LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen DREB5 phân lập từ hai giống đậu tương địa phương xuân lạng sơn và lơ bắc giang

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai cơng bố
trong một cơng trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ chuyên
ngành Di truyền học, Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên, tôi đã
nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ của các thầy cơ giáo, các đồng nghiệp, bạn bè
và gia đình.
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hồng
Mậu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu để tôi hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trường Đại
học Khoa học - Đại học Thái Ngun đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong q trình
thực hiện đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh- KTNN và khoa Sau
đại học, Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành
cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã ln cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm
Tác giả

ii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài...............................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu..........................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................... 3
Chương 1.......................................................................................................... 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................4
1.1.CÂY ĐẬU TƯƠNG.........................................................................................4
1.1.1.Đặc điểm sinh học cây đậu tương.............................................................4
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương............................................................. 6
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam......................7
1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG
......................................................................................................................... 11
1.2.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu tương
12
1.2.2. Nhóm gen điều khiển q trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn.......15
1.3. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB5 VÀ GEN DREB5........................................ 20
1.3.1. Nhân tố phiên mã DREB5.....................................................................20
1.3.2. Gen DREB5...........................................................................................21
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.............................................27
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.............................................................................27
2.2. HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ............................................................................ 28
2.2.1. Hóa chất...........................................................................................................28
2.2.2 Thiết bị................................................................................................... 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 30
2.3.1. Phương pháp sinh học phân tử........................................................................ 30
2.3.2. Phương pháp phân tích trình tự gen.................................................................36

3

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................37
3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN GEN DREB5 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG XLS VÀ LBG...................................................................................37
3.1.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tương.........................................................37
3.1.2. Kết quả nhân bản gen GmDREB5 bằng phản ứng PCR........................ 38
3.2. TÁCH DỊNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB5................40
3.3. SO SÁNH TRÌNH GEN GmDREB5 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG XLS VÀ LBG VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CÔNG BỐ....................43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................53

4


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
2,4 D

2,4- Diclorophenoxyacetic acid

ABA

Abscisis acid

bp

Cặp base

BAP

6- Bezyl amino purin

đtg

Cộng sự

DNA

Deoxiribonucleic acid

DREB

Dehydration- Responsive Element Binding

EDTA

Ethyen Diamin Tetraacetic Acid

HSP

Heat shock protein

kb

Kilo base

LEA

Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tích luỹ với số
lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)

LTP

Lipid Tranfer protein (Protein vận chuyển lipid)

LBG

Lơ Bắc Giang

MGPT

Môi giới phân tử

MS

Murashige- Skoog

NAA

Naphtyacetic acid

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

P5CS

Pyrroline- 5- Carboxylate Synthetase

TAE

Tris acetat EDTA

TBE

Tris borat EDTA

XLS

Xuân Lạng Sơn


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2005- 2011

9

Bảng 2.1

Nguồn gốc của các giống đậu tương nghiên cứu.

27

Bảng 2.2

Danh mục các thiết bị đã sử dụng

29

Bảng 2.3

Trình tự cặp mồi nhân gen DREB5

31

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng PCR

32

Bảng 2.5

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

32

Bảng 2.6

Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT

34

Bảng 3.1

Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bước sóng

38

260nm và 280nm của giống đậu tương XLS và LBG
Bảng 3.2

Hệ số tương đồng và hệ số sai khác của trình tự gen

46

GmDREB5 của 2 giống đậu tương LBG và XLS với trình
tự gen GmDREB5 của 6 giống đậu tương công bố trên
ngân hàng gen quốc tế
Bảng 3.3

Hệ số tương đồng và hệ số sai khác của trình tự amino
acid của Protein DREB5 của 2 giống đậu tương LBG và
XLS với trình tự amino acid của Protein DREB5 của 6
giống đậu tương công bố trên ngân hàng gen quốc tế

52


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Sản xuất đậu tương của Việt Nam

10

Hình 1.2

Sơ đồ mơ tả gen và vùng mã hóa của gen

22

GmDREB5 ở đậu tương
Hình 1.3

Sơ đồ mơ tả protein GmDREB5 ở đậu tương

22

Hình 1.4

Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein

23

DREB5 ở đậu tương

Hình 1.5

Mơ hình cấu trúc của miền AP2 của protein DREB5

23

Hình 1.6

Điểm liên kết với DNA của protein DREB5 (DNA

24

binding site)
Hình 1.7

Sơ đồ các điểm DNA- Binding của protein DREB5 ở

24

đậu tương
Hình 1.8

Sự đa dạng và mối quan hệ của vùng AP2 của protein

25

DREB5 ở đậu tương
Hình 2.1

Hình ảnh các giống đậu tương nghiên cứu

27

Hình 2.2

Sơ đồ vector pBT

34

Hình 3.1

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống XLS và

38

LBG
Hình 3.2

Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB5

39

Hình 3.3

Đĩa ni cấy dịng tế bào khả biến E.coli chủng

40

DH5α chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB5
Hình 3.4

Plasmid mang gen GmDREB5

41

Hình 3.5

So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân

42

lập từ hai giống đậu tương LBG và XLS

vii


Hình 3.6

So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân

45

lập từ hai giống đậu tương LBG và XLS với sáu trình
tự nucleotide của gen GmDREB5 đã cơng bố trên
Ngân hàng gen quốc tế
Hình 3.7

Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng gen

47

GmDREB5 của 8 giống đậu tương
Hình 3.8

So sánh trình tự amino acid mã hố bởi gen DREB5

49

phân lập từ 2 giống đậu tương LBG và XLS
Hình 3.9

So sánh trình tự amino acid mã hố bởi gen

50

GmDREB5 phân lập từ 2 giống đậu tương LBG và
XLS với trình tự amino acid mã hoá bởi gen
GmDREB5 của 6 giống đậu tương đã cơng bố trên
ngân hàng gen quốc tế
Hình 3.10

Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng Protein
DREB5 của 8 giống đậu tương

viii

52


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây cơng nghiệp ngắn ngày có vị
trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, là loại cây trồng chiến lược
của nhiều quốc gia trên thế giới bởi có tác dụng nhiều mặt và có hiệu quả kinh
tế cao, có thời gian sinh trưởng ngắn lại dễ trồng. Sản phẩm từ cây đậu tương
được sử dụng cho người và gia súc do đáp ứng được nhu cầu đạm trong khẩu
phần ăn hằng ngày của người cũng như gia súc [1], [3].
Hạt đậu tương được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia
súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là mặt hàng xuất khẩu. Trong hạt đậu
tương có hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa 35%- 52% protein, 18%- 25% lipit,
20% glucid và nhiều loại axit amin cần thiết như: leucin, isoleucin, lysin,
metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngồi ra, trong hạt đậu tương cịn
chứa nhiều vitamin (B1, B2, A, D, E, K…) là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao rất cần thiết cho cơ thể người và động vật. Đặc biệt, protein của đậu tương
được coi là một nguồn cung cấp protein hồn chỉnh vì chứa một lượng đáng
kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hố và khơng
có các thành phần tạo cholesterol. Lipit của đậu tương chứa tỉ lệ lớn các axit
béo chưa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137). Sử dụng
protein và lipit của hạt đậu tương cịn có tác dụng chữa một số bệnh như: đái
tháo đường, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não… [3].
Ngoài ra, ở rễ cây đậu tương có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng
sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Vì vậy, đậu tương là loại cây
trồng có tác dụng cải tạo đất, làm cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp

9


phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống ô nhiễm mơi trường do lạm dụng phân
bón và thuốc trừ sâu [3].
Với những giá trị to lớn đó, cây đậu tương được trồng phổ biến ở nhiều

o

o

nơi từ 55 vĩ Bắc đến 55 vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nước biển đến vùng
cao trên 2000m so với mực nước biển với diện tích đạt khoảng hơn 74,7 triệu
ha. Ở Việt Nam hiện nay, cây đậu tương chiếm một vị trí rất quan trọng trong
nền nông nghiệp, được gieo trồng ở cả 7 vùng nơng nghiệp trên cả nước với
mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu và
cải tạo đất. Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng cây đậu tương cịn khá phân
tán, năng suất và chất lượng chưa ổn định. Một trong những nguyên nhân làm
ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hạt là do sự biến đổi khí hậu tồn cầu
theo hướng sa mạc hố, gây hạn hán kéo dài. Vì vậy vấn đề đặt ra là phải
nghiên cứu và tuyển chọn những giống có khả năng chống chịu với điều kiện
bất lợi của mơi trường.
Khơ hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất đậu tương. Hiện nay, người
ta đang tập trung vào đối tượng khô hạn và mặn, hai dạng gây stress phi sinh
học quan trọng đến sản xuất đậu tương và đặt ra mục tiêu nghiên cứu hướng
tới cải tiến giống đậu tương trên tồn cầu. Khơ hạn có thể làm giảm 70% năng
suất cây trồng nói chung [12].
Có 2 nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của cây trồng nói chung và
cây đậu tương nói riêng, đó là nhóm gen mà sản phẩm của chúng tác động
trực tiếp tới quá trình chịu hạn (LEA, HSP, P5CS...) và nhóm gen mà sản
phẩm của chúng kích hoạt q trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn. Trong
đó, các protein DREB là nhân tố tham gia vào quá trình phiên mã của nhóm
gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương. Protein DREB là nhân tố
kích thích các gen chức năng hoạt động và không phụ thuộc vào ABA. Tuy


DREB khơng trực tiếp tham gia vào q trình kháng hạn nhưng nó giữ vai trị

là nhân tố kích hoạt đồng thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả
năng chịu hạn. Do vậy, việc nghiên cứu gen DREB là cơ sở để cải thiện đặc
tính chịu hạn của cây đậu tương thông qua kỹ thuật chuyển gen là cần thiết.
Xuất phát từ lý do trên tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm cấu
trúc gen DREB5 phân lập từ hai giống đậu tương địa phương Xuân Lạng
Sơn và Lơ Bắc Giang”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được sự khác biệt về trình tự gen DREB5 của hai giống đậu
tương địa phương Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang và sự đa dạng về cấu trúc
gen DREB5 ở cây đậu tương trên cơ sở phân tích các trình tự đã cơng bố.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khuếch đại gen DREB5 của hai giống đậu tương Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc
Giang bằng kỹ thuật PCR;
- Tách dịng và xác định trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tương Xuân
Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang;
- So sánh trình tự gen DREB5 của hai giống giống đậu tương Xuân Lạng Sơn
và Lơ Bắc Giang;
- So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid của protein DREB5 của
các giống đậu tương nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen quốc tế.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG
Cây đậu tương được thuần hóa ở Trung Quốc và được đưa đến Triều
Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa. Ở
Việt Nam cây đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu
vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đơng Nam Bộ.
Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill có bộ nhiễm

sắc thể 2n = 40, là loại cây trồng thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ phụ Cánh
Bướm (Papilionoideae) và bộ Phaseoleae. Cũng như một số cây họ đậu khác,
đậu tương có khả năng cải tạo đất thơng qua việc cố định đạm khí trời trên
các nốt sần ở rễ góp phần làm giảm nguy cơ thối hố đất do sử dụng phân
bón q nhiều.
1.1.1. Đặc điểm sinh học cây đậu tương
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, gồm các bộ phận chính: rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt.
Đậu tương là cây hai lá mầm có rễ cọc, gồm rễ cái và rễ bên. Khi hạt
nảy mầm, phôi phát triển thành rễ cái. Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm,
ăn lan khoảng 20– 40 cm. Trên rễ có nhiều nốt sần, những nốt sần này được
ví như nhà máy sản xuất đạm. Trên nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium
japonicum có khả năng cố định đạm của khơng khí tạo thành đạm dễ tiêu. Nốt
sần có phẩm chất tốt thì to, có màu hồng. Số lượng và trọng lượng nốt sần có
liên quan trực tiếp đến sinh trưởng và năng suất cây đậu tương.
Cây đậu tương là cây thân thảo, ít phân cành, dạng bụi. Thân hình trịn,
nhiều lơng, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi bị hay nửa bị, thân


thường có màu xanh, có từ 14 – 15 lóng, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,2 m,
thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón…
Cành đậu tương mọc ra từ các đốt trên thân. Đốt đầu tiên của thân chính
mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên
mỗi đốt mang một lá kép.
Lá đậu tương có hình dạng khác nhau: trịn, hẹp, bầu dục, lưỡi mác
hoặc hình thoi…nhưng thường quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp. Gồm có
các dạng lá theo từng thời kì sinh trưởng, phát triển của cây: lá mầm, lá đơn
và lá kép có 3 lá chét, đơi khi có 4-5 lá chét.
Thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào
giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ.

Hoa đậu tương thuộc hoa cánh bướm, mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ
7 – 8 hoa, có màu trắng hoặc tím, mọc ở ngọn hay nách lá.
Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, đa số ngồi vỏ có lơng bao phủ, khi
chín có màu vàng hoặc xám đen. Mỗi quả có 1 - 4 hạt, nhưng thường có 2 hạt.
Hạt đậu tương có hình dạng trịn hay bầu dục, trịn dài, trịn dẹt, vỏ
hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu đen…nhưng đa số
là hạt màu vàng. Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt.
Cây đậu tương có 2 đặc tính sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và sinh
trưởng vô hạn; căn cứ vào thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75- 85
ngày), trung bình (80- 100 ngày), chín muộn (110- 120 ngày).
Đậu tương là cây trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh.
Trong tập đồn giống đậu tương, có những giống chỉ trồng vào vụ hè, ngược
lại có những giống chỉ trồng vào vụ đông [3], [5].


1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương
Đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm
của nó làm thức ăn cho con người, gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là
hàng xuất khẩu, cải tạo đất tốt.
Giá trị về mặt thực phẩm
Mặc dù thành phần hóa sinh của hạt phụ thuộc vào giống cây, điều kiện
canh tác, khí hậu, dịch bệnh…Nhưng so với các lồi thực vật khác thì hạt đậu
tương có hàm lượng protein cao nhất, hàm lượng protein trung bình khoảng
35% - 40%. Trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ chứa 6,2- 12%,
ngơ 9,8- 13,2%, thịt bị 21%, thịt gà 20%, cá 17- 20% và 13- 14,8%. Trong
hạt đậu tương, protein dự trữ (chủ yếu là albumin và globulin) chiếm 70%
protein tổng số, Hàm lượng lipit từ 18%- 25%, glucid 20%. Ngoài ra là các
enzyme; các chất ức chế protease và lectin; muối khống; các vitamin nhóm
B; các amino acid cơ bản như isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,
tryptophan, valin. Đặc biệt, protein của đậu tương được coi là một nguồn

cung cấp protein hồn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không
thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hố và khơng có các thành phần tạo
cholesteron. Do có thành phần dinh dưỡng cao nên đậu tương có khả năng
cung cấp năng lượng khá cao, khoảng 4700 cal/kg.
Hiện nay, từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản
phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm như: đậu phụ,
tương, xì dầu, sữa, bánh kẹo... Ngồi ra, lipit của đậu tương chứa tỉ lệ lớn các
axit béo chưa no, có hệ số đồng hố lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137).


Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như
chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, dầu
bôi trơn trong ngành hàng không nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép
dầu. Hiện nay, trên thế giới có 8 loại cây lấy dầu quan trọng đó là: đậu tương,
bơng, lạc, hướng dương, cải dầu, dừa và cọ. Trong đó, đậu tương là cây đứng
đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu. Dầu đậu tương chiếm 50% tổng
lượng dầu thực vật. Từ dầu đậu tương người ta chế biến ra hàng trăm sản
phẩm công nghiệp khác như làm nến, xà phịng, ni lơng...Về xuất khẩu, đậu
tương là mặt hàng nơng sản có giá trị ổn định trên thị trường thế giới. Trung
bình một năm, lượng hạt đậu tương xuất khẩu ước tính khoảng 24- 26 triệu
tấn và khoảng 2- 4 triệu tấn dầu.
Giá trị về mặt nông nghiệp
Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc. 1kg hạt đậu tương tương
đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn ni. Tồn cây đậu tương có hàm lượng
đạm khá cao nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể sử dụng làm thức
ăn cho gia súc. Đậu tương còn là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1ha trồng đậu
tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 – 60kg Nitơ. Trong
hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ
có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây

trồng mà giảm chi phí cho việc bón đạm. Thân và lá đậu tương dùng bón
ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng Nitơ trong thân chiếm 0,05%,
trong lá chiếm 0,19%.
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Với những giá trị kinh tế và và giá trị sử dụng, cây đậu tương được xem
là một loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia, với vị trí thứ tư, sau lúa,
ngơ và lúa mỳ.


Đậu tương có khả năng thích ứng khá rộng nên được trồng khắp các
châu lục, đặc biệt là châu Mỹ (75,68%) và châu Á (21,27%).
Trong những năm gần đây, do kết quả của việc ứng dụng những tiến bộ
của công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất nên năng suất đậu
tương đã tăng lên đáng kể, đưa đậu tương trở thành cây trồng quan trọng
trong cơ cấu cây trồng của nhiều quốc gia.
Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế
giới. Trong đó, 4 nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là: Mỹ, Brazil,
Argentina và Trung Quốc. Đậu tương là nguồn cung cấp dầu và protein quan
trọng.
Ở Việt Nam, đậu tương được trồng từ rất lâu, trước cây đậu xanh và
các cây họ đậu khác. Các giống đậu tương ở nước ta bao gồm các giống đậu
tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến và các giống đậu
tương địa phương.
Trước cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tương ở
Việt Nam chỉ khoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha. Hiện nay, diện tích đó đã
được tăng lên đáng kể, cả nước có 7 vùng nơng nghiệp đều trồng được đậu
tương với diện tích gieo trồng (năm 1997) lớn nhất là miền núi phía bắc
(46,6%), tiếp đến là đồng bằng sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%),
miền Đông Nam Bộ (10,2%). đồng bằng sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn
(2,3%), vùng Duyên hải miền Trung (1,6%) [5].

Cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của
nước ta hiện nay, đặc biệt ở những vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát
triển.
Mặc dù quy mơ sản xuất cịn khá nhỏ và nhu cầu tiêu thụ trong nước có
xu hướng giảm, nhưng sản lượng đậu tương nước ta năm 2010 vẫn đạt
297.000 tấn, tăng 39% so với năm 2009. Nguyên nhân chính là do sự mở rộng


đáng kể về diện tích cây trồng (khoảng 35%) và những nỗ lực nhằm cải thiện
năng suất của ngành. Tuy nhiên, sản lượng trên vẫn còn thấp so với mục tiêu
đề ra cho năm 2010 là 325.000 tấn của Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng
thơn do chi phí sản xuất tăng và năng suất đậu tương của nước ta chưa cao.
Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tương được trồng
ở 28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam.
Khoảng 65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất không
cần màu mỡ; và 35% được trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằng
sông Hồng. Đậu tương được trồng ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vào
từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xn, vụ hè và vụ đơng.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2005- 2011
2005

2006

2007

2008

2009

Diện tích canh

tác (nghìn ha)

2010

2011

197,
204,1

185,6

190,1

192,1

146,2

8

215*

1,43

1,39

1,45

1,39

1,46

002

1,63*

Sản lượng
(tấn/ha)
Tổng sản lượng
(nghìn tấn)

296,
292,7

258,1

275,5

267,6

213,6

9

(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, * số liệu ước tính của FSA)

350*


TSL nghìn tấn

Năm

Hình 1.1. Sản xuất đậu tương của Việt Nam
Tuy nhiên, do chưa được đầu tư cao nên năng suất đậu tương cịn
nhiều hạn chế. Xét về diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm nhưng tỉ lệ
diện tích gieo trồng đậu tương cịn thấp, chỉ khoảng 1,5- 1,6%. Năng suất
đậu tương của nước ta rất thấp, chỉ bằng 50- 70% năng suất đậu tương của
toàn thế giới. Sản lượng đậu tương sản xuất ra chưa đủ đáp ứng nhu cầu
trong nước. Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng đáng kể
từ nước ngồi.
Có nhiều ngun nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể là do dịch bệnh,
kỹ thuật canh tác, nhưng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và hạn hán. Vì vậy
một trong những yêu cầu thực tiễn đặt ra là nghiên cứu tạo ra giống đậu tương
có khả năng thích nghi với những điều kiện sinh thái ở những vùng khác nhau.
Trong những năm gần đây, cùng với việc nghiên cứu các công nghệ
sinh học và các loại đậu tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao
với chi phí sản xuất thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên
cứu các giống đậu tương địa phương có năng suất thấp nhưng lại có chất


lượng hạt cao và có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của mơi
trường như: nóng, lạnh, mặn, phèn, hạn....
1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
TƯƠNG
Cây đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Các cây họ đậu nói
chung, cây đậu tương nói riêng do có hàm lượng protein và lipid trong hạt cao
nên nhu cầu về nước nhìn chung cao hơn các loại cây khác. Để tổng hợp 1 kg
chất khô cần 500- 530 kg nước. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nước
của đậu tương cũng khá cao, khoảng 50%, trong khi đó ở ngơ là 30%, ở lúa là
26% [6].

Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương liên quan chặt chẽ đến đặc điểm
hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của q trình trao đổi chất. Tính chịu
hạn của cây đậu tương mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh
khác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như
bản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trưởng và phát triển có
khả năng sử dụng nước tiết kiệm.
Hạn hán và độ mặn cao có ảnh hưởng làm giảm mạnh năng suất cây
trồng trên toàn thế giới (Boyer 1982) trong đó có đậu tương. Để thích ứng
với điều kiện như vậy cơ thể thực vật đã phát triển một loạt các cơ chế đòi hỏi
sự khởi động của nhiều gen liên quan chống lại stress do các điều kiện bất lợi
vô sinh. Một số lượng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu
mặn đã được xác định. Tuy nhiên, vẫn còn một số lượng đáng kể các gen liên
quan đến tính chống chịu của thực vật chưa được xác định (Bzay 1997, Zhu
2002). Vì vậy điều quan trọng là nghiên cứu các chức năng của gen liên quan
đến stress để cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng với hạn hán. Có hai
nhóm gen có liên quan chủ yếu đến tính chịu hạn của cây đậu tương:


(1). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới đặc
tính chịu hạn; (2). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt q trình
phiên mã của nhóm gen chịu hạn.
1.2.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu
tương
Các gen chức năng liên quan đến tính chịu hạn bao gồm: LEA, HSP,
Chaperons, LTP, P5CS….
LEA (Late embryogenesis abundant protein)
LEA là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn
cuối của q trình hình thành phơi, là một trong những nhóm protein liên
quan đến điều kiện mất nước của tế bào. Nhóm gen mã hóa loại protein LEA
đóng vai trị quan trọng trong sự chịu khơ hạn của hạt và liên quan đến khả

năng chống hạn của cây. Khi hiện tượng mất nước xảy ra, gen LEA phiên mã
tổng hợp một số lượng lớn mRNA trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá
trình nảy mầm. Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi acid
abcisic (ABA) và độ mất nước của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào.
Protein LEA được chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếu
nước [10], [12]. Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu, phân lập, xác định chức
năng. Đặc điểm nổi bật của nhóm LEA là: giàu acid amin ưa nước, không
chứa cystein và tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt. Chúng
thay thế vị trí nước trong tế bào và thực hiện các chức năng khác nhau như: cô
lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính và điều chỉnh
áp suất thẩm thấu. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại
phân tử của nó cho thấy nó có vai trị trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự
mất nước [11]. Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộn của
quá trình hình thành phơi.


LEA được chia thành 6 nhóm: nhóm 2- D19, nhóm 2- D11 (cịn gọi là
dehydrin), nhóm 3- D7, nhóm 4- D113, nhóm 5- D29, nhóm 6- D95. Khi điều
kiện mất nước xảy ra, LEA được tổng hợp với số lượng lớn, trong đó
dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hòa tan của hạt. Ngày nay,
người ta đã phân lập được 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm gen
dehydrin ở các cây trồng khác nhau. Gen mã hóa protein dehydrin ở đậu
tương đã được nghiên cứu tại một số phịng thí nghiệm trên thế giới và tới nay
đã có một số trình tự gen dehydrin đậu tương và một số thực vật khác được
công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế.
HSP (Heat Shock Protein) và mơi giới phân tử (Chaperons)
HSP có mặt hầu hết ở các lồi thực vật như: lúa mì, lúa mach, ngơ,
đậu… chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có hầu hết ở các loài thực
vật. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy
do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng nhiệt độ với sự chống chịu nhiệt độ

cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập trung thành các hạt sốc
nhiệt (HSG- Heat Shock Granules). Người ta cho rằng HSG gắn kết trên các
RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình
stress nóng. Sau khi gặp sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc
với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein. HSP xuất hiện trong các
quá trình sinh trưởng bình thường, các giai đoạn biệt hóa mơ và cả trong thời
kỳ sinh trưởng của thực vật. Ngoài ra, chúng được tổng hợp thêm trong điều
kiện cực đoan của môi trường [4].
Dựa trên khối lượng phân tử, HSP có thể chia thành 6 nhóm: HSP110,
HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại
diện của chất môi giới phân tử (MGPT) là HSP70, HSP60 nhưng cũng có
HSP khơng phải là MGPT như HSP8,5 (Ubiquitin). Ubiquitin được xem là


chất bảo vệ tế bào, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân
giải các protein khơng có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây
độc cho tế bào. Ubiquinin đóng vai trị quan trọng trong tự sửa chữa tế bào
bằng cách loại bỏ các protein biến tính khi gặp yếu tố cực đoan.
Các MGPT là chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các điều
kiện sinh trưởng cực thuận và đối lập. MGPT là một nhóm gồm nhiều loại
protein khác nhau. Phần lớn các MGPT có hoạt tính ATP- ase. Chức năng
chính của MGPT là: (1) Giữ ổn định chuỗi polypeptid khi đang tổng hợp và
tạo cấu trúc không gian đúng cho chúng; (2) Tạo lại cấu trúc không gian của
protein sau khi vận chuyển qua màng tế bào; (3) Lắp ráp các chuỗi polypeptid
vào phức để tạo cấu trúc bậc 4; (4) MGPT được tăng cường nhờ quá trình
tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào, nhất là sốc
nhiệt [18].
MGPT có 5 họ chính là: HSP 70 (Dnak), HSP 60 (Chaperonin), HSP
90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ mơi giới phân tử được
nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70. HSP70 đã được phân lập ở

đậu xanh.
Yang và đtg (2008) đã phân lập gen HSP 60 ở đậu tương và đăng ký
trên ngân hàng gen NCBI với mã số EU036414, kích thước là 498 bp [36].
Wang và đtg (2010) đã nghiên cứu phân lập gen HSP 90 và đăng ký
trên ngân hàng gen NCBI với mã số FJ969431, kích thước là 2100 bp [35].
Lei và đtg (2011) đã phân lập gen GmHSP 70, kích thước 1683 bp [23].


P5CS (pyrroline- 5- carboxylase)
P5CS là một trong những enzyme chức năng, cấu trúc của nó bao gồm
hai domain xúc tác của hai enzyme là glutamyl kinase và glutamic
seminaldehyde synthase. P5CS tham gia vào q trình tổng hợp proline.
Proline đóng vai trị quan trọng trong q trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu
trong cơ thể thực vật. P5CS biểu hiện mạnh mẽ làm tăng hàm lượng proline,
qua đó tăng cường áp suất thẩm thấu của tế bào và cây trong điều kiện khơ
hạn. Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã được nghiên cứu và tách dòng ở nhiều
loại cây khác nhau. Nhiều cây trồng đã được chuyển gen P5CS nhằm tăng
cường khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.
Prorcel và đtg (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tương và
đã đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thước là
831 bp [29]. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg (2009) đã phân lập
gen P5CS từ mRNA với kích thước 2148 bp [28].
LTP (Lipid transfer protein)
Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận
chuyển phospholipid qua màng. LTP liên quan đến sinh tổng hợp các biểu
bì, làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, qua đó làm giảm sự mất nước ở
thực vật.
Gen LTP đã được phân lập ở một số cây trồng như đậu xanh,
Arabidopsis [24], [25], [26].
1.2.2. Nhóm gen điều khiển q trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn

Tuy khơng tác động trực tiếp đến tính chịu hạn của thực vật nhưng các
gen điều khiển phiên mã lại có vai trị đáng kể trong việc kích thích sự biểu
hiện các gen chức năng.


Các gen điều khiển sự phiên mã mà sản phẩm của chúng có khả năng
hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám
vào trình tự DNA điều khiển (nhân tố tác động cis) trên vùng khởi động
(promoter) của gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp
khởi đầu quá trình phiên mã của các gen chức năng.
Theo nghiên cứu của một số tác giả đã được công bố trên Ngân hàng
gen quốc tế, có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn như:
DREB, ABRE, NAC, bZIP, ZFHD…[17], [21], [33].
Gen DREB
Stress phi sinh học và sinh học ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất cây trồng. Gần đây, một số yếu tố phiên mã tác động
đến sự biểu hiện của của các gen liên quan đến stress đã được phát hiện. Một
trong những nhóm của yếu tố phiên mã đó là nhóm DREB/CBF liên kết với
các yếu tố tác động cis đáp ứng hạn hán. DREBs thuộc họ ERF của các yếu tố
phiên mã bao gồm hai nhóm con, là DREB1/CBF và DREB2 được gây ra bởi
lạnh và mất nước. Các DREBs tham gia vào con đường tín hiệu stress sinh
học. Từ đó có thể cho phép thực hiện các kỹ thuật tạo cây trồng chuyển gen
bằng cách điều khiển sự biểu hiện của DREBs. Điều này sẽ mở ra một cơ hội
tuyệt vời để phát triển cây trồng có khả năng chống chịu với các điều kiện bất
lợi [37].
Nhóm DREB là một trong những nhân tố phiên mã đã được công bố
trên Ngân hàng gen quốc tế, bao gồm: DREB, AREB, NAC, bZIP, MYB,
ZFHD…
Nhiều cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho
rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào q trình này bằng

cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp


chống lại các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh. Nhân tố phiên mã DREB hoạt
động không cần thông qua sự tác động của ABA.
Các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu và giải
trình tự gen DREB trên loài cúc và hướng dương, lúa mỳ… Khi so sánh trình
tự gen của các lồi cây trồng và cây hoang dại cho thấy rằng có sự sai khác
giữa chúng, từ đó họ đã đề xuất phương án cải thiện khả năng chống chịu
thông qua việc cải tiến ở mức độ phân tử của cơ chế chống chịu điều kiện bất
lợi của mơi trường sống đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt vào
loài chống chịu kém.
Li và đtg (2005) phân lập gen trên đối tượng cây đậu tương đã chia
thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngồi ra
cịn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5, mỗi gen có trình tự, độ
dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp các điều
kiện hạn.
Trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự lõi là
A/GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện ở cây Arabidopsis, nằm trong vùng
điều khiển gen rd29 và sau này được phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển
gen của các gen biểu hiện trong điều kiện hạn và lạnh khác. Các gen điều
khiển quá trình phiên mã thuộc nhóm AP2

(APETALA2)/ethylene-

responsive element- binding factor (ERF) bám vào trình tự DRE và được đặt
tên là DREB1/CBF và DREB2 [19].
Wang và đtg (2006) đã mô tả mối quan hệ giữa yếu tố phiên mã DREB
và DRE/CRT cis- một nhân tố chức năng liên quan đến sự biểu hiện của gen
DREB, nghiên cứu đặc điểm và chức năng của nhóm nhân tố phiên mã

AP2/EREBP ở thực vật [34]. AP2/ERF là một họ lớn bao gồm các yếu tố
phiên mã quan trọng.