Xây dựng quy trình phát hiện đột biến kháng lamivudine bằng kỹ thuật real time PCR sử dụng MGB TAQMAN PROBE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
KHÁNG LAMIVUDINE BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME
PCR SỬ DỤNG MGB TAQMAN PROBE
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CBHD: PGS. TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2011


i

LUẬN VĂN THẠC SĨ

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS. Hồ Huỳnh Thùy
Dương. Trong suốt thời gian vừa qua, Cô đã tận tình giúp đỡ, chia sẻ, truyền
đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích cũng như những kinh nghiệm quý báu, tạo
điều kiện thuận lợi để em có thể hồn thành luận văn thạc sĩ.
Em cũng xin gửi lòng biết ơn chân thành đến TS. Nguyễn Thúy
Hương. Với vai trò là một giáo viên chủ nhiệm, trong suốt thời gian theo học
tại trường, cô đã giúp đỡ, dạy bảo cho chúng em những kiến thức bổ ích, thú
vị. Cơ ln là chỗ dựa, động viên chúng em những lúc khó khăn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Thành Khôi đã tận tình giúp
đỡ em trong thời gian qua. Em cảm ơn mọi người ở công ty Khoa Thương đã
tạo điều kiện cho em được học tập và làm việc thật tốt.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách Khoa
Tp.Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã dạy
bảo, truyền đạt kinh nghiệm, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có được kết
quả như ngày hơm nay.
Xin cảm ơn bố mẹ, gia đình và những người thương yêu đã luôn ở bên
cạnh, chia sẻ, động viên và tạo điều kiện cho chúng em trong suốt thời gian
theo học và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, xin gửi đến tất cả các anh chị, bạn bè – những người bạn
nhưng cũng chính là những người thân trong đại gia đình Cơng nghệ Sinh
học này – lời cảm ơn vì đã luôn sát cánh, giúp đỡ và hỗ trợ em.
Thành phố Hồ Chí Minh, 01/2011
Đào Thụy Mỹ Châu
 
 

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

ii

ABSTRACT
Lamivudine is the first nucleotide analoge that was demonstrated to have a
potent effect on HBV. Unfortunately, long-term lamivudine therapy promotes the
selection of HBV mutants with altered DNA polymerase resistant to therapy. A
method base on real-time PCR with MGB Taqman probe is described for identifying

lamivudine resistance mutations in HBV. The detection limit for YMDD, YVDD and
YIDD was 5.103 copies/ml, whereas the sensitivity was 10% within a mixed virus
population with 104 copies of HBV virus/ml. The real-time PCR was compared with
RFLP and direct Sanger in 20 clinical patients samples, the result of the real-time
PCR was correlate with the nucleotide sequence and RFLP. The assay has the
advantage of detecting a mixture of quasispecies with higher sensitive than
sequencing and less time consuming compared to RFLP. Thus, MGB real-time PCR
assay should be useful for detecting lamivudine resistance variants during lamivudine
therapy in clinical setting.

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

iii

TÓM TẮT
Lamivudine là chất tương đồng nucleotide đầu tiên gây ảnh hưởng lên HBV.
Tuy nhiên, việc sử dụng lamivudine trong thời gian dài sẽ làm xuất hiện các đột biến
trên vùng DNA polymerase dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Phương pháp real-time
PCR sử dụng mẫu dò MGB Taqman được phát triển để phát hiện chủng HBV đột biến
kháng lamivudine. Ngưỡng phát hiện của phản ứng là 5.103 bản sao/ml, độ chọn lọc
của phản ứng là 10% đột biến trong quần thể virus hoang dại và đột biến với nồng độ
tổng virus là 104 bản sao/ml. Nghiên cứu được thực hiện trên 20 mẫu bệnh phẩm, so
sánh với phương pháp RFLP và giải trình tự. Kết quả thu nhận của phương pháp realtime PCR tương đồng với kết quả RFLP và giải trình tự. Phương pháp real-time PCR
thuận lợi hơn phương pháp giải trình tự trong việc phát hiện các hỗn hợp virus và có
thời gian thực hiện ngắn hơn phương pháp RFLP. Do đó, phương pháp real-time sử
dụng mẫu dị MGB rất hữu ích trong việc phát hiện chủng đột biến kháng lamivudine
trong quá trình điều trị bằng liệu pháp lamivudine.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

iv

MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
2.1. Virus viêm gan B (hepatitis B) .................................................................... 4
2.1.1. Phân loại......................................................................................... 4
2.1.2. Cấu tạo HBV ................................................................................. 6
2.1.3. Vòng đời của HBV ...................................................................... 10
2.2. Lamivudine ................................................................................................ 12
2.2.1. Lamivudine .................................................................................. 12
2.2.2. Đột biến kháng lamivudine ......................................................... 13
2.3. Kỹ thuật real-time PCR ............................................................................. 14

2.3.1. Chất huỳnh quang khơng đặc hiệu ............................................... 15
2.3.2. Mẫu dị có gắn chất huỳnh quang ................................................ 16
2.3.3. Real-time PCR sử dụng mẫu dò MGB Taqman .......................... 16
2.4. Tình hình nghiên cứu ................................................................................. 19
2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................. 19
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 24
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 26
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.............................................................. 27
3.2. Hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm.......................................... 27
3.2.1. Hóa chất dùng để tách chiết DNA theo quy trình
tách chiết tủa phenol – choloroform ...................................................... 27
3.2.2. Hoá chất cho phản ứng real-time PCR ....................................... 27
3.2.3. Phát hiện HBV kháng lamivudine dựa trên kỹ thuật RFLP ........ 27
3.2.4. Hóa chất dùng cho điện di ........................................................... 28
3.2.5. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 28

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

v

3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 29
3.3.1. Thu nhận mẫu .............................................................................. 29
3.3.2. Tách chiết DNA từ bệnh phẩm .................................................... 29
3.3.2.1. Nguyên tắc........................................................................ 29
3.3.2.2. Cách tiến hành .................................................................. 29
3.3.3. Real-time PCR sử dụng mẫu dò MGB TaqMan ......................... 30
3.3.3.1. Kiểm tra mồi và mẫu dò ................................................... 30

3.3.3.2. Xây dựng các mẫu DNA tổng hợp (amplicon)
dùng làm chứng dương.................................................................. 31
3.3.3.3. Đánh giá hoạt động của mồi và mẫu dò ........................... 31
3.3.3.4. Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR ............................... 32
3.3.3.5. Xác định ngưỡng phát hiện và độ chọn lọc
của phản ứng real-time PCR đa mẫu dò........................................ 36
3.3.4. Kỹ thuật nested PCR – RFLP ...................................................... 38
3.3.4.1. Phản ứng nested – PCR .................................................... 38
3.3.4.2. Phản ứng enzyme cắt giới hạn ......................................... 38
3.3.4.3. Điện di trên gel agarose 2% ............................................. 38
3.3.5. Kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp ...................... 39
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................... 40
4.1. Kiểm tra mồi và mẫu dò ............................................................................ 41
4.2. Đánh giá hoạt động của mồi và mẫu dò trên amplicon ............................. 42
4.3. Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR .......................................................... 43
4.3.1. Tối ưu các phản ứng chứa từng mẫu dò đơn lẻ ........................... 44
4.3.1.1. Khảo sát gradient nhiệt độ với 3 loại phản
ứng chứa từng mẫu dò đơn lẻ (mẫu dò M, mẫu dò V,
mẫu dò I) với amplicon tương ứng................................................ 44

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

vi

4.3.1.2. Khảo sát nồng độ mẫu dò M của phản ứng M ................. 47
4.3.2. Phản ứng chứa hỗn hợp 2 mẫu dò: phản ứng MV (chứa
mẫu dò M và mẫu dò V) và phản ứng IV (chứa mẫu dò I và

mẫu dò V) với amplicon tương ứng ....................................................... 51
4.4. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng real-time PCR đa mẫu dò ....... 54
4.5. Xác định độ chọn lọc của phản ứng đa mẫu dò ......................................... 55
4.5.1. Phát hiện đột biến M204V trong quần thể virus
hoang dại và đột biến M204V................................................................ 55
4.5.2. Phát hiện đột biến M204I trong hỗn hợp virus
hoang dại và đột biến M204I ................................................................ 58
4.5.3. Phát hiện đột biến M204I và M204V trong hỗn hợp
virus hoang dại và đột biến M204V, M204I ........................................ 59
4.6 Thực hiện quy trình real-time PCR sử dụng mẫu dị MGB
trên 20 mẫu huyết thanh từ bệnh nhân viêm gan B .......................................... 61
4.7. Thực hiện quy trình nested PCR – RFLP trên 20 mẫu huyết thanh .......... 63
4.8. Kiểm tra 20 mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp giải trình tự ................... 64
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 68
PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................. 71
PHẦN 7. PHỤ LỤC ........................................................................................ 77

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

vii

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 2.1: Cấu trúc bên ngồi của HBV ............................................................. 6
Hình 2.2: Cấu trúc bộ gen của HBV .................................................................. 6
Hình 2.3. Quá trình xâm nhiễm của HBV ........................................................ 11
Hình 2.4. Chu trình của HBV........................................................................... 12
Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của lamivudine .................................................... 13

Hình 2.6: Cấu trúc của MGB ........................................................................... 17
Hình 2.7: Sự gắn của mẫu dị MGB Taqman lên sợi DNA ............................. 17
Hình 3.1. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng
đơn mẫu dị ....................................................................................................... 33
Hình 3.2. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dò M của
phản ứng M ....................................................................................................... 34
Hình 3.3. Sơ đồ thí nghiệm phản ứng đa mẫu dị ............................................ 35
Hình 4.1. Vị trí bắt cặp của mồi và mẫu dò trên DNA của HBV ..................... 41
Hình 4.2. Kết quả đánh giá hoạt động của mồi và mẫu dị
trên amplicon .................................................................................................... 43
Hình 4.3. Kết quả về độ nhạy của thí nghiệm khảo sát gradient
nhiệt độ của 3 phản ứng đơn mẫu dị ............................................................... 45
Hình 4.4. Kết quả về sự khơng đặc hiệu của thí nghiệm khảo sát
gradient nhiệt độ của 3 phản ứng đơn mẫu dò ................................................ 46
Hình 4.5. Kết quả về độ nhạy của thí nghiệm khảo sát nồng độ
mẫu dò M của phản ứng M với amplicon M nồng độ 5.103
bản sao/ml ở các dãy nhiệt độ .......................................................................... 49
Hình 4.6. Kết quả về sự khơng đặc hiệu của thí nghiệm khảo sát
nồng độ mẫu dò M của phản ứng M với từng loại amplicon .......................... 50
Hình 4.7. Kết quả thí nghiệm phản ứng chứa hỗn hợp 2 mẫu dị .................... 53
Hình 4.8. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng real-time PCR .. 55

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

viii

MỤC LỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Mối liên quan giữa kiểu huyết thanh (serotype)
và kiểu gen (genotype) ....................................................................................... 5
Bảng 2.2: Bản đồ phân bố kiểu gen HBV .......................................................... 5
Bảng 3.1. Trình tự mồi và mẫu dị ................................................................... 30
Bảng 3.2. Đột biến M204V (hoặc M204I) chiếm 5% trong quần
thể hỗn hợp hoang dại và đột biến M204V (hoặc M204I) ............................... 36
Bảng 3.3. Đột biến M204V (hoặc M204I) chiếm 10% trong quần
thể hỗn hợp hoang dại và đột biến M204V (hoặc M204I) ............................... 37
Bảng 3.4. Đột biến M204V và M204I chiếm đồng thời với tỉ lệ 5%
trong quần thể hỗn hợp hoang dại và đột biến M204V và M204I ................... 37
Bảng 3.5. Đột biến M204V và M204I chiếm đồng thời với tỉ lệ 10%
trong quần thể hỗn hợp hoang dại và đột biến M204V và M204I ................... 37
Bảng 4.1. Đặc tính của mồi và mẫu dị ............................................................ 41
Bảng 4.2. Kết quả đánh giá hoạt động của mồi và mẫu dò
trên amplicon .................................................................................................... 42
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ với 3 loại phản ứng
chứa từng mẫu dò đơn lẻ với amplicon tương ứng .......................................... 44
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò M của phản ứng M ................... 48
Bảng 4.5. Kết quả của 3 phản ứng đơn mẫu dò và 2 phản ứng đa
mẫu dò ở nhiệt độ 62,2°C ................................................................................. 52
Bảng 4.6. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng đa
mẫu dò

....................................................................................................... 54

Bảng 4.7. Kết quả xác định độ chọn lọc của phản ứng khi đột biến M204V
chiếm tỷ lệ 5% trong quần thể virus hoang dại và đột biến M204V ................ 56
Bảng 4.8. Kết quả xác định độ chọn lọc của phản ứng khi đột biến M204V
chiếm tỷ lệ 10% trong quần thể virus hoang dại và đột biến M204V .............. 57
Bảng 4.9. Kết quả xác định độ chọn lọc của phản ứng khi đột biến M204I

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

ix

chiếm tỷ lệ 5% trong quần thể virus hoang dại và đột biến M204I ................. 58
Bảng 4.10. Kết quả xác định độ chọn lọc của phản ứng khi đột biến M204I
chiếm tỷ lệ 10% trong quần thể virus hoang dại và đột biến M204I ............... 59
Bảng 4.11. Kết quả xác định độ chọn lọc của phản ứng khi đột biến M204V
và M204I chiếm tỷ lệ 5% trong quần thể virus hoang dại và đột biến
M204V, M204I .................................................................................................. 60
Bảng 4.12. Kết quả xác định độ chọn lọc của phản ứng khi đột biến M204V
và M204I chiếm tỷ lệ 10% trong quần thể virus hoang dại và đột biến
M204V, M204I .................................................................................................. 61
Bảng 4.13. Kết quả thực hiện quy trình real-time PCR sử dụng mẫu dò
MGB trên 20 mẫu huyết thanh ......................................................................... 62
Bảng 4.14. Kết quả thực hiện quy trình RFLP trên 20 mẫu
huyết thanh ....................................................................................................... 64
Bảng 4.15. Kết quả giải trình tự trên 20 mẫu huyết thanh và so sánh
với kết quả real-time PCR và RFLP ................................................................. 64

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Viêm gan B là một bệnh nhiễm trùng gan do virus viêm gan B gây ra. Viêm
gan mãn tính lâu dài có thể dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Đây là một trong mười
ngun nhân chính gây tử vong trên tồn thế giới [18].
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thời điểm năm 2008 đã có hơn 2 tỉ
người nhiễm virus viêm gan B, trong đó có 400 triệu người mắc bệnh viêm gan mãn
tính. Mỗi năm ước tính có đến 500 nghìn người chết vì bệnh xơ gan và ung thư gan,
40 nghìn người chết do viêm gan cấp tính (theo National Institutes of Health –
2008). Việt Nam là một trong những quốc gia có người bị nhiễm virus viêm gan B
cao. Riêng tỉnh Thanh Hóa (2003), tỷ lệ trẻ em nhiễm HBV là 18,4%, người lớn là
18,8%. Theo số liệu thống kê của Hội Gan Mật Việt Nam (năm 2005) có khoảng 1,5
triệu người nhiễm viêm gan B mãn tính, chiếm 15%- 20% dân số cả nước [16].
Các loại thuốc được hiệp hội FDA Hoa Kỳ (Food and Drug Administration)
chấp thuận trong việc điều trị viêm gan B gồm có interferon-alpha 2b, lamivudine,
adefovir, entecavir, peginterferon alpha-2a, telbivudine và tenofovir [18]. Trong đó
lamivudine được sử dụng bởi giá thành thấp, an toàn, khả năng dung nạp tốt và làm
giảm tốc độ tiến triển của bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng lamivudine trong thời gian
dài có thể dẫn đến các trường hợp kháng thuốc do đột biến tại vị trí hoạt động của
enzyme DNA polymerase của virus viêm gan B. Các đột biến này ảnh hưởng đến độ
nhạy cảm với thuốc lamivudine ở virus viêm gan B cũng như gây nên tính kháng
chéo đối với một số thuốc điều trị khác [49].
Vấn đề đặt ra là tìm một phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao để
phát hiện đột biến kháng lamivudine trong quá trình điều trị viêm gan B ở bệnh
nhân, từ đó định hướng trị liệu cho phù hợp. Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài “Xây
dựng quy trình phát hiện đột biến kháng lamivudine sử dụng kỹ thuật real-time PCR
dùng MGB TaqMan probe”.

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2

Nội dung của đề tài bao gồm:
-

Xây dựng phản ứng đa mẫu dò phát hiện các đột biến gây kháng
lamivudine ở virus viêm gan B.

-

Áp dụng quy trình real-time PCR phát hiện các đột biến này trên bệnh
phẩm và so sánh với phương pháp nested-PCR RFLP (restriction
fragment length polymorphism) và giải trình tự.

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

4

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Virus viêm gan B (hepatitis B)
2.1.1. Phân loại
Virus viêm gan B (HBV) là một loài thuộc chi Orthohepadnavirus, họ
Hepadnaviridae. HBV là virus gây nên bệnh viêm gan B, có thể dẫn tới xơ gan, ung
thư gan, và làm gia tăng nguy cơ ung thư tuyến tụy.
HBV có khả năng tồn tại cao trong điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và ẩm ướt.
HBV có thể tồn tại 15 năm ở -20°C, 24 tháng ở -80°C, 6 tháng ở nhiệt độ trong
phòng, và 7 ngày ở 44°C.
Có 2 cách phân loại HBV: kiểu huyết thanh (serotype) và kiểu gene
(genotype).
Kiểu huyết thanh:
• Có 4 yếu tố mang tính kháng nguyên chính được phân biệt với kháng thể
nhờ sự nhận diện các epitope khác nhau được định dạng bởi kháng
nguyên bề mặt - HBsAg. Tất cả các yếu tố này đều chứa yếu tố quyết
định ‘a’, được mã hóa bởi các amino acid từ 124 đến 147. Sự khác biệt
chủ yếu giữa các yếu tố mang tính kháng nguyên là do yếu tố quyết định
d/y và w/r do sự thay đổi từ K thành R tại amino acid 122 và 160.
• Yếu tố phụ được thêm vào để phân biệt 4 kiểu huyết thanh loại ayw và 2
kiểu adw. Như vậy, hiện có 8 kiểu huyết thanh: adr, ayr, ayw1, ayw2,
ayw3, ayw4, adw2, adw4. Còn nếu thêm yếu tố quyết định q+/q- được
tìm thấy trong kiểu huyết thanh adr thì HBV có 9 kiểu huyết thanh [36].
Kiểu gene: Virus có 8 kiểu gene (A - H) dựa vào sự khác nhau trên 8% của
toàn bộ bộ gene của HBV hoặc 4% trình tự của các kháng nguyên bề mặt [27].

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU

5

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Bảng 2.1. Mối liên quan giữa kiểu huyết thanh (serotype) và kiểu gen
(genotype) [27]
HBV genotype

HBV serotype

A

ayw1, adw2

B

ayw1, adw2

C

ayr, adrq’, adrq, adw2

D

ayw2, ayw3

E

ayw4

F

adw4

Sự phân bố về kiểu gene của HBV ở các châu lục và vùng lãnh thổ khác
nhau thì khác nhau. Sự khác biệt giữa các gene có ảnh hưởng đến tình trạng bệnh,
q trình, các biến chứng cũng như khả năng đáp ứng với phương pháp điều trị và
vaccine.
Bảng 2.2. Bản đồ phân bố kiểu gen HBV [27]
HBV genotype
A

Bắc Âu, Bắc Mỹ, Trung Mỹ

B

Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam

C
D

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU

Vùng địa lý

Đông Á, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật
Bản, Polynesia, Việt Nam
Vùng Địa trung hải, Trung Đông, Ấn
Độ

E

Châu Phi

F

thổ dân vùng Bắc Mỹ, Polynesia

G

Hoa Kỳ, Pháp

H

Trung Mỹ


6

LUẬN VĂN THẠC SĨ

2.1.2. Cấu tạo HBV
a. Cấu tạo
Virus gồm có màng bao ngồi lipid và protein nucleocapsid lõi hình đa diện
20 mặt. Protein nucleocapsid bao lấy DNA và enzyme reverse transcriptase. Màng
bao ngoài chứa protein “gắn” giúp virus bám, xâm nhập, và làm tổn thương tế bào
chủ. HBV là virus nhỏ nhất, có dạng hình cầu bán kính 42 nm, có nhiều cấu trúc
dạng ống.

Hình 2.1. Cấu trúc bên ngồi của HBV
b. Bộ gen

Hình 2.2. Cấu trúc bộ gen của HBV

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

7

Bộ gene của HBV được cấu tạo từ một phân tử DNA vịng, có khoảng 3200
nucleotide (3.2 kb). DNA này bao gồm hai chuỗi, có chiều dài khác nhau. Chuỗi dài
nằm ngồi có tính cực âm (-), tạo nên một vịng liên tục có chiều dài cố định 3200
nucleotide và gần như khép kín, mã hóa cho các thông tin di truyền của virus. Chuỗi
ngắn nằm trong có tính cực dương (+), chiều dài thay đổi từ 50 - 100% chiều dài bộ
gen. DNA của HBV không phải xoắn 2 vòng như các DNA của các virus khác mà
chỉ xoắn một đoạn cuối và xếp thành hình trịn.
DNA của HBV khơng sao chép thẳng thành một DNA mới khi vào tế bào
gan mà sao chép qua bước tạo ra mRNA dưới tác dụng của RNA polymerase của tế
bào gan. mRNA này gọi là tiền genome (pgRNA), chứa đựng tồn bộ thơng tin di
truyền của virus. Từ pgRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion, và lúc này
thì virion có enzyme reverse transcriptase để sao chép từ mRNA ra DNA của hệ gen
(quá trình phiên mã ngược).
Trên DNA của HBV có 4 đoạn gen (S, C, P, X) tương ứng với 4 khung đọc
mở (ORF) nằm gối chồng lên nhau. Các đoạn gen này là vùng mã hóa để tổng hợp
các protein của virus như protein bề mặt, protein lõi, polymerase và protein X, qua
trung gian của các mRNA, có chiều dài thay đổi lần lượt là 2.1 kb, 2.4 kb, 3.5 kb và
0.7kb [34].

• Gen pre-S1, pre-S2, và S : tổng hợp protein của kháng nguyên bề mặt
(HBsAg)
• Gen pre-C và C: tổng hợp protein của kháng nguyên lõi (HBcAg và
HBeAg)
• Gen X: tổng hợp protein có tác dụng chuyển hoạt hóa (transactivation)
• Gen P: tổng hợp polymerase
Gen S
Gen S chia làm 3 vùng khác nhau: pre-S1, pre-S2, S; chịu trách nhiệm mã
hóa cho các protein lớp vỏ, tạo ra kháng nguyên bề mặt HBsAg. Vùng S và pre-S2

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

8

có chiều dài cố định trong khi đó vùng pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng
type khác nhau.
Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (small) có chiều dài 24kDa gồm 226
amino acid. Protein này gồm hai thành phần là p24 và Gp27 (glycoprotein), đây là
protein chủ yếu vì nó chiếm đa số.
Đoạn S và pre-S2 tổng hợp protein M (medium) có chiều dài 33 kDa gồm
281 amino acid. Protein này gồm hai loại glycoprotein là Gp33 và Gp36.Vùng preS2 có vai trị giúp cho virus bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ nó liên
kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh người, đồng thời trên tế
bào gan cũng có các thụ thể gắn với albumin trùng hợp trong huyết thanh người
pHSA (polymerized human serum albumin). Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể
này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng đề kháng với sự nhiễm HBV.
Đoạn gen S, pre-S1 và pre-S2 tổng hợp protein L (Large) có chiều dài 39
kDa gồm hai loại protein p39 và Gp42. Chuỗi protein S1 có chiều dài thay đổi tùy

theo từng phân type khác nhau, đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của
tế bào gan sẽ liên kết với virus, giúp virus xâm nhập vào trong tế bào [34].
Gen C
Gen C bao gồm vùng C và pre-C.
Nếu quá trình đọc mã thực hiện suốt chiều dài của đoạn gen pre-C và C sẽ
tổng hợp được HBeAg. Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C sẽ mã hóa cho việc
tạo nên một đoạn peptide tín hiệu. Đoạn peptide tín hiệu này giúp cho HBeAg được
bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng thời cũng giúp cho kháng
nguyên này hịa tan được trong huyết thanh. Vì vậy, HBeAg được gọi là kháng
ngun hịa tan. Kháng ngun này khơng tham gia vào cấu trúc virion vì chức năng
của nó chưa được biết rõ. Sự hiện diện của HBeAg phản ánh tình trạng nhân đơi của
virus và có liên quan đến tính lây nhiễm.
Nếu q trình đọc mã chỉ thực hiện trên đoạn C thì sẽ tổng hợp nên kháng
nguyên lõi hay HBcAg. HBcAg khơng có đoạn peptide tín hiệu nên nó khơng được

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

9

bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó khơng thể tìm thấy HBcAg trong huyết thanh của
bệnh nhân [34].
Gen P
Gen P chiếm 80% chiều dài bộ gen.
Sản phẩm của gen P là một enzyme vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ
thuộc RNA, vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA.
DNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới từ pgRNA (sợi
RNA này được tạo ra từ khuôn mẫu DNA của HBV dưới tác dụng của RNA

polymerase của tế bào gan).
Cấu trúc của polymerase bao gồm:
• Ở đầu tận cùng của polymerase của virus có một amino acid là tyrosin
tương đối ổn định, được sử dụng làm chất mồi (primase) để khởi phát
quá trình tổng hợp DNA của virus.
• Tiếp theo là vùng khoảng trống (spacer) có trình tự thay đổi, nó giúp cho
enzyme này khơng thay đổi chức năng khi có đột biến xảy ra.
• Kế đến là vùng hoạt tính của enzyme sao chép ngược, bao gồm một trình
tự các amino acid tương đối ổn định là tyrosine-methionine-asparagineasparagine. Trình tự này là vị trí xúc tác của enzyme sao chép ngược.
• Ở đầu C tận cùng là vùng của enzyme ribonuclease H (Rnase H) có chức
năng phân cắt khn RNA trong lúc tổng hợp sợi DNA (-) [34].
Gen X
Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác, nhưng có lẽ nó đóng
vai trị chuyển hoạt hóa trong q trình nhân đơi của virus. Sự chuyển hoạt hóa như
vậy có thể làm tăng sự nhân lên của HBV và cả những virus ngồi HBV như HIV.
Protein X cịn liên quan đến sự điều hịa q trình tăng trưởng của tế bào,
cho nên có vai trị trong cơ chế sinh ung thư của tế bào gen bị nhiễm [34].

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

10

2.1.3. Vịng đời của HBV
Chu trình của virus viêm gan B rất phức tạp. HBV không thuộc dạng
retrovirus, nó sử dụng enzyme phiên mã ngược trong quá trình tái bản.
Đầu tiên, virus xâm nhập vào tế bào thông qua các receptor trên bề mặt tế
bào và đi vào tế bào bằng con đường thực bào. Màng virus làm tan màng tế bào chủ,

phóng thích nucleocapsid vào trong tế bào chất. Trên nucleocapsid có mang một
trình tự tín hiệu, giúp định vị nhân. Sau khi đến nhân, DNA virus được chuyển vào
trong nhân tế bào nhờ protein tế bào chủ (chaperones), bỏ lại phần vỏ nucleocapsid
bên ngoài.
Khi vào trong nhân của tế bào gan, sợi đôi DNA không hồn chỉnh sẽ tiến
hành sửa sai, chuyển thành sợi đơi hồn chỉnh và biến đổi thành DNA dạng vịng
khép kín (cccDNA) do các nối cộng hóa trị hình thành giữa hai mạch. Không như
các retrovirus, DNA HBV không cần sát nhập vào DNA của tế bào chủ mà vẫn thực
hiện được các chức năng sao chép và phiên mã bình thường.
Sau khi phân tử DNA được sửa sai, các yếu tố tăng cường phiên mã
(enhancer) và promoter bắt đầu hoạt động kích thích sự phiên mã, tạo ra hàng loạt
các sản phẩm các mRNA và pgRNA.
Các mRNA được sử dụng để tạo ra protein vỏ, protein lõi và DNA
polymerase thông qua q trình dịch mã. pgRNA khơng tham gia vào q trình dịch
mã mà đóng vai trị là vật chất di truyền tham gia trong sự đóng gói tạo virus mới.
Cụ thể, pgRNA được lắp ráp vào lõi nucleocapsid rỗng tự do trong tế bào chất để bắt
đầu quá trình đóng gói virus.
Ngay khi sự đóng lõi capsid bắt đầu, quá trình phiên mã ngược đồng thời
diễn ra. pgRNA làm khuôn phiên mã ngược tổng hợp DNA mạch (-). Sau đó,
pgRNA được loại bỏ, và lúc này DNA mạch (-) làm khuôn tổng hợp DNA mạch (+)
và lắp ráp vào các nucleocapsid.

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


11

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nucleocapsid được đóng gói vào màng bao, tạo thành các thế hệ virus mới,

được giải phóng ra khỏi tế bào, tấn công vào các nhân tế bào khác và tái tiếp tục chu
trình tạo ra nhiều bản sao.

Xâm nhập

Cởi bỏ màng bao

Đóng gói
Tổng hợp mạch

Vào
nhân

Loại bỏ

Sửa chữa
Dịch mã
Phiên mã

Lắp vỏ

Hình 2.3. Quá trình xâm nhiễm của HBV [23]

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU

Tổng hợp mạch (-)


12

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Xâm nhập ER
Hình thành
virion
Hình
thành
cccDNA

Tổng hợp
mạch (+)

Phiên mã ngược

Hình 2.4. Chu trình của HBV [34]
2.2. Lamivudine
2.2.1. Lamivudine
Lamivudine là một thuốc kháng HBV dùng bằng đường uống đầu tiên của
thế giới được FDA chấp thuận từ năm 1998 [7]. Lamivudine [(-) 2’-deoxy- 3’thiacytidine] là chất tương tự của nucleoside dideoxy cytidine trong tự nhiên. Nó
được phosphoryl hóa chuyển về dạng hoạt động, cạnh tranh với cơ chất tự nhiên gắn
vào DNA virus. Chúng có tác dụng ức chế enzyme phiên mã ngược và hoạt động
như một chuỗi kết thúc sự tổng hợp DNA. Sự thiếu nhóm 3’- OH trong lamivudine
ngăn cản sự hình thành liên kết phosphodiester theo hướng 5’ – 3’ thiết yếu cho sự
kéo dài chuỗi DNA và do đó sự gia tăng DNA virus bị ngừng lại.

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

13

Do giá thành thấp, độ an toàn cao, có khả năng dung nạp tốt, kết hợp với
tính ức chế mạnh HBV và làm giảm tốc độ tiến triển của bệnh nên lamivudine đã
được ứng dụng để điều trị bệnh nhân viêm gan B.

Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của lamivudine
2.2.2. Đột biến kháng lamivudine
Việc sử dụng lamivudine trong thời gian dài sẽ xuất hiện tình trạng kháng
thuốc do đột biến tại vùng motif YMDD (tyrosine - methionine – aspartate –
aspartate) là vùng motif bảo tồn trên RNA phụ thuộc DNA polymerase, liên quan
đến quá trình gắn nucleotide vào vị trí xúc tác của polymerase. Methionine ở vị trí
codon 204 (rt204) bị thay thế bởi valine (đột biến M204V) hoặc isoleucine (đột biến
M204I). Theo mơ hình phân tử cho thấy các đột biến này gây ra sự cản trở về mặt
không gian và lực đẩy tĩnh điện, do các amino acid thay thế đã làm giảm kích thước
vùng gắn của các dNTP cũng như thay đổi sự phân bố của trường năng lượng xung
quanh [36]. Sharon và Chu (2008) đã chứng minh rằng năng lượng gắn đối với các
polymerase của chủng virus đột biến khác biệt đáng kể giữa dCTP và lamivudine, do
lamivudine bị mất ái lực gắn với nucleotide đột biến khi so với cơ chất tự nhiên
dCTP [35]. Thêm vào đó đột biến M204V thường đi kèm với sự thay thế leucine ở
codon 180 (rt180) bởi methione (đột biến L180M). Nếu đột biến L180M chỉ xảy ra
đơn lẻ thì khơng có ảnh hưởng mạnh đến tính kháng lamivudine, nhưng khi hiện
diện cùng với đột biến rtM204V/I sẽ làm tăng khả năng tái bản cũng như tính đề
kháng lamivudine [29]. Ở đột biến đôi (L180M + M204I hoặc L180M + M204V)
cho thấy có sự va chạm khơng gian giữa I204 hoặc V204 với lamivudine. Ngoài ra,
đầu khử L180 tuy không tương tác trực tiếp với lamivudine, nhưng đột biến L180M

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

14

sẽ làm mất túi kỵ nước được tạo thành bởi các đầu khử A87, F88, P177, L180 và
M204. Do đó, ái lực của vịng oxathiolane của lamivudine-triphosphate bị giảm,
đồng thời làm tăng điện tích xung quanh vùng gắn deoxyribose cho phép phân biệt
tốt hơn giữa lamivudine-triphosphate (đồng phân nucleotide) và dCTP (nucleotide tự
nhiên). Vì vậy, các đồng phân này bị loại trừ, không được kếp hợp vào chuỗi DNA,
chu kỳ sao chép của virus vẫn hoàn tất. Tần số các loại đột biến kháng lamivudine là
18,6% M204I, 1,4% M204V, 11,4% L180M/M204I và 64,3% L180M/M204V [29].
Liaw cùng cộng sự (1999) đã đưa ra báo cáo ghi nhận có khoảng 41% bệnh
nhân có tình trạng bệnh trở nên trầm trọng hơn sau khi có dấu hiệu đột biến YMDD
mà vẫn tiếp tục sử dụng lamivudine. Thêm vào đó, tính kháng lamivudine kết hợp
với chứng xơ hóa gan, gây viêm cấp tính ở bệnh nhân tái nhiễm HBV sau quá trình
ghép gan trực tiếp. Tính kháng lamivudine có thể gây viêm gan cấp tính ở những
bệnh nhân đồng nhiễm HIV và HBV. Do đó, sự cần thiết để phát triển các liệu pháp
kháng virus cũng như đưa các biện pháp điều trị viêm gan B ngày càng rõ ràng hơn.
Các chủng virus đột biến thường xuất hiện từ sau 6 đến 9 tháng điều trị. Mức
độ kháng thuốc lamivudine kiểu YMDD gia tăng dần theo thời gian điều trị: 24%,
38%, 49%, 67% sau 1, 2, 3 và 4 năm [7]. Không những ảnh hưởng đến độ nhạy cảm
với thuốc lamivudine ở virus viêm gan B mà các đột biến này cịn gây nên tính
kháng chéo đối với một số thuốc điều trị khác [36].
2.3. Kỹ thuật real-time PCR
Để phát hiện đột biến YMDD, phương pháp giải trình tự được xem là
phương pháp chính xác nhất, tuy nhiên độ nhạy của phương pháp này thấp (chỉ phát
hiện được khi đột biến chiếm 25% quần thể virus) [18]. Một số phương pháp sinh
học phân tử khác đơn giản và khá chính xác được phát triển nhằm khắc phục hạn chế
của phương pháp giải trình tự trực tiếp, bao gồm phương pháp đa hình độ dài đoạn
cắt giới hạn (RFLP) [3] , phương pháp 5’-nuclease [3], phương pháp pyrosequencing

[22], phương pháp RDB (reverse dot blot) [45] và oligonucleotide chip [16]. Phương
pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu hoặc mẫu dò Taqman cũng được sử dụng trong việc

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

15

phát hiện đột biến kháng lamivudine, tuy nhiên độ nhạy của các phương pháp này
khơng cịn hiệu quả cao khi phát hiện lượng virus đột biến thấp hơn 4.102 bản sao/ml
DNA virus HBV.
Phản ứng real-time PCR, được gọi là phản ứng định lượng PCR (qPCR), là
kỹ thuật dựa trên nền PCR (phản ứng chuỗi polymerase), được sử dụng để nhân bản
và định lượng đồng thời phân tử DNA mục tiêu. Kỹ thuật này cho khả năng phát
hiện và định lượng (số bản sao của phân tử DNA) một hoặc nhiều trình tự mục tiêu
trong một mẫu ban đầu.
Phương pháp này tiến hành theo các bước cơ bản của phản ứng PCR, cho
phép phát hiện lượng DNA nhân bản tại thời điểm xác định, hơn hẳn phương pháp
PCR chỉ có thể phát hiện sản phẩm sau khi kết thúc phản ứng. Hai phương pháp phổ
biến được sử dụng để phát hiện sản phẩm trong phản ứng real-time PCR là: (1) chất
huỳnh quang khơng đặc hiệu có thể chèn vào bất kỳ DNA mạch đơi nào và (2) mẫu
dị DNA đặc hiệu gồm các đoạn oligonucleotide được đánh dấu với chất phát huỳnh
quang, cho phép chỉ phát hiện sản phẩm sau khi mẫu dò bắt cặp bổ sung với trình tự
DNA mục tiêu.
2.3.1. Chất huỳnh quang khơng đặc hiệu
Chất huỳnh quang khơng đặc hiệu có thể gắn lên tất cả các mạch đôi DNA
trong phản ứng PCR, gây phát tín hiệu huỳnh quang nếu được kích thích bởi một
nguồn sáng có bước sóng thích hợp. Lượng sản phẩm DNA tăng lên trong q trình

PCR, do đó cường độ huỳnh quang cũng tăng theo sau mỗi chu kỳ nhân bản, cho
phép xác định được lượng DNA. Tuy nhiên, chất huỳnh quang không đặc hiệu này
(SYBR Green) sẽ chèn vào tất cả các sản phẩm DNA, bao gồm cả sản phẩm PCR
không đặc hiệu như trường hợp “primer dimer” là hiện tượng bắt cặp lẫn nhau giữa
mồi do có những vị trí trên trình tự mồi mang những base bổ sung với nhau. Ở giai
đoạn cuối của PCR, các enzyme polymerase hoạt động kém dần nhưng vẫn có thể
kéo dài các mồi khi chúng bắt cặp lẫn nhau dù đầu 3’ của mồi khơng có bắt cặp đặc

ĐÀO THỤY MỸ CHÂU