Nghiên cứu phương pháp phát hiện virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ở việt nam bằng kỹ thuật PCR kết hợp với giải trình tự

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Quang Hƣng

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM
BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------**------------

Học viên : Nguyễn Quang Hƣng
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
VIRUT HAdV GÂY BỆNH ĐAU MẮT ĐỎ Ở VIỆT NAM
BẰNG KỸ THUẬT PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

Chuyên ngành :

Di truyền học

Mã số:

60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn:

Ts. Nguyễn Văn Sáng
Ts.Bs. Hoàng Anh Tuấn

Hà Nội, 2017


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tới TS. Nguyễn Văn Sáng – giảng
viên tại Bộ môn Di truyền, Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà
Nội, người Thầy đã ln tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trực tiếp giúp em tiếp thu được
nhiều kiến thức về kỹ thuật chuyên môn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong
suốt q trình thực hiện khóa luận này. Những chỉ dẫn của Thầy là định hướng quan trọng
cho em trong q trình thực hiện khóa luận.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. BS. Hoàng Anh Tuấn – Trưởng
khoa Xét nghiệm tổng hợp – Bệnh viện Mắt TW, người đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn
này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền học, Khoa
Sinh học nói riêng và các thầy cơ trong Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nói chung.
Em xin cảm ơn các thầy cơ đã hết lịng giảng dạy kiến thức và giúp đỡ em trong suốt bốn
năm học vừa qua.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em Nguyễn Tiến Đạt và Nguyễn Thu Huyền
làm việc tại phòng thí nghiệm bộ mơn di truyền là những người đã giúp đỡ em rất nhiều
trong quá trình em thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ nghiên cứu này trong
đề tài mã số QG.17.19.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đồng nghiệp anh chị tại Phòng Vi sinh - Khoa Xét
nghiệm tổng hợp - Bệnh viện Mắt Trung ương, gia đình, và người thân – những người đã
ln bên cạnh, tạo điều kiện và động viên cho em động lực để phấn đấu trong quá trình
học tập cũng như trong q trình thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng năm 2017

Nguyễn Quang Hưng

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

MỤC LỤC
MỤC LỤC ...................................................................................................... 2
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... 5
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... 6
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1.

Bệnh đau mắt đỏ ..............................................................................3

1.1.1.

Tình hình bệnh đau mắt đỏ trên thế giới ...................................3

1.1.2.

Tình hình bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam ..................................3

1.1.3.Triệu chứng đau mắt đỏ do HAdV ................................................3
1.1.3.
1.2.

Con đường lây lan của bệnh đau mắt đỏ do HAdVs .................4

TỔNG quan về HAdv và HAdv gây bệnh đau mắt đỏ ...................5

1.2.1.

Human Adenovirus (HAdV) .....................................................5

1.2.2.

HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ....................................................10

1.3.

Phương pháp phát hiện nhanh các chủng HAdV ..........................10

1.3.1.

Phương pháp phân lập virut .....................................................10

1.3.2.

Phương pháp khuếch đại gen chỉ thị .......................................11

1.4.

Kỹ thuật PCR.................................................................................11

1.4.1. Nguyên lý ....................................................................................11
1.4.2. Vùng gen đích và ý nghĩa ...........................................................12
1.5.

Kĩ Thuật Giải trình tự ....................................................................13

1.6.

XÂY DỰNG CÂY CHỦNG LOẠI PHÁT SINH ........................14

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................. 17
2.1.

ĐỐI tượng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ..................................17

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu ..............................................................17

2.1.3.

Hóa chất ...................................................................................17

2.2.

phương pháp nghiên cứu ...............................................................18

2.2.1.

Tách chiết ADN hệ gen của human adenovirus ......................19

2.2.2. Thiết kế mồi ................................................................................20
2.2.3. PCR khuếch đại các đoạn gen hexon, penton và fiber ...............21
2.2.4. Tinh sạch, giải trình tự các đoạn gen hexon, penton và fiber .....23
2.2.5. Phân tích trình tự và xây dựng cây mơ hình quan hệ di truyền ..24
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 26
3.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm ......................................................26
3.2. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI các ĐOẠN GEN chỉ thị .........................26
3.2.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen hexon (600 bp) ............................26
3.2.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen penton (1118 bp) .........................27
3.2.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen fiber (1264 bp) ............................28
3.3. KẾT QUẢ GIẢI và so sánh trình tự ..................................................29
3.3.1 Kết quả phân tích trình tự gen hexon ...........................................30

3.3.2 Kết quả phân tích trình tự gen peton ...........................................32
3.3.3 Kết quả phân tích trình tự gen fiber .............................................34
3.4. kết quả phân tích cây quan hệ di truyền ............................................ 39
3.4.1. Phân loại các chủng HAdV dựa trêntrình tự gen hexon .............39
3.4.2. Phân loại các chủng HAdV dựa trêntrình tự gen penton ............41
3.4.3. Phân loại các chủng HAdV dựa trêntrình tự gen fiber ...............43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 45
KẾT LUẬN ...............................................................................................45

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

KIẾN NGHỊ ..............................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 46

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

DANH MụC BảNG
Bảng 2. 1.Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu ..........................................18
Bảng 2.2. Tên và trình tự các cặp mồi đã thiết kế ...................................................21
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR .....................................................................21

Bảng 3. 1Phân tích kết quả giải trình tự gen hexon.................................................30
Bảng 3. 2 Phân tích kết quả giải trình tự gen penton ..............................................32
Bảng 3. 3 Phân tích kết quả giải trình tự gen fiber..................................................34
Bảng 3. 4Số lượng các chủng HAdV đã phát hiện dựa trên cả ba đoạn gen hexon,
peton và fiber ...........................................................................................................29

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bệnh đau mắt đỏ và hình ảnh mơ tả ...........................................................
Hình 1.2. Hình ảnh các hạt Adenovirus trên kính hiển vi điện tử ............................. 6
Hình 1.3. Mơ hình cấu trúc vỏ capsid của HAdV...................................................... 7
Hình 1.4. Cấu trúc và tổ chức các gen trong hệ gen HAdV ....................................... 8
Hình 1.5. Cơ chế xâm nhiễm của HAdV ................................................................. 9
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát quy trình nghiên cứu .....................................................19
Hình 2.2. Một phần các trình tự đoạn gen Hexon sau khi so sánh bằng phần mềm
MEGA7 .................................................................................................................. 24
Hình 3.1.Kết quả điện di sản phảm PCR khuếch đại đoạn gen hexon từ các
mẫu bệnh phẩm chứa hệ gen ADN của HAdVs ..................................................... 27
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen penton từ các
mẫu bệnh phẩm chứa hệ gen ADN của HAdVs. .................................................... 28
Hình 3.3.Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen fiber. .................... 29
Hình 3.4. So sánh trình tự gen hexon của các mẫu đã giải trình tự ........................ 31
Hình 3.5. So sánh trình tự gen penton của các mẫu đã giải trình tự ...................... 33
Hình 3.6. So sánh trình tự gen fiber của các mẫu đã giải trình tự .......................... 37

Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen hexon ......................................... 40
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen penton ........................................ 42
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại dựa vào gen fiber. ......................................... 43

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
UV

Ultra violet

TAE

Tris base - Acetic acid - Ethylenediaminetetraacetic acid

RNA/ARN

Ribonucleic Acid

mRNA

Messenger Ribonucleic Acid

mM

Millimol

Mm

Millimeter

ml

Milliliter

MEGA

Molecular Evolutionary Genetics Analysis

HVR

Hypervariable region

dNTPs

Deoxyribonucleotide Triphosphate

DNA/ADN

Deoxyribonucleic Acid

DDW

Deionized distill water

ddNTP

Dideoxiribonucleoside triphosphate

bp

Kilobase pairs

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

µl

Microliter

PCR

Polymerase chain reaction

QH.2014.T.CH - 60420121


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

MỞ ĐẦU
Đau mắt đỏ là từ dùng để chỉ bệnh viêm kết mạc cấp. Bệnh đau mắt đỏ là
một bệnh lý nhãn khoa rất phổ biến nhất trên thế giới. Đau mắt đỏ tiềm ẩn những

nguy cơ to lớn đối với sức khỏe người bệnh, trong nhiều trường hợp, nếu không
được điều trị đúng cách, đau mắt đỏ có thể gây ra các biến chứng nguy hiểm, để lại
di chứng về sau, gây giảm thị lực hoặc thậm chí mù lịa. Đau mắt đỏ do nhiều
nguyên nhân gây như nhiễm trùng, dị ứng, do hoá chất hoặc các tác nhân vật lý...
Một trong những tác nhân chính gây ra bệnh đau mắt đỏ ở người là Human
Adenovirus (HAdV). Bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi HAdV có tốc độ lây lan rất nhanh
và phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng.
Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ do HAdV đã và đang hoành hành liên tục suốt
hơn 10 năm qua với số lượng người bị nhiễm rất cao, có năm lên tới 80.000 người.
Hàng năm, cứ vào khoảng tháng 7 đến tháng 10, khi thời tiết thuận lợi, dịch đau mắt
đỏ do HAdV lại bùng phát. Khi bệnh xuất hiện, số lượng bệnh nhân tăng rất nhanh,
đặc biệt là ở những nơi có mật độ dân cư cao như trường học, bệnh viện, nhà máy
và các thành phố lớn.
Adenovirus (AdV) là nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác
nhau; trong đó có giống Mastedenovirus chuyên gây bệnh ở người, được gọi là
Human Adenovirus, viết tắt là HAdV. Hiện nay có trên 50 chủng adenovirus khác
nhau, do đó khả năng phát triển loại vaccine điều trị là rất thấp. Do chưa có vaccine
phịng bệnh, việc phát hiện sớm tác nhân gây đau mắt đỏ để có phác đồ điều trị phù
hợp là rất quan trọng.
Trước kia, phương pháp định danh các chủng HAdV thường được thực hiện
bằng cách phân lập virut, sau đó xác định nhóm huyết thanh của virut bằng phản
ứng ngưng kết kháng nguyên hoặc tách chiết ADN hệ gen và cắt bằng enzyme giới
hạn để định loại. Những phương pháp này có nhược điểm là phức tạp, tốn thời gian
và có độ chính xác cịn hạn chế. Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Nghiên cứu phƣơng pháp phát hiện virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt
Nam bằng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự” với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho việc nhân gen hexon, penton,
fiber của các chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ.

QH.2014.T.CH - 60420121

1


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

2. Tối ưu được quy trình PCR nhân đặc hiệu các gen hexon, penton, fiber của các
chủng HAdV gây bệnh` đau mắt đỏ.
3. Sử dụng quy trình PCR nhân đặc hiệu các gen hexon, penton, fiber trên các mẫu
bệnh phẩm thu được tại Bệnh viện Mắt Trung ương.
4. Giải trình tự gen ba gen hexon, penton và fiber và xây dựng được cây chủng
loại phát sinh nhằm xác định chính xác các chủng HAdV tại Việt Nam và chỉ ra
được chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ phổ biến ở Việt Nam.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã số
QG.17.19.

QH.2014.T.CH - 60420121
2


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

BệNH ĐAU MắT Đỏ
1.1.1. Tình hình bệnh đau mắt đỏ trên thế giới

Bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi adenovirut ở người (human adenovirus - HAdV)

là căn bệnh về mắt phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh có tốc độ lây lan rất nhanh và
phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp tới sức khỏe cộng đồng[1;24]. HAdV phân bố
ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới và thường xuyên gây ra các trận dịch ở
nhiều quốc gia như Mỹ, Đức, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Nhật Bản,
Thái Lan v.v... Chỉ tính riêng ở Nhật Bản, trong vòng 10 năm trở lại đây đã ghi
nhận ít nhất 3 trận dịch đau mắt đỏ do HAdV. Ở Đài Loan cũng ghi nhận 2 trận
dịch.
1.1.2. Tình hình bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam
Tại Việt Nam đau mắt đỏ là bệnh dịch định kỳ phát sinh khi giao mùa và lây
lan nhanh trên diện rộng ở nhiều tỉnh thành. Dịch đau mắt đỏ xuất hiện và diễn biến
phức tạp, đặc biệt là những đợt bùng phát dịch trên diện rộng trong phạm vi cả nước
vào năm 2013. Bệnh đau mắt đỏ đang có tốc độ lây lan khá nhanh trên cả miền Bắc
và miền Nam khiến người dân hoang mang và xáo trộn, ngoài ra bệnh dịch gia tăng
khiến dư luận dấy lên nghi ngờ về khả năng cung ứng thuốc phòng và trị bệnh đau
mắt đỏ của Việt Nam, điều nay kéo theo nhiều cửa hàng thuốc tây có biểu hiện
thơng báo cháy hàng nhằm tăng giá chuộc lợi.
Theo ghi nhận tại miền Bắc, các tỉnh lân cận và ngoại thành Hà Nội sự bùng
phát dịch khiến cho học sinh phải nghỉ học, nhiều người phải nghỉ làm để tránh lây
lan cộng đồng. Tại bệnh viện Mắt trung ương có khoảng 1200 - 1500 lượt người
bệnh đến khám điều trị được bác sĩ chẩn đoán là đau mắt đỏ trong mùa dịch.
1.1.3.Triệu chứng đau mắt đỏ do HAdV
Bệnh đau mắt đỏ do HAdV có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, thường khởi phát ở
các trẻ nhỏ. Bệnh có thể xảy ra ở một mắt nhưng đa số bị bệnh ở cả hai mắt, thông
thường một mắt phát bệnh trước vài ngày sau mới phát bệnh ở mắt thứ hai.
Người bị bệnh thường cảm thầy khó chịu ở mắt, phải thường xuyên dụi mắt,
cảm thấy ngứa, cộm, chói, đau nhức mắt, sợ ánh sáng, chảy nước mắt và đôi khi
QH.2014.T.CH - 60420121
3

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

sáng ngủ dậy tiết tố kết mạc (dử mắt) làm cho hai mi dính chặt lại nên rất khó mở
mắt. Đỏ mắt, kết mạc phù nề do cương tụ mạch máu lớp nông của kết mạc, xuất
huyết dưới kết mạc, mi mắt có thể sưng nề khiến mắt khó quan sát.
Một số trường hợp tiến triển nặng, các sợi Fibrine trong dịch tiết của kết mạc
sẽ kết hợp với tế bào viêm và vi khuẩn tạo thành một màng giả bám chặt ở mặt
trong kết mạc, gây sưng húp mi mắt, loét trợt biểu mơ giác mạc rất nguy hiểm. Có
thể kèm theo xuất huyết kết mạc và chảy nước mắt lẫn máu hồng gây tổn thương
giác mạc, làm cho giác mạc bị mờ đục do thẩm lậu viêm và apxe, khi đó thị lực của
bệnh nhân giảm rất nhiều.
Toàn thân người bênh có thể có sốt nhẹ, có sưng hạch góc hàm hoặc hạch
sau tai, họng đỏ, amidan sưng to. Một số trường hợp trẻ đau mắt đỏ do virut HAdV
có thể kèm theo các triệu chứng viêm đường hô hấp như ho, sốt nhẹ, sổ mũi, khò
khè sẽ bị nổi hạch trước tai sưng và đau.

1.1.3. Con đƣờng lây lan của bệnh đau mắt đỏ do HAdVs
Bệnh có thể lây từ người này sang người khác do bệnh có nguồn lây là virut
gây bệnh, virut có rất nhiều trong nước mắt và dử mắt người bệnh và có thể lây cho
người khác qua các đường khác nhau bao gồm:
Lây qua các vật dụng sinh hoạt: do dùng chung khăn mặt và chậu rửa mặt
dụi mắt và cầm nắm vào các đồ vật dùng chung như khăn mặt, chậu rửa, ly chén,
tay nắm cửa, đồ chơi, chăn gối hay gặp ở những người trong cùng gia đình, các nhà
trẻ, mẫu giáo, Bệnh khơng lây qua việc nhìn vào mắt người bệnh, vì vậy việc đeo
kính chỉ giúp người bệnh bớt chói mắt, bụi bặm và khó chịu chứ khơng ngăn chặn

QH.2014.T.CH - 60420121
4


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

được sự lây lan như dân gian thường quan niệm trước đây. Đặc biệt có một hình
thức lây lan rất mạnh đó là qua nước hồ bơi. Khi người bệnh bị đau mắt đỏ đi tắm
hồ, virut gây bệnh sẽ tồn lưu trong nước một thời gian và lây truyền cho những trẻ
khác.
Lây qua đường nước bọt: nước mắt được tiết ra sau khi làm nhiệm vụ dinh
dưỡng và làm sạch cho mắt sẽ thoát qua đường dẫn nước mắt (lệ đạo) để xuống
mũi, họng. Ở người bị đau mắt đỏ do HAdV trong nước mắt này có chứa rất nhiều
virut và khi bệnh nhân nói chuyện quá gần, ho hắt hơi, thơm, hơn thì virut HAdV sẽ
theo nước bọt bắn ra ngồi và lây bệnh cho người khác
Vì vậy bệnh có thể lây lan nhanh thành dịch ở những nơi tập trung đông dân
cư như trường học, doanh trại, ký túc xá, bến tàu xe, bệnh viện....Ở một số nơi do
vệ sinh kém (như ở một số vùng nơng thơn) có thể lây qua vật trung gian là ruồi,
muỗi.
1.2.

TỔNG QUAN Về HAdV VÀ HAdV GÂY BệNH ĐAU MắT Đỏ
1.2.1. Human Adenovirus (HAdV)
Adenovirut (AdV) là nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác

nhau, trong đó có giống Mastedenovirut chuyên gây bệnh ở người. Các adenovirut
gây bệnh ở người này có tên gọi là human adenovirut và được viết tắt là HAdV. Các
HAdV lây nhiễm hàng tỷ người trên thế giới và gây ra rất nhiều bệnh khác nhau như

bệnh đường hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu và bệnh về mắt[4;16].

QH.2014.T.CH - 60420121
5


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Hình 1.1.Hình ảnh các hạt Adenovirus trên kính hiển vi điện tử [36]
HAdV là virut có kích thước khoảng 80-100 nm, có vỏ capsid 20 mặt được cấu
thành bởi protein cấu trúc. HAdV khơng có lớp màng lipid kép bao bọc bên ngồi. Hệ
gen của HAdV là phân tử ADN sợi kép mạch thẳng, có kích thước khoảng 35
kbp[33;36]. Vỏ capsid của HAdV có các loại protein chính là hexon, penton và fiber.
Hexon là protein cấu tạo nên bề mặt bên, các penton nằm ở đỉnh và các fiber là các sợi
nhỏ gắn vào các đỉnh penton. Cấu trúc phân tử của các protein tham gia cấu thành nên
HAdV được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, cho đến nay cấu
trúc chi tiết ở mức độ phân tử của nhiều protein cấu thành nên HAdV vẫn chưa được
làm sáng tỏ.

QH.2014.T.CH - 60420121
6


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Fiber

Hexon

Penton base

Hình 1.2. Mơ hình cấu trúc vỏ capsid của HAdV[38]
Hệ gen của HAdV là một phân tử ADN sợi kép có cấu trúc dạng thẳng, chứa
các gen không phân mảnh. Số lượng các gen và thành phần các gen trong hệ gen
của HAdV thay đổi tùy theo chủng HAdV. Kích thước hệ gen các chủng HAdV gây
bệnh đau mắt đỏ khoảng 35 kbp trong đó có khoảng 38 gen mã hóa protein. Các gen
mã hóa protein này được sắp xếp thành các nhóm là các đơn vị phiên mã, mỗi đơn
vị phiên mã chứa từ 1-8 trình tự mã hóa protein. Mỗi đơn vị phiên mã sẽ tạo ra một
phân tử tiền mARN và sau đó được cắt thành nhiều phân tử mARN. Các đơn vị
phiên mã E1A, E1B, E2A, E2B, E3 và E4 mã hóa cho các protein tham gia điều
khiển quá trình phiên mã và sao chép ADN của HAdV. Do vậy, những gen này sẽ
được phiên mã ở giai đoạn sớm của chu trình sinh sản của virut HAdV. Chữ E của
các đơn vị phiên mã này có nguồn gốc từ chữ sớm (Early). Các đơn vị phiên mã từ
L1 đến L5 (L1-L5) mã hóa cho các protein vỏ capsid hoặc tham gia vào quá trình
lắp ghép capsid. Do vậy các gen thuộc các đơn vị phiên mã L1-L5 được phiên mã ở
giai đoạn muộn. Chữ L của các đơn vị phiên mã này có nguồn gốc từ chữ muộn
(Late). Các đơn vị phiên mã L1-L5 được điều khiển bởi cùng một vùng promoter và
có cùng một vị trí khởi đầu phiên mã. Do vậy, tất cả các gen do các đơn vị phiên mã
L1-L5 mã hóa sẽ được biểu hiện cùng một lúc.

QH.2014.T.CH - 60420121
7


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Hình 1.3. Cấu trúc và tổ chức các gen trong hệ gen HAdV [37]

- Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virut HAdV
Quá trình xâm nhiễm của HAdV bắt đầu bằng sự kiện domain ngoại biên của
protein sợi (fiber) của HAdV gắn vào thụ thể bề mặt CAR (Coxsackie-Adenovirut
receptor) của tế bào vật chủ [29]. Sau đó, motif có trình tự RGD nằm ở penton base
liên kết với αV integrins của tế bào chủ và kích hoạt q trình xâm nhiễm của virut
bằng con đường nhập bào (endocytosis). Sau đó, virut trải qua quá trình cởi bỏ lớp
vỏ ở trong endosome và di chuyển vào trong nhân tế bào vật chủ. ADN virut không
gắn vào nhiễm sắc thể tế bào vật chủ mà tồn tại độc lập. Sau đó, q trình phiên mã
và dịch mã các gen của HAdV diễn ra, tổng hợp nên protein cấu thành nên virut
mới. ADN virut cũng được nhân lên và lắp ráp với các protein vỏ để hình thành lên
virut mới. Enzyme HAdV protease cắt các tiền protein vùng lõi của HAdV làm cho
ADN của virut lỏng lẻo và linh động hơn giúp cho HAdV trưởng thành. Virut
HAdV trưởng thành sẽ được giải phóng khỏi tế bào và tiếp tục xâm nhiễm các tế
bào khác[26;33].

QH.2014.T.CH - 60420121
8


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Hình 1.4. Cơ chế xâm nhiễm của HAdV[37]
Hiện nay, có trên 50 chủng adenovirut khác nhau, do đó, khả năng phát triển
loại vắc-xin điều trị là rất thấp. Việc phát triển vắc-xin cho từng chủng hoặc một số

chủng HAdV cũng chưa đạt được những thành cơng đáng kể. Cho đến nay, chưa có
một loại vắc-xin điều trị cho bất kỳ dạng adenovirus nào được thương mại hóa. Chỉ
có một loại vắc-xin cho hai chủng HAdV-4 và HAdV-7 gây bệnh viêm đường hô
hấp cấp nguy hiểm ở người đã được quân đội Mỹ sử dụng từ những năm 1960. Tuy
nhiên, đây là loại vắc-xin sống và sử dụng qua đường uống trực tiếp. Các thử
nghiệm lâm sàng đối với loại vắc-xin của HAdV-4 và HAdV-7 ở dạng sống cho
thấy có vơ số tác dụng phụ không mong muốn với tỷ lệ rất cao như nghẹt mũi
(33%), ho (33%), đau họng (27%), đau đầu (20%), đau bụng (17%), đau khớp
(13%), buồn nôn (13%) và tiêu chảy (13%). Do vậy, còn rất nhiều vấn đề cần phải
nghiên cứu để có thể phát triển được loại vắc-xin phịng ngừa các chủng HAdV một
cách an tồn và hiệu quả. Việc tiếp tục phân lập và nghiên cứu các chủng HAdV là
hết sức cần thiết. Đặc biệt, cần phải nghiên cứu cấu trúc hệ gen, tốc độ tiến hóa hệ
gen, tốc độ biến đổi các gen quan trọng mã hóa cho các kháng ngun bề mặt nhằm
tìm ra các kháng ngun có tính bảo thủ cao, có thể phát triển vắc-xin tái tổ hợp,
giúp ngăn chặn sự hoành hành của bệnh dịch do HAdV gây ra.
QH.2014.T.CH - 60420121
9


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Hiện nay ở Nhật (Aoki K., Y. Tagawa, (2002) tỉ lệ nhiễm HAdV gây bệnh
đau mắt đỏ chủ yếu là chủng 37, còn tại Việt Nam theo những nghiên cứu trước đây
tỉ lệ mắc HAdV gây bệnh đau mắt đỏ chủ yếu do chủng 8.
1.2.2. HAdV gây bệnh đau mắt đỏ
Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ do HAdV đã và đang hoành hành liên tục suốt
hơn 10 năm qua với số lượng người bị nhiễm rất cao, có năm lên tới 80.000 người.
Hàng năm, cứ vào khoảng từ tháng 7 đến tháng 10, khi thời tiết thuận lợi, dịch đau

mắt đỏ do HAdV lại bùng phát. Khi bệnh xuất hiện, số lượng bệnh nhân tăng rất
nhanh, đặc biệt là ở những nơi có mật độ dân cư cao như trường học, bệnh viện, nhà
máy và các thành phố lớn. Bệnh xuất hiện ở mọi lứa tuổi, từ trẻ em đến người già.
Con đường lây nhiễm virut đau mắt đỏ rất đa dạng thông qua con đường nước bọt,
hô hấp, và thông qua tiếp xúc. Đến nay, bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi HAdV chưa có
vắc-xin phịng chống, chưa có thuốc điều trị. Điều này càng làm cho cơng tác phịng
và chống dịch đau mắt đỏ ở nước ta trở nên khó khăn và phức tạp. Các virut nói
chung và virut HAdV nói riêng ln có khả năng biến đổi hệ gen rất nhanh và có
thể xuất hiện chủng HAdV mới, nguy hiểm. Nếu khơng có các nghiên cứu phân tích
hệ gen và kiểm soát sự biến đổi các chủng HAdV ở Việt Nam thì khi xuất hiện
chủng HAdV mới có độc lực cao, chúng ta sẽ khơng có biện pháp ứng phó kịp thời.
Do chưa vắc-xin phịng bệnh và chưa có thuốc điều trị đặc hiệu bệnh đau mắt
đỏ do HAdV gây ra, nên các phương pháp phòng chống chủ yếu dựa vào phòng
bệnh, giữ vệ sinh và cách ly nguồn bệnh. Khi bị nhiễm bệnh, thuốc corticosteroids
có tác dụng chống viêm và giảm triệu chứng được dùng để điều trị cho bệnh nhân
đau mắt đỏ do HAdV. Nhưng corticosteroids có tác dụng phụ là làm chậm quá trình
giải phỏng virut và lại làm tăng sự sinh sản và kéo dài thời gian nhiễm bệnh, tăng
nguy cơ lây lan và có thể dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Do vậy, cho đến
nay, vẫn chưa có thuốc đặc trị HAdV. Điều này càng làm cho việc nghiên cứu các
chủng virut HAdV càng trở lên cấp thiết hơn.
1.3.

PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIệN NHANH CÁC CHủNG HAdV
1.3.1. Phƣơng pháp phân lập virut

Trước kia, phương pháp định danh các chủng HAdV thường được thực hiện
bằng cách phân lập virut, sau đó xác định nhóm huyết thanh của virut bằng phản
ứng ngưng kết kháng nguyên hoặc tách chiết ADN hệ gen và cắt ADN hệ gen virut
QH.2014.T.CH - 60420121
10

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

bằng enzyme giới hạn để định loại. Những phương pháp này trước đây được coi là
tiêu chuẩn vàng để xác định các chủng HAdV. Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là
phức tạp, tốn thời gian và có độ chính xác cịn hạn chế.
1.3.2. Phƣơng pháp khuếch đại gen chỉ thị
Gần đây, việc định loại các chủng virut HAdV được tiến hành dựa trên việc
khuếch đại và giải trình tự các đoạn gen chỉ thị của HAdV như gen hexon và fiber.
Các gen này có trình tự nucleotit biến đổi nhanh, do vậy rất hiệu quả trong xây
dựng cây phát sinh chủng loại và phân loại HAdV. Phương pháp này có ưu điểm là
phát hiện nhanh, chính xác và có độ nhạy rất cao, có thể định lượng được số bản
copy của virut.
Hiện nay, việc xác định nguyên nhân gây bệnh đau mắt đỏ ở các cơ sở y tế
trong nước cũng như trên thế giới chủ yếu dựa vào triệu chứng, khơng có các kit
chẩn đốn nhanh và chính xác giúp phân loại tác nhân gây đau mắt đỏ. Nguyên
nhân là do các phương pháp phân loại virut chỉ phù hợp với phòng thí nghiện khoa
học, chưa có các kit xét nghiệm đơn giản, nhanh chóng có thể triển khai được ở các
bệnh viện. Điều này có thể dẫn đến chậm trễ, thậm chí nhầm lẫn trong điều trị, ảnh
hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe về mắt của bệnh nhân. Do vậy, trong đề tài này,
chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp phát hiện HAdV gây bệnh đau mắt đỏ
chủ yếu ở Việt Nam dựa trên kỹ thuật khuếch đại gene chỉ thị, phục vụ trong chẩn
đoán nguyên nhân gây bệnh đau mắt đỏ.
1.4.

Kỹ THUậT PCR
1.4.1. Nguyên lý

PCR là phương pháp được xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980.
Phản ứng được thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi ADN mới bổ sung với
trình tự khn ADN ban đầu của DNA polymerase. Enzyme này chỉ có khả năng
kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức 3’- OH tự do của
nucleotide trước đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’- OH tự do để thực
hiện kéo dài chuỗi. Điều này dẫn đến sự đặc hiệu của phản ứng PCR trong việc
khuếch đại một vùng ADN mong muốn (vùng gen đích) bằng cách thiết kế mồi đặc
hiệu.
Phản ứng PCR được thực hiện bằng máy gia nhiệt, giúp tăng giảm chính xác
nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng một cách nhanh chóng tại các khoảng thời gian xác
QH.2014.T.CH - 60420121
11


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

định ở mỗi chu kỳ. Đầu tiên, hai sợi của phân tử ADN kép phải được tách ra để cho
phép các cặp mồi bám vào khn, được gọi là giai đoạn biến tính ADN (94 oC – 98 oC).
Sau khi tách sợi, nhiệt độ được làm giảm đến nhiệt độ gắn mồi, cho phép mồi xuôi
và mồi ngược liên kết với các sợi ADN đơn làm khn. Tùy vào mục đích nghiên
cứu, cặp mồi có thể được thiết kế gắn ngẫu nhiên hay gắn đặc hiệu dựa trên trình tự
của vùng ADN quan tâm. Tiếp theo, enzyme DNA polymerase dựa trên sợi ADN
làm khuôn sẽ xúc tác kéo dài chuỗi ADN từ đoạn mồi theo chiều 5’ - 3’ ở nhiệt độ
kéo dài chuỗi (72 oC). Quá trình này được lặp lại sau khoảng 25 - 40 chu kỳ. Phản
ứng có thể tổng hợp được rất nhiều bản sao của trình tự gen mong muốn chỉ trong
thời gian vài giờ.
Ở nhiệt độ biến tính ADN (khoảng 95 oC), các polymerase của đa số sinh vật

đều bị phân giải và mất hoạt tính; vì vậy enzyme sử dụng cho phản ứng PCR cần là
enzyme chịu nhiệt. Người ta đã phân lập được một số vi khuẩn phát triển trong điều
kiện nhiệt độ cao, có thể lên tới 100OC, như vi khuẩn suối nước nóng Thermus
aqaticus và tách được polymerase của vi khuẩn này (Taq polymerase). Việc tìm ra
enzyme chịu nhiệt đã mở ra bước tiến quan trọng cho phản ứng PCR và các kỹ thuật
ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu phân tử.
1.4.2. Vùng gen đích và ý nghĩa
Trước đây, việc phân loại các chủng HAdV chủ yếu dựa vào các phương
pháp miễn dich thì nay sẽ được phân loại bằng phương pháp PCR và giải trình tự
các đoạn gen hexon, penton và fiber.
Như đã phân tích cấu trúc hệ gen cũng như thành phần các protein cấu trúc
nên HAdV, các protein hexon, penton base, và fiber knob là ba thành phần chính
của vỏ capsid. Chúng đóng vai trò là các kháng nguyên đặc trưng được sử dụng
trong các phản ứng miễn dịch nhằm xác định, định loại các chủng HAdV. Trong hệ
gen HAdV, chúng được mã hóa bởi các gen phiên mã muộn là L2 (penton), L3
(hexon), L5 (fiber). Các gen hexon, penton và fiber chứa vùng gen siêu biến (HVR)
nên chúng được ví như là các điểm nóng về sự tái tổ hợp (recombination) của các
chủng HAdV khác nhau.
Trình tự vùng siêu biến HVR-7 là vùng quan trọng được sử dụng cho phân
loại các chủng HAdV do mức độ biến đổi rất cao. Vị trí của HVR-7 thuộc vùng
loop 2 của gen hexon. Việc phân loại các chủng HAdV sử dụng trình tự gen hexon
thường phổ biến và hiệu quả hơn trình tự gen penton hay fiber. Tuy nhiên hai gen
QH.2014.T.CH - 60420121
12


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

penton và fiber những năm gần đây được quan tâm nhiều hơn do chúng là một trong
những nhân tố thường xuyên xảy ra sự tái tổ hợp giữa các chủng cùng loài. Một số
báo cáo chỉ ra rằng gen penton có khả năng cao xảy ra sự tái tổ hợp. Vì vậy nghiên
cứu đồng thời cả ba gen hexon, penton và fiber là bước ngoặt lớn trong phân loại
HAdV nhằm mang lại cái nhìn tổng quát hơn về sự biến đổi của các chủng HAdV,
có ý nghĩa so sánh với các phương pháp phân loại truyền thống trước kia, tránh
được khả năng định loại sai cho các chủng tái tổ hợp (nếu có).
1.5.

KĨ THUậT GIảI TRÌNH Tự
Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ hiệu quả trong nghiên cứu

di truyền phân tử. Từ phương pháp giải trình tự đột phá đầu tiên của Sanger, đến
nay các phương pháp giải trình tự ngày càng được phát triển để đáp ứng với yêu cầu
về độ chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao cũng như giá thành rẻ.
Phương pháp giải trình tự ADN đầu tiên được mô tả bởi Sanger và Coulson
được gọi là phương pháp “cộng và trừ”. Phương pháp này sử dụng DNA
polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 với các nucleoside
triphosphate khác nhau. Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase được điện di trên gel
acrylamide. Do sự không hiệu quả của phương pháp này, nên 2 năm sau đó ơng và
cộng sự đã mơ tả một phương pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các
oligonucleotide thơng qua chuỗi trùng hợp bằng enzyme.
Phương pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và được biết
đến như phương pháp Sanger hay phương pháp dideoxynucleotide. Bao gồm một
enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ
sung với các mẫu ADN quan tâm. Phản ứng sẽ được kéo dài cho đến khi các
enzyme kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) được đánh dấu vào
chuỗi đang tổng hợp. Do các ddNTP khơng chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ
không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết
thúc. Phản ứng được thực hiện trong 4 ống khác nhau, mỗi ống ngồi thành phần

của phản ứng PCR thơng thường sẽ chứa một loại ddNTP được đánh dấu.
Sau quá trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp các ADN kích thước khác
nhau được điện di trên gel polyacrylamide biến tính theo 4 đường chạy song song
và được đọc bằng phóng xạ tự ghi. Các phương pháp giải trình tự bằng enzyme
khác cũng được sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu
di truyền.
QH.2014.T.CH - 60420121
13


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert
đã phát minh ra một phương pháp hóa học có thể xác định được trình tự các
nucleotide trong chuỗi ADN. Theo phương pháp này, trước hết phân tử ADN được
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể được phát
hiện bằng hình ảnh phóng xạ. Sau đó các nucleotide trong phân tử ADN được đánh
dấu sẽ được xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử ADN tại
những vị trí nucleotide khác nhau. Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C,
và C. Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1
base. Các đoạn này được điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy
phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme.
Tổng hợp các kết quả, ta thu được trình tự các nucleotide trên mạch đơn
ADN, từ đó ta biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.
Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của
máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của
phương pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP khơng được đánh dấu phóng
xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại

ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản,
hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ
được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu
sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G.
1.6.

XÂY DỰNG CÂY CHỦNG LOẠI PHÁT SINH

Cây phát sinh chủng loại là một mơ hình giả thuyết sử dụng phần mềm để
mơ tả mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, hay mối quan hệ di truyền của một số
nhóm lồi gần gũi. Nó được xây dựng dựa trên sự so sánh các đặc điểm tương đồng
về hình thái hoặc sự tương đồng của các trình tự phân tử giữa các nhóm sinh vật.
Các nhánh rẽ của cây phản ánh sự tiến hóa của các lồi từ lồi tổ tiên. Bằng cách
liên tục đưa ra các giả thuyết, các nhà khoa học cũng đồng thời xây dựng các thuật
toán khác nhau cho cây mơ hình để mơ tả lịch sử tiến hóa thực sự của một nhóm
trình tự hoặc sinh vật. Tuy vây, cây mơ hình xây dựng được sẽ có những ưu nhược
điểm riêng tùy thuộc vào cách lựa chọn mơ hình tiến hóa, các phương pháp xây
dựng cây của mỗi phần mềm. Có hai dạng: cây khơng gốc (phản ánh mối liên hệ
giữa các trình tự) và cây có gốc (phản ánh hướng thời gian tiến hóa).

QH.2014.T.CH - 60420121
14


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Cây phát sinh chủng loại phân tử nói riêng khơng thể thực hiện nghiên cứu
trực tiếp nên chỉ có thể được phỏng đốn dựa vào các dữ liệu trình tự hoặc các dữ

liệu phân tử khác. Hai phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tử
chính: dựa trên khoảng cách (distance-based method) hoặc dựa trên ký tự
(character- based method). Với các phương pháp ma trận khoảng cách thì khoảng
cách giữa mỗi cặp trình tự được tính tốn, và tập hợp thành một ma trận (distance
matrix) sử dụng để xây dựng cây mơ hình. Trong khi đó, phương pháp xây dựng
cây phát sinh dựa trên ký tự lại cùng lúc so sánh tất cả các trình tự được sắp xếp và
chỉ xem xét một ký tự (vị trí dóng hàng) tại đúng thời điểm tính tốn để đưa ra điểm
thay đổi cho mỗi mơ hình cây phát sinh. Theo lý thuyết, cây được xây dựng dựa
trên sự xem xét tất cả các con đường tiến hóa có thể xảy ra và chọn ra cây phù hợp
nhất. Phương pháp này mất nhiều thời gian và khá khó áp dụng trong các trường
hợp giả định không phù hợp với dữ liệu phân tử, hơn nữa đặc điểm hay dữ liệu phân
tử được sử dụng phải có mức độ biến đổi phản ánh được sự tiến hóa của lồi, tốc độ
tiến hóa của gen phải như nhau theo cùng một hướng. Các phương pháp được sử
dụng chính: Maximum Parsimony, Maximum likelihood và Bayesian.
Maximum Parsimony (MP): Phương pháp này sẽ tổng hợp ngẫu nhiên các
cây phát sinh chủng loại và phần mềm sẽ tính tổng số nucleotide thay đổi. Từ đó
tìm ra một cây phát sinh chủng loại có số thay đổi phân tử ít nhất trong các cây
được xây dựng. Đây là phương pháp khá nhanh. Tuy nhiên, do giới hạn của máy
tính nên nó thường dẫn đến các cây phát sinh chủng loại có cùng sự thay đổi như
nhau nên khó có thể đánh giá được sự lựa chọn cây và mất thời gian khá dài để
dựng cây. Hơn nữa, phương pháp này không quan tâm đến tốc độ tiến hóa khác
nhau giữa các vị trí khác nhau [14].
Distance Matrix Method: Khoảng cách trình tự so sánh được tính tốn dựa
trên mơ hình chuỗi thế nucleotide của Markov. Phương pháp xây dựng cây chủng
loại phát sinh phù hợp với một ma trận khoảng cách giữa các cặp trình tự dựa trên
mức độ thay thế các nucleotide giữa các trình tự đó mà khơng cần quan tâm đến con
đường tiến hóa của chúng. Với cách xây dựng này thuật toán sẽ nhanh hơn đối với
dữ liệu phân tử lớn, phù hợp với trình tự có độ tương đồng cao. Nhưng hầu hết các
vị trí nhìn chung sẽ được xem như nhau, không để ý sự khác nhau của mức độ tiến
hóa giữa các codon khác nhau. Phương pháp ma trận khoảng cách được sử dụng

rộng rãi nhất là Neighbour-joining, hiệu quả cho việc phân tích dữ liệu lớn và tương
đồng.
QH.2014.T.CH - 60420121
15


Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Quang Hưng

Maximum likelihood : Thuật tốn đầu tiên xây dựng cho phân tích
Maximum Likelihood của dữ liệu trình tự ADN được phát triển bởi Felsenstein.
Dựa vào phương pháp thống kê trong đó xác suất thay thế được xem xét cho từng
cặp nucleotide trong tất cả chuỗi trình tự được so sánh. Từ đó có thể xác định chiều
dài cành, cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn. Đây là
phương pháp tốn nhiều thời gian nhưng có độ tin cậy cao.
Bayesian: là một phương pháp thống kê khác với Maximum likelihood, ở
đây thơng số trong mơ hình được xem xét như các biến số ngẫu nhiên có phân bố
thống kê, sử dụng thuật toán Markov chain Monte Carlo (MCMC algorithms).
Phương pháp xây dựng cây cũng dựa trên mơ hình thế nucleotide giống như
Maximum likelihood.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp xây dựng cây phát
sinh chủng loại: Maximum likelihood để xây dựng cây có tiến hóa phù hợp nhất.
Để kiểm tra sự tin cậy của cây phát sinh được xây dựng nghiên cứu này sử
dụng phương pháp Bootstrap. Đây là phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên từ một bộ
trình tự, xây dựng lại cây từ các bộ dữ liệu đó và kiểm tra tần suất những phần của
cây được lặp lại. Giá trị của bootstrap biểu thị mức độ tin cậy của cây được xuất ra.
Giá trị này lớn hơn hoặc bằng 70% thì được coi là có ý nghĩa thống kê và trên 95%
được xem là có độ tin cậy cao.
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) là phần mềm được phát

triển để so sánh, phân tích các trình tự ADN và protein, từ đó suy ra cây tiến hóa
phân tử của gen, genome và các lồi qua thời. phần mềm được tích hợp nhiều
phương pháp so sánh (clustalW), tính tốn khoảng cách (Pairw distance), xây dựng
cây phát sinh chủng loại (Maximum, parsimony, Maximum Likelihood,..) phù hợp
với nghiên cứu này. Hơn nữa, MEGA7 đạt hiệu quả cao trong hoạt động và dung
lượng nhớ. So sánh 765 trình tự dài 2000bp chỉ mất 43 phút và 1GB dung lượng
nhớ.

QH.2014.T.CH - 60420121
16