) XÁC ĐỊNH MƠI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU CHO Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER SỬ DỤNG CƠ CHẤT BÃ TÁO TA VÀ VỎ CAM SÀNH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG
(Nghiên cứu sinh thực hiện)

XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU
CHO QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTIN
METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
SỬ DỤNG CƠ CHẤT BÃ TÁO TA VÀ VỎ CAM SÀNH
Mã số: NCST 2010 - 03

Chủ nhiệm đề tài
Ths. Trần Thanh Trúc

Cần Thơ, tháng 12/2010


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH
SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
SỬ DỤNG CƠ CHẤT BÃ TÁO TA VÀ VỎ CAM SÀNH

Mã số: NCST 2010 - 03
Thời gian thực hiện: từ tháng 04.2010 đến 12.2010

Cán bộ hướng dẫn
PGs Ts Nguyễn Văn Mười

Ts Nguyễn Văn Thành
Cán bộ phối hợp nghiên cứu
Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân
Vương Tố Trinh

Ngày ……tháng…… năm 2010

Ngày……tháng…… năm 2010

Chủ nhiệm đề tài

Chủ tịch hội đồng nghiệm thu

Trần Thanh Trúc

Trần Nhân Dũng
Ngày……tháng…… năm 2010
Cơ quan chủ trì

Trường Đại học Cần Thơ

Trang i


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

MỤC LỤC
MỤC LỤC.............................................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG.............................................................................................iv
DANH MỤC HÌNH...............................................................................................v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...............................................................................vi
TĨM TẮT............................................................................................................vii
ABSTRACT........................................................................................................viii
CHƯƠNG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài.........................................................................1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu...............................................................................1

CHƯƠNG 2
2.1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU............................................................2

Pectin methylesterase.............................................................................2

2.1.1

Khái quát chung................................................................................2

2.1.2

Một số đặc tính cơ bản của PME......................................................3

2.1.3

Một số ứng dụng của PME trong công nghệ thực phẩm...................4

2.2

Thu nhận enzyme PME..........................................................................5

2.2.1

Nguồn thu nhận PME........................................................................5

2.2.2

Vai trị của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME.........7

2.2.3

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME9

2.3

Các kết quả nghiên cứu có liên quan...................................................13

CHƯƠNG 3
3.1

PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU.........15

Phương tiện nghiên cứu........................................................................15

3.1.1

Địa điểm, thời gian..........................................................................15

3.1.2

Đối tượng nghiên cứu......................................................................15

3.1.3

Thiết bị, hoá chất.............................................................................15

3.1.4

Mơi trường ni cấy........................................................................16

3.2

Phương pháp thí nghiệm......................................................................17

3.2.1

Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu................................17

Trường Đại học Cần Thơ

Trang ii

Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

3.2.2

Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................17

3.2.3

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu............................................23

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ THẢO LUẬN..........................................................24

4.1 Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung riêng lẻ đến khả năng
sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger So2......................................24
4.2 Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến khả năng
sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger So2......................................28
4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin
methylesterase từ Aspergillus niger So2.........................................................29
4.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi khô đến quá trình sinh tổng hợp
PME từ A.niger So2.........................................................................................32
CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ.......................................................35

5.1

Kết luận.................................................................................................35

5.2

Kiến nghị...............................................................................................35

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................36
PHỤ LỤC 1

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.............................ix

(i) Phương pháp phân tích pectin....................................................................ix
(ii) Phương pháp trích ly PME.........................................................................x
(iii) Phương pháp xác định hoạt tính của PME (theo Crelier et al, 1995;
trích dẫn bởi Duvetter, 2007)............................................................................x
(iv) Cách chuẩn bị dung dịch đệm citrate - phosphate (pH 2,2 - 8,0)..........xi
PHỤ LỤC 2

KẾT QUẢ THỐNG KÊ.............................................................xii

1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung riêng lẻ đến
khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger............................xii
2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thành phần khoáng bổ sung kết hợp đến
khả năng sinh pectin methylesterase từ Aspergillus niger............................xv
3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung đến khả năng sinh pectin
methylesterase từ Aspergillus niger...............................................................xvi
4. Ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi khơ đến quá trình sinh tổng hợp
PME từ A.niger................................................................................................xx

Trường Đại học Cần Thơ

Trang iii

Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

CHƯƠNG 1..............................................................DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase....5
Bảng 2. Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu..............17
Bảng 3: Ảnh hưởng của việc bổ sung ZnCl2 và NaCl đến sự thay đổi hoạt tính
PME từ A.niger So2...............................................................................................24
Bảng 4: Tác động của thành phần khoáng MgCl2, CaCl2 và KCl đến sự thay đổi
hoạt tính PME từ A.niger So2................................................................................26
Bảng 5: Ảnh hưởng của việc bổ sung kết hợp các loại khoáng đến hoạt tính PME
............................................................................................................................... 28
Bảng 6: Ảnh hưởng của nguồn nitrogen bổ sung ở các tỷ lệ sử dụng khác nhau đến
hoạt tính PME từ quá trình lên men A.niger So2...................................................30
Bảng 7: Ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi đến hoạt tính PME từ quá trình sinh
tổng hợp A.niger So2.............................................................................................33
Bảng 8: Kết quả tổng hợp thành phần môi trường lên men tối ưu cho sự sinh tổng
hợp PME của A.niger.............................................................................................33
Bảng PL1: Cách chuẩn bị dung dịch đệm citrate - phosphate (pH 2,2 - 8,0).........xi

Trường Đại học Cần Thơ

Trang iv


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME................................................................2

Hình 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát..............................................................18
Hình 3: Đồ thị biểu diễn mức độ thay đổi hoạt tính enzyme PME dưới tác dụng
của thành phần khoáng bổ sung NaCl và ZnCl2.....................................................25

Trường Đại học Cần Thơ

Trang v


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
A.awamori

Aspergillus awamori

A.niger

Aspergillus niger

DE

Degree of esterification (Độ ester hóa pectin)

HG

Homogalacturonan

PME

Pectin methylesterase

So2

Chủng nấm mốc được phân lập từ cam soàn

U

Đơn vị đo hoạt tính enzyme

Trường Đại học Cần Thơ

Trang vi


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định điều kiện mơi trường tối ưu cho quá
trình sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ
Aspergillus niger trên cơ chất bã táo ta và vỏ cam sành đạt hiệu quả cao. Thông
qua nghiên cứu, tác động của các thành phần khoáng và nitrogen bổ sung đến
quá trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger So2 cũng được xác định. Đồng
thời, ảnh hưởng của việc bổ sung vỏ bưởi đến hiệu quả sinh tổng hợp PME từ
Aspergillus niger So2 cũng được khảo sát.
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi lên men Aspergillus niger sinh enzyme pectin
methylesterase trên môi trường bã táo ta và vỏ cam với tỉ lệ 70:30 (%, w/w), hàm
lượng khoáng bổ sung thích hợp là 0,5% MgCl 2 và 1,5% CaCl2, kết hợp với 0,1%
urea từ nguồn dinh dưỡng bổ sung cho hiệu quả cải thiện đáng kể hoạt tính PME.

Đồng thời, việc bổ sung 5% vỏ bưởi khô làm gia tăng lượng pectin trong môi
trường lên men, điều chỉnh độ DE của cơ chất và tạo điều kiện thích hợp cho sự
sinh tổng hợp PME đạt hiệu quả cao nhất với hoạt tính PME thu được là 40,0 ±
1,0 U/mL, tăng gấp 2 lần so với giá trị PME thu nhận ban đầu.
Điểm mới của đề tài chính là việc sử dụng phụ phẩm nơng nghiệp giàu pectin sẵn
có của địa phương (bã táo ta khơ, vỏ cam tươi và vỏ bưởi khô) làm cơ chất lên
men sinh tổng hợp enzyme cho hiệu quả kinh tế và đáp ứng yêu cầu về môi trường.
Đồng thời, việc kết hợp vỏ cam, bã táo và vỏ bưởi với một tỉ lệ nhất định, thay vì
sử dụng riêng lẻ đã cho thấy hiệu quả cải thiện hoạt tính enzyme PME rõ rệt. Quá
trình ni cấy sử dụng nấm mốc Aspergillus niger đã từ phân lập và tuyển chọn từ
cam soàn (Citrus sinensis) trong điều kiện phịng thí nghiệm.

Trường Đại học Cần Thơ

Trang vii


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

ABSTRACT
In production of fungal pectin esterase in solid state fermentation, control of
medium composition is an important key for improved the activity of enzyme. The
objective of this investigation was to determine optimized parameters of medium
composition for PME biosynthesis in solid state fermentation by Aspergillus niger
So2. Based on this objective, effects of different nutrition source with various
concentrations in fermentation medium to production PME were studied. In this
study, a mixture of 70: 30 (%, w/w) of apple pomace and orange peels were used
as a main substrate for SSF. The substrate was diluted by phosphate/citrate buffer
(pH 3.5) to obtained 60% moisturea content of medium. The result showed that,
the addition of 1,5% CaCl2, 0.5% MgCl2 combined with 0.1% urea from

nutritional supplements were improved efficiency PME activity. Also, the addition
of 5% dried grapefruit peel to increase the amount of pectin in the fermentation
environment, adjust the DE of the substrate were a suitable condition for the
biosynthesis of PME. After the incubation period of 96 h, activity of PME from
Aspergillus niger can be obtained the value of 40.0 ± 1.0 U/mL. Overall, the
addition of essential nutrition source can get 2 times higher PME activity than the
control.
Using agro waste as substrate for fermentation processing is the important
information of this study. In addition, the combination of apple pomace, orange
peels and grapefruit peels with suitable ratio can obtained the higher maximum
yield. The experiment were also affirmed that, Aspergillus niger So2 from sweet
orange (Citrus sinensis) was found as a best strain for PME productivity.

Trường Đại học Cần Thơ

Trang viii


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

CHƯƠNG 2

ĐẶT VẤN ĐỀ

2.1 Tính cấp thiết của đề tài
Việc ly trích và ứng dụng PME vào trong quá trình chế biến thực phẩm đã được
phát triển khá rộng rãi ở nhiều quốc gia (Duvetter, 2006), tuy nhiên khả năng sử
dụng của enzyme này vẫn chưa được quan tâm ở Việt Nam. Hiện khơng có PME
thương mại được sản xuất ở nước ta, việc nhập khẩu PME được ly trích và tinh chế
ở nước ngoài thường có giá quá cao. Điều này làm ảnh hưởng không nhỏ đến việc

phát triển khả năng ứng dụng của enzyme PME vào quá trình chế biến thực phẩm.
Chính vì thế, nghiên cứu ly trích PME trong điều kiện hiện tại ở Việt Nam là một
trong những việc cần thiết, cần được quan tâm.
Nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả đề tài đã cho thấy hiệu quả của việc sử dụng
bã táo ta khô và vỏ cam làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp PME từ A.niger.
Tuy nhiên, hiệu quả lên men vẫn còn khá thấp khi so sánh với một số khảo sát đã
được thực hiện trên thế giới (Joshi et al., 2006). Chính vì thế, cần có biện pháp
thích hợp để gia tăng hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp enzyme PME. Bên cạnh
việc sử dụng cơ chất cảm ứng thích hợp (phụ phẩm giàu pectin có độ ester hóa
cao) và điều khiển nguồn nấm mốc sử dụng, hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp
enzyme PME có thể gia tăng bằng cách cải thiện môi trường lên men – bổ sung
các nguồn khoáng và vi chất dinh dưỡng (Nguyễn Đức Lượng, 2004; Rao, 2005;
Joshi et al., 2006). Đây chính là cơ sở cho việc nghiên cứu cải thiện hoạt tính PME
từ Aspergillus niger được thực hiện.
2.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với mục tiêu xác định điều kiện mơi trường tối ưu cho q
trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo ta và vỏ cam sành
đạt hiệu quả cao.

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 0


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

CHƯƠNG 3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

3.1 Pectin methylesterase
Khái quát chung
Pectin methylesterase (PME, E.C.3.1.1.11) là enzyme thuộc nhóm enzyme
pectinase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin, giải phóng
methanol và hình thành pectin có độ methoxyl thấp (là các acid pectinic hoặc acid
pectic) (hình 1). Hiệu suất thủy phân có thể đạt đến 98%. Vị trí thủy phân của
PME là liên kết methyl ester ở C6 của 1 gốc GalA trong HG (homogalacturonan)
của pectin trong mơi trường nước (các nhóm estermethyl của đơn vị galacturonate
nằm kề đơn vị không bị ester hóa).

Hình 1: Sơ đồ thủy phân pectin của PME
(Nguồn: Sila et al., 2003)

Khi enzyme hoạt động không phải toàn bộ cấu trúc enzyme tham gia hoạt động
xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động của enzyme tham gia phản ứng. Trung tâm
hoạt động của enzyme do cấu trúc của enzyme tạo ra.
Dựa trên cấu trúc của PME carrot, Johansson et al. (2002) đề nghị cơ chế hoạt
động như sau: trung tâm hoạt động của PME carrot bao gồm Asp157, Arg225,
Gln113, Gln115 vaf Asp136. Trong đó, Asp157 có liên kết hydro gắn với cả oxy và
Arg225. Arg225 được xem là một phần tử ái điện tử tấn công chủ yếu vào nhóm
carbon từ carboxymethyl và carbonyl của pectin. Asp136 liên kết với Phe160, có

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 1


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

tính acid trong giai đoạn đầu phản ứng và methanol được tách ra. Tiếp theo,

Asp136 có khả năng phản ứng như một bazơ tách hydro của một phân tử nước để
cắt liên kết hóa trị giữa cơ chất và Asp157 và phục hồi lại trung tâm hoạt động cho
enzyme (Johansson et al., 2002).

3.1.1 Một số đặc tính cơ bản của PME
PME là những enzyme có kích thước trung bình và phân tử khối (MM) vào
khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003). PME thu nhận từ những nguồn khác
nhau có điểm đẳng điện không giống nhau. Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ
3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến pI = 11 đối với PME cà chua. Hầu hết PME
chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME có
tính acid (Bordenave, 1996).
Nhiều loại PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa được tìm thấy
ở các thực vật 2 lá mầm (Bordenave et al., 1996; Bordenave and Goldberg, 1994;
Giovane et al., 1994; Pressey và Woods, 1992). Hầu hết các PME nguồn gốc thực
vật thủy phân liên ester của pectin từ đầu khử hoặc đầu không khử, hoặc gần với
nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn (Nguyễn Đức
Lượng, 2004). Phản ứng khử ester bắt đầu ở gần nhóm carboxyl tự do hay từ đầu
khử của mạch polygalacturonic (chỉ tác dụng tại một vị trí trên mạch), kết quả tạo
thành các gốc galacturonic bị khử nhóm ester (Solms và Deuel, 1955; Rexova,
Benkova và Markovic, 1976; Markovic và Kohn, 1984; Willats et al., 2001). Do
hoạt động cần có nhóm carboxyl tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thực
vật ít hoạt động trên các pectin có độ ester hóa cao hơn là các pectin có độ ester
hóa từ 20  30% (Evans và MacHale, 1978; Seymour et al., 1991).
Ngược lại, PME từ nấm mốc (Aspergillus spp) có thể phân cắt cơ chất một cách
ngẫu nhiên (Ishi et al., 1979; Kohn et al., 1982; Limberg et al., 2000), ngoại trừ
PME từ nấm mốc Trichoderma reesei khử ester hóa theo từng block (Markovic và
Kohn, 1984), và phản ứng khử nhóm ester của PME từ nấm Erwinia chrysanthemi
cũng tương tự như ở PME từ thực vật (Christensen et al., 2001).

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 2


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

Phản ứng tiếp theo của quá trình khử ester rất khác nhau. Sự thủy phân theo vị trí
cố định (blockwise), các pectin đã bị khử ester hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diện
của ion Calcium (Micheli, 2001) làm thành tế bào trở nên cứng chắc. Trong khi đó,
polygalacturonase và pectate lyase sẽ hoạt động và thủy phân ngẫu nhiên mạch
polymer của pectin.

3.1.2 Một số ứng dụng của PME trong công nghệ thực phẩm
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzyme là một tiến bộ khoa
học lớn. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự thành lập các chất gây
đục không mong muốn trong nước trái cây và rượu vang là do sự hiện diện các
hợp chất pectic đặc biệt là pectin hòa tan, các chất này nằm ở thành tế bào được
phóng thích khi trái cây bị nghiền nhão. Các chế phẩm enzyme sử dụng trong sản
xuất nước quả có tác dụng làm trong dịch chiết ép (nhất là đối với những quả có
nhiều pectin, độ nhớt cao) tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cô đặc dịch quả,
làm tăng hiệu suất ép, hiệu suất trích ly các chất trong tế bào thực vật.
Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Nếu
pectin còn nhiều sẽ theo vào nước quả gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ
keo cao và rất khó lọc trong.
Trong các sản phẩm đòi hỏi tính giòn, độ cứng chắc của sản phẩm (như trong sản
phẩm rau muối chua, táo cắt lát, rau quả đóng hộp…). Trong q trình chần
ngun liệu ở nhiệt độ thấp, thời gian dài sẽ làm kích hoạt PME phân cắt nhóm
ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca 2+ tạo cấu trúc theo
mong muốn. Ảnh hưởng của sự tách loại nhóm methoxyl trong phân tử pectin đối
với độ cứng mô thực vật bao gồm hai hiện tượng: ở mô chưa xử lý, sự hiện diện

các nhóm carboxyl tự do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calcium
giữa hai mạch pectin, và ở mơ đã xử lý nhiệt sẽ có sự gia tăng liên kết với Ca 2+ và
làm giảm nguy cơ bị tự phân cắt hay còn gọi là β – elimination (Sajjaanatukal và
Pitifer, 1991).
Tuy nhiên, một vài loại trái cây chỉ chứa một lượng rất nhỏ PME nội bào. Do đó
nhiều phương pháp khác nhau được đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật
nguyên vẹn và cách đơn giản nhất là phương pháp ngâm – thấm thụ động. Tuy
Trường Đại học Cần Thơ

Trang 3


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

nhiên đây là một quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mơ chỉ giới hạn ở
bề mặt. Vì thế cần có sự hiện diện của các chất phụ gia. Nếu trong mơ có khoảng
khơng chứa khí đáng kể thì phải tiến hành dưới áp lực trực tiếp hoặc là chân
không. Kỹ thuật ngâm chân không (vacuum infusion – VI) được sử dụng trong
nhiều quá trình chế biến khác nhau để cải thiện chất lượng về cấu trúc của sản
phẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành phần chức năng trong sản phẩm.
Ngâm bằng kỹ thuật chân không áp dụng cho trái đào cắt nửa với PME của bưởi
và CaCl2 đã làm tăng đáng kể độ cứng của trái đào đóng hộp. Theo Baker và
Wicker (1996), có mối tương quan giữa mức độ ester hóa của pectin với khả năng
cải thiện độ cứng. Kỹ thuật ngâm chân không của PME nấm mốc với CaCl 2 được
khảo sát thấy có hiệu quả cải thiện độ cứng cho dâu tây cắt nửa lạnh đông.
Bảng 1: Hiệu quả xử lý nước táo và nước vải bằng chế phẩm enzyme pectinase
Độ
acid
chuẩn
(%)

Đường
(%)

Pectin
(%)

(%)

Hàm
lượng
chất
khơ
(%)

Điểm
đánh
giá
cảm
quan

a- Khơng có chế phẩm enzyme

71,2

10,2

0,53

6,7

0,33

4,5

b- Có chế phẩm enzyme
Nước quả vải

78,8

11,5

0,62

8,0

0,15

4,8

a- Khơng có chế phẩm enzyme

49,2

8,5

0,91

5,62

0,26

3,8

b- Có chế phẩm enzyme

72,4

10,2

1,16

7,4

0,12

4,3

Loại nước quả

Hiệu
suất
nước
quả

Nước quả từ táo

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

3.2 Thu nhận enzyme PME

3.2.1 Nguồn thu nhận PME
Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống. Việc điều chế
chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầy
tốn kém nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học (Nguyễn Đức
Lượng, 2004). Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực
vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 4


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme
cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng.
Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào
cũng có thể có nhiều enzyme này song khơng có enzyme khác. Lượng enzyme lại
thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài.
Chính vì thế, việc chọn lựa nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh
chế enzyme cần được quan tâm (Favelar – Torres et al., 2006).
Enzyme pectin methylesterase có thể được thu nhận từ hai nguồn là thực vật và vi
sinh vật. Trong hầu hết các loại cây ăn trái, đều có sự hiện diện của PME với hàm
lượng khác nhau. Việc ly trích PME thực vật cũng được tiến hành trên nhiều loại
quả như cà chua (Pressey và Woods, 1992; Giovane et al., 1994), carrot (Alonso et
al., 2003) hay bơ (Awad và Young, 1980). PME từ vỏ cam hiện đã được tinh sạch
và sản xuất thương mại (P5400, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Mặc dù vậy,
việc thu nhận PME từ thực vật vẫn gặp nhiều hạn chế, rất khó sử dụng để sản xuất
các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm như:

-

Chu kỳ sinh trưởng của thực vật khá dài,

-

Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được,

-

Nhiều ngun liệu dùng làm thực phẩm, khơng có tính kinh tế khi sử dụng
làm nguồn ly trích enzyme thương mại.

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Việc sử dụng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme là giải pháp
khả thi do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật rất ngắn (16 – 100 giờ), tốc độ sinh
sản nhanh. Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng
tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực
vật khơng tổng hợp được. Phần lớn các thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ tìm và giá
rẻ. Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên các mơi
trường đơn giản, dễ tìm như các phế liệu của các ngành sản xuất. Hơn nữa, có thể
dùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vơ cơ để
ni vi sinh vật. Chính vì thế, sử dụng vi sinh vật làm nguồn thu nhận enzyme sẽ

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 5


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao (Nguyễn Đức
Lượng, 2004; Favelar – Torres et al., 2006).
Mặc dù có rất nhiều giống nấm mốc và vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme
PME … (Reignault et al., 1994 ; Joshi et al., 2006), tuy nhiên Aspergillus spp. là
nguồn chủ yếu (Patil và Dayanand, 2006 ; Arotupin et al., 2008 ; Joshi et al.,
2006). Đặc biệt, Aspergillus niger được ưu tiên chọn lựa nhờ vào đặc tính an toàn
(GRAS) và khả năng dễ phát triển, dễ phân lập và thu nhận enzyme pectinase nói
chung cũng như PME nói riêng có hoạt tính cao (Deraeve et al., 2003). Chính vì
thế, quá trình sinh tổng hợp enzyme PME từ nguồn nấm mốc Aspergillus niger
được quan tâm.
Hiệu quả của quá trình lên men sinh PME cũng như các enzyme khác phụ thuộc
vào rất nhiều thông số như chủng vi sinh vật, thành phần cơ chất, các vi chất dinh
dưỡng, khoáng chất và điều kiện lên men. Khi quá trình tuyển chọn chủng vi sinh
vật có hoạt tính PME cao, số lượng nhiều đã được tiến hành thì thành phần cơ
chất, mức độ bổ sung khoáng, chất dinh dưỡng và điều kiện lên men là những nhân
tố thiết yếu, có ảnh hưởng sâu sắc đến hiệu quả của q trình ni cấy, sinh tổng
hợp enzyme mong muốn (Rao, 2005).
Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng
như các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần mơi trường phải có đủ các
chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp
enzyme. Tuy nhiên, để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Ở điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượng
enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý của chúng (tổng hợp enzyme “bản thể”). Để
thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải tiến hành q trình ni
cấy thích hợp với sự tham gia của cơ chất cảm ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004;
Favelar – Torres et al., 2006). Sự hiện diện của chất cảm ứng thích hợp trong môi
trường nuôi cấy sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm, nhờ
đó thúc đẩy hiệu quả sinh tổng hợp enzyme.

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 6


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

Trong trường hợp sinh tổng hợp pectin methylesterase cũng như các pectinase
khác, cơ chất cảm ứng tương thích được biết đến là pectin, acid pectic, Dgalacturonate và một số nguồn carbohydrate khác (Sajjaanantakul và Pitifer,
1991). Tuy nhiên, việc sử dụng cơ chất pectin từ nguồn phụ phẩm nông nghiệp
được ưa chuộng nhất (Patil, 2006). Hàm lượng pectin cao (15  25%) trong các
phụ phẩm nơng nghiệp như cám mì (Taragano et al., 1997), bã mía, bã củ cải
đường (Solis-Pereyra et al., 1993, 1996), xác đậu cove (Boccas et al., 1994), vỏ
chanh (Larios et al., 1989) và bã táo (Hours et al., 1988) được biến đến như nguồn
cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase nguồn gốc vi sinh. Ngoài ra, độ
methoxyl hóa cao (60 ÷ 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông nghiệp chính là
điều kiện thuận lợi cho hoạt động của PME (Jayani et al., 2005). Một ưu điểm
khác của việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm cơ chất cho q trình ni cấy
sinh enzyme PME là sự hiện diện trong nguyên liệu của một số thành phần nitơ,
chất xơ và khống cần thiết cho q trình lên men (Martin et al., 2004; Favelar –
Torres et al., 2006).
Đối với từng loại enzyme chuyên biệt, tỉ lệ tối ưu cho hoạt động cảm ứng của cơ
chất thay đổi khác nhau. Tỉ lệ pectin dao động trong khoảng 2% thường được lựa
chọn cho quá trình lên men sinh enzyme pectin esterase (Grebechova et al., 2007).
Tuy nhiên, việc gia tăng nồng độ cơ chất pectin có hiệu quả rất tích cực trong việc
đẩy nhanh tốc độ lên men và gia tăng hoạt tính enzyme pectin esterase (Maldonad
and Callieri, 2005). Ở cùng một tỉ lệ pectin sử dụng, nguồn gốc nguyên liệu khác
nhau cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính PME thu nhận được (Grebechova et al.,
2007). Chính vì thế, việc khảo sát tỉ lệ pectin thích hợp cho quá trình lên men sinh

enzyme cần phải được tiến hành cho từng cơ chất chuyên biệt và điều kiện nuôi
cấy cụ thể.
Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME
Những yếu tố chính có ảnh hưởng đến sự tổng hợp vi sinh vật của enzyme trong hệ
thống lên men bao gồm: sự chọn lọc của cơ chất thích hợp và chủng vi sinh vật,
quá trình tiền xử lý cơ chất, nhiệt độ ủ và thời gian lên men cũng như hàm lượng
khoáng dinh và dưỡng chất bổ sung. Đặc biệt, trong q trình ni cấy trong mơi

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 7


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

trường rắn, kích cỡ của cơ chất (khoảng trống giữa các hạt và diện tích bề mặt tiếp
xúc), hàm lượng nước và aw của cơ chất, độ ẩm của môi trường nuôi cấy, tốc độ
tiêu thụ oxygen là những yếu tố có chi phối mạnh đến q trình sinh tổng hợp
enzyme nói chung và enzyme PME nói riêng. Việc đo lường hoạt tính đã chỉ ra sự
khác biệt giữa các loại PME lấy từ các điều kiện nuôi cấy khác nhau hoặc trong
giai đoạn phát triển khác nhau của PME (Bordenave và Goldberg, 1993).
(i) Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men
Trong quá trình lên bề mặt ở trạng thái rắn, vi sinh vật phát triển và sản sinh ra sản
phẩm tại gần bề mặt cơ chất rắn có hàm lượng ẩm thấp. Do đó, cần thiết cung cấp
một lượng nước tối ưu và kiểm tra độ hoạt động của nước (a w) của cơ chất lên
men. Sự hiện diện của một lượng ẩm cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng bất lợi
cho hoạt động của vi sinh vật. Hơn nữa, nước có ảnh hưởng sâu sắc đến các tính
chất hóa lý của chất rắn và do đó ảnh hưởng đến hiệu suất của toàn bộ tiến trình
ni cấy (Ashok Pandey et al., 2000).
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của mơi trường là 58 ÷ 60% và

phải giữ cho độ ẩm của môi trường ổn định trong q trình ni. Độ ẩm tăng q
70% sẽ làm giảm độ thống khí, cịn độ ẩm thấp hơn 50  55% thì sẽ kiềm hãm sự
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như tạo enzyme (Ashok Pandey et
al., 2000).
(ii) Ảnh hưởng của pH môi trường lên men
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, do môi trường có dung dịch đệm cao và
hàm ẩm thấp nên pH môi trường thường ít thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy.
Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của mơi trường có ảnh hưởng khơng nhỏ đến sự phát
triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Khi pH môi trường dịch về phía acid
hoặc phía kiềm, sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành
enzyme pectinase bị kiềm hãm. pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật
trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007). Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc
điểm từng enzyme, loại cơ chất và chủng nấm mốc, giá trị pH tối thích cho hoạt

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 8


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

động của. Chính vì thế, cần thiết phải xác định điều kiện pH ban đầu của môi
trường nuôi cấy đến hiệu quả thu nhận enzyme mong muốn.
(iii) Nhiệt độ và thời gian lên men
Ở mức nhiệt độ nuôi cấy dao động trong khoảng 25 ÷ 40C hầu như khơng có tác
động đến sự hình thành sinh khối của hệ enzyme pectinase hay polygalacturones.
Nhiều khảo sát cho thấy, nhiệt độ dao động trong khoảng 28 ÷ 30C là giá trị tối
thích cho việc sản sinh pectinesterase (Maldonad và Callieri, 2005; Joshi et al.,
2006) ở điều kiện ôn đới. Đồng thời, tốc độ lên men cũng phụ thuộc rất lớn vào
đặc điểm môi trường nuôi cấy.

Thời gian lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản sinh enzyme cũng như
hoạt tính của enzyme. Vi sinh vật cần thời gian đủ dài để phát triển và sản sinh
enzyme. Tuy nhiên, khi thời gian ủ quá dài, môi trường cạn dần chất dinh dưỡng,
vi sinh vật phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm.
Thời gian nuôi cấy để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định bằng thực
nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng khơng mong muốn vì thường làm giảm hoạt
tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thường kết
thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử đính (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nấm mốc
Aspergillus niger thường được nuôi cấy trong thời gian 48 đến 96 giờ cho quá
trình sinh tổng hợp PME (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006).
(iv) Nguồn dinh dưỡng và khoáng chất bổ sung
Nguồn Nitrogen
Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong các quá trình sống
để xây dựng tế bào. Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều có chứa nitơ
(protein, acid nucleic, enzyme, …).
Trong tất cả các môi trường nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất nitơ mà vi
sinh vật có thể đồng hóa được. Việc chọn nguồn nitơ là rất cần để đảm bảo được
hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất vi sinh vật. Các nguồn nitơ
dùng trong công nghiệp lên men thường là các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ
(Lương Đức Phẩm, 1998).
Trường Đại học Cần Thơ

Trang 9


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH4+. Trong đó, urea là
nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý. Khi bị phân giải bởi enzyme urease,
urea sẽ giải phóng thành NH3 và CO2. Phần NH3 được vi sinh vật sử dụng mà

không làm chua môi trường như đối với các muối amon :
NH2 - CO - NH2 + H2O → 2NH3 + CO2
Vi sinh vật cịn có khả năng đồng hố rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ.
Các thức ăn này sẽ vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh
vật. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại
chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy. Chúng khác
nhau về lượng chứa các loại polipeptit và lượng chứa axit amin tự do.
Muối khoáng
Muối khống chiếm khoảng 2 ÷ 5% khối lượng khơ của tế bào. Chúng thường tồn
tại dưới dạng các muối sunphat, photphat, cacbonat, clorua ... Trong tế bào chúng
thường ở dạng các ion. Dạng cation chẳng hạn như Mg 2+, Ca2+, K+, Na+, ...dạng
anion chẳng hạn như HPO42−, SO42−, HCO3−, Cl- ... Các ion trong tế bào vi sinh vật
luôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định nhằm duy trì độ pH và lực thẩm thấu thích hợp
cho từng loại vi sinh vật.
Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp enzyme
của vi sinh vật. Trong vòng đời phát triển của vi sinh vật nhu cầu sử dụng Mg khá
cao (10,3 ÷ 10,4M). Magie mang tính chất một cofactor, chúng tham gia vào nhiều
phản ứng enzyme có liên quan đến các q trình phosphoryl hoá (chuyển H 3PO4 từ
một hợp chất hữu cơ này sang một hợp chất hữu cơ khác). Mg 2+ có thể làm hoạt
hố các hexokinase, ATP-ase, pirophosphatase, phosphopherase, transacetylase,
phosphoglucomutase, cacboxylase, enolase, các men trao đổi protein, các men oxi
hoá khử của chu trình Krebs (tất cả khoảng trên 80 enzyme khác nhau). Ion Mg 2+
cịn có vai trị quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần riboxom với nhau.
Bên cạnh đó, Mg2+ cũng có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme.

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 10

Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

Lưu huỳnh kích thích tạo enzyme (Lưu huỳnh có trong thành phần các acid amin
quan trọng như methionine, cystein). Ngoài ra, calcium, mangan, coban, … cũng
ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Calcium mặc dầu là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các hợp chất hữu
cơ nhưng nó có vai trị đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào.
Calcium đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tế
bào sống (như giữa ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotit với nhau, giữa
ARN và protein trong riboxom). Calcium rất cần thiết đối với việc hình thành các
cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như riboxom, ti thể, nhân ...
Kali là nguyên tố chiếm một tỷ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi
sinh vật, nhưng cho đến nay người ta chưa thấy Kali tham gia vào bất kỳ thành
phần nào của nguyên sinh chất, cũng chưa tìm thấy bất kỳ enzyme nào có chứa
Kali. Người ta nhận thấy Kali thường tồn tại trong dạng ion K + ở mặt ngoài cấu
trúc tế bào. Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do đó ảnh hưởng
đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp. Kali có thể cịn
tham gia vào q trình tổng hợp một số vitamin (như thiamin ...) và có những ảnh
hưởng đáng kể đến q trình hơ hấp của tế bào vi sinh vật.
(Lê Xuân Phương, 2009)
Theo nhiều tác giả, các ion K +, Na+, Ca2+ có ảnh hưởng tích cực trong việc gia tăng
hoạt tính của PME. Kretovits (1982) thừa nhận rằng muối Ca 2+ và Mg2+ nâng cao
hoạt độ của enzyme, còn các ion Zn2+, Mn2+ và Cu2+ là nhân tố ức chế hoạt độ của
enzyme PME. Tuy nhiên, KCl, HCl, HgCl 2, H2O2 khơng có tác dụng tới hoạt độ
PME trong cam trong khi acid ascorbic, NaHSO 3 với nồng độ thấp có khả năng
nâng cao hoạt độ của enzyme này. Nghiên cứu của Hossam (2005) đã đưa ra kết
luận EDTA, PbCl2, HgCl2 và IAA là nhân tố ức chế khả năng lên men của
Aspergillus repens, làm giảm hoạt tính PME.
3.3 Các kết quả nghiên cứu có liên quan
PME đã được phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991;

Solís-Pereira, 1993), đặc biệt là A.niger đã được khảo sát khá chi tiết với cả hai

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 11


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

phương thức lên men nổi và lên men chìm (Joshi et al., 2006) trên nhiều loại cơ
chất khác nhau (Schmitz, 2002; Joshi et al., 2006). Nhìn chung, đặc điểm thành
phần cơ chất giàu pectin – cơ chất cảm ứng cho hoạt động của PME và điều kiện
môi trường, tác động của thành phần khống bổ sung, đặc biệt là tính cân bằng của
mơi trường dinh dưỡng về cacbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp
sinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nitơ tham gia vào q trình tạo
protein, acid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật.
Môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết sẽ tích lũy lượng enzyme lớn
nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa của cấu tử kia.
Theo nghiên cứu của Joshi et al., (2006) về việc sinh pectin methylesterase (PME)
từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo đã cho thấy, nhiệt độ ủ 25 oC, điều kiện pH
phản ứng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiện tối ưu cho việc lên men sinh
PME ở cả môi trường rắn (SSF) và môi trường lỏng (SmF). Ngoài ra, vai trò của
các nguồn nitơ bổ sung như (NH4)2SO4, thành phần khoáng cũng như tỷ lệ pha
loãng của cơ chất : nước nhằm tạo độ ẩm cho quá trình lên men sinh PME thích
hợp cũng được xác định. (Joshi et al., 2006).
Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích
trong khoảng từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở 55  62oC và được hoạt hóa bởi Ca 2+ và
Mg2+. Phương pháp trích ly PME cũng được nghiên cứu (Contreras – Esquivel,
1999), kết quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% được sử dụng trích ly PME
từ vỏ quả chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích ly

cao nhất.
Sarvamangala et al. (2006) đã nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger với cơ chất là
hạt của hoa hướng dương và kết quả cho thấy rằng, với 4% glucose bổ sung trong
quá trình lên men ở trạng thái rắn, 6% succrose quá trình lên men chìm và 0,3%
amonium sulphate cho cả 2 quá trình lên men thì kết quả cho thấy hoạt tính của
pectinase thu được trên môi trường rắn cao hơn gần gấp 2 lần so với pectinase thu
được trên môi trường lỏng (45,9 U/g và 18,9 U/g).
Vỏ cam cũng được sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất pectin
lyase từ Rhizopus oryzea với những điều kiện thích hợp (bổ sung NH 4NO3, NH4Cl,
Trường Đại học Cần Thơ

Trang 12


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

nhiệt độ đạt 50oC và pH = 7,5 với sự có mặt của các chất khoáng như Ca 2+, Mg2+,
Na+ và K+) (Hossam, 2005). Kết quả thu được pectin lyase với hoạt tính là 297
U/mL. Đồng thời, nghiên cứu này cũng cho thấy ion Zn 2+, Co2+, Mn2+, Hg2+ là nhân
tố ức chế khả năng sinh pectin lyase của Rhizopus oryzea.
Thêm vào đó, việc sử dụng kết hợp các nguồn phụ phẩm nông nghiệp đã chứng tỏ
hiệu quả trong việc sinh tổng hợp enzyme. Díaz (2004) khi nghiên cứu sản xuất
các loại enzyme thủy phân từ A.awamori sử dụng cơ chất lên men là hỗn hợp tỉ lệ
1:1 (w/v) của bã nho và vỏ cam cho hiệu quả vượt trội.
Tóm lại, q trình lên men sinh enzyme PME phụ thuộc rất nhiều yếu tố khác
nhau, vì vậy cần phải được khảo sát một cách cẩn thận cho từng chủng nấm mốc
sử dụng, từng loại cơ chất cũng như các điều kiện của môi trường lên men
Ở Việt Nam, nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến hiệu quả sinh
tổng hợp enzyme cũng được tiến hành trên một số enzyme khác cùng nhóm (Pham
et al., 2007; Ngo et al., 2008; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008), tuy

nhiên chưa được thực hiện đối với đối tượng là enzyme PME. Mặc dù vậy, đây
cũng chính là thông tin hữu ích cho việc nghiên cứu bổ sung các thành phần vi
chất dinh dưỡng, tạo điều kiện môi trường lên men tối ưu cho quá trình sinh tổng
hợp PME từ Aspergillus niger.
Dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được khảo sát và điều kiện thực tế, việc
đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung các thành phần khoáng chất, nguồn nitrogen
và vỏ bưởi khô (dạng bột) vào môi trường lên men đến hiệu quả sinh enzyme
pectin methylesterase khi lên men bề mặt Aspergillus niger trên môi trường rắn, sử
dụng hai phụ phẩm nông nghiệp (bã táo và vỏ cam sành) được tiến hành.

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 13


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

CHƯƠNG 4

PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

4.1 Phương tiện nghiên cứu
Địa điểm, thời gian
Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ
Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ tháng 04/2010 đến tháng 12/2010.
Đối tượng nghiên cứu
Nấm sợi Aspergillus niger đã được phân lập từ cam soàn (So2) và tuyển chọn phù
hợp cho q trình ni cấy sinh pectin methylesterase (Tran et al., 2010)
Môi trường lên men sinh PME: bã táo ta (Ziziphus nummularia) và vỏ cam sành

(Citrus nobilis var typica Hassk)
Thiết bị, hoá chất

(i) Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức)
Máy đo pH (HANA pH 212, Trung Quốc)
Máy khuấy từ
Tủ ủ Sanyo
Tủ cấy
Máy ép trái cây
Tủ sấy mẫu
Thiết bị gia nhiệt, thanh trùng
Ống nghiệm có nắp, đũa và que cấy, đĩa petri, bình tam giác 250 mL
Một số dụng cụ và thiết bị khác

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 14


Báo cáo đề tài NCKH cấp Trường 2010

Hóa chất


Cồn 70o



Cồn 96o



NaOH 0,1N (Merck)



NaCl (Merck)



KCl (Merk)



CaCl2 (Merk)



MgCl2 (Merk)



ZnCl2 (Merk)



Amonium sulfate ((NH4)2SO4 )



Amonium dihydrogen phosphate (NH4H2PO4 )



Urea (P.A)



Pepton (Ấn Độ)



NaH2PO4.2H20 (Merck)



Acid citric (Merck)



Pectin táo DE = 75% (Sigma)

Môi trường nuôi cấy
Cơ chất
Bã táo: bã táo ta (Ziziphus nummularia) được tách loại nước bằng cơ học và được
sấy ở nhiệt độ (60  1)C đến khi độ ẩm còn (4  1)%. Bã táo khơ được nghiền
thành bột và đóng trong các bao PE nhỏ (Joshi et al., 2006) hay để trong keo thủy
tinh cách ẩm.
Vỏ cam sành: lấy phần vỏ trắng bên trong, rửa sạch, cắt nhỏ khoảng 1mm (chú ý

luôn duy trì độ ẩm vỏ cam 75%).

Trường Đại học Cần Thơ

Trang 15