KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (KIỂM NGHIỆM và độc CHẤT) xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
====== ======

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
====== ======

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
KHOÁ:

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ
Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ mơn Hố Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa
Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo
và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện khóa luận này.
Tơi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ mơn Hố Dược và Kiểm nghiệm
thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có
thể thực hiện khóa luận này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã
cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và
rèn luyện tại Khoa.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã ln
bên cạnh, động viên tơi trong lúc khó khăn cũng như trong q trình thực hiện
khóa luận này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên


CHỮ VIẾT TẮT
ACN

Acetonitril

BP

Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia)

DAD

Máy đo quang (Diode Array Detector)

EP

Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia)

GC

Sắc ký khí (Gas Chromatography)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid
chromatography)

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hồ hố các thủ tục đăng ký dược
phẩm sử dụng cho con người (International conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MS

Phương pháp khối phổ (Phương pháp khối phổ)

NIR

Quang phổ cận hồng ngoại

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

USP

Dược điển Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia)


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN..........................................................................2
1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh...........................................................2
1.2. Giới thiệu chung về citral.......................................................................4
1.2.1. Nguồn gốc...........................................................................................4
1.2.2. Cấu trúc và tính chất........................................................................... 5
1.2.3. Cơng dụng...........................................................................................5
1.2.4. Các phương pháp định lượng citral.....................................................6
1.3. Thẩm định quy trình phân tích...............................................................9
1.3.1. Tính đặc hiệu.......................................................................................9
1.3.2. Miền giá trị........................................................................................10
1.3.3. Tính tuyến tính.................................................................................. 10
1.3.4. Giới hạn phát hiện............................................................................. 11

1.3.5. Giới hạn định lượng.......................................................................... 11
1.3.6. Độ đúng.............................................................................................12
1.3.7. Độ chính xác..................................................................................... 13
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 14
2.1. Ngun vật liệu, trang thiết bị..............................................................14
2.1.1. Dung mơi, hố chất........................................................................... 14
2.1.2. Trang thiết bị.....................................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................14
2.2.1. Tối ưu hố điều kiện sắc ký.............................................................. 14
2.2.2. Thẩm định tính đặc hiệu....................................................................15
2.2.3. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị...............................15
2.2.4.


2.2.5.


3.8.1. Sản phẩm C..................................................................................................... 33
2.2.6. 3.8. Bàn luận..........................................................................................35
2.2.7..........................................CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
4.1. Kết luận........................................................................................................... 38
4.2. Kiến nghị......................................................................................................... 39
2.2.8.

TÀI LIỆU THAM KHẢO


2.2.9. DANH MỤC CÁC HÌNH
2.2.10.

2.2.11.

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B) 5

2.2.12. Hình 3.1. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml
tại bước sóng 233 nm, hệ dung mơi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v) 17
2.2.13. Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml
tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH :
H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v)
18
2.2.14.

Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV-VIS của Neral (A) và Geranial (B) 19

2.2.15. Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml
trong điều kiện sắc ký được lựa chọn
20
2.2.16.

Hình 3.5. Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol 21

2.2.17. Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml
geraniol tại bước sóng phát hiện 200 nm
21
2.2.18. Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml
geraniol tại bước sóng phát hiện 242 nm
22
2.2.19. Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung
dịch và diện tích pic của đồng phân neral
24

2.2.20. Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch
và diện tích pic của đồng phân geranial
25
2.2.21. Hình 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với
đồng phân neral
28
2.2.22.

Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml 32

2.2.23.

Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml 33

2.2.24.

Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml 34


2.2.25.

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.2.26.

Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước 2

2.2.27.

Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu 4

2.2.28.

Bảng 3.1. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25
µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung mơi ACN : H2O
= 70 : 30 (v/v) 18

2.2.29.

Bảng 3.2. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25
µg/ml tại bước sóng phát hiện 233 nm với hệ dung mơi ACN :
MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v)
19

2.2.30.

Bảng 3.3. Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml
2.2.31.
trong điều kiện sắc ký được lựa chọn 20

2.2.32.

Bảng 3.4. Thông số các pic của dung dịch citral 20 µg/ml và dung
dịch geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện 200 nm
22

2.2.33.

Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ
dung dịch và diện tích pic của đồng phân neral

23

2.2.34.

Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ
dung dịch và diện tích pic của đồng phân geranial
25

2.2.35.

Bảng 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral 26

2.2.36.

Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial 27

2.2.37.

Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng
phân geranial
29

2.2.38.

Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương
pháp đối với đồng phân neral
30

2.2.39.

Bảng 3.11. So sánh một số phương pháp định lượng citral 35

2.2.40.

Bảng 4.1. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với neral 38

2.2.41. Bảng 4.2. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với geranial 39


2.2.42.


2.2.43.

MỞ ĐẦU

2.2.44.
2.2.45. Sả chanh (Cymbopogon citratus) còn được gọi là cỏ sả, lá
sả, hương mao, thuộc họ Lúa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới. Cây cao
khoảng 1,5 m sống lâu năm mọc thành bụi, phân nhánh nhiều. Sả không
những được sử dụng làm gia vị trong chế biến các món ăn mà cịn được
sử dụng ở nhiều nước trên thế giới [16]. Tại Việt Nam, cây sả chanh dễ
trồng, thích hợp với nhiều loại đất ở các vùng trung du, miền núi và mang lại
hiệu quả kinh tế cao.
2.2.46. Tinh dầu sả chanh được các nhà khoa học quan tâm bởi
khả năng ức chế hoạt động sống của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh và
hoạt tính dược lý của nó. Priyanka Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh
hưởng của tinh dầu sả chanh đến sự phát triển và khả năng sản sinh độc tố
của Aspergillus flavus. Kết quả cho thấy tinh dầu sả chanh ức chế hoàn toàn
sự phát triển của nấm mốc A. flavus [38] và ức chế sự hình thành của

các biofilm gây nên bởi Candida albicans, Listeria monocytogenes (biofilm
là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn trong công nghiệp sản xuất thực
phẩm bởi chúng rất khó bị loại trừ trong q trình vệ sinh hệ thống trang
thiết bị) [21,27]. Một số cơng trình nghiên cứu về thành phần tinh dầu sả
chanh (Cymbopogon citratus) cho thấy thành phần chính của tinh dầu sả
chanh là citral, bao gồm hai đồng phân geranial (citral-A) và neral (citralB) [6].
2.2.47. Tại Việt Nam, tinh dầu sả chanh khá phổ biến trên thị trường
nhưng chất lượng chưa được kiểm soát chặt chẽ. Nhằm kiểm soát chất lượng
của tinh dầu sả chanh, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình định lượng
citral trong tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá
các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người (International
conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human use) và ứng dụng phương pháp để xác định hàm
lượng citral trong một số sản phẩm thương mại.
2.2.48.
2.2.49.
2.2.50.
2.2.51.
2.2.52.
2.2.53.


2.2.54.
2.2.55.

1


2.2.56.

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

2.2.57.
1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh
2.2.58. Cây sả chanh tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc
họ Poaceae, là một loại thảo dược ở vùng nhiệt đới và có nguồn gốc từ
Ấn Độ và Sri Lanka [32]. Loài cây này được sử dụng ở nhiều nước trên thế
giới với nhiều tên gọi khác nhau (bảng 1.1).
2.2.59.
2.2.60.
2.2.61.
2.2.63.
2.2.65.
Arabic)
2.2.67.

Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước [45]
2.2.62.

Đất nước

Tên gọi

2.2.64.
Lemon grass,
Citronella
2.2.66. ِ‫( يش َةش ل َلا يش نوو‬
Hashisha al-limun)
2.2.68.

(Chou geung)

English
Middle Eastern (
Chinese

2.2.69.

(Fung

maauh) (Chou geung) 
(Fung maauh) 
(Nihng mung chou)

2.2.70.

Malaysia

2.2.71. Serai, Serai dapur

2.2.72.

Dutch

2.2.73. Citroengras, Sereh

2.2.74.

French

2.2.75. Verveine des Indes

2.2.76.

German

2.2.78.

2.2.82.

2.2.77.
Zitronengras, Citronella,
Lemongras
2.2.79. Λεμονόχορτο
(Lemonochorto )

Greek

2.2.80.
Κιτρονέλλα
(Kitronella)
(Cymbopogon
2.2.83.
‫( בשע ןומיל‬Essef
limon)

Hebrew

2.2.84.
2.2.85.

2


2.2.86.
2.2.87.
2.2.89.
2.2.91.
2.2.93.

India (Hindi)

2.2.88.
‫( ןומיל סארג‬Limonit
rehanit)
2.2.90.Sera, Verveine

Italian
Russian

2.2.94.

2.2.92.
Cimbopogon
e
Лимонное

сорго(Limonnoe sorgo) Лимонная
2.2.95.

2.2.98.

Spanish

трава(Limmonaya
trava)de limón,
2.2.96.
Zacate
Te de limón, Ca
de

Japanese

2.2.97.
Limón, Citronella, Hierba
2.2.99.

(Remonso)

2.2.101.
2.2.103.

Turkish
Vietnamese

2.2.100.

(Remonguraso
2.2.102. Limon out
2.2.104.

Sa)

Sả chanh, Sả (Sa chanh,

2.2.105.
2.2.106. Cây được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và
thích hợp với khí hậu ẩm ướt trong điều kiện đầy đủ ánh nắng mặt trời. Trong
điều kiện được hỗ trợ, cây sẽ chịu đựng được các loại khí hậu khác. Tuy
nhiên, ở khu vực ôn đới, cây không sống được vào mùa đơng vì rễ bị đóng
băng [49]. Loại cây nhiệt đới này phát triển nhanh thành cụm dày đặc, có
thể đạt chiều cao 180 cm và chiều rộng khoảng 120 cm. Lá rộng khoảng 3
cm, dài khoảng 90 cm, đầu lá nhọn rủ xuống và có màu xanh hơi sáng [50].
Cây sả chanh có lẽ được biết đến nhiều nhất vì sự xuất hiện trong ẩm thực
Thái Lan và Việt Nam. Sả chanh cũng được sử dụng trong các loại trà thảo
dược và đồ uống không cồn khác, trong các món nướng và trong bánh kẹo.
Sả chanh từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ như một loại
thuốc để hạ sốt, làm giảm ợ hơi trong đường tiêu hóa, chống nhiễm trùng và
chống côn trùng rất hiệu quả [39]. Tinh dầu chiết xuất từ sả chanh được
sử dụng rộng rãi như một hương thơm trong nước hoa và mỹ phẩm vì có
đặc tính khử mùi tốt. Trong liệu pháp mùi hương, tinh dầu sả chanh được
sử dụng như một chất chống trầm cảm, làm dịu cơn đau nhức và giảm căng
thẳng [39].
2.2.107.
2.2.108.


2.2.109. 3


2.2.110. Tinh dầu sả chanh có thành phần chính là citral. Chất

lượng của tinh dầu sả chanh được xác định bởi hàm lượng citral, mùi thơm
của tinh dầu sả chanh do thành phần aldehyd quyết định [34]. Trong tinh dầu
sả chanh, đồng phân trans geranial (40 đến 62%) chiếm ưu thế so với đồng
phân cis neral (25 đến 38%) [37].
1.2. Giới thiệu chung về citral
1.2.1. Nguồn gốc
2.2.111. Citral là thành phần chính của một số loại tinh dầu (bảng 1.2) [15,25,30].
2.2.112.
2.2.113.

2.2.114.

Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu
Loại tinh dầu

2.2.116. Backhousia
citriodora
2.2.118.
Litsea
citrata
2.2.120.
Litsea
cubeba
2.2.122. Cymbopogon
citratus
2.2.124.
Leptospermum
liversidgei
2.2.126. Ocimum
gratissimum

2.2.128. Lindera citriodora
2.2.130.
Calypranthes
parriculata
2.2.132. Petitgrain
2.2.134. Eucalyptus
staigeriana
2.2.136. Aloysia citriodora
2.2.138. Melissa officinalis

2.2.115. Hàm lượng citral
(%)
2.2.117.
90-98
2.2.119.

90

2.2.121.

70-85

2.2.123.

65-85

2.2.125.

70-80

2.2.127. 66,5
2.2.129.

65

2.2.131.

62

2.2.133.

36

2.2.135.

26

2.2.137.
2.2.139.

30-35
11

2.2.140.
2.2.141. Citral là một aldehyd có cơng thức C10H16O được phân lập lần
đầu tiên bởi Bertram [8] từ tinh dầu Backhousia citriodora. Năm 1890,
Dodge phân
2.2.142.
lập được citral từ tinh dầu sả chanh [12]. Sau đó, Tiemann và các cộng sự [23]
2.2.143.

2.2.144.
phân lập được đồng thời hai đồng phân geranial (citral A) và neral (citral B)
2.2.145.
2.2.146. 4


2.2.147.
2.2.148.
của citral. Citral A dễ dàng tách khỏi citral B bằng phương pháp bisulphate
2.2.149.
2.2.150.
natri được đề xuất bởi Tiemann [44].
2.2.151.
1.2.2. Cấu trúc và tính chất
2.2.152. Citral có danh pháp quốc tế là 3,7-dimethyl-2,6-octadienal,
khối lượng mol phân tử là 152,237 g/mol. Citral có số CAS là 5392-40-5, mã
Pubchem là 638011 [51].
2.2.153. Citral là một chất lỏng màu vàng nhạt, có mùi chanh mạnh.
Citral hòa tan trong nước rất kém (độ hòa tan trong nước là 0,059 g/100ml ở
250C); hòa tan được trong rượu (độ hòa tan trong rượu là 1 ml trong 7ml cồn
70%); đồng tan trong benzen benzoat, diethyl phthalate, glycerin, propylene
glycol, dầu khoáng, dầu cố định và cồn 95%. Citral có khối lượng riêng
0.9 g/cm³ và
2.2.154.
nhiệt độ sơi ở 229 °C (502 K; 444 °F) [51].
2.2.155.
2.2.156.
Citral là hỗn hợp của hai đồng phần hình học monoterpene aldehyd có

2.2.157.
2.2.158.
cùng cơng thức phân tử là C10H16O. Hai đồng phân này có tên gọi lần lượt là
2.2.159.
2.2.160.
neral (Cis hay Z) và geranial (Trans hay E) cùng thể hiện tính chất vật lí gần
2.2.161.
2.2.162.
giống nhau.
2.2.163.


2.2.164.

2.2.165.
2.2.166.

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B)

1.2.3. Cơng dụng
2.2.167.
2.2.168.
Geranial có mùi chanh mạnh. Mùi chanh của neral ít nồng hơn, nhưng
2.2.169.
2.2.170.
ngọt hơn. Do đó Citral là một hợp chất hương thơm được sử dụng trong nước
2.2.171.
2.2.172.
hoa để tạo mùi hương của họ cam quýt. Citral cũng được sử dụng như một
2.2.173.

2.2.174.
hương liệu và làm tăng thêm mùi hương của tinh dầu sả chanh.
2.2.175.
2.2.176. Citral cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể chống lại
vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm do tinh dầu có tính chất
kỵ nước, có thể tấn cơng và phá vỡ màng tế bào, gây ảnh hưởng đến hệ
thống enzym dẫn đến ức chế hô hấp và gây chết tế bào. Do đó, citral được
sử dụng như một
2.2.177.
2.2.178. 5


2.2.179. chất bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, xà
phòng và mỹ phẩm [30].
2.2.180. Mặc dù citral trong tinh dầu sả chanh có khả năng xua đuổi
cơn trùng, tuy nhiên tinh dầu sả chanh lại có tác dụng hấp dẫn và được sử
dụng như "mồi nhử" để thu hút ong mật. Vì một trong những chất pheromone
từ ong chúa tiết ra giống như mùi của tinh dầu sả chanh. Do đó trong kỹ
thuật ni ong mật người ta dùng tinh dầu sả chanh như chất gọi đàn khi
đàn ong mới được chuyển vùng [24,33].
2.2.181.
2.2.182.

Citral còn được dùng để tổng hợp vitamin A, ionone và methylionone.

2.2.183.
2.2.184.
Citral đã được thử nghiệm lâm sàng rộng rãi, không gây biến đổi gen
2.2.185. hay gây ung thư [40].
1.2.4. Các phương pháp định lượng citral

2.2.186. Phương pháp chuẩn độ (theo dược điển Anh)
2.2.187. Tiến hành lấy 25 mẫu tinh dầu sả chanh nguyên chất và trộn
mỗi mẫu với ethanol tuyệt đối. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trên dung dịch
hydroxylamine hydrochloride và dung dịch xanh promophenol. Thêm axit
clohydric, hiệu chỉnh lượng axit clohydric theo phản ứng của hydroxylamine
với citral. Axit clohydric đã phản ứng được chuẩn độ từ từ với dung dịch kali
hydroxit etanolic chuẩn cho đến khi màu 19 chuyển từ màu vàng sang màu
xanh ơ liu. Hàm lượng citral được tìm thấy trong mẫu tinh dầu sả chanh là
69,89-76,95%.
2.2.188. Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại
2.2.189. Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được Wilson và
các cộng sự xây dựng để xác định hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh
vào năm 2002 [17]. Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại dựa trên sự
hấp thụ bức xạ điện tử ở các bước sóng trong phạm vi 750 – 2500 nm: Khi
có một chùm ánh sáng tới chiếu qua các mẫu, vùng ánh sáng cận hồng ngoại
(bước sóng 750 – 2500 nm) được các liên kết C-H, N-H, O-H có trong các
chất hữu cơ hấp phụ. Ghi nhận phổ ánh sáng phản xạ từ các mẫu sẽ thu được
các thông tin về thành phần hóa học của mẫu đó. Phổ thu được sẽ được
phân tích bằng phần mềm


2.2.190. 6


2.2.191. máy tính. Áp dụng mơ hình thống kê nhiều biến sẽ mô tả được
mối quan hệ giữa phổ hấp phụ và thành phần hóa học; mối quan hệ này là
cơ sở để xác định thành phần hóa học tại các máy phân tích (máy NIR) [46].
2.2.192. Các tác giả tiến hành lấy 26 mẫu tinh dầu sả chanh và quét
phổ trong khoảng 1100-2500 nm trên máy Foss NIR- System 6500 Rapid
Content Sample. Mỗi mẫu thu lấy 3 phổ (mỗi phổ là trung bình của 32

lần quét). Quang phổ sau đó được tính trung bình bằng phần mềm NSAS
phiên bản 3.52. Kết quả thu được hàm lượng citral trung bình trong mẫu tinh
dầu sả chanh là 75,77% (w/w) có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ
chính xác trung gian là 1,00% và RSD của độ đúng là 0,23% [46].
2.2.193. Tham chiếu với phương pháp định lượng citral trong tinh
dầu sả chanh quy định trong Dược điển Anh, phương pháp NIR có độ
chính xác tương đương. Tuy nhiên, phương pháp NIR có ưu điểm hơn so với
phương pháp của Dược điển Anh là thực hiện đơn giản hơn, không cần xử lý
mẫu và thời gian định lượng nhanh hơn [46].
2.2.194. Phương pháp sắc ký khí
2.2.195. Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây
dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong
mẫu tinh dầu sả chanh. Phân tích được thực hiện trên máy Agilent
technologies 5975 Inert Mass Selective Detector GC–MS. Sử dụng cột sắc
ký HP-5MS với chiều dài 30 mm, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp
phim mỏng 0,25 µm. Heli được sử dụng làm khí mang với tốc độ dịng
1ml/phút. Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250oC. Nhiệt độ bộ phận phát hiện
260oC. Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: duy trình nhiệt độ 75oC
trong 2 phút, tăng 4oC/phút cho đến 250oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10
phút. Kết quả thu được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là
72,57%.
2.2.196. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
2.2.197. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ
sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
Khi phân tích
2.2.198.

2.2.199. 7


2.2.200. sắc ký, các chất được hòa tan trong dung mơi thích hợp và hầu
hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các chất
không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,11,22,29].
2.2.201. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận
2.2.202. Phương pháp được Rauber và các cộng sự [50] xây dựng
để xác định hàm lượng citral có trong tinh dầu sả chanh. Phân tích sử dụng
pha động là n- hexane : ethanol (85:15, v/v) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút,
ghép với đầu dò UV được cài đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral.
Phương pháp sử dụng cột pha thuận CN. Kết quả thực nghiệm cho thấy,
thời gian lưu của citral là 13,8 phút. Trong khoảng nồng độ tiến hành có sự
tương quan chặt chẽ với độ lệch chuẩn se slopes là 1,78 và hệ số xác định
R2 = 0,9991. Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ đúng và độ
chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,37%.
2.2.203. Ứng dụng phương pháp trên, xác định được hàm lượng citral
trong mẫu tinh dầu sả chanh là 75,20%.
2.2.204. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
2.2.205. Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây
dựng để định lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong một
số mẫu tinh dầu. Phân tích sử dụng cột silicagel pha đảo Enable C - 18G (250
ì 4,6 mm, 5 à), pha ng là acetonitril : nước (70: 30, v/v) với tốc độ dòng
1 ml/phút; ghép với đầu dò DAD được đặt ở bước sóng 233nm để phát
hiện citral. Nhiệt độ cột 22oC, đầu dị có nhiệt độ 40oC và độ rộng khe
1,2 nm. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của neral và geranial
tương ứng là 7,246 phút và 7,680 phút. Trong khoảng nồng độ citral từ 3 –
100 µg/ml, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y
(mAU.min) và nồng độ dung dịch x (µg/ml) theo phương trình đối với đồng
phân neral là y = 230540x – 100165 (hệ số xác định R2 = 0,9996), phương

trình đối với đồng phân geranial là y = 260014x + 23521 (hệ số xác định R2
= 0,9964). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối
với đồng phân neral lần lượt là 0,062 µg/ml và 0,205 µg/ml, đối với đồng
phân geranial lần lượt là 0,059
2.2.206.

µg/ml và 0,198 µg/ml. Phương pháp
đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ
8


2.2.207. đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của
độ lặp lại ≤ 1,74%, RSD của độ chính xác trung gian ≤ 1,93%.
2.2.208. Ứng dụng phương pháp để định lượng citral có trong tinh
dầu của cây sả chanh, tinh dầu lá chanh ta và tinh dầu vỏ quả chanh tây. Kết
quả xác định được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 74,98%,
trong mẫu tinh dầu lá chanh ta là 2.09% và trong mẫu tinh dầu từ vỏ quả
chanh tây là 0,3%.
1.3. Thẩm định quy trình phân tích
2.2.209. Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung
và phương pháp”(Validation of analytical procedures: text and
methodology) của ICH (International conference on Harmonisation of
Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human
use) ban hành vào tháng 11 năm 2005 [43], các yếu tố của một quy trình
phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc
hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị. LOD và LOQ là các thơng số
khơng bắt buộc phải có trong quy trình thẩm định.
1.3.1. Tính đặc hiệu
2.2.210. Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
-Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau khơng có ý nghĩa

thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
-Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,14,43].
2.2.211. Phương pháp xác định
2.2.212. Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối
phổ, việc sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh
nhầm lẫn với các hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không
phải là pic của hai thành phần trở lên.
2.2.213. Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay
khơng thì tự tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu khơng
có sản phẩm phân huỷ.
2.2.214.
2.2.215.
2.2.216.
2.2.217. 9