Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.35 MB, 27 trang )
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-----------------------------------
NGUYỄN THỊ NHẬT LINH
NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM
NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN
TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
HUẾ - NĂM 2017
Cơng trình được hồn thành tại:
VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Dương Tấn Nhựt
GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc
Phản biện 1: ...........................................................................................
...............................................................................................................
Phản biện 2: ..........................................................................................
...............................................................................................................
Phản biện 3: ..........................................................................................
...............................................................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế
họp tại: ..................................................................................................
...............................................................................................................
Vào hồi .........giờ..............ngày..............tháng.........năm............
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: ....................................................
...............................................................................................................
...............................................................................................................
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vietnamese ginseng, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.), một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, chứa rất nhiều dược
chất saponin hơn so với các loài sâm quý khác trên thế giới Ngoài
26 hợp chất tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên, trong sâm Ngọc
Linh còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác. Những saponin
quý này có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hịa
huyết áp, chống oxy hóa, điều trị các bệnh ung thư, gan, thận và
tiểu đường,... Tuy nhiên, lồi sâm q và có giá trị kinh tế cao này
đang nằm trong danh mục sách đỏ cần được bảo tồn. Hơn nữa, để
sử dụng các hợp chất từ sâm Ngọc Linh vào sản xuất dược phẩm
vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn do thiếu nguồn ngun liệu.
Ni cấy rễ sâm in vitro có tiềm năng thu sinh khối lớn trong
thời gian ngắn. Rễ sâm Ngọc Linh in vitro tăng trưởng tốt khi có
được mơi trường và điều kiện ni cấy thích hợp. Tuy nhiên, ngồi
việc gia tăng sinh khối rễ, sự tích lũy các dược chất saponin cũng
đóng vai trò hết sức quan trọng. Sinh khối rễ sâm Ngọc Linh lớn có
thể làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng, thậm chí để
sản xuất thuốc, nếu có hàm lượng saponin cao. Nhưng thực tế, rế
sâm in vitro có hàm lượng saponin thấp hơn rất nhiều so với rễ thu
ngồi tự nhiên. Với lợi ích to lớn của các elicitor trong việc tăng
cường tích lũy saponin trong ni cấy mô sẹo sâm Ngọc Linh, các
nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc
Linh là rất cần thiết. Chính vì thế, Đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy rễ
thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và
khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin.”
đã được thực hiện để khơng những cải thiện sự hình thành rễ thứ
cấp (RTC) từ nuôi cấy rễ bất định (RBĐ) in vitro khi tối ưu môi
2
trường và điều kiện ni cấy, cịn tăng cường được hàm lượng 3
saponin (MR2, Rb1 và Rg1) trong sâm Ngọc Linh nhờ tác dụng của
các elicitor.
Mục tiêu của luận án
Xác định được điều kiện ni cấy và mơi trường thích hợp để
RBĐ của sâm Ngọc Linh phát triển và hình thành nhiều RTC, từ đó,
có được nguồn sinh khối lớn và ổn định để nhân nhanh sinh khối rễ
sâm Ngọc Linh trong các hệ thống lớn như Bioreactor.
Xác đinh được các loại, nồng độ của các elicitor khác nhau lên
quá trình sản xuất ba saponin (MR2, Rg1 và Rb1) quan trọng có
trong RTC sâm Ngọc Linh in vitro thơng qua 5 loại elicitor (SA, JA,
ABA, CHN và YE) hiện có tại phịng thí nghiệm. Sau đó, tiến hành
kết hợp các elicitor có nguồn gốc khác nhau để nâng cao hiệu quả
sản xuất saponin, đồng thời tìm được thời điểm thích hợp để bổ sung
các elicitor này vào nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro.
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này cung cấp các dẫn liệu khoa học
mới có giá trị về nghiên cứu phát sinh hình thái rễ, nhân nhanh sinh
khối và tăng cường tích lũy các hợp chất saponin trong các nuôi cấy
RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro. Đồng thời, đây là tài liệu tham
khảo hữu ích cho việc nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực chuyển
hóa thứ cấp, sinh lý thực vật và nuôi cấy mô thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn: Luận án thiết lập được môi trường nuôi cấy, điều
kiện nuôi cấy và hệ thống nuôi cấy tối ưu cho RBĐ sâm Ngọc Linh
tăng sinh và tạo nhiều RTC trong thời gian ngắn nhất. Đồng thời,
nâng cao hàm lượng các saponin nội sinh (MR2, Rg1 và Rb1). Kết
quả này có thể ứng dụng vào sản xuất sâm Ngọc Linh trên quy mô
lớn nhằm giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH
Cây sâm Ngọc Linh là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam,
chỉ có trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam.
Hiện nay, sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến bởi những hợp
chất saponin của loài sâm này vượt trội so với một số loài sâm nổi
tiếng khác như sâm Triều Tiên và sâm Mỹ.
1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển
1.2. Đặc điểm hình thái và sinh trưởng
1.3. Đặc điểm phân bố
1.4. Đặc điểm đa dạng di truyền
1.5. Tác dụng dược lý
2. HỢP CHẤT SAPONIN CỦA SÂM NGỌC LINH
Saponin hay saponoside là một hợp chất glycoside tự nhiên
có hoạt tính bề mặt. Đây là một nhóm đa dạng của terpenoid được
đặc trưng bởi các cấu trúc khác nhau. Saponin được cấu tạo từ một
aglycon steroid hoặc triterpenoid với một hoặc nhiều chuỗi đường.
Những kết quả nghiên cứu phân lập thành phần hóa học mới nhất
được công bố cho thấy các hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh có
trên 60 loại, mà nhóm chất quan trọng nhất của loài sâm này là các
triterpene saponin với các đại diện chính là MR2, Rb1 và Rg1 nằm
trong nhóm dammaran. Triterpene saponin có cấu trúc phức tạp nên
tổng hợp hóa học khơng có khả năng cạnh tranh kinh tế khi sản
xuất trên quy mô lớn mà nguồn sâm lại vơ cùng hiếm.
3. NI CẤY TẠO RỄ THỨ CẤP TỪ RỄ BẤT ĐỊNH
Rễ bất định (RBĐ) là những rễ có nguồn gốc nội sinh, phát sinh
từ nhiều cơ quan khác nhau của thực vật (như lá, hoa, cuống lá) do
4
sự phản biệt hóa của tế bào nhu mơ nằm xung quanh hệ thống mô
mạch dưới tác động của auxin.
Rễ thứ cấp (RTC) được hình thành từ các vùng ngoại vi của trụ
bì trưởng thành ở những khoảng cách khác nhau từ các mô phân sinh
đỉnh của rễ. Sơ khởi RTC phát triển thơng qua một chương trình
phân chia tế bào rất đặc trưng để tạo ra một cấu trúc y như khn
mẫu của rễ chính.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp và rễ bất định:
Loại mẫu cấy, vị trí phát sinh, vai trị điều hòa của auxin, tương tác
giữa auxin và cytokinin, nhiệt độ, ánh sáng, giá thể nuôi cấy.
Các nghiên cưu trong và ngồi nước vể ni cấy rễ
4. ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG
Elicitor (elicitor thực vật) có thể được định nghĩa như là một chất
cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì
khởi động q trình phịng vệ ở thực vật, dẫn đến sinh tổng hợp các
hợp chất thứ cấp. Kích kháng là việc gây kích thích hay tăng cường
q trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp do sự hiện diện của các
elicitor trong mơi trường ni cấy. Elicitor có thể được phân loại dựa
vào bản chất hoặc dựa trên nguồn gốc.
Cho đến nay, các nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy in
vitro sâm Ngọc Linh nhằm nâng cao hàm lượng các saponin còn rất
hạn chế. Dương Tấn Nhựt và cs (2012) bước đầu nghiên cứu đánh
giá tác động của MeJA lên việc tích lũy saponin của mơ sẹo sâm
Ngọc Linh đã cho thấy hiệu quả của các elicitor trong việc tăng
cường các saponin lên đáng kể. Trịnh Thị Hương (2017) cũng đã
bước đầu nghiên cứu tác động của MeJA, SA và ABA nhằm tăng
cường các hợp chất saponin trong nuôi cấy rễ tơ sâm Ngọc Linh.
5
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Nguồn mẫu
Mẫu rễ bất định (RBĐ) 30 ngày tuổi được tách ra từ các cụm
RBĐ nuôi cấy trên môi trường SH bổ sung 5 mg/L IBA hiện có tại
Phịng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên
cứu Khoa học Tây Nguyên.
2. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.1. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC từ nuôi cấy
rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro
2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình
thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp giữa auxin và cytokinin
lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3- trong mơi trường MS
lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường carbohydrate lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể ni cấy lên sự hình thành và
tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng
cường sự hình thành RTC và tích lũy saponin trong nuôi cấy in vitro
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng sinh và
6
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự tăng sinh và
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ ni cấy rễ bất định in vitro
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự
tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích ni cấy lên sự tăng trưởng
của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tăng sinh và
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3. Tối ưu khả năng tích lũy saponin của RTC hình thành từ rễ bất
định sâm Ngọc Linh nhờ tác động của các elicitor
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh
và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của elicitor ngoại sinh và elicitor
nội sinh lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
in vitro
2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor lên sự tăng
sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ
7
bất định in vitro
2.4. Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng, tỷ lệ chất khơ, tỷ lệ
hình thành và tăng sinh của mẫu cấy
2.5. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng khống MS, SH và B5 có bổ sung 30 g/L
đường sucrose, 8 g/L agar, pH = 5,8 và thay đổi tùy vào từng thí
nghiệm.
2.6. Điều kiện ni cấy
Các thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25±2C (trừ thí nghiệm
khảo sát nhiệt độ ni cấy), độ ẩm trung bình 50-60%, tất cả các thí
nghiệm đều đặt trong điều kiện tối hồn tồn (trừ thí nghiệm khảo sát
về thời gian chiếu sáng), các thí nghiệm ngồi sáng được để dưới ánh
sáng đèn huỳnh quang có cường độ chiếu sáng khoảng 40-45
µmol.m-2.s-1 với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày. Ni cấy lỏng trên
máy lắc Innova 2100 plantform shaker (Hermle, Đức) với tốc độ 100
vịng/phút.
3. PHƯƠNG PHÁP SINH HĨA ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH
LƯỢNG SAPONIN
3.1. Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng
3.2. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.3. Phương pháp xác định năng suất tổng hợp saponin
4. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO HỌC
5. PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. TỐI ƯU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH TỪ
NHỮNG MẪU RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO
1.1. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC sâm
Ngọc Linh
1.1.1. Ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn RBĐ (RBĐ) lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh in vitro thể hiện
ở Bảng 3.1, cho thấy nguồn RBĐ từ mẫu cuống lá, kích thước 2 cm,
khơng tách hết mẫu cấy là thích hợp nhất cho RTC sâm Ngọc Linh
in vitro hình thành và tăng trưởng.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của cách cắt mẫu RBĐ lên khả năng hình
thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ tạo
Chiều dài
Số
KLT
RTC
RTC
RTC
(mg)
(%)
(cm)
e
h
f
1
31,67 *
0,33
0,37
29,33g
C1
d
efg
f
2
46,67
2,00
0,83
39,67f
Từ
b
ef
e
Lá
1
82,33
2,33
2,00
65,00c
C2
c
bc
b
a
2
7,33
3,33
73,00
93,33
d
fgh
e
1
46,00
1,33
1,67
30,33g
C1
Từ
cd
b
a
2
53,67
10,00
5,23
49,67e
cuống
b
e
cd
1
79,00
3,00
3,13
57,67d
lá
C2
2
94,33a
13,67a
5,60a
78,00a
d
gh
f
1
48,33
0,67
0,67
42,33f
C1
c
d
b
2
60,00
6,00
4,03
51,00e
Từ
thân củ
1
75,00b
8,33c
2,33de
56,33d
C2
2
83,33b
13,33a
5,00a
71,33b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, TM: Cách cắt mẫu, C1: mẫu được
cắt ngang RBĐ để bỏ phần mẫu tái sinh, C2: mẫu cắt trên phần mẫu tái sinh, KT:
Chiều dài mẫu cắt.
Mẫu
RBĐ
TM
KT
(cm)
9
1.1.2. Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng trưởng của
RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của auxin lên khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Auxin
(mg/L)
Tỷ lệ tạo
Số
Chiều dài
KLT
KLK
RTC (%)
RTC
RTC (cm)
(mg)
(mg)
0
0,00f*
0,00i
0,00f
23,33h
1,33i
e
f
e
g
3
60,00
7,67
0,83
40,2
2,70h
c
c
d
f
5
78,33
13,67
1,83
47,67
4,00fg
NAA
7
59,33e
15,67a
3,13c
62,67d
5,70d
de
f
b
d
9
63,33
7,33
4,67
65,00
5,00de
c
e
d
e
3
78,33
9,00
1,77
54,67
5,67d
5
93,67ab
16,00a
5,17b
115,33c
11,00b
IBA
7
96,33ab
17,67a
6,00a
158,33a
15,27a
a
b
b
b
9
98,67
14,67
4,60
140,33
11,63b
d
h
e
g
3
66,67
5,33
1,03
32,00
1,33i
5
90,00b
6,33g
1,83d
48,33f
3,17gh
IAA
7
91,67b
12,33d
3,33c
56,33e
4,67ef
b
d
c
d
9
90,00
12,67
3,56
66,67
6,83c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.1.3. Ảnh hưởng của việc kết hợp auxin với cytokinin lên sự hình
thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của IBA kết hợp với cytokinin lên sự hình
thành và tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
IBA
(mg/L)
7,0
Cytokinin
(mg/L)
0
0,1
0,5
Kin
1,0
2,0
0,1
0,5
BA
1,0
2,0
0,01
0,05
TDZ
0,1
0,2
Tỷ lệ tạo
RTC
94,53a*
81,53b
68,75cd
47,50f
25,00g
85,00ab
92,50a
77,50bc
56,25ef
82,75ab
65,00de
30,00g
10,00h
Số
RTC
13,75a
5,75c
4,00de
2,75ef
1,50fg
10,25b
12,50a
4,75cd
1,75fg
4,00de
2,75ef
1,50fg
0,75g
Chiều dài
RTC (cm)
5,25a
0,95de
0,75ef
0,45fgh
0,20gh
1,95b
2,23b
1,25cd
0,70ef
1,50c
0,85def
0,65efg
0,13h
KLT (mg)
155,00de
85,50g
121,00f
229,00b
70,25g
125,25f
260,25a
132,25ef
164,25cd
117,50f
233,00ab
187,25c
60,00g
KLK
(mg)
14,25de
6,50hi
13,75def
17,00bc
5,98hi
7,75h
21,50a
12,25efg
11,78fg
10,23g
15,25cd
18,50b
5,00i
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan.
10
1.1.4. Ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự hình thành và
tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các mơi trường khác nhau lên sự hình
thành và phát triển RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Mơi
trường
Tỷ lệ
tạo
RTC
(%)
Số
RTC
Chiều
dài
RTC
(cm)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
SH
78,70b*
16,50b
3,63b
206,75c
20,75b
MS
92,50a
18,26a
4,50a
346,25a
31,25a
B5
82,50ab
14,00c
1,35c
312,25b
21,75b
Đặc điểm rễ
RTC màu trắng trong
và mảnh, rễ chính
màu trắng và mảnh
RTC mập, màu
trắng đục và rễ
chính màu vàng,
dày
RTC màu vàng và
mảnh, rễ chính hóa
nâu, phồng dày lên
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong Duncan’s test. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô, RTC: Rễ thứ cấp.
1.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3- trong môi trường MS lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4+/NO3- lên sự hình thành và tăng
trưởng RTC của RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
NH4+/NO3-
Số
RTC
0/2
1/2
1/1
3/2
2/0
2/2
2/3
15,22c*
19,33a
16,83b
13,00d
4,00f
15,67bc
11,00e
Chiều
dài RTC
(cm)
4,33bc
6,57a
3,50cd
2,67d
2,87d
2,60d
4,67b
KLT
(mg)
KLK
(mg)
323,67b
396,00a
281,00b
219,67c
63,33d
316,67b
99,67d
24,33b
26,67a
22,83c
21,50d
5,67f
24,67b
9,27e
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
11
Số rễ và chiều dài rễ (cm)
20
15
c
Chiều dài rễ (cm)
a
a
b bc
400
b c
300
d
c
e
200
d f
10
c
5
c
b
e
a
a
100
d
0
0
1/2 MS 1/2 SH 3/4 MS 3/4 SH MS MSCB
Môi trường nuôi cấy
Biểu đồ 3.1.
Khối lượng tươi (mg)
Số rễ/mẫu
a
b
25
SH
So sánh giữa mơi trường cải biên có tỷ lệ NH4+/NO3- tốt
nhất so với các môi trường nuôi cấy khác.
Các chữ cái khác nhau (a, b, c...) trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p
≤ 0,05 trong phép thử Duncan.
1.1.6. Ảnh hưởng các loại đường carbohydrate lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.6. Ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên sự hình thành và
tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
chất
Đặc điểm rễ
khô
(%)
51,67e*
3,33hi
6,42d
trong, nhũn, không phát triển
0
160,33d
15,00gh
9,82bc
trắng, dài, phân nhánh ít
10
206,67d
18,33g
8,89bcd
trắng, rất dài, phân nhánh ít
30
D379,33c
41,57e
10,96ab
trắng, rất dài, mập, ít nhánh
40
Glucose
577,67b
51,93bcd
8,99bcd
trắng, rất dài, mập, nhiều nhánh
50
523,00b
67,40a
13,03a
trắng, rất dài, mập, nhiều nhánh
60
374,33c
29,33f
8,85bcd
trắng đục, trịn đều, mập, ít nhánh
10
dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
30
641,33a
55,33bc
8,64bcd
572,33b
56,00b
9,79ab
dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
Sucrose
40
533,33b
47,83cde
9,16bcd
dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
50
526,67b
46,33de
7,80cd
dài, hơi vàng, mập, nhiều nhánh
60
91,67e
9,00hi
8,22bcd
vàng, ít phân nhánh và kéo dài
10
182,67d
15,33gh
9,54bc
vàng, ít phân nhánh
30
181,67d
17,33f
9,76bc
vàng, ít phân nhánh
Maltose
40
102,73e
7,67hi
7,37cd
vàng, mọng nước, ít phân nhánh
50
62,53e
4,33hi
6,94cd
vàng, khơng phân nhánh
60
*Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong
phép thử Duncan.
Loại đường
(g/L)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
12
1.1.7. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng hình thành
và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
Số lượng
Chiều
tạo
Giá thể
rễ
dài rễ
RTC
(rễ/mẫu)
(cm)
(%)
Agar
100,00a
48,45a*
2,70a
a
b
Gelrite
100,00
13,83
0,94b
Bơng gịn
93,34b
8,80c
0,68b
KLT
(mg)
KLK
(mg)
121,40a
121,03a
77,20b
12,47a
13,23a
8,27b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc
Linh in vitro
1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng trưởng của
RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
300
277,7a
R² = 0.9508 b
230
250
203,3b
200
148,7c
150
88d
100
58a
50
0,63e
11e
28,3d
0e
5,3d
38c
13,3c
27,8a
56,3ab
17,7b
54,3b
16,3b
0
14
28
42
56
70
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Khối lượng khô (mg)
Khối lượng tươi (mg)
84
Số lượng rễ thứ cấp/mẫu
Hướng phát triển của rễ thứ cấp
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy đến khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro.
13
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của RTC sâm
Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tăng trưởng của
RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Nhiệt độ
(°C)
22
25
28
Tỷ lệ tạo RTC
(%)
100a*
100a
100a
Số RTC
(rễ/mẫu)
41,67a
23,67b
18,00c
Chiều dài rễ
(cm)
1,00a
0,73b
0,50c
KLT
(mg)
127,33a
102,00b
62,00c
KLK
(mg)
8,33a
6,67b
4,33c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng của RTC
sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
pH
4,3
4,8
5,3
5,8
6,3
Tỷ lệ tạo
RTC
(%)
100a*
100a
100a
100a
100a
Số RTC
18,67c
36,67b
56,00a
30,00bc
21,33c
Chiều dài
RTC
(cm)
0,80c
1,07b
1,37a
1,00bc
1,00bc
KLT
(mg)
KLK
(mg)
91,67bc
169,67b
210,67a
116,33b
77,33c
9,67c
16,33b
20,67a
11,33c
8,00c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.2.4. Ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các điều kiện chiếu sáng lên sự hình
thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Thời điểm
chiếu sáng
100%Tối
80% Tối
50% Tối
100% Sáng
Tỷ lệ tạo
RTC (%)
94,00a*
94,67a
64,67b
12,33c
Số
RTC
18,67a
19,00a
8,67b
1,00c
Chiều dài
RTC (cm)
5,66a
5,00a
2,83b
0,83c
KLT (mg)
a
365,33
369,00a
188,67b
24,67c
KLK (mg)
26,67b
34,33a
13,67c
1,67d
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. 80% tối ở thời gian đầu nuôi cấy; 100% tối là thời gian ni cấy hồn tồn trong
tối; 50% tối là nửa thời gian đầu nuôi cấy trong tối hồn tồn; 100% sáng là ni cấy ngồi
sáng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày.
14
1.2.5. Ảnh hưởng của thể tích mơi trường ni cấy lên sự tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thể tích mơi trường ni cấy lên khả
năng hình thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
Chiều
Thể tích
Số lượng rễ
KLT
KLK
tạo rễ
dài rễ
(mL)
(rễ/mẫu)
(mg)
(mg)
(%)
(cm)
93,34b
8,2d*
2,12b
117,20c 12,80c
10
a
a
a
100
30
70,60
3,18
455,60a 45,60a
a
b
a
100
38,80
2,84
176,40b 18,20b
50
100a
14,40c
2,38b
134,00c 13,40c
70
b
c
c
93,34
12,60
1,32
114,00c 12,00c
90
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi,
KLK: Khối lượng khô.
1.2.6. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của hệ thống ni cấy đến sự hình thành và
tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Hệ thống ni cấy 3 L
Bioreactor tự tạo
Bình tam giác kết hợp
lắc
Bioreactor hình cầu
*Các chữ cái khác nhau
nghĩa với p ≤ 0,05 trong
KLK: Khối lượng khô.
KLT
(g)
KLK
(g)
72,82a*
6,74a
Tỷ lệ
tăng sinh
(lần)
9,71a
30,54c
2,65c
4,07c
Tỷ lệ chất
khô (%)
9,25a
8,68b
51,30b 4,63b
6,84b
9,03ab
trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý
phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi,
15
2. TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY SAPONIN CỦA RỄ THỨ CẤP
SÂM NGỌC LINH
2.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.1. Ảnh hưởng của các giai đoạn nuôi cấy lên sự tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy đến khả năng tích lũy
saponin từ RTC của nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
Thời gian
NS
Tổng (Rg1+
(ngày)
(mg/L)
Rg1 Rb1 MR2
Rb1+ MR2)
0,00 0,00 0,00
0,00
0,00
14
0,05 0,02 0,74
0,81
0,14
28
0,06 0,03 1,05
1,14
0,51
42
56
0,05 0,01 2,41
2,47
2,29
0,06 0,02 3,13
3,21
1,89
70
0,08
0,02
3,26
3,36
1,83
84
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khơ; NS: năng suất
tổng hợp cả 3 saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tích lũy saponin của RTC
sâm Ngọc Linh ni cấy từ RBĐ in vitro
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tích lũy saponin
của RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
Nhiệt
NS
độ (°C) Rg1 Rb1 MR2
(mg)
Tổng 3 saponin
22
0,06c 0,76a 0,64a
1,40a
0,40a
b
b
b
b
0,07 0,73
0,35
1,12
0,23b
25
0,07b 0,62c 0,39b
1,08c
0,17c
28
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khô; NS: Năng suất
tổng hợp cả ba saponin trên tồn bộ sinh khối khơ thu được.
16
2.1.3. Ảnh hưởng của pH lên sự tích lũy saponin của RTC sâm
Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tích lũy saponin ở RTC
sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
pH
Rg1
Rb1
MR2
c
b
c
NS
(mg)
Tổng 3 saponin
1,25
1,29
c
0,42c
4,3
0,03
0,01
4,8
0,03c
0,01b
1,45c
1,49c
0,81b
5,3
0,04b
0,02ab
1,62b
1,68b
1,16a
5,8
0,04b
0,02a
2,45a
2,51a
0,95ab
6,3
0,06a 0,02b 1,61b
1,67b
0,45c
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khơ; NS: Năng suất
tổng hợp cả ba saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
2.1.4. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tích lũy saponin
của RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hệ thống ni cấy đến khả năng tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Hệ thống nuôi cấy 3
L
Bioreactor tự tạo
Bình tam giác kết
hợp lắc
Hàm lượng saponin (‰)*
Tổng
NS
(mg)
Rg1
Rb1
MR2
0,12c
1,03c
3,00b
4,15b
0,93b
0,35a
1,90a
1,15c
3,40b
0,30c
3 saponin
Bioreactor hình cầu 0,25ab 1,41ab 6,86a
8,52a
1,31a
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khơ; NS: năng suất
tổng hợp cả ba saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
17
2.2. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh ni cấy từ RBĐ in vitro
2.2.1. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy saponin
của RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
CHN
KLT
KLK
Tổng 3
(mg/L)
(mg)
(mg)
Rg1
Rb1
MR2
saponin
0,88d
0
456,90a* 41,85a 0,339d 0,144d 0,395c
271,82c 26,93c 0,260e 0,466a 0,164e
0,89d
50
e
e
a
d
d
100
159,93 15,85 1,632 0,142 0,251
2,03a
d
d
b
b
a
202,87 20,32 0,676 0,328 0,433
1,43b
150
b
c
c
b
298,33b 29,50 0,368 0,231 0,415
1,02c
200
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
2.2.2. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
YE
KLT
KLK
(mg/L)
(mg)
(mg)
c*
c
41,85
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
Rg1
Rb1
c
0,339
MR2
c
Tổng 3
saponin
0,144
0,395
d
0,88d
0,679c
1,48b
0
456,90
50
510,83a
51,25a 0,502b 0,251a
100
473,30b
47,25b
0,534b 0,200b 0,743b
1,42b
150
250,03d
25,03d
2,482a 0,244a 0,786b
3,51a
200
154,60e 15,39e 0,544b 0,256a 0,842a
1,67c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.
18
2.2.3. Ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro
ABA
(µg/L)
0
50
100
150
200
KLT
(mg)
456,9a*
156,33b
107,17c
82,47d
76,30d
KLK
(mg)
41,85a
16,67b
10,59c
8,25d
7,58d
Rg1
0,339d
0,703c
1,234b
1,506a
0,731c
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khơ)
Rb1
MR2
Tổng 3 saponin
0,144d
0,395d
0,88e
0,198c
1,058b
1,96d
0,204c
0,973c
2,41c
b
a
0,219
1,651
3,37a
2,65b
0,277a
1,637a
**Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong
phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
2.2.4. Ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC từ mẫu RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
Tổng 3
Rb1
MR2
saponin
0
0,339d
0,144d
0,395c
0,88d
456,9a*
41,85a
1,79a
50
433,07b
43,52a
0,675a
0,248b
0,867a
b
b
a
100
200,03c
19,8b
0,455c
0,599
1,44
0,385
150
84,23d
8,18c
0,503b
0,176c
0,576b
1,25c
200
67,37d
6,79c
0,439c
0,356b
0,398c
1,19c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khơ.
SA
(µg/L)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Rg1
2.2.5. Ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC từ mẫu RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
JA
KLT
KLK
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khơ)
(µg/L)
(mg)
(mg)
Rg1
Rb1
MR2
Tổng saponin
0
0,144e
0,395e
0,88d
456,90a* 41,85a 0,339e
b
b
c
c
a
50
166,24
15,89
2,227
1,855
4,93c
0,849
100
125,56c
12,76c 3,219a
0,718b
1,302d
5,24b
150
81,56d
8,59d
2,524b
0,582c
2,464b
5,57a
200
75,56d
7,59d
1,975d
0,401d
5,21b
2,826a
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
19
2.2.6. So sánh tác động của các elicitor đơn lẻ lên sư tổng hợp
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Năng suất tổng hợp 3
saponin (mg/L)
25
a
b
20
c
c
15
10
f
5
0
e
e
hij hij ij
fg
b
d
f fgh
ghi
k
fg
j
l
l
ĐC 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200
ABA (µg/L)
Biểu đồ 3.3.
CHN (mg/L)
SA (µg/L)
YE (mg/L)
JA (µg/L)
Ảnh hưởng của elicitor lên năng suất tổng hợp cả ba
saponin trong RTC sâm Ngọc Linh.
4
Rg1 (%)
3
2
1
0
ĐC
50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200
CHN (mg/L)
YE(mg/L)
ABA (µg/L)
SA (µg/L)
JA (µg/L)
3
MR2 (%)
2
1
0
ĐC
CHN (mg/L)
1
Rb1 (%)
50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200
ABA (µg/L)
SA (µg/L)
JA (µg/L)
0.5
0
ĐC
50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200
CHN (mg/L)
Tổng 3 saponin (%)
YE(mg/L)
YE(mg/L)
ABA (µg/L)
SA (µg/L)
JA (µg/L)
6
4
2
0
ĐC
50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200 50 100 150 200
CHN (mg/L)
YE(mg/L)
ABA (µg/L)
SA (µg/L)
JA (µg/L)
sánh ảnh hưởng của elicitor lên sự tổng hợp cả ba
saponin trong RTC sâm Ngọc Linh.
Biểu đồ 3.4. So
20
2.2.7. Ảnh hưởng của việc kết hợp đồng thời salicylic acid và dịch
chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của
RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của việc kết hợp giữa acid salicylic và dịch
chiết nấm men lên khả năng phát triển của RTC từ nguồn RBĐ sâm
Ngọc Linh
SA
µg/L
YE
(mg/L)
KLT
(mg/L)
KLK
(mg/L)
Chỉ số tăng
trưởng
% tỷ lệ
chất khơ
0
453,47a
41,85a
17,14a
9,23bcde
25
440,00a
33,67b
16,60a
7,69def
c
e
c
342,20
28,8d
12,69
8,42bcde
50
de
h
de
281,5
21,75
10,26
7,73cdef
100
ghi
ij
ghi
219,00
19,00
7,76
8,68bcde
150
205,00hijk
17,06km
7,20hijk
8,32bcde
200
182,22ijk
15,67mn
6,29ijk
8,61bcde
50
25
ghij
ijk
ghij
217,11
18,33
7,68
9,78b
50
255,00efg
24,67f
9,20efg
9,68bc
100
267,00ef
34,00b
9,68ef
150
12,73a
k
mn
k
174,25
16,38
5,97
9,40bcd
200
ef
fg
ef
266,33
23,67
9,65
8,89bcde
100
25
240,67fgh
23,00gh
8,63fgh
9,57bcd
50
de
h
de
283,00
22,00
10,32
7,77cdef
100
cd
f
cd
320,00
25,00
11,80
7,82cdef
150
198,33ijk
16,00mn
6,93ijk
8,07cdef
200
de
ijk
de
288,67
18,33
10,55
6,35f
150
25
b
c
b
383,67
31,00
14,35
8,08cdef
50
b
cd
b
404,33
30,11
15,17
7,44ef
100
255,00efg
20,00i
9,20efg
7,86cdef
150
178,70jk
15,00n
6,15jk
8,39bcde
200
b
b
b
379,33
32,67
14,17
8,61bcde
200
25
311,33cd
28,00e
11,45cd
8,99bcde
50
de
fg
de
290,33
23,67
10,61
8,15cdef
100
hijk
ij
hijk
211,67
19,33
7,47
9,13bcde
150
ijk
jk
ijk
192,25
18,06
6,69
9,39bcde
200
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
0
25
Rb1 (%/gKLK)
21
a b
0.5
0.4
c
d de
0.3
efg
0.2
g
h
j
d
e
f
fgh hi h
i
fg
h g
j
j
jk
0.1
kl
k
k
l
MR2 (%/g KLK)
25
0.8
50
100
150
200
150
50
100
25
200
150
50
100
25
200
150
50
100
25
200
150
50
100
25
200
150
50
100
25
ĐC
0
200
SA (µg/L)
a
b
0.6
de e de
e ef
h
i
f
h
j
ij ijk
0.2
c
bcd
d
d
0.4
YE (mg/L)
cd
e
ef
e
f
g
ij
k
50
b
gh h
ij
l
100
150
150
100
50
25
200
lm
200
i
100
150
k
25
200
100
25
50
200
o n
150
ijk ij
50
g
j
150
100
l
200
150
100
50
25
200
150
100
50
25
200
150
50
100
25
200
f
l
YE (mg/L)
SA (µg/L)
200
c
50
25
200
150
100
50
25
150
YE (mg/L)
SA (µg/L)
200
a
b
8
bc
b
c
6
4
d d
j
l
i
hi fgh
efg g
e e
d c
fg
de
f
h
k
l
i
jk
0
ĐC
25
50
100
150
200
25
50
100
150
200
25
50
100
150
200
25
50
100
150
200
25
50
100
150
200
Năng suất
tổng hợp 3 saponin (mg/L)
100
a
25
2
150
50
0.035
0.03
d
0.025
e
0.02
0.015
fg
0.01
m n
mn
o
0.005
0
ĐC
Rg1 (%/g KLK)
25
10
100
50
25
200
150
100
50
25
ĐC
0
25
Biểu đồ 3.5. Tác
50
100
150
200
YE (mg/L)
SA (µg/L)
động đồng thời dịch chiết nấm men và salycylic acid
lên khả năng tích lũy các saponin trong ni cấy tạo RTC
sâm Ngọc Linh.
Năng suất tổng hợp 3
saponin (mg/L)
23,41
25
20
15
9,15
10
Rb1 (%/g KLK)
22
30
0,24
0.25
0,19
0.2
0.15
0.1
0.05
5
0
25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE
0.3
0,25
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
MR2 (%/g KLK)
0
25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE
Rg1 (%/g KLK)
Biểu đồ 3.6.
0.3
0.9
0,79
0.8
0.7
0.6
0,45
0.5
So sánh tác động
kết hợp của dịch
chiết nấm men
và salycylic acid
lên sự tích lũy
các
saponin
trong ni cấy
tạo RTC sâm
Ngọc Linh.
0.4
0.3
0.2
0,02
0.1
0
25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE
0
25 mg/L YE + 25 µg/L SA 150 mg/L YE
2.2.8. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên
sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
656,5a
0.35
0,29a
0,26b
Khối lượng tươi RTC (mg)
600
500
0.25
374,5b
373,4b
400
0.20
0,13c
300
254,4c
200
0,08e
0.30
0.15
0,10d
0.10
208,25cd
100
0.05
0
0.00
T0
T10
T20
T30
NS (mg/L)
T40
Năng suất tổng hợp 3 saponin
(mg/L)
700
Biểu đồ 3.7.
Năng xuất tổng
hợp saponin ở
các thời điểm xử
lý với dịch chiết
nấm men trong
nuôi cấy RBĐ
sâm Ngọc Linh
in vitro
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của thời gian bổ sung dịch chiết nấm men
lên khả năng phát triển của RTC từ nguồn RBĐ sâm Ngọc Linh
Thời
gian
(ngày)
0
10
20
30
40
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Hàm lượng
(% trên 1 g RTC khô)
Rb1
MR2
Rg1
Tổng
Nồng độ (µg/mL) suy ra từ đường
chuẩn
Rb1
MR2
Rg1
Tổng
254,40c
24,40c
0,0237d
236,6e
785,81b
1046,46b
0,7858a
0,2405a
1,050a
24,05a
208,25c
20,00c
0,1793c
0,4836b
0,0042e
0,667b
327,26c
22,16b
882,70a
1232,13a
373,40b
33,20b
0,2366d
0,0097c
0,558b
431,48d
17,70b
1016,68b
0,3112a
567,50a
374,75b
29,50c
0,2210b
0,1020e
0,0051d
0,328d
405,03b
186,96e
9,37d
601,36d
0,1655c
0,2763c
0,0122b
0,454c
301,32d
502,80c
7,62e
811,73c
656,50a
64,00a
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng
tươi, KLK: Khối lượng khô.
23
KẾT LUẬN
Từ những các kết quả đạt được cho thấy:
1. Các RTC sâm Ngọc Linh hình thành từ trụ bì tại vị trí của bó
mạch dẫn trung tâm đạt tốt nhất ở mẫu RBĐ 2 cm tái sinh từ cuống
lá và không bỏ phần mô cuống lá này trong khi nuôi cấy tạo RTC.
2. Nhu cầu về dinh dưỡng, các CĐHST và đường carbohydrate
đảm bảo tốt nhất cho RTC sâm Ngọc Linh tăng trưởng từ RBĐ in
vitro là môi trường MS cải biên có tỷ lệ NH4+/NO3- (1/2), bổ sung 7
mg/L IBA, 0,5 mg/L BA và 30 g/L sucrose.
3. Điều kiện thích hợp nhất cho RTC sâm Ngọc Linh tăng
trưởng và tích lũy saponin là ni cấy tối đa trong 56 ngày, với 45
ngày đầu trong tối và 11 ngày sau ngồi sáng; ở nhiệt độ 22C, trong
30 mL mơi trường ở bình 250 mL và pH = 5,3. Hệ thống nuôi cấy tốt
nhất là Bioreactor tự tạo 3 L chứa 1,5 L môi trường và 8 g RBĐ.
4. Khi sử dụng đơn lẻ các elicitor, JA và ABA ức chế sinh
trưởng mạnh nhất, cịn SA, YE và CHN ít ức chế tăng trưởng hơn.
Đối với sự tích lũy các saponin, hàm lượng Rb1 đạt cao nhất ở 50
µg/L JA, Rg1 ở 100 µg/L JA, MR2 ở 200 µg/L JA và năng suất tổng
hợp cả ba saponin này đạt cao nhất ở 150 mg/L YE.
5. Kết hợp đồng thời YE và SA không hiệu quả bằng chỉ sử
dụng 150 mg/L YE.
6. Thời gian thích hợp nhất để bổ sung 150 mg/L YE vào môi
trường nuôi cấy là tại ngày thứ 40 ngày (16 ngày trước khi thu
hoạch) trong quá trình nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất
định in vitro.
