/D2 của 26S được xác định theo
Takashima và Nakase (1999), Kurtzman và Robnnet (1997). Sử dụng
chương trình computer CLUSTAL X ver 1.83 của Thompson và cộng
sự (1994). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát
sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và Gen Bank.
Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương
pháp của Saitou và Nei (1987).
5. Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN thực hiện theo
phương pháp của Takashima và Nakase (2000). Các thí nghiệm lai
ADN-ADN genom được thực hiện theo phương pháp huỳnh quang của

Ezaki và cộng sự (1989).


6. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh
bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Xác định sinh khối bằng
phương pháp cân trọng lượng khô (Nguyễn Lân Dũng và đtg, 1972).
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP NẤM MEN
Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, sử
dụng phương pháp phân lập nấm men sinh bào tử bắn của Nakase và
Takashima, đã phân lập được 151 chủng nấm men trong đó có 121
chủng nấm men sinh bào tử bắn. Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử,
hình thái màu sắc khuẩn lạc, các chủng này được ghép thành 85 nhóm,
trong đó mỗi nhóm chọn một chủng làm đại diện cho các nghiên cứu
tiếp theo.
3.2. PHÂN LOẠI NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN
3.2.1. Phân loại đến chi
Dựa trên các tiêu chí phân loại nấm men sinh bào tử bắn bao
gồm: hình thái bào tử bắn, sự tạo thành bào tử đính có cuống, sự tồn
tại của xyloza và ubiquinon chủ yếu, 85 chủng nghiên cứu đã được
xếp vào 3 lớp: Hymenomycetes, Urediniomycetes và
Ustilaginomycetes. Lớp Hymenomycetes bao gồm 2 chi là Bullera và
Kockovaella. Lớp Urediniomycetes gồm 2 chi là Bannoa và
Sprobolomyces. Lớp Ustilaginomycetes gồm một chi Tilletiopsis
(Bảng 3.2).
Có 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được đặc trưng bởi
khuẩn lạc màu trắng đến hơi vàng, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối
xứng và bằng bào tử nảy chồi, chứa xyloza trong tế bào và ubiquinon
chủ yếu là Q-10. Có 5 chủng có các đặc điểm: chứa xyloza trong tế
bào, Q-10 là ubiquinon chủ yếu, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối

xứng, bào tử đính có cuống và tế bào nảy chồi. Đây là các đặc điểm đặc
trưng cho chi Kockovaella. Có 34 chủng nấm men được đặc trưng bởi
khuẩn lạc có màu hồng, cam đến đỏ, sinh sản bằng bào tử bắn dạng
không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có ubiquinon chủ
yếu là Q-10 những chủng này thuộc chi Sporobolomyces. Có 5 chủng
nấm men được đặc trưng bởi khuẩn lạc có màu hồng, cam, sinh sản bằng
bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có
ubiquinon chủ yếu là Q-10(H2). Những chủng này thuộc chi Bannoa.
Có 2 chủng nấm men được đặc trưng bởi sinh sản bằng bào tử bắn
dạng dài và cong lưỡi liềm, không đối xứng, không chứa xyloza trong
tế bào và có ubiquinon chủ yếu là Q-10. Những chủng này thuộc chi
Tilletiopsis.
Bảng 3.2. Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi
dựa trên các đặc điểm hố phân loại và hình thái
Hình
Số Xyloza Ubiquinon dạng
lượng trong
chủ yếu bào tử
chủng tế bào
bắn
39

+

5

+

34

-

5

-

2

-

Q-10

Đối
xứng
Q-10
Đối
xứng
Khơng
Q-10
đối
xứng
Khơng
Q-10 (H2)
đối
xứng
dài,
Q-10
cong

lưỡi
liềm

Bào
tử
đính
có
cuống

Chi

-

Bullera

+

Kockovaella

-

Sporobolomyces

Lớp

Hymenomycetes

Urediniomycetes
-

Bannoa

-

Tilletiopsis

Ustilaginomycetes

3.2.2. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn
thuộc chi Bullera


Để xác định vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập,
thuộc chi Bullera, chúng tôi tiến hành đọc trình tự ADNr của 18S, các
vùng ITS, đoạn D1/D2 của 26S và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý,
sinh hố của chúng. Một số nhóm chưa xác định rõ vị trí phân loại sẽ
được tiến hành lai ADN genom .
Trình tự của các đoạn ADNr 18S , ITS và 26S (đoạn D1/D2)
của các chủng nấm men được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự
động ABI 3100 Avant của hãng Applied Biosystems (Mỹ). Trình tự
nucleotit của các chủng nấm men được so sánh với các trình tự đã có
trong GenBank sử dụng giao diện tìm kiếm “nucleotide-nucleotide
BLAST” của Trung tâm Tin- Công nghệ sinh học Quốc gia (National
Center
for
Biotechnology
().

Information),

Bethesda

Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 18S (450 bp) của
các chủng nghiên cứu so sánh với 38 loài thuộc các chi Bullera,
Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella,
Trimorphomyces và
Udeniomyces.
Kết quả hình 3.3 cho thấy: 39 chủng nấm men mới phân lập thuộc chi
Bullera gộp thành 5 nhóm nằm rải rác trong các dòng Bulleromyces và
Cryptococcus luteolus (hay Luteolus) của lớp Hymenomycetes. Nhóm
A có số lượng lớn nhất gồm 27 chủng có quan hệ họ hàng gần với các
lồi thuộc nhánh Bullera huiaensis và B. mrakii của dịng (lineage)
Cryptococcus luteolus. Nhóm này phân lập được ở 15/20 mẫu lá, chứng
tỏ chúng rất phổ biến ở Vườn quốc gia Cúc Phương. Nhóm B gồm 1
chủng cùng nhánh với Cryptococcus podzolicus (không sinh bào tử bắn).
Nhóm C gồm 4 chủng nằm ở vị trí gần với B. coprosmaensis, B. sinensis
và C. luteolus. Nhóm D gồm 4 chủng có quan hệ họ hàng gần với nhóm
B. variabilis. Nhóm E gồm 2 chủng hợp thành nhóm với các lồi B.


pseudoalba, B. unica, C. cellulolyticus và C. laurentii của dòng
Bulleromyces.
Để xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh
bào tử bắn đến lồi, chúng tơi tiến hành nghiên cứu kết hợp giữa các đặc
điểm hình thái, sinh lý, sinh hố và so sánh các trình tự ADNr ITS và
26S (D1/D2).
Berbee và đtg (1995); Fell và đtg (2000); James và đtg (1996) đã sử
dụng trình tự vùng ITS như một thước đo phân loại hữu ích nhờ vùng
này có tỷ lệ sai khác cao hơn hẳn so với các vùng ADNr 18S và 26S..
Fell và đtg (2000); Sugita và đtg (1999) cũng đã chứng minh rằng tỷ lệ

nucleotit trong vùng ITS ở cùng một loài thường khác nhau nhỏ hơn 1%.


VY-143
VY-85
VY-23
50 VY-5
VY-69
VY-50
Bullera pseudohuiaensis (AF314994)
Bullera mrakii (AF314993)
54
VY-3
52 VY-116
VY-51
VY-20
VY-144
VY-42
68
VY-21
VY-75
Nhóm A
VY-91
54
VY-102
Bullera waltii (AB022929)
52
Bullera boninensis (AB022928)
Bullera huiaensis (D78331)
56

VY-103
VY-65
VY-142
54
VY-55
Bullera anomala (AF453291)
VY-86
91
VY-140
61 VY-60
VY-57
83
VY-145
VY-105
76
VY-45
Bullera pseudoschimicola (AF314997)
72
Bullera komagatae (AF314995)
79
VY-139
72
Bullera schimicola (AB022930)
77
Dioszegia hungarica (AB032638)
Dioszegia changbaiensis (AY242817)
93
crocea (D31648)
73 Dioszegia
Dioszegia aurantiaca (AB049615)

65
71
Bullera melastomae (AB118872)
Bullera formosana (AB118873)
86
VY112 (AB261011)
Nhóm B
Cryptococcus podzolicus (AB032645)
VY-104
89
96 88 VY-48
Bullera coprosmaensis
58 90 Bullera derxii (D78329)
VY-77
Bullera sinensis (D78328)
Nhóm C
85
VY-132
50
91 Bullera kunmingensis (AF325169)
Cryptococcus luteolus (AB032641)
100 Bullera oryzae (D31652)
99
Bullera setariae (AB118875)
VY 2
100 100 VY-128
Bullera pseudovariabilis (AF453290)
Bullera variabilis (D31654)
100
89

100 Bullera panici (AY188386)
Bullera begoniae (AB118874)
100 Bullera siamensis (AY188389)
100 VY-118
VY-63
54
100 Bullera penniseticola
58
Bullera hannae
78 VY-120
Bullera alba
56
Bullera unica
Cryptococcus laurentii (AB032640)
58
51
55 62 Bullera pseudoalba (D31660)
VY-68 (AB110694)
Kockovaella thailandica
63
Trimorphomyces_papilionaceus (AB085808)
Udeniomyces puniceus (D31658)
54
61

0.02

Nhóm D

Nhóm E

Hình 3.3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn
thuộc chi Bullera với các lồi có quan hệ họ hàng gần dựa vào
trình tự ADNr 18S
Cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được xác định trình tự
ADNr các vùng ITS (480- 580 bp). Cây phả hệ được xây dựng dựa


trên trình tự ADNr các vùng ITS của các chủng nghiên cứu so sánh
với 38 loài thuộc các chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces,
Calathella, Cryptococcus, Dioszegia. Trên cây phả hệ, 39 chủng nấm
men nghiên cứu cũng nằm rải rác trong 5 nhóm như ở cây phả hệ của
ADNr 18S

ở các dòng Bulleromyces và C. luteolus

của lớp

Hymenomycetes.
Hiện nay, ngày càng có nhiều dữ liệu về đoạn D1/D2 của ADNr
26S của nấm men đã được gửi vào GenBank và càng có nhiều người
sử dụng các số liệu này trong phân loại nấm men. Fell và đtg (2000);
Kurtzman và Robnett (1997, 1998); Sugita và Nishikawa (2003)
chứng minh rằng các chủng nấm men có tỷ lệ nucleotit khác nhau lớn
hơn 1% sẽ thuộc các loài khác nhau.
Tất cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được xác định trình tự
ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp). Cây phả hệ được xây dựng dựa trên
trình tự của 39 chủng nghiên cứu so sánh với 36 loài thuộc các chi
Auriculibuller, Bullera, Bulleribasidium, Cryptococcus, Dioszegia,
Kockovaella, Tremella, Trichosporon. Trên cây phả hệ dựa vào ADNr

26S đoạn D1/D2, 39 chủng nấm men nghiên cứu thuộc chi Bullera
cũng nằm xen kẽ trong 5 nhóm ở các dịng Bulleromyces và
Cryptococcus luteolus của lớp Hymenomycetes tương tự như ở cây
phả hệ của 18S và ITS.
Sự sai khác về trình tự ADNr vùng ITS và D1/D2 của các chủng
nấm men nghiên cứu với các lồi có quan hệ họ hàng gần được so
sánh.
Nhóm A: gồm 27 chủng được chia thành 7 nhóm nhỏ
Nhóm nhỏ A1: có 5 chủng VY-3, VT-20, VY-85, VY-91 và VY102 được xếp vào cùng một lồi vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ


ADNr rất nhỏ 0-1,1 % ở vùng ITS và 0-0,3% ở 26S (D1/D2), ngoài ra
các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tương tự nhau. Năm
chủng này sai khác với B. mrakii 0,3-1% trong vùng ITS và 0,5-0,8% ở
26S (D1/D2), các đặc điểm sinh lý sinh hoá cũng giống nhiều nhất với
B. mrakii. Các chủng VY-3, VT-20, VY-85, VY-91 và VY-102 thuộc
lồi Bullera mrakii.
Nhóm nhỏ A2: gồm 5 chủng VY-42, VY-51, VY-75, VY-116 và VY143. Sự sai khác giữa các chủng này ở ADNr ở vùng ITS là 0,2-1,3 %
và ở 26S (D1/D2 ) là 0,2-0,3%, các đặc điểm sinh lý sinh hố giữa chúng
khơng có khác biệt nhiều, nên cần phải thực hiện lai ADN genom để xác
định xem chúng có cùng lồi hay khơng. Năm chủng này là lồi mới do
khác biệt lớn về trình tự ADNr với các loài đã biết: 9,4-23,6% ở vùng ITS
và 1,5-4,0 % ở 26S (D1/D2).
Nhóm nhỏ A3: gồm VY-5, VY-21, VY-23, VY-69 và VY-103. Sự
sắp xếp vị trí phân loại của các chủng này với B. nakasei chưa rõ ràng
vì sai khác ở mức độ ADNr giữa các chủng này với B. nakasei là 3,54,1 % ở vùng ITS và 0,8-1,5 % ở 26S (D1/D2). Để khẳng định rõ vị
trí phân loại của nhóm này cần thực hiện lai ADN genom.
Nhóm nhỏ A4: chủng VY-50 sai khác ADNr với các loài đã biết
10,1 – 27,4% ở vùng ITS và 1,4-3.8 % ở 26S (D1/D2). Các đặc điểm
sinh lý sinh hoá giữa VY-50 và các loài đã biết sai khác nhiều. VY-50

thuộc lồi mới.
Nhóm nhỏ A5: gồm các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139 và
VY-145 được xếp vào cùng một lồi vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ
ADNr rất nhỏ 0-0,2% ở vùng ITS và 26S (D1/D2), ngoài ra các đặc
điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tương tự nhau. Năm chủng này
sai khác với B. pseudoschimicola 0,5-0,7 % trong vùng ITS và 0- 0,5 %


ở 26S (D1/D2). Các đặc điểm sinh lý sinh hoá cũng tương tự khi so sánh
với B. pseudoschimicola. Các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139
và VY-145 thuộc lồi Bullera pseudoschimicola.
Nhóm nhỏ A6: gồm 3 chủng VY-60, VY-86 và VY-140. Ba chủng
này tương đồng về trình tự ADNr ITS, sai khác 0,2-0,5 % ở 26S
(D1/D2) nên chúng thuộc cùng loài. ADNr của 3 chủng nghiên cứu sai
khác 20,0-24,9 % ở vùng ITS và 3,5-5,5 % đoạn D1/D2 với các lồi
đã biết. Vì vậy 3 chủng VY-60, VY-86 và VY-140 thuộc một loài và
là lồi mới.
Nhóm nhỏ A7: gồm 3 chủng VY-55, VY-65 và VY-142 sai khác
ADNr 0,3- 0,7 % trong vùng ITS và 26S (D1/D2), và sai khác với các
loài đã biết 25,5-28% trong vùng ITS và 3,7-5,5 % đoạn D1/D2. Các
chủng VY-55, VY-65 và VY-142 là các loài chưa biết. Cần xác định
vị trí của 3 chủng này thơng qua lai ADN genom.
Nhóm B: sự sai khác về trình tự ADNr của chủng VY-112 với
Cryptococcus podzolicus đủ lớn để khẳng định VY-112 là loài mới
(8,7 % ở vùng ITS và 5% ở đoạn D1/D2).
Nhóm C: gồm 3 nhóm nhỏ
Hai chủng VY-132 và VY-144, tương đồng về trình tự ADNr
vùng ITS và 26S (D1/D2). Chúng sai khác với B. oryzae 0,2 % ở
ADNr vùng ITS và đoạn D1/D2. So sánh các đặc điểm sinh lý sinh
hoá của 2 chủng này và B. oryzae khơng có sự khác biệt nhiều. VY132 và VY-144 là một loài và chúng thuộc Bullera oryzae.

Hai chủng VY-48 và VY-104, thuộc cùng lồi vì mức độ sai
khác nhau về trình tự ADNr vùng ITS và D1/D2 là rất nhỏ (0,2 %).
Chúng sai khác với C. luteolus 1,2-1,4 % ADNr ở vùng ITS và 1,2 %


trong đoạn D1/D2. Cần phải thực hiện lai ADN genom của 2 chủng
này với C. luteolus.
-

Chủng VY-77 sai khác với B. sinensis 0,6 % ADNr ở vùng ITS
và tương đồng ở đoạn D1/D2. Chủng này cũng không khác biệt nhiều
khi so sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hoá với lồi B. sinensis. VY-77
thuộc lồi Bullera sinensis.
Nhóm D: gồm 4 chủng chia làm 3 nhóm nhỏ
Hai chủng VY-63 và VY-118, khơng có sự sai khác về trình tự
ADNr ở các vùng ITS và D1/D2, sai khác với B. panici 1,9 % ở vùng
ITS và 26S (D1/D2) là 0,5 %. Cần thực hiện lai ADN genom để xác
định rõ vị trí phân loại của nhóm nhỏ này.
Chủng VY-2 sai khác với B. setariae 4,5 % ADNr ở vùng ITS và
D1/D2 là 3 %. VY-2 thuộc lồi mới.
Chủng VY-128 có mức độ sai khác đủ lớn để phân biệt loài khác
về ADNr ở vùng ITS với B. variabilis và B. pseudovariabilis (4,75,3 %) và đoạn D1/D2 với B. pseudovariabilis, B. variabilis và
Bulleribasidium oberjochense (2,0-2,2 %). VY-128 thuộc lồi mới.
Nhóm E: gồm 2 chủng chia làm 2 nhóm nhỏ.
Chủng VY-68 sai khác với B. pseudoalba 3,6 % ở vùng ITS và
D1/D2 26S là 0,7 %. Cần lai ADN genom để xác định rõ vị trí phân
loại của nhóm nhỏ này.
Chủng VY-120 sai khác với B. japonica 0,3 % ADNr ở vùng ITS
và D1/D2 là 0,2 %. VY-120 thuộc loài Bullera japonica.
Lai ADN genom

Thí nghiệm lai ADN genom được thực hiện giữa các chủng
nấm men chưa xác định rõ vị trí phân loại với các chủng nghiên cứu
hoặc với chủng chuẩn có quan hệ gần nhất.
Nhóm A có 3 nhóm nhỏ A2, A3 và A7.
Nhóm nhỏ A2 có hai chủng VY-42 và VY-75 được chọn làm
đại diện để thực hiện lai ADN. Kết quả ghi ở bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ
bắt cặp ADN của chúng rất cao (92-93 %), hai chủng VY-42 và VY75 thuộc cùng một lồi.
Nhóm nhỏ A3, gồm 5 chủng chia làm đôi là VY-5, VY-23, VY103 và VY-21, VY-69, chúng sai khác nhau 18-19 bp ở ADNr vùng
ITS và 4-5 bp ở đoạn D1/D2, tỷ lệ G+C cũng khác nhau 2,5 %. Hai
chủng VY-5 và VY-69 được chọn để lai cùng chủng chuẩn Bullera
nakasei JCM 13329. Kết quả ghi ở bảng 3.9 cho thấy cả 3 chủng này
có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp 16,3- 48,8 %, vì vậy chúng thuộc 3 loài
khác nhau. VY-5 và VY-69 là 2 lồi mới khác nhau.
Nhóm nhỏ A7 gồm 3 chủng VY-55, VY-65 và VY-142, khác
với các loài đã biết, nhưng khác nhau 4 bp ở ADNr cả 2 vùng ITS và
D1/D2. Kết quả lai cho thấy chúng thuộc cùng một loài (tỷ lệ bắt cặp
ADN 72,3 - 93,1%).
Bảng 3.9. Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi ngờ
là lồi mới thuộc nhóm A chi Bullera
Chủng
VY-42
VY-75
VY-5
VY-69
JCM
13329

Tỷ lệ

G+C
(Mol%)
41,7
43,1
39,7
42,2

Nhóm A2
VY42

VY75

100
92

93
100

Tỷ lệ ADN bắt cặp (%)
Nhóm A3
VY-5

VY69

JCM
13329

100
48,8

43,6
100

16,3
26,1

25,8

36,8

100

VY55

Nhóm A7
VY65

VY142


VY-55
VY-65
VY-142

43.8
44.6
43.7

100
74.6

72.3

91.3
100
100

86.5
93.1
100

Nhóm C có ba chủng VY-48, VY-104 và chủng chuẩn Cryptococcus
luteolus JCM 3689 được tiến hành lai ADN genom với nhau. Kết quả
ghi ở bảng 3.10 cho thấy hai chủng VY-48 và VY-104 có tỷ lệ ADN
genom bắt cặp rất cao 95,2-100 %, giống như kết quả tương đồng về
trình tự ITS và D1/D2. Trái lại chúng có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với
Cryptococcus luteolus, là lồi khơng sinh bào tử bắn (24-35%). Có thể
nhận định VY-48 và VY-104 là cùng một lồi và là lồi mới.
Nhóm D. Lai ADN genom được thực hiện giữa các chủng VY-63, VY118 và chủng chuẩn B. panici JCM 11819. Kết quả lai của 3 chủng
khẳng định rõ VY-63 và VY-118 là cùng một lồi và khác hẳn với B.
panici vì có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp (13,1-16,5%) và khác xa ở tỷ lệ
G+C (8,3 %). VY-63 và VY-118 là một loài (bảng 3.10).
Nhóm E. Chủng VY-68 và chủng chuẩn B. pseudoalba JCM 5290 được
lai ADN với nhau. Tỷ lệ bắt cặp ADN của chúng rất thấp 12-14 % đã
khẳng định VY-68 là loài mới.
Bảng 3.10. Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi
ngờ là loài mới của các nhóm C, D và E thuộc chi Bullera
Tỷ lệ ADN bắt cặp (%)
Chủng

Tỷ lệ

Nhóm C

Nhóm D

G+C
(Mol%)

VY48

VY104

JCM
3689

VY-48

59,1

100

95,2

24,6

VY-104

58,7

100

100

26,8

JCM
3689

59,5

35,8

32,5

100

VY-63

54,2

Nhóm E

VY63

VY- JCM VY118 11819 68

100

98,6

15,9

JCM
5290


VY-118

54,7

100

100

16,5

JCM
11819

46,4

13,7

13,1

100

VY-68

54,0

100

14

JCM
5290

52,0

12

100

Mơ tả lồi mới
Có 25/44 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera
được xếp vào 12 loài mới. Đại diện cho 12 chủng chuẩn là: VY-75,
VY-5, VY-69, VY-50, VY-55, VY-86, VY-112, VY-48, VY-2, VY118, VY-128 và VY-68. Các chủng chuẩn được mô tả bằng tiếng Latin
và tiếng Việt gồm các đặc điểm hình thái, ni cấy: màu sắc, hình
dạng, bề mặt khuẩn lạc; hình dạng, kích thước tế bào sinh dưỡng, bào
tử chồi, bào tử bắn; sự tạo thành khuẩn ty thật và khuẩn ty giả; các đặc
điểm sinh lý sinh hoá: khả năng lên men, khả năng đồng hoá 46 nguồn
cacbon, khả năng đồng hoá 6 nguồn nitơ, nhiệt độ giới hạn cao nhất
cho sinh trưởng, vitamin bắt buộc, cơ chất tạo thành giống tinh bột,
phản ứng mầu với xanh Diazoni B, phân giải urê, tách axít béo, hố
lỏng gelatin, sinh trưởng trên mơi trường chứa 50% glucoza; các đặc
điểm hoá phân loại như thành phần C+G của ADN, hệ thống ubiquinon
chủ yếu và sự tồn tại xyloza trong tế bào. Tên chủng chuẩn, nguồn gốc
và mã số của 2 nơi lưu giữ ở Việt Nam và Nhật Bản.
3.2.3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử

bắn thuộc chi Kockovaella
Để xác định vị trí phân loại của các chủng phân lập thuộc chi
Kockovaella, chúng tơi tiến hành đọc trình tự ADNr 18S, vùng ITS,


26S đoạn D1/D2 và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các
chủng nấm men. Những chủng chưa xác định rõ vị trí phân loại sẽ tiến
hành lai ADN genom.
Có 5 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi Kockovaella:
VY-61, VY-67, VY-125, VY-127 và VY-137. Trình tự gần 1800
nucleotit của ADNr 18S của 5 chủng nấm men được xác định. So sánh
độ tương đồng với trình tự của các lồi có quan hệ họ hàng gần, bằng
chương trình Blast.
Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 18S của 5 chủng
nghiên cứu với 26 loài thuộc các chi Bullera, Cryptococcus, Fellomyces,
Fibulobasidium, Filobasidiell, Kockovaella và Trimorphomyces (Hình
3.6). Quan sát trên cây phả hệ, 5 chủng nghiên cứu nằm rất gần với nhóm
Fellomyces sichuanensis, F. chinensis, F. lichenicola và K. schimae.


0.01

Filobasidiella neoformans_ AF356652
91 VY-61
99 VY-67
86 VY-137
81 VY-127
97 VY-125
79 Fellomyces sichuanensis_ AB032662
Kockovaella schimae_AB005482

88
Fellomyces
chinensis_AB032660
75
Fellomyces lichenicola_ AB032661
69
Fellomyces distylii_AB001036
59
Fellomyces ogasawarensis_ AB001035
Fellomyces thailandicus_ AB044804
83
Kockovaella phaffii_AB005481
Kockovaella machilophila_ AB005479
87
Kockovaella barringtoniae_ AB052631
Kockovaella thailandica_ AB052559
51
Kockovaella
imperatae_AB005561
94
67
62 Kockovaella sacchari_AB052560
Fellomyces fuzhouensis_ AB001032
89
100
Fellomyces_polyborus_D64117
Fellomyces
borneensis_AB032659
82
Fellomyces horovitziae_ AB001033

Fibulobasidium inconspicuum_D25367
Cryptococcus laurentii_ AB032640
53 50
Cryptococcus flavescens_ AB085797
99
93
Cryptococcus aureus_AB085795
Bullera globospora_D31650
100 Cryptococcus dimennae_AB032627
Cryptococcus carnescens_ AB085798
95
Cryptococcus peneaus_AB085799

Hình 3.6. Vị trí phân loại của 5 chủng nấm men sinh bào tử bắn
thuộc chi Kockovaella với các lồi có quan hệ họ hàng gần dựa vào
trình tự ADNr 18S
Trình tự ADNr các vùng ITS (bao gồm cả vùng 5,8S) của 5
chủng nấm men nghiên cứu được xác định (515- 525 bp). Cây phả hệ
được xây dựng dựa trên trình tự ADNr các vùng ITS của 5 chủng
nghiên cứu với 25 loài thuộc các chi Auriculibuller, Bullera,
Bulleromyces, Calathella, Cryptococcus, Fellomyces và Kockovaella
Năm chủng nghiên cứu tạo thành một nhánh khác biệt với các
loài đã biết. So sánh trình tự ADNr vùng ITS cũng thể hiện rõ: 5


chủng nghiên cứu sai khác nhau 5-12/571 bp (0,9-2,1 %) và sai khác
với các loài gần nhất 35-54/571 bp (6,1-9,5 %). VY-61 sai khác với
VY-67 và VY- 125 là 5 bp (0,9 %), khác với VY-127 là 8 bp (1,4 %)
và khác với VY-137 là 10 bp (1,8 %). Hai chủng VY-67 và VY-125
có trình tự ITS tương đồng, sai khác với VY-127 và VY-137 là 9 bp

(1,6 %). Chủng VY-127 sai khác với VY-137 là 12 bp (2,1 %). Từ
những kết quả này có thể sắp xếp 5 chủng nghiên cứu thuộc 4 loài
khác nhau và khác với các lồi đã biết.
Trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) được xác định. Cây phả
hệ được xây dựng giữa 5 chủng nghiên cứu với 27 loài thuộc các chi
Auriculibuller, Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella và
Sterigmatosporidium. Quan sát trên cây phát sinh chủng loại cho thấy
5 chủng nghiên cứu nằm rất gần nhau và tách hẳn một nhánh cùng
Kockovaella schimae. So sánh trình tự ADNr đoạn D1/D2 cũng khẳng
định điều này: 5 chủng nghiên cứu sai khác nhau 2-5/591 bp (0,30,8 %), sai khác với Kockovaella schimae 3-5/591 bp (0,5-0,8 %) và
sai khác với các lồi có quan hệ gần khác 6-12/591 bp (1,0-2,0 %).
Từ những kết quả phân tích trình tự ADNr 18S, vùng ITS và
D1/D2 26S của 5 chủng nấm men thuộc chi Kockovaella chưa thể
khẳng định được vị trí phân loại của chúng. Muốn biết chắc chắn
chúng có phải là lồi mới khơng cần phải thực hiện lai ADN genom.
Kết quả ghi ở bảng 3.14 cho thấy chủng VY-61 có tỷ lệ bắt cặp
ADN thấp với các chủng nghiên cứu khác (15-35 %) và rất thấp với
các lồi có quan hệ gần (2-22 %). Hai chủng VY-67 và VY-125 có tỷ
lệ bắt cặp với nhau cao (84-93 %), nhưng thấp với các loài nghiên cứu
khác 28-47 %, và cũng thấp với các lồi có quan hệ gần (3-30 %).
Chủng VY-127 có tỷ lệ bắt cặp ADN thấp với các chủng nghiên cứu