Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Xác định hiệu suất, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phương pháp kết hợp enzym với axit

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của TS. Phạm Trung Sản và tham khảo thêm các tài liệu đã đƣợc
cơng bố trƣớc đó có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu nêu trong luận văn là kết
quả làm việc của tơi trong suốt q trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và
Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.

Nha Trang, ngày 23 tháng 10 năm 2020
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Trinh


LỜI CÁM ƠN
Trƣớc tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Trung Sản
và TS. Đào Việt Hà đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình
hồn thành luận văn. Và tơi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Hồng
- Phịng Nghiên cứu ăn mịn và Cơng nghệ điện hóa - Viện Nghiên cứu và
Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tơi hồn thành tốt phần thực
nghiệm của mình.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Cơng
nghệ, Phịng Đào tạo, Khoa Hóa học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng nhƣ hồn thành mọi
thủ tục cần thiết.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang cũng nhƣ các anh chị trong phịng Nghiên cứu ăn
mịn và Cơng nghệ điện hóa đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho
tôi trong q trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân
và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học

tập và hoàn thành luận văn.
Nha Trang, ngày 23 tháng 10 năm 2020
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Trinh


1
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN....................................................................................... 1
LỜI CÁM ƠN ............................................................................................ 2
MỤC LỤC ................................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................... 6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ....................................................... 7
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................ 9
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................... 11
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN.......................................................... 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 12
1.2.1. Giới thiệu chung về carrageenan ................................................ 12
1.2.2. Cấu trúc carrageenan ................................................................. 13
1.2.3. Tính chất lí hóa carrageenan....................................................... 15
1.2.4. Oligo carrageenan và ứng dụng .................................................. 18
1.2.4.1. Oligo carrageenan ............................................................. 18
1.2.4.2. Ứng dụng của oligo carrageenan ........................................ 19
1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về phƣơng pháp thủy
phân carrageenan thành oligo carrageenan ........................................... 22
1.2.5.1. Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở Việt Nam........... 22
1.2.5.2. Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở nƣớc ngồi ........ 23

1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA
RONG SỤN ............................................................................................. 26
1.3.1. Phân tích protein tổng số bằng phƣơng pháp Kieldahl ................. 26


2
1.3.2. Phân tích hàm lƣợng lipid tổng số bằng phƣơng pháp Folch ........ 27
1.3.3. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng tro ........................................ 27
1.3.4. Phƣơng pháp phân tích độ ẩm của rong biển khơ ........................ 27
1.3.5. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng sau thủy phân
................................................................................................................ 27
1.3.6. Phân tích trọng lƣợng phân tử của oligo carrageenan bằng phƣơng pháp
sắc kí thẩm thấu (GPC). ............................................................................ 27
1.3.7. Phân tích đặc trƣng cấu trúc oligo carrageenan bằng phổ hồng ngoại
( IR). ........................................................................................................ 29
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 30
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU............................................................. 30
2.2. DỤNG CỤ-THIẾT BỊ-HÓA CHẤT:................................................... 30
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 31
2.3.1. Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn .................. 31
2.3.1.1. Phân tích protein thơ bằng phƣơng pháp Kieldahl ............... 31
2.3.1.2. Phân tích lipid thơ bằng phƣơng pháp Folch ....................... 32
2.3.1.3. Phân tích hàm lƣợng tro..................................................... 33
2.3.1.4. Phân tích độ ẩm................................................................. 34
2.3.2. Phƣơng pháp thủy phân tạo oligo carrageenan ............................ 35
2.3.3. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng. .................. 35
2.3.4. Phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp sắc
ký thẩm thấu gel (GPC)....................................................................... 35
2.3.5. Phƣơng pháp phân tích đặc trƣng cấu trúc carrageenan bằng phổ IR
.......................................................................................................... 35

2.4. THỰC NGHIỆM ............................................................................... 36
2.4.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm .............................................................. 36


3
2.4.2. Thu và xử lý nguyên liệu ........................................................... 37
2.4.3. Thủy phân rong sụn bằng enzym kết hợp axit ở các điều kiện khác
nhau ................................................................................................... 38
2.4.3.1. So sánh hiệu suất thủy phân giữa mẫu xử lí enzym và khơng
xử lí enzym ................................................................................... 38
2.4.3.2. So sánh hiệu suất thủy phân trong thời gian xử lí enzym từ 1-2
ngày .............................................................................................. 39
2.4.3.3. So sánh hiệu suất thủy phân trong thời gian 60-120 phút ..... 40
2.4.4. Thu hồi oligo carrageenan .......................................................... 41
2.4.5. Phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng........................................ 41
2.4.6. Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lƣợng phân tử dịch thủy phân
.......................................................................................................... 41
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 42
3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN............................................ 42
3.2. HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CARRAGEENAN .................................. 43
3.2.1. Ảnh hƣởng của enzym trong quá trình thủy phân ........................ 43
3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lí enzym trong quá trình thủy phân .. 44
3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ............................................ 45
3.3. ĐẶC TRƢNG CẤU TRÚC OLIGO CARRAGEENAN ...................... 47
3.4. KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ OLIGO CARRAGEENAN ...................... 52
3.5. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN RONG SỤN KAPPAPHYSUS
ALVAREZII BẰNG PHƢƠNG PHÁP ENZYM KẾT HỢP AXIT ............. 55
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 57
4.1. KẾT LUẬN ...................................................................................... 57
4.2. KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 58


4
PHỤ LỤC ............................................................................................... 69


5
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

3,6 AG

3,6-AnhydroGalactose

3,6-AnhydroGalactose

GPC

Gel Permeation Chromatography

Sắc ký thẩm thấu gel

IR

InfraRed

Phổ hồng ngoại

κ -Car

Kappa carrageenan

Kappa carrageenan

ι -Car

Iota carrageenan

Iota carrageenan

λ-Car

Lamda carrageenan

Lamda carrageenan


6
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn .............................................. 12
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của rong sụn – Kappaphycus alvarezii ........ 42
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của enzym trong quá trình thủy phân ........................ 43
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian xử lí enzym trong quá trình thủy phân .. 44
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân carageenan đến carbohydratcủa
mẫu xử lí enzym ........................................................................ 45
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân carageenan đến carbohydrat
của mẫu khơng xử lí enzym ....................................................... 46
Bảng 3.6. Một số dao động đặc trƣng của nhóm nguyên tử và các liên kết
trong phổ hồng ngoại của kappa carrageenan .............................. 50

7
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của carrageenan ............................................... 13
Hình 1.2. Cấu trúc của κ-carrageenan ........................................................ 14
Hình 1.3. Cấu trúc của ι –carrageenan........................................................ 14
Hình 1.4. Cấu trúc của λ -carrageenan ....................................................... 15
Hình 1.5. Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan ........... 17
Hình 1.6. Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành
galactobiose .............................................................................. 18
Hình 1.7. Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc .................................. 18
Hình 1.8. Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzym,
trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ. ......................... 19
Hình 2.1. Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ............................. 30
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm............................................................... 36
Hình 2.3. Qui trình xử lý rong biển trƣớc khi xử lí enzym........................... 37
Hình 2.4. Qui trình thủy phân mẫu xử lí enzym và mẫu khơng xử lí enzym 38
Hình 2.5. Qui trình thủy phân xử lí enzym 1-2 ngày. .................................. 39
Hình 2.6. Qui trình theo thời gian thủy phân .............................................. 40
Hình 3.1. Phổ hồng ngoại (IR) carageenan mẫu.......................................... 48
Hình 3.2. Phổ hồng ngoại (IR) oligo carragenaan xử lí enzym Viscozyme L
2% 1 ngày, thủy phân 60 phút ................................................... 49
Hình 3.3. Phổ hồng ngoại (IR) oligo carrageenan ủ enzym Viscozyme L 2% 1
ngày, thủy phân 120 phút ........................................................... 49
Hình 3.4. Phổ GPC carrageenan mẫu ......................................................... 52
Hình 3.5. Phổ GPC khi thủy phân rong sụn enzyne Viscozyme L 2% kết hợp
axit H3PO4 0,15M, 60 phút, ủ 1 ngày, 700C................................. 53

8
Hình 3.6. Phổ GPC khi thủy phân rong sụn enzyne Viscozyme L 2 % kết hợp
axit H3PO4 0,15M, ủ 1 ngày, 90 phút, 700C)................................ 53
Hình 3.7. Quy trình đề xuất thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng
phƣơng pháp enzym kết hợp axit ................................................ 56


9
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, nhiều loài rong biển đƣợc sử dụng để nghiên cứu trong lĩnh
vực nông nghiệp nhằm phát triển các dạng phân bón. Trong đó, rong sụn
Kappaphycus alvarezii đƣợc đặc biệt quan tâm vì thành phần chủ yếu κcarrageenan, nếu chúng ta thủy phân đƣa về dạng oligo ( κ-oligo carrageenan)
sẽ tác động tích cực đến sự sinh trƣởng của thực vật [1,2,3], ngoài ra rong sụn
Kappaphycus alvarezii cịn có chứa các khống chất vi lƣợng: niken, cabon,
kẽm, đồng, sắt... ; khoáng đa lƣợng nhƣ natri, canxi [4] đáp ứng tốt cho nhu
cầu sinh trƣởng, phát triển cho cây trồng.
Rong sụn Kappaphycus alvarezii chứa hàm lƣợng carrageenan khá cao
(40% trọng lƣợng chất khô). Carrageenan ngày càng đƣợc ứng dụng phổ biển
trong nhiều lĩnh vực khác nhau [4], [5], [6], [7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu
gần đây cho thấy việc thủy phân carrageenan đƣa về dạng oligo carrageenan
đang là xu hƣớng cần thiết. Bởi lẽ, oligo carrageenan là một loại
oligosaccharide có hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng vi-rút, chất
chống oxy hóa, chất điều hịa miễn dịch, chống viêm và chống khối u [8,9] và
nhiều ứng dụng thực phẩm nhƣ làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả
năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm. Đặc biệt oligo carrageenan cịn thúc đẩy
q trình quang hợp, kích thích sự sinh trƣởng ở thực vật [1,10] đƣợc nghiên
cứu và làm phân bón lá có hiệu quả rõ rệt [11,12,13].
Oligo carrageenan đƣợc đƣợc thủy phân bằng nhiều phƣơng pháp khác
nhau ( vật lí [14,15], hóa học [16,17,18], sinh học [19,20,21]). Trong phƣơng
pháp hóa học, phƣơng pháp thủy phân bằng xúc tác axit có một số lợi thế

quan trọng nhƣ tốc độ phản ứng nhanh, giá rẻ và dễ dàng có sẵn; nhƣợc điểm
là quá trình tách sản phẩm trong dịch thủy phân sẽ khó khăn.
Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng enzym để thu
carrrageenan có nhiều ƣu điểm carrrageenan thu đƣợc dễ dàng tinh chế. Bởi
vì, trong q trình thủy phân enzym làm suy yếu các mơ của rong biển và bào
mòn thành tế bào của thân rong, giúp cho quá trình chiết đƣợc triệt để và dễ
dàng hơn. Tuy nhiên, Tan và Lee, (2014) [22] cho thấy κ-carrageenan không
dễ dàng bị thủy phân bởi enzym do sự liên kết của κ-carrageenan và nƣớc tạo


10
một liên kết khá chắc chắn chống lại sự thủy phân của enzym dẫn đến hiệu
suất thủy phân không cao. Vì thế sử dụng axit H3PO4 nhƣ là một chất xúc tác
trong quá trình thủy phân carrageenan nhằm nâng cao hiệu suất thủy phân
rong sụn Kappaphycus alvarezii.
Nhằm đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp để tạo ra hiệu suất thủy phân
cao sử dụng sản phẩm (oligo carrageenan) từ rong sụn Kappaphycus alvarezii
làm phân bón trong nơng nghiệp. Vì vậy thực hiện đề tài ― Xác định hiệu suất,
trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong
sụn Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp kết hợp enzym với axit ‖ là cần
thiết, góp phần mở ra một hƣớng phát triển cho ngành nông nghiệp, đặc biệt
ngành công nghiệp phân bón nƣớc ta.
Mục tiêu của luận văn
Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc của oligo
carrageenan thu đƣợc bằng phƣơng pháp thủy phân enzym kết hợp axit
(enzym Viscozyme L và axit H3PO4 0,15M) ở các điều kiện khác nhau (ảnh
hƣởng của enzym, thời gian xử lí enzym, thời gian thủy phân), từ đó đƣa ra
quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích làm chất kích thích sinh trƣởng
trong nơng nghiệp.
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao

gồm:
-

Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau.

-

Đƣa ra các điều kiện thủy phân đạt hiệu suất thủy phân thích hợp.

Phân tích trọng lƣợng phân tử trung bình và đặc trƣng cấu trúc của
carrageenan trong dịch oligo carrageenan thu đƣợc sau quá trình thủy phân.


11
1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN
Rong sụn thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), phân lớp:
Rhodophyceae, bộ: Gigartinales, họ: Solieriaceae, giống: Kappaphycus,
lồi: alvarezii, trong đó lồi Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là lồi có sản
lƣợng lớn nhất [23].
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc trồng phổ biến với mục đích
làm thức ăn hoặc nhƣ một nguồn cung cấp carrageenan cho ngành cơng
nghiệp. Lồi này đã đƣợc ni thành cơng ở Philippines kể từ những năm
1970 và đã đƣợc giới thiệu ở hơn 20 quốc gia cho mục đích ni trồng thủy
sản. Gần đây, K. alvarezii đã thu hút sự chú ý đáng kể khơng chỉ nhƣ một
nguồn cung cấp carrageenans cịn là nguồn protein có giá trị thực tiễn trong y
học.
Vào năm 1993, Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
đã di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống và tiến hành
nuôi trồng thử nghiệm rong sụn tại các vùng ven biển của Việt Nam (Khánh

Hịa, Ninh Thuận…).
Rong sụn tƣơi thƣờng có màu xanh đỏ nâu hoặc màu xanh do trong
rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh
tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll. Rong sụn thuộc lồi đơn trụ bao
gồm 2 phần:
Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn.
Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thƣớc lớn, hình trịn hay
hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dƣỡng.
Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình trịn hay hình
bầu dục, khơng trong suốt, chứa đầy sắc tố. Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa
cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lƣợng rong khơ, đóng vai trị bảo vệ các
lớp bên trong [24].


12
Thành phần chính của rong sụn là carrageenan. Hàm lƣợng carrageenan
có thể chiếm đến 40% trọng lƣợng khơ của rong sụn. Thành phần hóa học cơ
bản của rong sụn nguyên liệu trình bày ở Bảng 1.1
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn [25]
Tên thành phần hóa học

% (khối lƣợng)

Protein

2,4

Cellulose

4,0

Ẩm

19,4

Tro tổng

20,0

Carrageenan

40,0

Thành phần khác

14,2

1.2. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN
1.2.1. Giới thiệu chung về carrageenan
Tên carrageenan có nguồn gốc từ loài rong biển Chondrus crispus đƣợc
gọi là Carrageen Moss hoặc Ailen Moss ở Anh, và Carraigin ở Ireland.
Carraigin đã đƣợc sử dụng ở Ireland từ 400 năm sau công nguyên dƣới dạng
gelatin và làm thuốc tại nhà để chữa ho và cảm lạnh.
Carrageenan đƣợc sử dụng trong nhiều ứng dụng thƣơng mại nhƣ chất
tạo gel, làm đặc và ổn định, đặc biệt là trong thực phẩm sản phẩm và nƣớc
sốt. Ngoài những chức năng này, carrageenan đƣợc sử dụng trong y học thực
nghiệm, dƣợc phẩm công thức, mỹ phẩm và các ứng dụng công nghiệp.
Từ thế kỷ 19, rong biển đỏ Chondrus crispus cũng đƣợc sử dụng trong
công nghiệp bia. Năm 1930 ở Mỹ bắt đầu sản xuất carrageenan thƣơng mại
chuyển từ bột rong biển khô sang carrageenan tinh chế [26]. Sau chiến tranh

thế giới thứ hai, việc đáp ứng lƣợng carrageenan ngày càng tăng cao. Do đó,


13
vào đầu những năm 1950. Quá trình phân đoạn chiết xuất carrageenan thơ ra
đời [27].
Carrageenan là thành phần chính của thành tế bào ở tảo đỏ hay
Rhodophyta, là một polysaccharide có chứa các đơn vị galactose lặp lại và
3,6-anhydrogalactose ở cả hai loại sulfat và khơng sulfat hóa [28]. Trong số
đó, κ-carrageenan chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thƣờng đƣợc
sử dụng cho các ứng dụng rộng rãi trong khoa học thực phẩm, công nghệ
dƣợc phẩm và nông nghiệp [29].
Trong cấu tạo của carrageenan gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) cịn LGalactose chiếm lƣợng rất nhỏ. Do đó, carrageenan tạo thành chủ yếu bởi các
mạch poly D-Galactose bị sulfat hoá có phân tử lƣợng 500 ÷ 700kDalton [30].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của carrageenan
Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan.
Ngồi mạch polysaccharide chính cịn có thể có các nhóm sulfat đƣợc gắn vào
carrageenan ở những vị trí và số lƣợng khác nhau. Vì vậy, carrageenan khơng
chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là các galactan
sulfat. Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có ký hiệu
riêng. Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [31]
1.2.2. Cấu trúc carrageenan
Bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân phát hiện carrageenan có
nhiều dạng cấu trúc hố học khác nhau. Dựa vào cấu trúc hố học, ngƣời ta có
thể phân carrageenan thành các loại nhƣ sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta
và xi. Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sulfat hố, vị trí sulfat hố, mức
độ dehydrat hoá của chuỗi polysacharid. Khối lƣợng phân tử của đại phân tử

14
carrageenan khoảng từ 105 đến 106 phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu và
quá trình chiết [32], [33], [34], [35].
Về cơ bản carrageenan chia thành 3 loại chính: κ-car, ι -car, λ -car.
Trong đó, κ-car chiếm thị phần lớn nhất (80%). Mu và Nu là chất ban đầu
tổng hợp nên kappa và iota, việc chuyển đổi này là do enzym dekinkase có
trong rong biển hay trong q trình sản xuất khi dùng xúc tác để loại nhóm 6
sulfat [30].
* κ-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn, có cấu tạo xen kẽ
giữa D- galactose-4-sulfat (GalS) và 3,6 anhydro D-galactose (GalA) (Hình
1.2). Cấu trúc phân tử của κ-car là vòng xoắn kép bậc III.

Hình 1.2. Cấu trúc của κ-carrageenan
*ι -carrageenan : là một loại car có số lƣợng gốc sulfat nằm trung gian
giữa số lƣợng gốc sulfat của κ-car và λ -car (Hình 1.3). Khi tạo gel, khối gel
của ι -car có tính đàn hồi tốt hơn khối gel của các loại carrageenan khác.

Hình 1.3. Cấu trúc của ι –carrageenan


15
*λ -carrageenan: Trong mạch phân tử gồm các đơn vị monomer gồm:
D- galactose-2-sulfat (1,3) và D-Galactose-2-6-disulfat nối xen kẽ với nhau
(Hình 1.4).

Hình 1.4. Cấu trúc của λ -carrageenan
Các loại carrageenan đều có tính đa phân tán, nhƣng chúng chỉ khác
nhau về thành phần sulfat ester và gốc quay quang. λ -Car có khối lƣợng phân
tử cao và mạch dài hơn κ-Car. Thành phần của phân đoạn này cũng phụ thuộc
vào nhiệt độ chiết và loại rong nguyên liệu [30], [35], [36].

Sự khác nhau của các loại carrageenan trên ở vị trí và số lƣợng nhóm
ester sulfat đính vào chuỗi polysacharide, do đó mỗi loại có tính chất vật lý và
hố học đặc trƣng khác nhau.
1.2.3. Tính chất lí hóa carrageenan

Khả năng phản ứng hóa học của carrageenan phụ thuộc chủ yếu vào
các nhóm este sulfat. Carrageenan là anion mạnh có thể so sánh với chất vô
cơ. Liên kết cation cùng với cấu trúc của đƣờng các đơn vị trong chuỗi
polyme xác định thuộc tính vật lý của carrageenan. Ví dụ: kappa- và iotacarrageenan tạo thành gel khi có của các ion kali hoặc canxi trong khi lamdacarrageenan thì khơng [37]. Chức năng của carrageenan trong các ứng dụng
khác nhau phụ thuộc phần lớn vào tính chất lƣu biến.
Carrageenan dạng polyme mạch thẳng, tan trong nƣớc, thƣờng tạo
thành các dung dịch nƣớc có độ nhớt cao. Độ nhớt phụ thuộc vào nồng độ,
nhiệt độ, sự hiện diện của các chất hòa tan khác và loại của carrageenan và
trọng lƣợng phân tử [38]. Độ nhớt tăng khi tăng nồng độ carrageenan và giảm


16
theo nhiệt độ. Nếu nhƣ nhiệt độ cao và độ pH thấp thì tốc độ thủy phân của
car càng nhanh [39].
Trong mơi trƣờng kiềm, carrageenan từ nhóm cấu trúc khơng có cầu
nối 3,6 – anhydro – D – galactose thành nhóm cấu trúc có cầu nối 3,6 –
anhydro – D – galactose [40]. Ví dụ: µ-, ν- carrageenan đƣợc xem là tiền thân
của κ- và ι- carrageenan. Sự hình thành liên kết cầu nối 3,6 – anhydro – D –
galactose trong tự nhiên đƣợc xúc tác bởi các enzym sulphohydrolase [39]


17

Hình 1.5. Q trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan [40]

18
1.2.4. Oligo carrageenan và ứng dụng
1.2.4.1. Oligo carrageenan
Tiến hành thủy phân carrageenan của các cấu trúc kappa, lamda và iota
thì mạch carrageenan bị cắt ngắn thu đƣợc oligo carrageenan . Những oligo
carrageenan này bao gồm khoảng 20 đơn vị galactose sulphat liên kết luân
phiên bởi liên kết glycoside β-1,4- và α-1,3- với nhóm sulphat ở vị trí 2, 4 và
6 của vịng galactose có hoặc khơng có đơn vị anhydrogalactose [11].
Carrageenan rất dễ bị axit và chất oxy hóa bẻ gãy các liên kết. Khi thủy
phân bằng axít yếu, các liên kết glycoside α-l,3- bị phá vỡ, tạo thành các
mảnh carrabiose. Mảnh carrabiose chính là galactose nên gọi là galactobiose
(Hình 1.6).

Hình 1.6. Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành
galactobiose
Trong trƣờng hợp thuỷ phân bằng axít đậm đặc, lực ion lớn khơng
những liên kết glycoside α- l,3- bị phá vỡ mà cả liên kết glycoside β-1,4- cũng
bị phá vỡ.

Hình 1.7. Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc [16]


19
Khi thuỷ phân bằng enzym, liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ, sản
phẩm đƣợc tạo thành là neocarrabiose (Hình 1.8). Khi thủy phân bằng enzym,
do có tính lựa chọn cao nên cần phải lựa chọn các enzym cho phù hợp.

Hình 1.8. Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzym,
trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ.

1.2.4.2. Ứng dụng của oligo carrageenan

 Ứng dụng trong thực phẩm và y học
Ngày nay, carrageenan đƣợc ứng dụng ngày càng phổ biến trong nhiều
lĩnh vực nhƣ y dƣợc cụ thể là chất kháng ung thƣ, sản phẩm nhiên liệu sinh
học, phụ gia trong thực phẩm, trong ngành công nghiệp dệt ..; Tuy nhiên oligo
carrageenan sản phẩm sau thủy phân carrageenan là vẫn còn giới hạn và đang
đƣợc các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc nghiên cứu. Cụ thể, luận văn thạc
sĩ, Bùi Huy Chích [6] sử dụng enzym Alpha-amylase Novo (hay cịn gọi là
Termamyl-Te) cho q trình thủy phân carrageenan từ rong sụn Kappaphycus
alvarezii (Doty) Doty với các điều kiện thủy phân [Te]=0,2 %;
[carrageenan]=0,75 %; pH=6,5; t0=80 0C; [Ca2+]=40 ppm; thời gian= 9 giờ.
Sản phẩm sau thủy phân là oligo carrageenan có khối lƣợng phân tử trung
bình là 51.885 Da và đƣợc ứng dụng để sản xuất nƣớc uống trà hòa tan.
 Oligo carrageenan dùng làm chất phụ gia chế biến và bảo quản
thực phẩm có hiệu quả để thay thế hàn the đƣợc Vũ Ngọc Ban và cộng sự
[41] đã cơng bố, điều kiện cho q trình thủy phân carrageenan ở pH ban đầu
= 1,0 – 1,5 với axit HC1 1N, nhiệt độ 60 °C với thời gian thủy phân là 120
phút. Với việc sử dụng phƣơng pháp đo độ nhớt, khối lƣợng phân tử trung
bình của carrageenan đƣợc xác định là 27,7 kDa. Kết quả nghiên cứu chỉ ra


20
rằng khi sử dụng oligo carrageenan với hàm lƣợng 0,3 % cho kết quả tƣơng
đƣơng với hàn the hàm lƣợng 0,5 %.
Trong luận án tiến sĩ vào năm 2017, Bùi Huy Chích [42] đã tiến hành
khảo sát và nghiên cứu ứng dụng oligo carrageenan trong sản xuất surimi từ
cá đổng sử dụng enzym polysaccharase để thủy phân carrageenan thành oligo
carrageenan: nồng độ carrageenan 1%, nồng độ enzym Termamyl 120 L 0,5
%, nhiệt độ 85 0C, pH = 6,5 và thủy phân trong 16 giờ. Sản phẩm oligo

carrageenan thu đƣợc có từ 2 đến 10 monose và có khối lƣợng phân tử trung
bình nhỏ hơn carrageenan khoảng 132 lần. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi
bổ sung oligo carrageenan 0,2 % vào surimi cá đổng có thể làm tăng chất
lƣợng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lƣợng của surimi trong q
trình bảo quản đơng.
 Trong y học, oligo carrageenan có khả năng chống oxy hóa [43],
chống viêm và điều hịa miễn dịch [28,44,45,46], chống đơng máu [43],
kháng khuẩn và đặc tính kháng virus [28,43,47,48,49,50] và chữa bệnh [51],
chống ung thƣ [43,52,53,54,55], với độc tính tế bào thấp [54] và cải thiện
năng lực miễn dịch bị tổn hại bởi các loại thuốc gây ra
Cụ thể, nghiên cứu của Haijn và cộng sự (2003)[56] oligo carrageenan
có trọng lƣợng phân tử 1.726 Da, khi dùng đƣờng uống với liều 100 mg/kg ở
chuột thì sự hình thành khối u bị ức chế rõ rệt. Tuy nhiên, hoạt tính chống
khối u của carrageenan có sulfonated cao ít hơn nhiều so với chế phẩm khơng
sulfonated hoặc sulfonated nhẹ. Hoạt tính của các superoxide dismutase và
catalase đƣợc tăng cƣờng đáng kể, điều này cho thấy carrageenan
oligosaccharide có hiệu quả trong việc thúc đẩy khả năng chống oxy hóa và
loại bỏ các gốc tự do.
 Ứng dụng trong nghành cơng nghiệp phân bón
Trong nơng nghiệp thƣờng sử dụng rong biển (chứa nhiều chất dinh
dƣỡng cho cây trồng) dƣới dạng bột nghiền làm phân bón nhƣng hiệu quả
không cao. Trong rong biển các thành phần dinh dƣỡng chính nhƣ N, P và K
trong khơng nhiều, đặc biệt là các vi lƣợng không đủ nên khi sản xuất phân


21
bón cho cây trồng ngƣời ta thƣờng sử dụng thêm một số vi lƣợng và sử dụng
đồng thời với các chất dinh dƣỡng chiết xuất bằng phƣơng pháp thủy phân
các chất giàu protein và khoáng chất, vitamin khác nhƣ cá biển, cám, đỗ
tƣơng.

Các oligo carrageenan thúc đẩy sự phát triển của thực vật bằng cách
tăng cƣờng quang hợp, đồng hóa nitơ, hình thành phơi, q trình chuyển hóa ,
phân chia tế bào, điều chỉnh tổng hợp phytohormone [1,57,58,59] và bằng
cách tăng cƣờng bảo vệ chống lại vi rút, nấm và nhiễm trùng do vi khuẩn
[47,60,61,62]. Ngoài ra, các oligosaccharide của carrageenan kích thích cho
sự tích lũy dinh dƣỡng và tái tạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa
và tạo quả tốt hơn. Do đó, oligo carrageenan có thể sử dụng nhƣ một chất tăng
trƣởng tự nhiên.
Alberto González và cộng sự [11] đã nghiên cứu oligo kappa
carrageenan có trọng lƣợng phân tử khoảng 10 kDa thu đƣợc bằng cách thủy
phân carageenan bằng axit có khả năng kích thích sự phát triển của cây bạch
đàn, làm tăng cƣờng chiều cao, đƣờng kính thân cây cũng nhƣ hàm lƣợng αcellulose lên 58 %, 44 % và 16 % tƣơng ứng, với liều lƣợng phun một tuần
một lần với tổng số là 4 lần phun. Một nghiên cứu khác của Lucille V. Abad
và cộng sự (2016) [12] cho thấy khi chiếu xạ κ-carrageenan ở mức 20 kGy và
30 kGy với tốc độ liều lƣợng 6 kGy/h sử dụng Co-60 tại Viện nghiên cứu hạt
nhân Philippine, oligo κ- carageenan đƣợc tạo ra có trọng lƣợng phân tử 1
kDa cho kết quả thử nghiệm trên cây cải thìa khá tốt. Với chu kỳ phun 2 lần
một tuần, sau 45 ngày phun trên lá thì chiều dài của chồi non đạt 308,98 mm
ở 1 kDa, cao hơn so với mẫu đối chứng phun bằng nƣớc là 252,23 mm; khi sử
dụng oligo κ-carrageenan với trọng lƣợng phân tử trung bình tăng lên 2 kDa
và 3 kDa thì chiều dài của chồi non lại giảm đi xuống còn 289,08 mm và
278,08 mm tƣơng ứng.
Một nghiên cứu phân bón cho cây sả từ oligo carrageenan, Minu Singh
và cộng sự (2017) [63] đã sử dụng oligo carrageenan thu đƣợc từ phƣơng
pháp chiếu xạ để phun. Với nồng độ oligo carrageenan 80 mg/L, chu kỳ phun
2 tuần một lần, sau 90 ngày và 120 ngày phun thì lƣợng tinh dầu xả tăng lên


22
18,9 và 25,0 %, hàm lƣợng citral 7,33 và 8,19 % và hàm lƣợng geraniol lên

9,2 và 8,9 % tƣơng ứng.
1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc về phƣơng pháp
thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan
1.2.5.1. Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở Việt Nam
Một số cơng trình nghiên cứu tại Việt Nam về oligo carrageenan nhƣ
Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự nghiên cứu sử dụng chùm electron năng lƣợng
thấp để cắt carrageenan thành oligo carrageenan. Tuy nhiên, phƣơng pháp này
đòi hỏi đầu tƣ thiết bị bức xạ khá tốn kém và ngƣời tham gia sản xuất phải có
trình độ kỹ thuật cao [64].
Bùi Huy Chích (2009) đã nghiên cứu và nhận thấy enzym Termamyl
120L là loại enzym thích hợp cho thủy phân carrageenan từ rong sụn K.
alvarezii. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy enzym amylase chỉ cắt
mạch liên kết glycoside mà không ảnh hƣởng đến sự phá vỡ cấu trúc phân tử
carrageenan [6],
Trần Đình Toại và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thủy phân
carrageenan chiết từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae để tạo oligo
carrageenan bằng phƣơng pháp sử dụng axit HCl. Kết quả phân tích cấu trúc
của sản phẩm oligo carrrageenan thu đƣợc bằng phƣơng pháp phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng
(LC- MS) cho thấy thủy phân carrageenan không làm thay đổi cấu trúc của
carrageenan mà chỉ phá vỡ các liên kết glycoside dẫn tới làm cắt ngắn mạch
polymer [7].
Sử dụng axit HCl để thủy phân carrageenan là một phƣơng pháp thƣờng
dùng trong nghiên cứu thủy phân carrageenan, phƣơng pháp này có ƣu điểm
là đơn giản. Tuy nhiên, sử dụng phƣơng pháp này để sản xuất oligo
carrageenan có nhƣợc điểm là gây nhiễm mơi trƣờng và độc hại cho ngƣời
trực tiếp sản xuất.
Trần Đình Toại và cộng sự (2009) đã tiến hành thủy phân carrageenan

23
bằng enzym Phitopain do trung tâm Kỹ nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học - Nga cung cấp. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thủy phân carrageenan bằng
enzym Phitopain làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của carrageenan, chỉ có
tác dụng phá vỡ các liên kết glycoside, cắt ngắn mạch tạo thành oligo
carrageenan [65]. Tuy nhiên, enzym Phitopain không phải là enzym thƣơng
mại nên chƣa có cơng bố về thành phần của enzym và hiện khơng có bán ở thị
trƣờng Việt Nam.
Trong luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng (2019) đã sử dụng axit H2SO4,
ascorbic thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii thu hồi oligo
carrageenan[66]. Kết quả cho thấy axit H2SO4 làm thay đổi cấu trúc
carrageenan, axit ascorbic không làm thay đổi cấu trúc. Tuy nhiên cả 2 axit
đều làm cho q trình tinh chế carrageenan gặp khó khăn.
1.2.5.2. Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở nước ngồi
 Phƣơng pháp hóa học.
Sang-Bum Lee và cộng sự (2015) [17] nghiên cứu quá trình thủy phân
rong sụn Kappaphycus alvarezii sử dụng H2SO4. Tối ƣu hóa các điều kiện
thủy phân, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng ở nhiệt độ thủy phân 160 0C, nồng
độ axit 1,09 % và thời gian thủy phân 20 phút thì hàm lƣợng glucose thu đƣợc
là 2,15 g/L. Cùng điều kiện thủy phân, nồng độ axit giảm còn 1,02 % thì
hàm lƣợng galactose thu đƣợc 14,47 g/L.
Khi khảo sát các loại axit có hằng số phân ly pKa khác nhau
(CH3COOH, HCOOH, H3PO4, CF3COOH, HNO3, H2SO4, và HCl) với điều
kiện thủy phân bao gồm 2 % (w/v) κ-carrageenan, nồng độ axit 0,2 M, nhiệt
độ thủy phân 100 oC và thời gian thủy phân 1 giờ, kết quả nghiên cứu của
Jeong Ah Kim và Sun Bok Lee (2016) [16] cho thấy chỉ có 3 loại axit
CF3COOH, HCl và HNO3 cho ra 3,6- anhydro-Dgalactose (D-AnG) có hàm
lƣợng cao hơn 2 g/L. Tiếp tục khảo sát các điều kiện thủy phân tối ƣu thì khi
thủy phân bằng axit HCl sẽ tạo ra D-AnG có hàm lƣợng cao nhất 2,81 g/L khi
thủy phân ở T = 100 °C và t = 30 phút với 0,2 M HCl.