Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn tách quercetin có tính chọn lọc cao

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ QUERCETIN ĐỊNH
HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT
PHA RẮN TÁCH QUERCETIN CĨ TÍNH CHỌN LỌC CAO

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS. Phan Văn Hồ Nam

Tp. Hồ Chí Minh, 03/2019

.


.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ QUERCETIN ĐỊNH

HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT
PHA RẮN TÁCH QUERCETIN CĨ TÍNH CHỌN LỌC CAO

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 03/2019

.


.

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN
CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

1. Chủ nhiệm đề tài: TS. Phan Văn Hồ Nam
2. Thành viên tham gia đề tài: Phan Nguyễn Huy Việt
3. Đơn vị thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, khoa Dược, Đại học Y
Dược TP.HCM

.


i.

MỤC LỤC
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ

TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH ........................................................... i
MỤC LỤC ........................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................. vii
DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................... viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
TÍNH CẤP THIẾT ......................................................................................... 1
MỤC TIÊU ..................................................................................................... 3
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ ............ 3
Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 3
Dung mơi-hóa chất ................................................................................................ 3
Trang thiết bị ......................................................................................................... 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 4
Biện luận công thức tổng hợp polymer ban đầu ................................................ 4
Khảo sát tính tan của các thành phần trong các dung môi .............................. 5
Khảo sát điều kiện polymer hóa .......................................................................... 5
Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer ................................................. 5
Tồng hợp NIP .......................................................................................................... 5
Tổng hợp MIP .......................................................................................................... 5
Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ UV-Vis........................... 6

.


.

i

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ IR ................................... 6
Tạo hạt bằng phương pháp kết tủa ..................................................................... 6
Tổng hợp NIP .......................................................................................................... 6
Tổng hợp MIP: ........................................................................................................ 6
Tạo hạt (tiểu phân nano - nanoparticles): ............................................................. 6
Kiểm tra khả năng lưu giữ quercetin của MIP, và khả năng rửa giải của các
dung môi ................................................................................................................ 7
Kiểm tra khả năng tái hấp phụ của MIP và NIP ............................................... 7
Khảo sát dung môi tạo hạt polymer .................................................................... 8
Hiệu suất tạo hạt từ gel polymer ......................................................................... 8
Nhồi cột SPE .......................................................................................................... 9
Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng ..................................................................... 9
Khảo sát một số đặc tính của cột SPE............................................................... 10
Khảo sát độ lặp lại ................................................................................................10
Khảo sát khả năng tải mẫu ...................................................................................10
Khảo sát sơ bộ độ chọn lọc ...................................................................................10

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................... 12
CHƯƠNG 1. BIỆN LUẬN CÔNG THỨC TỔNG HỢP POLYMER BAN
ĐẦU .............................................................................................................. 12
CHƯƠNG 2. KHẢO SÁT DUNG MƠI POLYMER HĨA ........................ 13
CHƯƠNG 3. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN POLYMER HÓA ......................... 13
CHƯƠNG 4. KIỂM TRA KHẢ NĂNG GIỮ QUERCETIN TRÊN
POLYMER ................................................................................................... 14

.


.

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng màng mỏng bằng phổ
UV-Vis .................................................................................................................. 14
Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng rắn bằng phổ IR......... 15
Kiểm tra sự có mặt của quercetin trong polymer ở dạng hạt bằng phổ UV-Vis
............................................................................................................................... 16

CHƯƠNG 5. KIỂM TRA KHẢ NĂNG TÁI HẤP PHỤ CỦA POLYMER18
CHƯƠNG 6. KHẢO SÁT DUNG MÔI TẠO HẠT POLYMER ................ 19
CHƯƠNG 7. HIỆU SUẤT TẠO HẠT CỦA PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA 24
CHƯƠNG 8. KHẢO SÁT TỶ LỆ MONOMER CHỨC NĂNG................. 24
CHƯƠNG 9. KIỂM TRA KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CỦA SPE .......... 27
CHƯƠNG 10. KIỂM TRA TÍNH CHỌN LỌC CỦA MIP ......................... 28
KẾT LUẬN .................................................................................................... 31
ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 33

.


.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Từ tiếng anh

Tiếng Việt

MIP

Molecularly imprinted polymer

Polymer đóng dấu phân tử

NIP

Non impringting polymer

Polymer khơng đóng dấu

LDL

Low density lipoprotein

Lipoprotein tỷ trọng thấp

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

MISPE

Molecularly imprinted solid-phase
extraction

Chiết pha rắn sử dụng
polymer đóng dấu phân tử

làm pha rắn

NMR

Nuclear magnetic resonance

Phổ cộng hưởng từ

FT-IR

Fourier transform infrared

Quang phổ hồng ngoại

AFM

Atomic Force microscopy

Kính hiển vi lực nguyên tử

STM

Scanning tunneling microscopy

Kính hiển vi quét chui hầm

SEM

Scanning electron microscope

Kính hiên vi quét điện

HPLC

High performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

.


i.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Thành phần sơ bộ tổng hợp polymer đóng dấu phân tử. ...............................4
Bảng 2. Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng. ..............................................................9
Bảng 3. Công thức tổng hợp polymer ban đầu dựa theo tài liệu tham khảo [1, 3, 11]
...................................................................................................................................12
Bảng 4. Khảo sát dung mơi polymer hóa. .................................................................13
Bảng 5. Kết quả khảo sát thời gian polymer hóa ở những điều kiện nhiệt độ, quang
hóa khác nhau. ...........................................................................................................13
Bảng 6. Rửa giải MIP và NIP bằng các dung môi khác nhau (Phụ lục 4.8-4.16 ). ..16
Bảng 7. Rửa giải ống 1,2,3,4 tiếp với dung môi Methanol: Acid acetic (9:1) ..........17
Bảng 8. Kiểm tra khả năng tái hấp phụ quercetin (Phụ lục 4.17-4.18). ....................18
Bảng 9. Khảo sát tính chất của hạt polymer trong các dung môi và tỷ lệ khác nhau
...................................................................................................................................19
Bảng 10. Hiệu suất thu hạt. .......................................................................................24
Bảng 11. Kết quả định lượng quercetin cột SPE công thức 1...................................25
Bảng 12. Kết quả định lượng quercetin cột SPE công thức 2...................................25

Bảng13: Kết quả định lượng quercetin cột SPE công thức 3 ...................................26
Bảng14: Kiểm tra khả năng tái sử dụng trên một cột SPE ......................................27
Bảng15: Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của MIP công thức 2. ...............................28

.


.

i

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Q trình tổng hợp MIP[7] ............................................................................2
Hình 2. Quy trình khảo sát dung mơi rửa giải.............................................................8
Hình 3. Phổ truyền qua của màng mỏng MIP và NIP...............................................14
Hình 4. Phổ IR của MIP ............................................................................................15
Hình 5. Phổ IR của NIP.............................................................................................15
Hình 6. Phổ IR của MIP đã được rửa giải với Methanol:acid acetic (9:1) ...............16
Hình 7. Hình chụp các hạt polymer được tạo trong các dung mơi khác nhau. .........23
Hình 8. Hạt phương pháp nghiền ..............................................................................23
Hình 9. Hạt phương pháp kết tủa ..............................................................................23
Hình 10. Sắc ký đồ dịch rửa NIP bằng methanol:acid acetic (9:1) ...........................29
Hình 11. Sắc ký đồ dịch rửa MIP bằng methanol:acid acetic (9:1) .........................29
Hình 12. Sắc ký đồ dịch rửa MIP bằng methanol .....................................................29
Hình 13. Sắc ký đồ dịch rửa NIP bằng methanol .....................................................30
Hình 14. Sắc ký đồ methanol rửa MIP dư. ...............................................................30
Hình 15. Sắc ký đồ methanol rửa NIP dư. ................................................................30

.

.
ii

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Đường tuyến tính nồng độ và độ hấp thu của quercetin trong Methanol:acid
acetic (9:1) .................................................................................................................33
Phụ lục 2: Đường tuyến tính nồng độ và độ hấp thu của quercetin trong Methanol 33
Phụ lục 3: Phổ chuẩn rutin ........................................................................................34
Phụ lục 4: Phổ chuẩn của quercetin ..........................................................................34
Phụ lục 5: Phổ rửa MIP công thức 3 bằng methanol:acid acetic. .............................35
Phụ lục 6: Phổ rửa MIP công thức 1 bằng Methanol:acid acetic (9:1) .....................35
Phụ lục 7: Phổ truyền qua của MIP và NIP .............................................................36
Phụ lục 8. Phổ UV-Vis rửa MIP bằng n-butanol ......................................................36
Phụ lục 9: Phổ UV-Vis rửa MIP với n-butanol đến hết quercetin ............................37
Phụ lục 10: Phổ UV-Vis rửa methanol:acid acetic (9:1) sau khi rửa bằng n-butanol
...................................................................................................................................37
Phụ lục 11: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng ethanol........................................................38
Phụ lục 12: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng ethanol đến hết quercetin ...........................38
Phụ lục 13: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol:acid acetic (9:1) sau khi rửa bằng
ethanol .......................................................................................................................39
Phụ lục 14: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng nước. ..........................................................39
Phụ lục 15: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol ....................................................40
Phụ lục 16: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol đến hết. .......................................40
Phụ lục 17: Phổ UV-Vis rửa MIP bằng methanol:acid acetic (9:1) sau khi rửa bằng
methanol ....................................................................................................................41
Phụ lục 18: Phổ UV-Vis rửa MIP được tái hấp phụ bằng methanol .........................41
Phụ lục 19: Rửa MIP bằng methanol tái hấp phụ đến hết.........................................42

.

.

Phụ lục 20: Phổ UV-Vis rửa MIP tái hấp phụ bằng methanol: acid (9:1) sau khi rửa
bằng methanol. ..........................................................................................................42
Phụ lục 21: Đường tuyến tính thể hiện tương quan giữa nồng độ quercetin và diện
tích đỉnh. ....................................................................................................................43
Phụ lục 22: Đường tuyến tính thể hiện tương quan giữa nồng độ rutin và diện tích
đỉnh. ...........................................................................................................................43
Phụ lục 23: Tính tuyết tính tương quan giữa nồng độ quercetin và diện tích đỉnh ...44
Phụ lục 24: Tính tuyết tính tương quan giữa nồng độ quercetin và diện tích đỉnh ...46
Phụ lục 25: Tính tương thích hệ thống quercetin ........................................................1
Phụ lục 26: Tính tương thích hệ thống Rutin ..............................................................1

.


.

1

MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT
Tuy Việt Nam vẫn cịn là một nước đang phát triển nhưng hiện nay đã ứng dụng các
cơng cụ phân tích hiện đại có chi phí cao và địi hỏi chun mơn sâu để vận hành, điển
hình như HPLC, GC, SPE…. Mặc dù vậy, các phương pháp này cũng chưa cho thấy hiệu
quả trong một số trường hợp như tách các chất đồng phân, tách hoạt chất trong hỗn hợp
có nguồn gốc từ dược liệu [5].
Gần đây polymer đóng dấu phân tử (Molecular imprinted polymers – MIPs) nổi lên như

là một sự thay thế các tác nhân nhận diện sinh học như kháng nguyên, enzyme hay các
phân tử thụ thể khác. Mặc dù những tác nhân nhận diện sinh học này có tính chọn lọc và
đặc hiệu nhưng thường khơng ổn định, đắt tiền và có mật độ vị trí gắn kết thấp. Sự phát
triển phương pháp đóng dấu phân tử cung cấp một lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn liên
quan tới nhận diện phân tử sinh học. Polymer đóng dấu phân tử đã được ứng dụng rộng
rãi như chiết pha rắn, cảm biến, chất xúc tác, kháng nguyên nhân tạo, kháng thể nhân
tạo…[4]
Trong phương pháp tách và làm giàu các chất phân tích có nồng độ rất thấp như chiết
lỏng-lỏng, chiết pha rắn, kết tủa, cộng kết, sắc ký thì chiết pha rắn là phương pháp hiệu
quả nhất. Nhờ vào đặc tính chọn lọc, độ bền cơ học, bền với nhiệt cũng như giá thành
thấp và dể chế tạo. Chính vì vậy polymer đóng dấu phân tử là một lựa tốt để thay thế các
pha tĩnh truyền thống trong chiết pha rắn [10].
Phương pháp polymer đóng dấu phân tử nhận diện phân tử dựa trên ngun tắc “chìa
khóa và ổ khóa” (Hình 1).

.


.

2

Hình 1. Quá trình tổng hợp MIP[7]
Trong phương pháp này, phân tử chất phân tích như là một mẫu (chìa khóa), các
monomer sẽ tạo các liên kết với chất phân tích, sau đó các liên kết này được cố định bởi
sự polymer hóa. Sau khi hồn thành chất mẫu được lấy ra bằng cách rửa hoặc bốc hơi.
Quá trình này để lại trên polymer các vị trí liên kết có thể gắn kết lại với chất mẫu. Sau
đó các polymer in dấu phân tử này được nghiền mịn hoặc tồng hợp tiểu phân nano bằng
phương pháp kết tủa trong dung mơi [7].
Quercetin, một flavonoid có nhiều lợi ích đã được chứng minh, được lựa chọn làm phân

tử mẫu để lần đầu tiên tại Việt Nam áp dụng kỹ thuật đóng dấu phân tử định hướng tạo
vật liệu pha tĩnh cho kỹ thuật chiết pha rắn - solid phase extraction (SPE), định hướng
ứng dụng chiết và làm giàu quercetin [8, 10].
Do đó, đề tài Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin định hướng ứng dụng
làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn tách Quercetin có mục đích là nghiên cứu
và ứng dụng phương pháp polymer đóng dấu phân tử vào trong chiết và làm giàu
quercetin với những ưu điểm riêng của nó phù hợp điều kiện kinh tế Việt Nam hiện nay.

.


.

3

MỤC TIÊU
− Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer
− Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử quercetin (Quercetin-MIPs)
− Ứng dụng Quercetin-MIPs làm pha tĩnh trong chiết pha rắn để tách và làm giàu
quercetin
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ

Đối tượng nghiên cứu
Quercetin-MIPs: Vật liệu polymer đóng dấu phân tử quercetin (quercetin-MIP) có khả
năng lưu giữ, hấp phụ, tái hấp phụ chọn lọc quercetin, định hướng sử dụng là pha tĩnh
chiết pha rắn.

Dung mơi-hóa chất
Dung mơi, hóa chất thuốc thử đạt độ tinh khiết tùy mục đích sử dụng.
− Nguyên liệu quercetin hàm lượng 95% xuất xứ Việt Nam.

− 4-vinylpyridin (4-VP), acid methacrylic (MAA), ethylene glycol dimethacrylate
(EDMA), Azobisisobutyronitril (AIBN) được sản xuất bởi Sigma-Aldrich.
− Aceton, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol, acid acetic, cloroform, n-hexan
xuất xứ Trung Quốc.
− Methanol, acetonitril, nước cất dành cho sắc ký lỏng.

Trang thiết bị
Các thí nghiệm được thực hiện tại bộ mơn Phân tích-Kiểm nghiệm Khoa Dược, Đại học
Y Dược thành phố Hồ Chí Minh với các trang thiết bị như sau:
− Máy cô quay chân không R-210S (Bucchi)
− Bếp cách thủy Memmert WB-14, tủ sấy Memmert WM 500 CO
− Bể siêu âm Elma-Đức

.


.

4

− Cân điện tử phân tích HR-200, cân điện tử kỹ thuật
− Máy HPLC Alliance Waters 2695-PDA
− Máy quang phổ UV Shimadzu UV-2450
− Máy khuấy từ gia nhiệt IKA
− Spin-coater
− Kính hiển vi Olympus CH20.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Biện luận cơng thức tổng hợp polymer ban đầu
Bảng 1. Thành phần sơ bộ tổng hợp polymer đóng dấu phân tử.

Thành phần

Khối lượng

4-vinylpyridin

30 mg

Acid methacrylic

10 mg

EDMA

150 mg

AIBN (12% trong aceton)

30 mg

Quercetin

0.75 mg

Dung môi tổng hợp polymer

300 μl

Dựa trên tài liệu tham khảo, công thức theo Bảng 1 được đưa ra làm cơ sở tiến hành
nghiên cứu. Công thức thành phần tổng hợp polymer sử dụng 4-vinylpyridin, acid

methacrylic làm monomer chức năng, ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) là chất
tạo liên kết chéo, azobisisobutyronitrile (AIBN) làm chất khơi mào.

.


.

5

Khảo sát tính tan của các thành phần trong các dung môi
Dung môi sử dụng làm dung môi tổng hợp polymer phải hòa tan được các monomer
chức năng, phân tử mẫu, chất tạo liên kết chéo, chất khởi tạo thì các thành phần này mới
có thể tương tác với nhau để thực hiện phản ứng polymer hóa. Tổng hợp quercetin-MIP
cho quercetin sử dụng liên kết hydro làm tương tác chính giữa monomer chức năng và
phân tử quercetin, do đó dung môi làm dung môi tổng hợp polymer không được quá
phân cực vì nó sẽ cạnh tranh liên kết hydro giữa monomer chức năng và phân tử mẫu.
Khảo sát các dung môi: methanol, isopropanol, aceton, tetrehydrofuran, cloroform,
aceton + acid acetic.

Khảo sát điều kiện polymer hóa
Chuẩn bị cơng thức polymer như Bảng 1. Thực hiện phản ứng polymer hóa ở các điều
kiện khác nhau: nhiệt độ 45 oC, 60 oC, 75 oC hoặc chiếu tia UV 365 nm đến khi polymer
hình thành trạng thái gel (gel point) , giai đoạn mà các oligomer được hình thành.

Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer
Tồng hợp NIP
Tổng hợp polymer có thành phần như Bảng 1 tuy nhiên khơng thêm quercetin. Polymer
hóa ở điều kiện được lựa chọn trong mục “Khảo sát điều kiện polymer hóa” đến khi hỗn
hợp đạt trạng thái gel, sử dụng polymer gel này cho các bước tiếp theo.

Tổng hợp MIP
Tổng hợp polymer có thành phần như Bảng 1. Polymer hóa ở điều kiện được lựa chọn
trong mục “Khảo sát điều kiện polymer hóa” đến khi hỗn hợp đạt trạng thái gel,sử dụng
polymer gel này cho các bước tiếp theo.

.


.

6

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ UV-Vis
Khi các chuỗi polymer vẫn ở dạng oligomer thì nó ở dạng gel, có khả năng bám dính.
polymer gel tạo thành được dàn thành màng mỏng trên mặt kính. Tiếp tục polymer hóa
ở nhiệt độ 75oC trong 3 giờ đến khi màng trên mặt kính cứng lại.
Đo phổ truyền qua của polymer NIP và MIP trước và sau khi rửa giải với dung môi khác
nhau: nước, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol. So sánh phổ của NIP và MIP để
xác định sự tồn tại quercetin trong polymer.
Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer bằng phổ IR
Thực hiện phản ứng polymer đến khi polymer hình thành trạng thái rắn, nghiền mịn. Đo
phổ IR của MIP và NIP trước và sau khi rửa giải. So sánh phổ của NIP và MIP để xác
định sự tồn tại quercetin trong polymer.

Tạo hạt bằng phương pháp kết tủa
Tổng hợp NIP
Thực hiện tương tự mục “Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer”
Tổng hợp MIP:
Thực hiện tương tự mục “Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer”
Tạo hạt (tiểu phân nano - nanoparticles):

Cho 200 μl gel tạo được vào trong ống nghiệm thủy tinh 12 ml có nắp đậy có chứa sẵn
5ml dung mơi (nước cất 2 lần, methanol, ethanol, isopropanol, n-butanol). Vortex trong
1 phút, khuấy từ với tốc độ 2000 rpm trong 12 giờ. Hỗn hợp thu được dạng hỗn dịch với
các hạt polymer có kích thước hàng micromet đến nanomet.

.


.

7

Kiểm tra khả năng lưu giữ quercetin của MIP, và khả năng rửa giải của các
dung môi
Đem hỗn dịch trên đi ly tâm 4000 vòng trong 5 phút, bỏ phần dịch, thu được các hạt
polymer (MIP hoặc NIP). Rửa sạch các hạt bằng aceton để loại bỏ phần dịch dư có
quercetin, đảm bảo khơng cịn bám trên bề mặt của hạt và thành ống nghiệm.
Sử dụng các dung môi khác nhau để rửa giải các hạt polymer tạo được bằng cách cho
5ml dung môi vào ống nghiệm chứa hạt polymer, vortex trong 2 phút, sau đó ly tâm ở
tốc độ 4000 rpm trong 5 phút lấy phần dịch đem quét phổ hấp phụ ở bước sóng 600 200 nm để xác định sự có mặt quercetin.

Kiểm tra khả năng tái hấp phụ của MIP và NIP
Rửa tủa hạt polymer (MIP hay NIP) bằng dung môi methanol:acid acetic (9:1) đến khi
không cịn quercetin trong cấu trúc polymer (dung dịch rửa khơng có quercetin). Cho 1
ml dung dịch quercetin nồng độ 1mg/ml trong aceton vào ống nghiệm chứa tủa hạt đã
sạch quercetin. Vortex trong vịng 5 phút, sau đó đem ly tâm với tốc độ 4000 rpm trong
5 phút. Loại bỏ phần dịch và rửa với aceton để đảm bảo khơng cịn quercetin thừa không
hấp phụ trong polymer. Rửa tủa hạt polymer bằng dung môi methanol và methanol:acid
acetic (9:1), đo quang phổ dịch rửa giải.

.


.

8

Hình 2. Quy trình khảo sát dung mơi rửa giải

Khảo sát dung môi tạo hạt polymer
Tổng hợp MIP tương tự như mục “Kiểm tra khả năng giữ quercetin trên polymer”, thu
được MIP đang ở dạng gel.
Khảo sát tạo hạt với các dung môi khác nhau là: nước, methanol, ethanol, isopropanol,
n-butanol, n-hexan, chloroform, ethyl acetat, aceton với các tỷ lệ khác nhau là 1:25, 1:50,
1:100, 1:200.
Hỗn hợp gel polymer và dung mơi được khuấy trong máy khuấy từ trong vịng 24 giờ ở
nhiệt độ ta thu được hỗn dịch mà các tiểu phân là các hạt MIP. Đem hỗn dịch này trải
thành một lớp mỏng bằng cách sử dụng máy spin-coat. Sau đó đem soi dưới kính hiển
vi, xác định được kích thước, độ đồng nhất của các loại hạt được kết tủa trong từng loại
dung môi khác nhau.

Hiệu suất tạo hạt từ gel polymer
Hiệu suất tạo hạt được tính bằng phần trăm khối lượng hạt polymer thu được so với khối
lượng gel polymer sử dụng.

.


.

9

Nhồi cột SPE
Nhồi cột bằng 500 mg hạt polymer trong dung môi methanol dưới áp suất giảm. Rửa cột
bằng dung mơi thích hợp đến khi khơng cịn quercetin trong dịch rửa. Kiểm tra bằng
cách đo độ hấp thu UV-Vis của dịch rửa giải. Sau đó cột được ổn định bằng 10 ml dung
môi methanol.
Tải 1 ml dung dịch mẫu quercetin trong methanol với nồng độ 100 μg/ml sau đó rửa lần
lượt với 16 ml methanol và 16ml methanol:acid acetic (9:1).

Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng
Monomer chức năng giữ vai trị chính trong tương tác giữa polymer với mẫu, thơng qua
các nhóm chức –COOH, -NH2, ... Tỷ lệ các nhóm chức này sẽ ảnh hưởng tới khả năng
lưu giữ mẫu của polymer. Quercetin có 5 nhóm OH trong cơng thức, có tính acid yếu,
nên tỷ lệ acid methacrylic và 4-vinylpirydin cần được khảo sát để tìm ra xác nhận nhóm
chức nào –COOH hay pyridin có ảnh hưởng tới liên kết hydro với quercetin.
Tiến hành tổng hợp polymer với thành bảng như Bảng 2 và tạo hạt.
Bảng 2. Khảo sát tỷ lệ monomer chức năng.
Công thức

1

2

3

4-vinylpyridin (mg)

240

80

160

Acid methacrylic (mg)

80

240

160

EDMA (mg)

1200 1200 1200

AIBN (12% trong aceton) (mg)

240

240

240

Quercetin (mg)

6.4

6.4

6.4

Aceton (mg)

2400 2400 2400

Acid acetic (mg)

160

Tiến hành nhồi cột SPE.

.

0

25


.

10

Tải 1 ml dung dịch mẫu quercetin trong methanol với nồng độ 100 μg/ml sau đó rửa lần
lượt với 16 ml methanol và 16ml methanol:acid acetic (9:1).
Xác nhận sự có mặt của quercetin trong dịch rửa giải bằng phổ UV-Vis.

Khảo sát một số đặc tính của cột SPE
Khảo sát độ lặp lại
Tiến hành tái hấp phụ quercetin nhiều lần trên một cột SPE.

Khảo sát khả năng tải mẫu
Tiến hành tái hấp phụ quercetin với những hàm lượng khác nhau.
Khảo sát sơ bộ độ chọn lọc
Sử dụng rutin có cấu trúc gần giống với quercetin để kiềm tra tính chọn lọc của MIP
đối với phân tử quercetin. Tải quercetin với nồng độ 10 ppm bằng với khoảng nồng độ
trong mẫu tự nhiên. [2]
Tải 1 ml dung dịch gồm rutin, quercetin trong methanol với nồng độ quercetin 10 ppm
và rutin 10 ppm vào cột SPE sử dụng MIP đóng dấu quercetin làm pha rắn đã được ổn
định cột lần lượt với 5 ml methanol:acid acetic (9:1) và 5 ml methanol. Tiến hành rửa
giải theo thứ tự 16 ml methanol và 16 ml methanol:acid acetic (9:1), quercetin và rutin
trong dịch rửa giải được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC). Phương pháp được kiểm tra tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống và tính
tuyến tính trước khi tiến hành định lượng đồng thời quercetin, rutin trong dịch rửa giải.
Điều kiện sắc ký:
✓ Pha tĩnh: Cột sắc ký Nucleosil CI 8 (250 x 4 mm, 5 μm).
✓ Pha dộng: Methanol - acetonitril – đệm phosphat 0,01M pH 3 (30:60:10).
✓ Thể tích tiêm: 20 μ.l.
✓ Tốc độ dịng: 0,6 ml/ phút.

.


.

11

✓ Detector UV: 355 nm.
✓ Nhiệt độ cột: 30 0C

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

12

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
CHƯƠNG 1. BIỆN LUẬN CÔNG THỨC TỔNG HỢP POLYMER BAN ĐẦU
Bảng 3. Công thức tổng hợp polymer ban đầu dựa theo tài liệu tham khảo [1, 3, 11]
4-vinylpyridin

30 mg

Acid methacrylic

10 mg

EDMA

150 mg

AIBN (12 % trong aceton)

30 μl

Quercetin (5 mg/ml trong aceton)

0,75 mg

Dung môi tổng hợp polymer

300 μl

Trong công thức của polymer, tỷ lệ chất tạo liên kết chéo thường cao (thường là 80%)
để tạo ra vật liệu cấu trúc đủ cứng, duy trì sự ổn định các điểm nhân diện sau khi tách
phân tử mẫu ra. Trong công thức tỷ lệ của monomer chức năng thường cao hơn phân tử
mẫu để tạo thuận lợi cho sự hình thành phức hợp monomer chức năng và phân tử mẫu,
thường monomer chức năng phải dư thừa so với phân tử mẫu (4:1). Tuy nhiên, nếu tỷ lệ
monomer chức năng quá lớn thì tạo ra những điểm gắn kết khơng đặc hiệu, giảm tính
chọn lọc của polymer đóng dấu phân tử, nếu monomer chức năng có tỷ lệ quá ít, sẽ tạo
ra số lỗ gắn kết quá ít.
Tỷ lệ chất khơi mào trong phản ứng polymer thường thấp, khoảng 2% đến 3%.

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

13

CHƯƠNG 2. KHẢO SÁT DUNG MƠI POLYMER HÓA
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN POLYMER HÓA
Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp kết tủa để tạo hạt polymer, do đó polymer
phải ở dạng gel để tổng hợp polymer. Trong quá trình tổng hợp polymer, trạng thái gel
của polymer là trạng thái mà lúc đó dịch polymer có độ nhớt lớn, quan sát độ nhớt
polymer này bằng mắt thường.
Bảng 5. Kết quả khảo sát thời gian polymer hóa ở những điều kiện nhiệt độ, quang hóa
khác nhau.
Điều kiện polymer hóa Nhiệt độ 45 OC Nhiệt độ 60 OC Nhiệt độ 75 OC Tia UV
Thời gian polymer hóa >24 giờ

Trạng thái gel
Chú thích:

-

12 giờ

23 phút
-

+

>24 giờ
-

(-): Khó nhận biết.
(+): Dễ nhận biết.

Nhận xét: Như vậy theo Bảng 5 , trong khn khổ thời gian nghiên cứu có hạn, lựa chọn
điều kiện thực hiện phản ứng polymer hóa ở nhiệt độ 75 oC là phù hợp và thời gian phản
ứng polymer hóa là 23 phút.

.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

14

CHƯƠNG 3. KIỂM TRA KHẢ NĂNG GIỮ QUERCETIN TRÊN POLYMER

Kiểm tra sự có mặt quercetin trong polymer ở dạng màng mỏng bằng phổ
UV-Vis

Hình 3. Phổ truyền qua của màng mỏng MIP và NIP
So sánh phổ truyền qua của MIP và NIP cho thấy sự khác nhau, do đó có thể dùng phổ
truyền qua UV-Vis để khảo sát sự có mặt của quercetin trong cấu trúc phân tử. Sự khác
nhau này chứng tỏ MIP có khả năng giữ quercetin trong cấu trúc của nó so với NIP
khơng có.
Khi sử dụng các dung mơi dùng để rửa giải quercetin ra khỏi cấu trúc của MIP thì các
polymer khơng cịn khả năng bám dính trên bề mặt lam kính. Hơn nữa cường độ hấp thu
của màng polymer khó kiểm soát, cao hơn ngưỡng nhận biết của máy dẫn đến phổ thu
được khơng có đỉnh rõ ràng. Như vậy, sử dụng phương pháp này để kiểm tra khả năng
rửa giải của các dung mơi là khơng thích hợp.

.