Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng phương pháp điện di mao quản

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN
QUANG HỌC TRAMADOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN
/2017/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng
ThS. Trần Quốc Thanh

Tp. Hồ Chí Minh 9-2018

.


.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN
QUANG HỌC TRAMADOL BẰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐIỆN DI MAO QUẢN
/2017/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 9-2018

.


.

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
ThS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng
ThS. Trần Quốc Thanh
Lâm Yến Huê

.


.

MỤC LỤC
1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3
2.1. TRAMADOL HYDROCLORID .............................................................................. 3

2.2. Các cơng trình tách đồng phân tramadol bằng điện di mao quản ............................. 4
3. ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 5
3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 5
3.2. . PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................... 6
4. KẾT QUẢ ................................................................................................................. 11
4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA
TRAMADOL ................................................................................................................. 11
4.1.1. Khảo sát pH .......................................................................................................... 11
4.1.2. Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền .............................................................. 11
4.1.3. Khảo sát tác nhân đối quang ................................................................................ 12
4.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CỦA
TRAMADOL ................................................................................................................. 13
4.2.1. Tính phù hợp hệ thống ......................................................................................... 13
4.2.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................ 14
4.2.3. Tính tuyến tính ..................................................................................................... 16
4.2.4. Độ lặp lại .............................................................................................................. 20
4.2.5. Độ đúng ................................................................................................................ 21
5. KẾT LUẬN ............................................................................................................... 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO

.


.

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ nguyên

Nghĩa Tiếng Việt

BGE

Background Electrolyte

Dung dịch điện ly nền

CD

Cyclodextrin

Cyclodextrin

CE

Capillary Electrophoresis

Điện di mao quản

CM--CD

Carboxymethyl--cyclodextrin

CorrArea

Corrected Area

Diện tích pic đƣợc chuẩn hóa

CZE

Capillary Zone Electrophoresis

Điện di mao quản vùng

HP--CD

Hydroxypropyl--cyclodextrin

M--CD

Methyl--cyclodextrin

MC--CD

Methoxycarbonyl--cyclodextrin

Rs

Resolution

Độ phân giải

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

TB

Trung bình

tM

Migration time

.

Thời gian di chuyển


.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu........................................................5
Bảng 3.2. Dung mơi hóa chất sử dụng ........................................................................5
Bảng 4.1. Kết quả tính phù hợp hệ thống. ................................................................13
Bảng 4.2. Kết quả tính đặc hiệu. ...............................................................................15
Bảng 4.3. Kết quả khảo sát sự tƣơng quan giữa tỉ số nồng độ mỗi đồng phân/
epedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa. .................................................................17
Bảng 4.4. Kết quả xử lý thống kê..............................................................................18
Bảng 4.5. Kết quả độ lặp lại. .....................................................................................20

Bảng 4.6. Kết quả khảo sát độ đúng của đồng phân (-) tramadol .............................21
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát độ đúng của đồng phân (+) tramadol ............................22

.


.

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cơng thức cấu tạo của tramadol hydroclorid. .............................................3
Hình 4.1. Đồ thị biểu biễn sự phụ thuộc độ phân giải theo pH dung dịch điện ly nền
...................................................................................................................................11
Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ phân giải theo nồng độ dung dịch
điện ly nền .................................................................................................................12
Hình 4.3. Điện di đồ của tramadol với các tác nhân đối quang khác nhau. ..............12
Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn độ phân giải theo nồng độ CM-β-CD.............................13
Hình 4.5. Điện di đồ các mẫu trắng, chuẩn, thử và thử thêm chuẩn. ........................15
Hình 4.6. Điện di đồ các mẫu đối chiếu. ...................................................................16
Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa tỉ số nồng độ đồng phân (-) tramadol/
ephedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa. ...............................................................17
Hình 4.8. Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quang giữa tỉ số nồng độ đồng phân(+)
Tramadol/ ephedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa. .............................................18

.


.

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng
phƣơng pháp điện di mao quản.
- Mã số:
- Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Minh Phƣơng

Điện thoại: 0909810668

Email:
- Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Bộ môn PT-KN, khoa Dƣợc
- Đồng chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Thanh

Điện thoại: 0903389214

Email:
- Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Bộ môn Bào chế, khoa Dƣợc
- Thời gian thực hiện: 10/2017 – 10/2018
2. Mục tiêu: Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng
phƣơng pháp điện di mao quản.
3. Nội dung chính:
-

Xây dựng quy trình ứng dụng tác nhân đối quang tổng hợp để tách đồng phân
quang học tramadol bằng kỹ thuật điện di mao quản.

-

Khảo sát các điều kiện tách đồng phân quang học tramadol bằng kỹ thuật điện
di mao quản.

-

Đánh giá quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol.

4. Kết quả chính đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...)
- Quy trình phân tách đồng phân tramadol bằng phƣơng pháp điện di mao quản đã
đƣợc xây dựng, sử dụng hệ điện ly nền phosphat – tris 50 mM pH 3; tác nhân đối

.


.

quang carboxymethyl-β-CD 5 mg/ ml; điện thế 25 kV; nhiệt độ cột 25 oC; áp suất
bơm mẫu 50 mbar; thời gian bơm mẫu 5s; nội chuẩn ephedrin 50 µg/ ml. Kết quả
thẩm định cho thấy quy trình phân tách có tính đặc hiệu; khoảng tuyến tính 2,5 –
125 µg/ml cho mỗi đồng phân với hệ số tƣơng quan cao (R > 0,995); độ lặp lại đạt
(RSD < 2 %) và độ đúng với tỷ lệ phục hồi 98 - 106%.
- Bài báo cáo poster tại hội nghị ASEAN PharmNET 2 2017 Malaysia

.


.

1. MỞ ĐẦU
Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của chúng đƣợc sử dụng phổ biến trong
các phƣơng pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao
quản (CE), ...làm tác nhân đối quang tách đồng phân quang học (1, 3, 4, 5, 6, 7), đặc biệt
đƣợc ứng dụng trong kiểm nghiệm các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt. Để

phân tách các dƣợc chất quang hoạt cần tác nhân đối quang phù hợp với tính chất của
dƣợc chất, đơi khi để phân tách đƣợc các dạng đồng phân của một chất còn cần phải
phối hợp nhiều tác nhân quang hoạt với nhau. Các thuốc có hoạt chất là dạng đồng
phân riêng lẻ xuất hiện ngày càng nhiều trên thị trƣờng dƣợc phẩm trong và ngồi
nƣớc do có hoạt tính mạnh và ít tác dụng phụ hơn dạng racemic của chúng nhƣ: Samlodipin, levofloxacin, levocetirizin, esomeprazol, .....So với một số lƣợng lớn các
dƣợc chất quang hoạt rất đa dạng về cấu trúc và tính chất đang có mặt trên thị trƣờng
hiện nay thì số lƣợng các tác nhân quang hoạt đƣợc thƣơng mại hóa cịn ít, giá thành
cao. Chính vì vậy, xu hƣớng của các nhà nghiên cứu ở các nƣớc hiện nay là tổng
hợp nhiều tác nhân tách đồng phân chun biệt có tính chọn lọc cao và có giá trị
kinh tế (4,6). Gần đây nhóm nghiên cứu chúng tơi đã tổng hợp đƣợc các dẫn chất
methyl--CD (M--CD), methoxycarbonyl--CD (MC--CD) và carboxymethyl-CD (CM--CD). Với mong muốn chứng minh hiệu quả của các sản phẩm này trong
vai trò làm tác nhân đối quang để phân tách các đồng phân quang học bằng CE, đề
tài: “Xây dựng quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng phƣơng
pháp điện di mao quản” đã đƣợc thực hiện với mục tiêu xây dựng và thẩm định quy
trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng phƣơng pháp điện di mao quản
dùng tác nhân đối quang tự tổng hợp.
với các mục tiêu sau:
- Ứng dụng tác nhân đối quang đã tổng hợp đƣợc để phân tách đồng phân quang
học tramadol bằng phƣơng pháp điện di mao quản
- Khảo sát các điều kiện điện di nhƣ dung dịch điện ly nền, pH, tác nhân đối quang,
dung môi hữu cơ thêm vào dung dịch điện ly nền

1
.


.

- Xây dựng và thẩm định quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol bằng
phƣơng pháp điện di mao quản.

2
.


.

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TRAMADOL HYDROCLORID
2.1.1. Tên gọi và cơng thức hóa học
Tên khoa học:
(1RS,2RS)-2-[(Dimethylamino)

methyl]-1-(3-methoxyphenyl)

cyclohexanol

hydrochloride.
Cơng thức phân tử: C16H25NO2.HCl
Phân tử lƣợng: 299,8 g/ mol.

Hình 2.1. Cơng thức cấu tạo của tramadol hydroclorid.

2.1.2. Tính chất
Bột tinh thể trắng hoặc gần nhƣ trắng. pKa = 9,41. Điểm chảy 180 OC – 184 OC.
Tan tự do trong nƣớc và methanol, tan kém trong aceton

2.1.3. Cơ chế tác dụng, chỉ định và tác dụng phụ
Tramadol là thuốc tổng hợp, thuộc nhóm thuốc giảm đau opioid, tác động trên các
receptor µ, κ ở tận cùng sợi thần kinh hƣớng tâm tại sừng sau tủy sống gây ức chế

sự tiết chất P (một peptid) là chất trung gian hóa học có vai trị trong sự dẫn truyền
cảm giác đau theo trục tủy – đồi thị - vỏ não. Do đó, nó có tác dụng giảm đau. Tuy
có cấu trúc tƣơng cận codein, nhƣng ái lực gắn kết với receptor µ kém hơn codein
nên khả ngăn gây nghiện cũng thấp hơn. Hiệu lực giảm đau của tramadol cịn có thể
do tác động ức chế sự tái bắt giữ noradrenalin và serotonin ở thần kinh trung ƣơng,
gây ra sự ngăn chặn dẫn truyền cảm giác đau từ tủy sống đến trung ƣơng.

3
.


.

Tramadol đƣợc chỉ định trong các chứng đau từ trung bình đến nặng nhƣ đau cơ,
khớp, đau hậu phẫu, đau do nguyên nhân thần kinh, đau do ung thƣ.
Tramadol có thể gây ra tác dụng không mong muốn: rối loạn thần kinh – tâm thần
(tùy thuộc vào đáp ứng cá thể, thƣờng gặp ở ngƣời cao tuổi), có thể gây lẫn lộn, ảo
giác, co giật khi sử dụng liều cao hoặc đồng thời với các thuốc làm giảm ngƣỡng
kích thích gây động kinh. Các tác dụng phụ thƣờng gặp nhất là buồn nơn, nơn, buồn
ngủ, đau đầu, chóng mặt, vã mồ hơi, mệt mỏi, khơ miệng, táo bón khi sử dụng kéo
dài. Các phản ứng hiếm gặp hơn bao gồm đau thƣợng vị, phát ban, suy nhƣợc, giảm
thị lực và rối loạn tim mạch. Các phản ứng rất hiếm gặp: phản ứng phản vệ (mề đay,
phù mạch, co thắt phế quản) đơi khi dẫn đến sốc có thể gây tử vong; rối loạn tiết
niệu (tiểu khó, bí tiểu); rối loạn hô hấp hoặc suy hô hấp nếu sử dụng liều vƣợt quá
liều khuyến cáo, hoặc dùng đồng thời với các thuốc giảm đau khác; lệ thuộc thuốc;
hội chứng cai thuốc sau khi sử dụng một thời gian dài, với các triệu chứng kích
động, lo âu, căng thẳng, mất ngủ, tăng động, rung rẩy và triệu chứng trên tiêu hóa.
Tăng enzym gan đƣợc ghi nhận trong một số ca sử dụng tramadol.

2.2. Các cơng trình tách đồng phân tramadol bằng điện di mao quản

-

Phƣơng pháp CE: sử dụng cột mao quản silica khơng bao, đƣờng kính trong

75 µm, chiều dài cột 40 cm (chiều dài hiệu quả 32 cm), dung dịch điện ly nền
phosphat 25 mM, pH 7,0 chứa 2% (kl/ tt) HS-γ-CD, điện thế 10 kV, nhiệt độ cột 20
o

C, bƣớc sóng phát hiện 200 nm.(1)
-

Phƣơng pháp CE: sử dụng cột mao quản silica đƣờng kính trong 75 µm,

chiều dài 70 cm (chiều dài hiệu quả 60 cm), dung dịch điện ly nền tris phosphat 50
mM, pH 2,5 chứa 2 mM CM-β-CD, điện thế 20 kV, nhiệt độ cột 25 oC, bƣớc sóng
phát hiện 195 nm. (3)

4
.


.

3. ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng: Thuốc viên nang cứng Tramadol MYLAN (tramadol clohydrat) 50 mg,
số lô 30461

Chất đối chiếu:
Bảng 3.1. Chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu

Tramadol hydroclorid

Ephedrin hydroclorid

231 011213

249 010515

100,03%

99,62%

Viện kiểm nghiệm

Viện kiểm nghiệm

TP.HCM

TP.HCM

2 – 8 oC

2 – 8 oC

Số kiểm sốt
Hàm lƣợng tính trên chế
phẩm ngun trạng (%)
Nơi cung cấp

Bảo quản

Dung mơi hóa chất
Bảng 3.2. Dung mơi hóa chất sử dụng
Tên dung mơi/ hóa chất
Tris (hydroxymethyl
aminomethane)

Nguồn gốc

Merck

Methanol

Merck

Natri hydroxid

Merck

Acid phosphoric đậm đặc

Merck

5
.


.

Kali dihydrophosphat

Merck

CM-β-CD

Tổng hợp

HP-β-CD

Himedia

M-β-CD

Tổng hợp

MC-β-CD

Tổng hợp

Trang thiết bị
- Cân phân tích Satorius
- Máy đo pH Neomet 240 L
- Bể siêu âm Brason
- Máy quang phổ UV- Vis Shimadzu MPC – 2200
- Máy điện di mao quản đầu dò DAD Agilent CE 7100 (Đức)
- Cột mao quản silica nung chảy chiều dài 56 cm, chiều dài hiệu lực 50 cm, đƣờng
kính trong 50 µm
- Màng lọc PTFE 0,22 µm
- Các dụng cụ thƣờng quy trong phịng thí nghiệm: pipet khắc vạch, pipet chính
xác, phễu lọc, bình định mức, becher…

3.2. . PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu
Dung dịch đối chiếu gốc tramadol hydroclorid 1000 µg/ ml
Cân chính xác 100 mg tramadol hyroclorid chuẩn cho vào bình định mức 100 ml.
Thêm 60 ml methanol. Siêu âm cho tan hoàn toàn. Bổ sung methanol đến vạch, lắc
đều.
Dung dịch chuẩn gốc ephedrin hydroclorid 1000 µg/ ml

6
.


.

Cân chính xác 100 mg ephedrin hydroclorid chuẩn cho vào bình định mức 100 ml.
Thêm 60 ml methanol. Siêu âm cho tan hoàn toàn. Bổ sung methanol đến vạch, lắc
đều.
Dung dịch đối chiếu tramadol hydroclorid 50 µg/ ml (có nội chuẩn)
Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc tramadol hydroclorid và 1 ml dung dịch
chuẩn gốc ephedrin hydroclorid 1000 µg/ ml cho vào bình định mức 20 ml. Thêm
nƣớc khử khoáng vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc milipore 0,2 µm.
Dung dịch thử tramadol hydroclorid 1000 µg/ ml
Cân 100 mg tramadol hydroclorid nguyên liệu cho vào bình định mức 100 ml.
Thêm 60 ml methanol. Siêu âm cho tan hoàn toàn. Bổ sung methanol đến vạch, lắc
đều.
Dung dịch thử tramadol hydroclorid 50 µg/ ml (có nội chuẩn)
Hút chính xác 1 ml dung dịch thử tramadol hydroclorid 1000 µg/ ml và 1 ml dung
dịch chuẩn gốc ephedrin hydroclorid 1000 µg/ ml cho vào bình định mức 20 ml.
Thêm nƣớc khử khoáng vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc milipore 0,2

µm.
Dung dịch acid phosphoric 0,5 M
Hút chính xác 5 ml dung dịch acid phosphoric đậm đặc cho vào bình định mức 100
ml. Thêm nƣớc khử khống vừa đủ đến vạch, lắc đều.
Dung dịch tris 0,5 M
Cân chính xác 3,0285 g tris cho vào bình định mức 50 ml. Thêm nƣớc khử khống,
lắc cho tan hồn tồn. Bổ sung nƣớc khử khoáng đến vạch, lắc đều.
Dung dịch điện ly nền phosphat – tris 50 mM pH 3
Hút chính xác 5 ml dung dịch acid phosphoric 0,5 M cho vào bình định mức 50 ml.
Thêm nƣớc khử khống đến vạch, lắc đều. Chỉnh pH đến 3 bằng dung dịch tris 0,5

7
.


.

M. Lọc qua giấy lọc thƣờng. Dùng dung dịch điện ly nền để pha dung dịch có chứa
tác nhân đối quang với nồng độ khảo sát, lọc qua màng lọc milipore 0,2 µm.

3.2.2. Chuẩn bị cột
Hoạt hóa cột bằng NaOH 1M trong 30 phút, nƣớc trong 30 phút rồi cân bằng đệm
trong 30 phút.
Đầu mỗi ngày, tiến hành rửa cột với nƣớc trong 10 phút, NaOH 0,1 M trong 10
phút, rồi rửa lại với nƣớc trong 10 phút. Sau đó cân bằng đệm 30 phút.
Giữa các lần tiêm mẫu, rửa cột bằng nƣớc trong 5 phút, dung dịch đệm 15 phút.

3.2.3. Khảo sát điều kiện phân tách đồng phân quang học tramadol
3.2.3.1. Điều kiện cố định
Quá trình điện di đƣợc tiến hành trên cột mao quản silica nung chảy, đƣờng kính

trong 50 µm, chiều dài tổng cộng 56 cm, chiều dài hiệu quả 50 cm.
Cài đặt nhiệt độ mao quản 25 oC, điện thế 25 kV.
Tiêm mẫu bằng chƣơng trình áp suất 50 mbar × 5 giây.
Bƣớc sóng phát hiện: bƣớc sóng hấp thu cực đại của tramadol.

3.2.3.2. Điều kiện khảo sát
Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình phân tách đồng
phân nhƣ: dung dịch điện ly nền: phosphat – tris, kali dihydrophosphat; pH 2 – 6;
tác nhân đối quang: M-β-CD, HP-β-CD, CM-β-CD, MC-β-CD; nồng độ tác nhân
đối quang: 3 – 10 mg/ml.Điều kiện điện di đƣợc chọn phải có đáp ứng đầu dị cao,
đƣờng nền ít bị nhiễu, hai đỉnh đồng phân tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs
> 1,5.
Thẩm định quy trình đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của ICH. (2)

3.2.4. Đánh giá quy trình phân tách đồng phân quang học tramadol
Sau khi tiến hành khảo sát và chọn một điều kiện để phân tách đồng phân quang học
tramadol, tiến hành đánh giá quy trình với điều kiện đã chọn.
8
.


.

3.2.4.1. Khảo sát tính phù hợp hệ thống
Bơm lần lƣợt 6 lần dung dịch đối chiếu vào máy điện di mao quản, tiến hành điện di
với điều kiện đƣợc lựa chọn. Tính phù hợp hệ thống đƣợc xác định dựa trên giá trị
và độ lặp lại các thông số.


Tỉ số thời gian lƣu tM của chuẩn so với chuẩn nội



Tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa CorrArea của chuẩn so với chuẩn nội

Quy trình đạt tính phù hợp hệ thống khi:


Tỉ số thời gian lƣu tM của chuẩn so với chuẩn nội có RSD ≤ 2,0 %



Tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa CorrArea của chuẩn so với chuẩn nội có RSD ≤
2,0 %

3.2.4.2. Xác định tính đặc hiệu
Bơm dung dịch đối chiếu, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chất đối chiếu và mẫu
trắng vào máy điện di mao quản. Tiến hành điện di.
Quy trình đạt tính đặc hiệu khi:
Tỉ số thời gian lƣu của mẫu thử so với chuẩn nội và tỉ số thời gian lƣu so với chuẩn
nội của mẫu thử thêm chất đối chiếu phải tƣơng đƣơng so với tỉ số thời gian lƣu so
với chuẩn nội của mẫu đối chiếu.
Điện di đồ mẫu trắng không đƣợc có đỉnh trùng với đỉnh của mẫu đối chiếu.
Diện tích đỉnh chuẩn hóa, chiều cao của đỉnh của dung dịch thử thêm chất đối chiếu
phải tăng lên so với mẫu thử.

3.2.4.3. Khảo sát độ lặp lại
Tiến hành trên 6 mẫu thử, mỗi mẫu bơm 1 lần, tính RSD của các kết quả thu đƣợc
từ 6 lần đo.
Quy trình đạt độ lặp lại khi hàm lƣợng mỗi đồng phân tìm đƣợc có RSD  2,0%.

9
.


.

3.2.4.4. Xác định khoảng tuyến tính
Bơm 6 dung dịch chuẩn có nồng độ tramadol tƣơng ứng là 5 µg/ ml, 10 µg/ ml, 20
µg/ ml, 50 µg/ ml, 100 µg/ ml, 250 µg/ ml và nồng độ ephedrin trong mỗi dung dịch
trên là 50 µg/ ml. Mỗi dung dịch bơm 1 lần. Ghi nhận giá trị diện tích đỉnh chuẩn
hóa và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa của từng đồng phân so với ephedrin trong mỗi
mẫu. Dùng phần mềm Excel để vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỉ
số nồng độ mỗi đồng phân so với chuẩn nội ephedrin và tỉ số diện tích đỉnh chuẩn
hóa của mỗi đồng phân so với ephedrin. Thiết lập phƣơng trình hồi quy thể hiện
mối tƣơng quan tuyến tính cho 2 đồng phân. Dùng trắc nghiệm F (Fisher) và trắc
nghiệm t (Student) kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy và ý nghĩa
các các hệ số trong phƣơng trình, tính giá trị R2. Từ đó đánh giá tính tuyến tính với
yêu cầu R2 ≥ 0,995.

3.2.4.5. Khảo sát độ đúng
Khảo sát độ đúng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp mẫu thử thêm chuẩn.
Thêm chất đối chiếu tƣơng ứng với 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120 % so với nồng
độ đo đƣợc của mẫu thử. Tiến hành đo 3 nồng độ mẫu thử thêm chuẩn, mỗi nồng độ
đo 3 lần. Xác định tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa, tính hàm lƣợng tổng cộng tìm
thấy, suy ra hàm lƣợng chất đối chiếu tìm thấy, từ đó tính tỷ lệ phục hồi. Tỷ lệ phục
hồi ở mỗi mức nồng độ phải đáp ứng ở mức giới hạn cho phép.

10
.

.

4. KẾT QUẢ
4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG
HỌC CỦA TRAMADOL
4.1.1. Khảo sát pH
Kết quả cho thấy đồng phân tramadol tách tốt trong khoảng pH 2,0 – 4,0 và không
phân tách với pH lớn hơn 4,0. Tiến hành điện di khảo sát ảnh hƣởng của pH trong
khoảng 2,0 – 4,0 với khoảng cách pH là 0,5 cho kết quả pH 3,0 cho thấy độ phân
giải tốt nhất (Rs = 3,21) so với pH 2,0 (Rs = 2,30); pH 2,5 (Rs = 2, 78) và pH 4,0
(Rs = 2,06). Chọn dung dịch điện ly nền phosphat – tris pH 3 làm điều kiện điện di
để tách đồng phân tramadol.

Hình 4.1. Đồ thị biểu biễn sự phụ thuộc độ phân giải theo pH dung dịch điện ly nền

4.1.2. Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền
Kết quả khảo sát cho thấy, độ phân giải tăng lên trong khoảng nồng độ dung dịch
điện ly nền từ 20 – 50 mM và giảm nhẹ trong khoảng 50 – 60 mM. Độ phân giải ở
nồng độ dung dịch điện ly nền 50 mM là cao nhất.Chọn dung dịch điện ly nền
phosphat- tris 50 mM pH 3 làm điều kiện phân tách đồng phân tramadol.

11
.


.

Nồng độ BGE

Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ phân giải theo nồng độ dung dịch
điện ly nền

4.1.3. Khảo sát tác nhân đối quang
Dung dịch đối chiếu và dung dịch điện ly nền đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 3.2.1.
Các điều kiện điện di khác nhƣ pH, dung dịch đệm, điện thế, nhiệt độ cột mao quản
đƣợc cố định. Khảo sát khả năng tách đồng phân tramadol của các loại tác nhân đối
quang M-β-CD, HP-β-CD, MC-β-CD, CM-β-CD ở nồng độ khảo sát 5 mg/ ml. Kết
quả khảo sát đƣợc thể hiện ở hình 4.3

M-β-

MC-β-CD CM-β-CD

HP-β-

CD
CD
Hình 4.3. Điện di đồ của tramadol với các tác nhân đối quang khác nhau.
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy trong các loại tác nhân đối quang thì chỉ có
CM-β-CD có khả năng tách đồng phân tramadol.
Kết luận: Tiếp tục khảo sát về các nồng độ CM-β-CD lân cận 5 mg/ ml.

12
.


.

4.1.3.1. Khảo sát nồng độ tác nhân đối quang

Khảo sát độ phân giải của đồng phân tramadol trong các dung dịch điện ly nền
phosphat – tris 50 mM pH 3 chứa các nồng độ CM-β-CD 3 mg/ ml, 5 mg/ ml, 7 mg/
ml, 10 mg/ ml.

Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn độ phân giải theo nồng độ CM-β-CD.
Nhận xét: Với nồng đồ 3 mg/ ml, độ phân giải nhỏ hơn 1,5. Ở các nồng độ 5, 7, 10
mg/ ml, độ phân giải đều đạt trên 1,5. Tuy nhiên ở nồng độ 5 mg/ ml có độ phân
giải cao nhất (2,69). Khi nồng độ CM-β-CD tăng lên, hiện tƣợng kéo đuôi của pic
càng nhiều.
Kết luận: Chọn nồng độ CM-β-CD 5 mg/ ml làm điều kiện tách đồng phân.

4.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG
HỌC CỦA TRAMADOL
4.2.1. Tính phù hợp hệ thống
Bảng 4.1. Kết quả tính phù hợp hệ thống.
Lần

Tỉ số thời gian lƣu

Tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa

(tS/ tIS)

(CorrAreaS/ CorrAreaIS)

tiêm
mẫu

Rs

(-) Tramadol

(+) Tramadol

(-) Tramadol

(+) Tramadol

1

1,478506

1,539865

1,068634

1,061697

2,93

2

1,475024

1,531895

1,067125

1,057475

2,86

13
.


.

3

1,467339

1,520194

1,078854

1,075316

2,78

4

1,473094

1,524557

1,098236

1,072721

2,69

5

1,466749

1,514740

1,045925

1,024552

2,63

6

1,462799

1,508687

1,083778

1,084972

2,51

TB

1,470585

1,523323

1,073759

1,062789

2,73

SD

0,005909

0,011369

0,017723

0,021162

0,401843

0,746352

1,650538

1,991186

RSD
(%)
Nhận xét:

Sau 6 lần tiêm, mẫu chuẩn tramadol đều có RSD của tỉ số thời gian lƣu (tS/ tIS) và
RSD của tỉ số diện tích đỉnh chuẩn hóa (CorrAreaS/ CorrAreaIS) ≤ 2,0 %, và độ
phân giải giữa 2 pic đồng phân đều lớn hơn 1,5 nên quy trình phân tích đạt tính phù
hợp hệ thống.

4.2.2. Tính đặc hiệu
Tiến hành điện di mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn với điều
kiện đã khảo sát. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4.5.

14
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Hình 4.5. Điện di đồ các mẫu trắng, chuẩn, thử và thử thêm chuẩn.
Bảng 4.2. Kết quả tính đặc hiệu.
Chuẩn nội

(-) Tramadol

Ephedrin

(+) Tramadol

Mẫu
T1

Tm1

Trắng

-

-

-

-

-

Chuẩn

16.683

24.750

1,484

25.811

1,547

Thử

16.306

24.189

1,483

25.142

1,542

15.660

23.070

1,473

23.983

1,531

(Tm1/ TmIS)

Tm2

T2

TmIS

(Tm2/ TmIS)

Thử thêm
chuẩn

Nhận xét: Kết quả cho thấy trong cùng một điều kiện phân tích:

Tỉ số thời gian lƣu giữa các đỉnh trong mẫu thử so với chuẩn nội Ephedrin tƣơng
đƣơng với tỉ số thời gian lƣu giữa các đỉnh trong mẫu chuẩn so với chuẩn nội
Ephedrin.
15
.


Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

Điện di đồ mẫu trắng khơng có đỉnh trùng với đỉnh của mẫu đối chiếu.
Diện tích đỉnh chuẩn hóa, chiều cao của đỉnh của dung dịch thử thêm chất đối chiếu
tăng lên so với mẫu thử.
Kết luận: Vậy quy trình có tính đặc hiệu.
Do khơng có chuẩn đồng phân, nên dựa vào tài liệu tham khảo của tác giả Jean Luc
Veuthey Serge Rudaz, Claudia Desiderio, Salvatore Fanali, (1998)

(3)

có điều kiện

tiến hành điện di tƣơng tự để xác định các đỉnh đồng phân của tramadol trên điện di
đồ

(-)

(+)

tramadol

tramadol

Hình 4.6. Điện di đồ các mẫu đối chiếu.

4.2.3. Tính tuyến tính
Tiến hành điện di với các mẫu dung dịch đối chiếu tramadol hydroclorid có nồng độ
5 µg/ ml, 10 µg/ ml, 20 µg/ ml, 50 µg/ ml, 100 µg/ ml, 250 µg/ ml và nồng độ
ephedrin trong mỗi dung dịch trên là 50 µg/ ml. Với điều kiện điện di đã chọn, ghi
nhận giá trị CorrArea của các mẫu dung dịch đối chiếu. Kết quả đƣợc xử lý bằng
phần mềm MS- Excel và các trắc nghiệm thống kê (trắc nghiệm Fisher và trắc
nghiệm Student), kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở bảng 4.3.

16
.