Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời omeprazole, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC DAD)

NGUYỄN LÊ VÂN HÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN LÊ VÂN HÀ

QUẢN LÝ VÀ CUNG ỨNG THUỐC

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE,
RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG
HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD)

KHÓA 2013

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

TPHCM – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN LÊ VÂN HÀ

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD)

Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: DS. Dương Đình Chung

TPHCM – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình
nào khác.
Chữ ký SV

SV. Nguyễn Lê Vân Hà


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS.
Dương Đình Chung, người thầy đã tận tình hướng dẫn cũng như truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp tôi
bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và hồn thành tốt khóa luận
này.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị trong bộ mơn Hóa phân
tích – Kiểm nghiệm cũng như các thầy cô trong khoa Dược – trường Đại học
Nguyễn Tất Thành đã tận tình truyền dạy cho tơi những kiến thức quý báu và giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại trường.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến các thầy cơ, các cán bộ trường Đại học Nguyễn
Tất Thành, những người đã trang bị cho tôi rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình

học tập để tơi có được thành quả ngày hơm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn!


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs ......................................................................2
1.1.1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton ..................................2
1.1.2. Cơng thức hóa học và tính chất ................................................................3
1.1.3. Cơ chế tác dụng ........................................................................................4
1.1.4. Dược động học .........................................................................................4
1.1.5. Dược lực học ............................................................................................4
1.1.6. Tác dụng không mong muốn ....................................................................4
1.1.7. Chỉ định ....................................................................................................4
1.1.8. Chống chỉ định .........................................................................................5
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG
DỊCH SINH HỌC ...................................................................................................5
1.2.1. Trên thế giới .............................................................................................5
1.2.2. Trong nước ...............................................................................................7
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ...............................8
1.3.1. Cơ sở lý thuyết..........................................................................................8
1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC .........................................................8
1.3.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký ...........................................9
1.3.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký................................11
1.3.5. Một số phương pháp tính tốn kết quả định lượng bằng HPLC ............13
1.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 14
1.4.1. Khái niệm ...............................................................................................14
1.4.2. Các chỉ tiêu thẩm định ............................................................................14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................18

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.......................................18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................18
2.1.2. Hóa chất, dung mơi.................................................................................18

i


2.1.3. Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu ........................................................18
2.1.4. Dụng cụ, máy móc, thiết bị ....................................................................18
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................19
2.2.1. Các dung dịch thử nghiệm ......................................................................19
2.2.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................20
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ............................................................26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................28
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .............................................................28
3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện ....................................................28
3.1.2. Kết quả khảo sát pha động......................................................................29
3.1.3. Lựa chọn nội chuẩn ................................................................................34
3.2. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU ....................................................................36
3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN ................................39
3.3.1. Tính tương thích hệ thống ......................................................................39
3.3.2. Thẩm định tính đặc hiệu .........................................................................42
3.3.3. Thẩm định độ tuyến tính.........................................................................45
3.3.4. Giới hạn định lượng dưới .......................................................................48
3.3.5. Thẩm định độ đúng, độ lặp lại ................................................................49
3.3.6. Hiệu suất chiết ........................................................................................54
3.3.7. Độ ổn định ..............................................................................................54
3.4. BÀN LUẬN ...................................................................................................62
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................67
4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................67

4.2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ACN

Acetonitril

Acetonitril

AUC

Area Under Curve

Diện tích dưới đường cong
Nồng độ đỉnh

Cmax
CTCT

Cơng thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

CV

Coefficient of Variation

Hệ số biến thiên

DĐVN

Dược điển Việt Nam

EMA

European Medicine Agency

FDA

Food and Drug Administration

HQC

High Quality Control Sample

HPLC

High Performance Liquid

IS

Cơ quan quản lý thực phẩm và
thuốc Hoa Kỳ
Mẫu kiểm tra nồng độ cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography

Huyết tương

HT
IDM

Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu

Indomethacin

Indomethacin

Internal Standand

Chất nội chuẩn
Khối lượng phân tử

KLPT
Lower Limit Of Quantification

Giới hạn định lượng dưới

LPZ

Lansoprazole

Lansoprazol

LQC

Lower Quality Control Sample

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

Methanol

Methanol

Mobile phase

Pha động

MQC

Middle Quality Control Sample

Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

OPZ

Omeprazole

Omeprazol

Photodiod array

Dãy diod quang

LLOQ

MeOH
MP

PDA/
DAD

iii


PPIs

Proton Pump Inhibitors

Ức chế bơm proton

PPZ

Pantoprazole

Pantoprazol

RPZ

Rabeprazole

Rabeprazol

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

Standard

Chất chuẩn

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

S
SD
SKD

Sinh khả dụng

SKĐ

Sắc ký đồ

S/N

Signal/Noise

SW

Standard Working

Dung dịch chuẩn làm việc

TB

Trung bình

TĐSH
TEA
USP
UV-Vis

Tương đương sinh học
Triethylamine

Triethylamin

The United States

Dược điển Mỹ

Pharmacopoeia

Ultraviolet - Visible

Tử ngoại - khả kiến

iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu .......................................................................20
Hình 3.1. Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ ...........................................................29
Hình 3.2. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) ..30
Hình 3.3. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (75 : 25) ..30
Hình 3.4. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) .....31
Hình 3.5. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (25 : 75) .....31
Hình 3.6. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm natri acetat 5 mM, pH 7,6 (25 : 75)
...................................................................................................................................32
Hình 3.7. SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45)........33
Hình 3.8. SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, ...................33
Hình 3.9 SKĐ: a. chất nội chuẩn domperidone và PPIs; b. chất nội chuẩn
metronidazole và PPIs và c. chất nội chuẩn indomethacin và PPIs ..........................35
Hình 3.10. SKĐ: a. huyết tương trắng; b. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương
pháp gây tủa protein với MeOH; c. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây
tủa protein với MeOH thêm dung dịch kiềm hóa KOH, d. Mẫu huyết tương xử lý
bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng và e. Mẫu chuẩn, nội chuẩn pha trong
pha động (hệ pha động số 7). ....................................................................................38
Hình 3.11. SKĐ: a. mẫu huyết tương trắng; b. mẫu thử giả lập; c. mẫu huyết tương
chứa mẫu thử thêm chuẩn; d. mẫu pha động ............................................................43
Hình 3.12. Phổ hấp thu UV: a. IS; b. PPZ; c. OPZ; d. RPZ ; e. LPZ; Độ tinh khiết
pic: f. IS; g. PPZ; h. OPZ; i. RPZ ; j. LPZ ................................................................44
Hình 3.13. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ

của PPZ .....................................................................................................................45
Hình 3.14. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ
của OPZ .....................................................................................................................46
Hình 3.15. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ
của RPZ .....................................................................................................................47
Hình 3.16. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ
của LPZ .....................................................................................................................48

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cơng thức hóa học và tính chất của các PPIs.............................................3
Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch
sinh học đã được công bố trên Thế giới ......................................................................5
Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu ....................................................18
Bảng 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................................18
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu ...................................................................23
Bảng 3.1. Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu ........................39
Bảng 3.2. Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống ...................................41
Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ................................................45
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ ...............................................46
Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ ...............................................47
Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ ...............................................48
Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3
ngày) ..........................................................................................................................49
Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày....50
Bảng 3.9. Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng) ..............................................51
Bảng 3.10. Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ ...............................................52
Bảng 3.11. Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ ...............................................53

Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS ............55
Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của PPZ trong huyết tương ..................57
Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của OPZ trong huyết tương .................58
Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của RPZ trong huyết tương..................59
Bảng 3.16. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của LPZ trong huyết tương ..................60
Bảng 3.17. Kết quả phân tích thống kê nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương ...61

vi


TĨM TẮT
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018
XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE,
PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD)

Nguyễn Lê Vân Hà
Hướng dẫn khoa học: DS. Dương Đình Chung
Mở đầu
Nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) bao gồm Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ),
Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ), được dùng để điều trị bệnh trào ngược dạ dày - thực quản,
loét dạ dày tá tràng,...Tuy nhiên việc định lượng riêng lẻ từng hoạt chất trong nhóm thuốc này phải qua
nhiều quy trình khác nhau gây phức tạp và tốn kém. Do đó, mục tiêu của đề tài là xây dựng và thẩm
định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp
HPLC theo hướng dẫn của FDA. Đồng thời ứng dụng quy trình này để phát triển vào nghiên cứu dược
động học lâm sàng đối với nhóm thuốc PPIs.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các thuốc OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương.
Phương pháp nghiên cứu: xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và
RPZ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD).

Kết quả
Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời bốn PPIs trong huyết tương bằng phương pháp
HPLC là: Cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), đầu dị DAD với bước sóng phát hiện
285 nm, pha động là hỗn hợp nước 0,3 % TEA (pH = 7,2 được điều chỉnh bằng acid acetic) – ACN –
MeOH (53 : 15 : 32, tt/tt/tt), tốc độ dịng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, nhiệt độ cột là 45ºC.
Quy trình đã được thẩm định đạt các chỉ tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính
xác, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ ổn định theo hướng dẫn của FDA.
Kết luận
Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dị dãy diod quang. Quy trình đã được thẩm định, đáp
ứng đầy đủ yêu cầu của một quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn của FDA.
Từ khóa: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, định lượng, thẩm định.


ABSTRACT
Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 -2018

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY METHOD (HPLC – DAD) FOR THE SIMULTANEOUS
DETERMINATION OF OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE AND
LANSOPRAZOLE IN HUMAN PLASMA

Nguyen Le Van Ha
Supervisor: B.S. Duong Dinh Chung
Introduction
Proton pump inhibitors (PPIs), viz. Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ), Pantoprazole (PPZ) and
Rabeprazole (RPZ), are used for treating gastro-oesophagal reflux disease, duodenal gastric
ulcers,...However, the quantitation of these compounds is often complex and difficult as each
component requires each analytical procedure. Therefore, the aim of this study is to develop and
validate a simple and rapid reverse-phase HPLC method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ,

PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines. The developed method is applied to
a pharmacokinetic study for PPIs.
Materials and methods
Materials: OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma.
Methods: Developing and validating the method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and
RPZ in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC - DAD).
Results
The separation of the four components was performed on XDB Zobrax C18 column (150 x 4.6 mm, 5
µm), using the mixture of 0.3% triethylamine (pH 7.2 adjusted with acetic acid) – acetonitrile –
methanol (53 : 15 : 32, v/v/v) as a mobile phase. An isocratic elution was made at 45ºC, flow rate of
1.0 ml/min with 20 μL injection volume. The UV detection was performed at 285 nm.
Validation results showed that the method is suitable for the HPLC system and the procedure obtained
the specificity, accuracy, precision, lower limit of quantitation, linearity, and stability according to the
FDA guidelines.
Conclusion
A reverse-phase HPLC method was developed and validated for the simultaneous determination of
OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines.
Keywords: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, Quantitation, Validation.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Loét dạ dày - tá tràng là bệnh đứng đầu về mức độ phổ biến trong số các bệnh
lý đường tiêu hóa. Ước tính khoảng 10 % dân số thế giới mắc bệnh ở mọi lứa tuổi,
không phân biệt giới tính và mỗi năm tăng thêm khoảng 0,2 % dân số mắc bệnh.
Trước thực trạng đó, nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm
kháng acid, kháng histamin H2 hay ức chế bơm proton…được sử dụng trong điều
trị. Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) thường được kê đơn nhiều vì
ưu điểm cho tác dụng nhanh, hiệu quả làm lành vết loét có thể đạt đến 95% sau tám
tuần điều trị; thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố
nội tại và sự co bóp dạ dày [5].

Omeprazole (OPZ), Lansoprazole (LPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole
(RPZ) là các đại diện quan trọng và được kê đơn phổ biến nhất của nhóm ức chế
bơm proton. Để có được sự điều chỉnh liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh
nhân thì việc kiểm sốt nồng độ các hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết,
từ đó, làm định hướng giúp bác sĩ thực hiện kê đơn thuốc an toàn và hiệu quả. Tuy
nhiên, cho đến nay, nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện
phịng thí nghiệm để định lượng đồng thời các hoạt chất này trong huyết tương. Do
đó, xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng một quy trình chung,
nhanh chóng, chính xác, đơn giản và tiện lợi để xác định đồng thời 4 hoạt chất trên
trong huyết tương nhằm phục vụ công tác điều trị cũng như đánh giá sinh khả dụng
(SKD) và tương đương sinh học (TĐSH), chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây
dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole,
Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)”. Đề tài được thực hiện với mục tiêu:
1. Nghiên cứu điều kiện sắc ký định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ
trong huyết tương.
2. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu.
3. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng và đề ra quy trình phân tích
thường quy để định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết
tương theo hướng dẫn FDA.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs
1.1.1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton
Thuốc PPI đầu tiên ra đời vào năm 1989 là OPZ, tiếp theo đó là sự ra đời của
các thuốc LPZ, PPZ và RPZ, esomeprazole và mới đây nhất là dexlansoprazole.
Các thuốc ức chế bơm proton gồm OPZ, esomeprazole, LPZ, PPZ và RPZ.

Chúng ức chế bài tiết acid dịch vị do ức chế hệ thống enzym H+/K+ – ATPase
(“bơm proton”) của tế bào thành dạ dày. Các thuốc ức chế bơm proton điều trị có
hiệu quả trong loét dạ dày và tá tràng, phối hợp với kháng sinh để tiệt trừ
Helicobacter pylori.
Trong bệnh trào ngược dạ dày – thực quản, chỉ dùng thuốc nhóm này khi có
triệu chứng nặng (lúc đầu ngắn ngày) và khi có các biến chứng như hẹp, loét, chảy
máu đã được xác định bằng nội soi (phải điều trị duy trì đủ liều bằng một thuốc của
nhóm này).
Các thuốc ức chế bơm proton cũng được dùng để phòng ngừa và điều trị các
trường hợp loét do dùng NSAID. ở những người phải tiếp tục dùng NSAID sau khi
vết loét đã liền, thông thường không nên giảm liều thuốc ức chế bơm proton vì tình
trạng lt khơng triệu chứng có thể xảy ra. Thuốc ức chế bơm proton có hiệu quả
trong điều trị hội chứng Zollinger – Ellison (kể cả các trường hợp kháng với các
điều trị khác) [6].

2


1.1.2. Cơng thức hóa học và tính chất
Bảng 1.1. Cơng thức hóa học và tính chất của các PPIs
OPZ

LPZ

PPZ

RPZ

CTPT

C17H19N3O3S

C16H14F3N3O2S

C16H15F2N3O4S

C18H21N3O3S

KLPT

345,4

369,36

383,4

358,4

Danh
pháp

5-methoxy-2-[(4-methoxy-3,5dimethylpyridin-2-yl)methylsulfinyl]-1Hbenzimidazole

2-[[3-methyl-4-(2,2,2trifluoroethoxy)pyridin-2-yl]methylsulfinyl]-1H-benzimidazole

6-(Difluoromethoxy)-2-[[(3,4imethoxypyridin-2-yl)
methylsulfinyl]-1Hbenzimidazole

2-[[4-(3-methoxypropoxy)-3methylpyridin-2-yl]methylsulfinyl]-1H-benzimidazole

Bột trắng hoặc gần như trắng.
Tan trong dicloromethan và
dung dịch kiềm loãng, hơi tan
trong
ethanol
96%
và
methanol, rất khó tan trong
nước [1], [21].

Bột kết tinh màu trắng hay nâu nhạt,
nhiệt độ nóng chảy khoảng 166°C.
Rất dễ tan trong dimethylformamid,
tan trong methanol, hơi tan trong
ethanol, khó tan trong ethyl acetat,
dicloromethan, rất khó tan trong
acetonitril, thực tế không tan trong
hexan và nước [1], [21], [22].

Bột kết tinh màu trắng hay gần
như trắng. Khó tan trong nước và
ethanol (96%), thực tế không tan
trong hexan. Rất dễ bị phân hủy
trong môi trường acid, thường
thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5
phân tử nước [4], [11], [14], [21].

Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi
vàng trắng. Khó tan trong nước và
ethanol, thực tế không tan trong

hexan. Rất dễ bị phân hủy trong
môi trường acid, thường thấy ở
dạng muối natri [21].

CTCT

Tính
chất

3


1.1.3. Cơ chế tác dụng
Các thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton là dẫn xuất benzimidazole, chúng
có cùng cơ chế là ức chế bơm H+/ K+ ATPase (còn gọi là bơm proton). Sau khi vào
trong cơ thể, ở pH ≤ 5, thuốc được proton hóa thành 2 dạng: acid sulphenic và
sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfhydryl của bơm H+/ K+
ATPase ở tế bào thành dạ dày nên ức chế bài tiết acid do bất kỳ nguyên nhân nào
[3], [6].
1.1.4. Dược động học
Khi dùng đường uống, các PPIs hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa nhưng thay
đổi tùy thuộc theo liều dùng và pH dạ dày. Sinh khả dụng theo đường uống có thể
đạt đến 70 % nếu dùng lặp lại. Các thuốc gắn mạnh vào protein huyết tương (> 95
%). Nhóm thuốc PPIs chuyển hóa chủ yếu qua gan, chất chuyển hóa được đào thải
chủ yếu qua nước tiểu (80 %), phần còn lại qua mật vào phân. Thời gian bán thải
khoảng 30 – 90 phút [3], [6].
1.1.5. Dược lực học
Thuốc ức chế đặc hiệu và không hồi phục bơm proton do tác dụng chọn lọc
trên tế bào thành dạ dày nên thuốc tác dụng nhanh và hiệu quả hơn các thuốc khác.
Tỷ lệ làm lành vết loét có thể đạt 95 % sau 8 tuần điều trị. Rất ít ảnh hưởng đến

khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày [2], [6].
1.1.6. Tác dụng khơng mong muốn
Thuốc có thể gây các rối loạn tiêu hóa như buồn nơn, táo bón hay tiêu chảy,
các rối loạn thần kinh trung ương như chóng mặt, nhức đầu, ngủ gà (ít gặp). Ngồi
ra, do thuốc gây ức chế tiết acid sẽ khiến pH dạ dày tăng lên, làm cho một số vi
khuẩn phát triển gây ung thư (hiếm). PPIs ức chế cytochrome P450 nên có thể ảnh
hưởng đến tác dụng của các thuốc khác khi dùng đồng thời [2], [6].
1.1.7. Chỉ định
 Trào ngược dạ dày - thực quản.
 Loét dạ dày, tá tràng.
 Dự phòng loét dạ dày, tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do
stress.
 Hội chứng Zollinger – Ellison [6].

4


1.1.8. Chống chỉ định
Quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc [6].
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC
1.2.1. Trên thế giới
Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới
Đối tượng
định lượng

Chuẩn nội

H.A. Dugger và
các cộng sự
(2001)

LPZ

Megesterol
acetat

[12]

OPZ

Chloramphenicol

[24]

[19]

dihydrophosphat pH 4,5 (46 :
54)

C18, 250 mm x
4,6 mm; 5µm

Thể tích

phát hiện

dịng

bơm

(nm)

(ml/phút)

mẫu (µl)

285

1,5

10

(ACN) (65 : 35), đã điều chỉnh

C18, 150 mm x

pH đến 6,5 bằng acid acetic

4,6 mm; 5 µm

302

1,0

20

290

1,0

100

băng

Ramakrishna và
cộng sự (2005)

ACN – đệm kali

Cột sắc ký

Tốc độ

Na2HPO4 0,05 M – acetonitril

K.H. Yuen và các
cộng sự (2001)

Pha động

Bước sóng

PPZ

Zonisamide

Đệm phosphate 10 mM (pH

C18, 250 mm x

6,0) – ACN (6 1: 39)

4,6 mm; 5 µm

5


Đệm amoni acetate 5 mM (đã

Ramakrishna và
các cộng sự

RPZ

PPZ

(2005) [20]

C18, 250 mm x

dung dịch natri hydroxit) –

4,6 mm; 5µm

284

1,0

100

1,0

20

1,0

20

1,0

50

ACN – MeOH (45 : 20 : 35)
Đệm amoni bihydro phosphate

Zeng Xiaohui và
các cộng sự

điều chỉnh pH đến 7,4 bằng

LPZ

OPZ

(2006) [23]

285 nm

0,01 M – ACN

C18, 150 mm x

với LPZ

(66 : 34), được thêm 1 ‰

4,6 mm; 5 µm

và 305nm

Octylamine

D.V. Bharathi và

OPZ,

cộng sự (2009)

LPZ, PPZ

[10]

và RPZ

với OPZ

Triethylamin (TEA) 0,1 % (pH
Zonisamide

= 6,0 được điều chỉnh bằng

C18, 75 mm x

acid ortho phosphoric) – ACN

4,6 mm; 3,5 µm

270

(72 : 28)
Định lượng OPZ

Maryam
Noubarani và các
cộng sự (2010)
[18]

và LPZ thì PPZ

290 nm

OPZ,

được sử dụng

Đệm phosphate 10 mM –

LPZ, PPZ

làm chất chuẩn

ACN (53 : 47), đã điều chỉnh

và RPZ

nội. Định lượng

pH đến 7,3 bằng TEA

PPZ và RPZ thì

C18, 150 mm x
4,6 mm; 5 µm

đối với
PPZ và
285 nm
với LPZ

LPZ được dùng

6


làm chất chuẩn
nội
Đệm Na2HPO4 0,05 M –ACN

R.F. Hussein và
cộng sự (2016)

[16]

OPZ

LPZ

(60 : 40), đã điều chỉnh pH đến
7,0 bằng acid phosphoric

Cột C18, 4,5 x
150 mm; 5 µm

302

1,0

100

Các PPIs cũng có thể được định lượng trong huyết tương bằng một số phương pháp khác như: phương pháp LC/MS,
LC/MS/MS [15], [25], [27], [28], [31] hay phương pháp điện di mao quản [30].
1.2.2. Trong nước
Năm 2010, Đào Văn Đôn và các cộng sự đã nghiên cứu định lượng PPZ trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC, sử
dụng chất nội chuẩn là LPZ. Với điều kiện sắc ký là cột Gemini C18, 250 mm x 4 mm; 5 µm. Pha động ACN – đệm K2HPO4 0,01
M, điều chỉnh pH đến 6,0 (39 : 61); tốc độ dịng là 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu là 100 µl. Đầu dị UV ở bước sóng 296 nm. Kết
quả cho thấy khảo sát độ tuyến tính trong khoảng nồng độ 20 – 5000 ng/ml. Phương pháp HPLC có độ chính xác trong ngày và
khác ngày lần lượt là 1,4 – 5,2 % và 1,5 – 4 %. Độ đúng trong ngày và khác ngày tương ứng là 99,3 – 102,2 % và 100,7 – 103,5 %
[7].

7

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Cơ sở lý thuyết
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Q trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion
hay tương tác hóa học trên bề mặt [8], [5].
1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
1.3.2.1. Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(thường là từ 0 - 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dịng ổn
định, phù hợp với q trình sắc ký [8], [5].
1.3.2.2. Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi
Bình chứa dung mơi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung
môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm) và đuổi khí
hịa tan trong dung mơi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) [8], [5].
1.3.2.3. Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ
thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay)
hay microsyringe tiêm trong hệ thống tiêm mẫu tự động [8], [5].
1.3.2.4. Cột sắc ký
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy
ra quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa
chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar.
Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của q trình sắc ký.
Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính 2 – 5
mm [8], [5].

8


1.3.2.5. Bộ phận phát hiện
Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân
tích mà sử dụng đầu dị thích hợp, hiện nay có các loại đầu dị sau: Đầu dị hấp thụ
UV – Vis, đầu dò phổ phát xạ nguyên tử, đầu dị huỳnh quang [8], [5].
1.3.3. Một số thơng số cơ bản của quá trình sắc ký
1.3.3.1. Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR
Thời gian lưu (tR): Là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua
cột sắc ký, tới bộ phận phát hiện và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc
xuất hiện đỉnh của pic. Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ,
với một chất nhất định tR là một hằng số khi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.
Trong một phép phân tích cịn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực
(tR’), được tính bằng cơng thức sau:
𝑡R’ = 𝑡R − 𝑡M
Với tM là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.
Nếu tR q nhỏ thì sự tách kém, cịn nếu tR q lớn thì pic bị giãn, thời gian
phân tích kéo dài.
Thể tích lưu (VR): Là thể tích dung mơi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới bộ phận phát hiện và cho pic trên sắc ký đồ.
VR = t R × Fc
Với Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian.
Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu
đến khi tín hiệu sắc ký đầu tiên ra khỏi hệ thống [8], [5].
1.3.3.2. Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố K là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng, xác định tốc độ trung
bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.
K =

CS
CM

Trong đó: Cs và CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động.

9


Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản
chất pha tĩnh và nhiệt độ cột. Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua
pha tĩnh càng chậm [8], [5].
1.3.3.3. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai
pha và được tính theo sức chứa của cột:
𝑘′ = 𝑘 ×

𝑣𝑆
𝑄𝑠
𝑡′𝑅
𝑡𝑅 − 𝑡0
=
=
=
𝑣𝑅
𝑄𝑀
𝑡′0
𝑡0

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc vào bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt
độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. Trong phân tích thường chọn cột,

pha động và các điều kiện phân tích sao cho 1 ≤ k’ ≤ 8 [8], [5].
1.3.3.4. Hệ số chọn lọc α
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất A và B, người ta dùng hệ
số chọn lọc α:
α =

𝐾𝐴
𝑘′𝐴 𝑡(R)A − 𝑡M
=
=
𝐾𝐵
𝑘′𝐵 𝑡(R)B − 𝑡M

Quy ước: Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1. Để tách riêng
hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [8], [5].
1.3.3.5. Hệ số đối xứng của pic F
𝐹 =

𝑊
2𝑎

Trong đó: W: Chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic; a: Khoảng cách
từ chân đường vng góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí
1/20 chiều cao pic [8], [5].
1.3.3.6. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:
𝑡𝑅 2
𝑡𝑅
)
𝑁 = 16 ( ) hay N = 5,54 (

𝑊
𝑊1⁄

2

2

Trong đó: W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic; W: Chiều
rộng của pic đo ở đáy pic [8], [5].
10


1.3.3.7. Độ phân giải Rs của cột
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
Rs =

2. [𝑡(R)A − 𝑡(R)B ]
1,18. [𝑡(R)A − 𝑡(R)B ]
hoặc
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵
𝑊1⁄ 𝐴 + 𝑊1⁄ 𝐵
2

2

Trong đó:
t(R)A, t(R)B: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).
WA, WB: Độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: Rs > 1, giá trị tối ưu để định lượng Rs > 1,5 [8], [5].

1.3.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.3.4.1. Lựa chọn pha tĩnh
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách
của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động, sắc ký
được chia thành 2 loại:


Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động khơng phân cực, chất phân

tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.


Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích

thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ
pha đảo, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt nên được sử dụng nhiều nhất.
Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:


R là các nhóm phân cực (ưa nước): Nhóm –OH hoặc các alkylamin –CH2-

NH2, alkyl nitril –CH2–CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để
phân tích các chất ít hoặc khơng phân cực [29].


R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng

cách alkyl hóa các nhóm –OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl (-R) của

mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm –OH thân
nước được thay thế bằng các gốc –R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica
11


đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân
cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [8].
Tuy vậy do hiệu ứng lập thể nên những nhóm –OH tự do chưa được thay thế
trong cấu trúc của pha tĩnh có thể gây ảnh hưởng xấu đến q trình sắc ký tùy theo
mơi trường pH phân tích. Trong mơi trường acid mạnh, pH < 2 thì có sự phân ly các
nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích
khơng thể tương tác với cột. Trong môi trường base (pH > 7), các nhóm –OH trong
cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác
của chất tan với nhóm –SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những
đỉnh ra khác nhau hay hiện tượng kéo đi làm cho việc phân tích diện tích hay
chiều cao pic có độ chính xác khơng cao. Một trong những cách khắc phục hiện
tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc
hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Ngồi ra, trong
một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ
phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp
chất phân cực mạnh [8], [29].
1.3.4.2. Lựa chọn pha động
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như: Nước, MeOH, ACN,… hoặc hỗn hợp của chúng.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thơng số của q trình sắc ký như:
Độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs,…nên việc phân tích, lựa chọn pha
động thích hợp rất quan trọng. Yêu cầu của một pha động [29]:


Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.



Hòa tan được chất cần phân tích.



Có độ tinh khiết cao.



Nhanh đạt trạng thái cân bằng trong q trình sắc ký.



Có tính kinh tế và không gây ô nhiễm môi trường.
Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả [29]:

12




Bản chất của dung môi để pha pha động.



Thành phần các chất trong pha động.



pH của pha động.



Tốc độ dòng của pha động.

1.3.4.3. Lựa chọn bộ phận phát hiện
Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ phận phát
hiện, sau đó chuyển thành tín hiệu và được ghi trên SKĐ. Đầu dị phổ biến nhất là
UV – Vis. Tùy theo chất phân tích mà người ta lựa chọn các bước sóng phát hiện
khác nhau [29].
1.3.5. Một số phương pháp tính tốn kết quả định lượng bằng HPLC
Tất cả các phương pháp tính tốn kết quả định lượng bằng sắc ký đều dựa trên
nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của nó.
Có 4 phương pháp tính tốn kết quả định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:
chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn và chuẩn hóa diện tích. Hiện nay, phương pháp
chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong dịch sinh học.
Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn
ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là
với những quy trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định
lượng thấp [8], [5].
Phương pháp chuẩn nội:


Nguyên tắc: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của

một chất tinh khiết (chất chuẩn nội - IS) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.


Yêu cầu với chất chuẩn nội:
 Trong cùng điều kiện sắc ký, IS phải được tách hồn tồn và có thời gian lưu
gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
 Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
 Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.
 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
 Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
13