Xây dựng quy trình phát hiện escherichia coli 0157h7 trên mẫu ray ăn sống bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KĨ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN
ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRÊN MẪU RAU
ĂN SỐNG BẰNG THỰC KHUẨN THỂ TÁI TỔ HỢP
CHUYÊN NGÀNH: Công Nghệ Sinh Học
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. HOÀNG ANH HOÀNG

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. LƯƠNG THỊ MỸ NGÂN

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 12 tháng 01 năm 2018.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
2. Thư ký: TS. HOÀNG MỸ DUNG

3. Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
4. Phản biện 2: TS. LƯƠNG THỊ MỸ NGÂN
5. Ủy viên: PGS.TS LÊ PHI NGA
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG

MSHV: 7140862

Ngày, tháng, năm sinh: 25-03-1990

Nơi sinh: Đồng Nai

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số : 60420201

TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia coli O157:H7 trên mẫu rau ăn

sống bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp.
I. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
1. Xây dựng quy trình phát hiện Escherichia coli O157:H7 trên 4 mẫu rau: rau xà
lách, rau cải xanh, rau giá, rau ngò.
2. Xác định thời gian phát hiện và độ nhạy của phương pháp.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 10/07/2017
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 3/12/2017
IV.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. HOÀNG ANH HOÀNG

Tp. HCM, ngày 03 tháng 01 năm 2018
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TS. Hoàng Anh Hoàng
TRƯỞNG KHOA….………
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Trong q trình học tập và hồn thành luận văn tại trường Đại học Bách Khoa –
ĐHQG TP. Hồ Chí Minh, Tơi đã được tạo điều kiện và nhận được nhiều sự giúp đỡ, chia
sẽ.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Hoàng Anh
Hoàng người đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện tốt cho tôi thực hiện và hồn thành
luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn Q thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học trường
Đại học Bách Khoa đã giảng dạy nhiệt tình, truyền đạt kiến thức, kỹ năng và tạo điều

kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để tơi có thể thực hiện luận văn thuận lợi.
Tôi xin chân thành cảm ơn quỹ Quốc tế về Khoa học (International Foundation for
Science – IFS), Thụy Điển đã hỗ trợ tài chính cho nghiên cứu này (Mã số đề tài nhận tài
trợ E-5847-1).
Xin cảm ơn các em Thanh Xuân, Thanh Ngoan, Hoàng Yến, Thanh Trúc, Thị Hà
và các bạn, các anh chị lớp cao học Cơng nghệ Sinh học khóa 14 đã ln ở bên cạnh,
quan tâm và giúp đỡ tôi.
Cuối cùng, với tất cả lịng biết ơn của mình, con xin gửi đến ba mẹ lời tri ân sâu
sắc, vì đã ln thương u, động viên, luôn bên cạnh con và là chỗ dựa vững chắc cho
con.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2018
Nguyễn Thị Tuyết Nhung

Trang i


TÓM TẮT
E. coli O157:H7 là chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến, nhiều trường hợp ngộ độc
thực phẩm do sự dụng rau nhiễm E. coli O157:H7 đã được báo cáo. Tại Việt Nam thói
quen ăn sống các loại rau làm tăng nguy cơ nhiễm E. coli O157:H7. Do đó, trong nghiên
cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp phát hiên Escherichia coli O157:H7 trên mẫu
rau ăn sống bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp. PP01ccp là thực khuẩn thể PP01
mang gen mã hóa enzyme Cytochrome C Peroxidase (ccp), enzyme ccp được tạo ra qua
quá trình xâm nhiễm đặc hiệu vào E. coli O157:H7.
Để có thể phát hiện E. coli O157:H7 tại nồng độ thấp, tăng sinh là giai đoạn cần
thiết, nhằm hạn chế sự cạnh tranh phát triển của các vi khuẩn có trên rau với E. coli
O157:H7 trong giai đoạn tăng sinh sự kết hợp 2 kháng sinh vancomicin và novobiocin
với nồng độ novobiocin 5mg/L and vancomycin 10 mg/L đã được lựa chọn để sử dụng
trong quy trình.

Phương pháp sử dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp có thể phát hiện E. coli
O157:H7 ở nồng độ 2 CFU/g trên 4 mẫu rau ăn sống thông dụng là rau xà lách, rau cải
xanh, giá và rau ngò sau thời gian 16,5 giờ. Đây là phương pháp có độ nhạy cao, đồng
thời có thể rút ngắn thời giai phát hiện vi khuẩn gây bệnh so với phương pháp truyền
thống sử dụng môi trường chuẩn SMAC agar hoặc các phương pháp khác dựa vào thực
khuẩn thể.

Trang ii


ABSTRACT
E. coli O157:H7 is a common pathogen. Many cases of food poisoning due to the
use vegetables containing E. coli O157:H7 have been reported. In Vietnam, usage of
fresh vegetables in meals is popular resulting in the risk of E. coli O157: H7 infection.
Therefore,, in this study, we developed a method for the detection of E. coli O157:H7 in
ready-to-eat fresh vegetables by a recombinant phage. Recombinant PP01ccp phage was
constructed from PP01 phage that carries a gene encoding Cytochrome C Peroxidase
(ccp) chromogenic enzyme. PP01ccp produces the chromogenic enzyme through its
specific infection into E. coli O157:H7.
In order to detect E. coli O157:H7 at low concentrations, pre-cultivation step was
needed. In this step, novobiocin and vancomycin, were selected to suppress background
bacteria without effect on E. coli O157:H7 in vegetables. Concentrations of novobiocin 5
mg L-1 and vancomycin 10 mg L-1 were employed.
The method was able to detect E. coli O157:H7 at very low concentration of 2
CFU per gram of each vegetable; i.e. lettuce, mustard greens, seed sprouts, or coriander;
within 16.5 hours. This is a highly sensitive and rapid method compared to conventional
method using the standard SMAC agar medium or orther existing phage-base methods

Trang iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn
này là do tôi thực hiện, không sao chép của bất kỳ người nào khác.
Nguyễn Thị Tuyết Nhung

Trang iv


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i
TÓM TẮT............................................................................................................................ ii
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... x
LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 1
1.1.

Escherichia coli (E. coli) ........................................................................................... 2

1.2.

Hiện trạng nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm. ................ 3

1.3.

Các phương pháp phát hiện Escherichia coli O157:H7 ........................................... 5

1.3.1.

Phát hiện E. coli O157:H7 bằng môi trường đặc hiệu .................................... 5

1.3.2.

Phương pháp PCR: .......................................................................................... 6

1.3.3.

Phương pháp phân tách miễn dịch (IMS) ....................................................... 7

1.3.4.

Phương pháp sử dụng thực khuẩn thể ............................................................. 8

1.4. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp thực khuẩn thể trong phát hiện vi khuẩn gây
bệnh ................................................................................................................................... 9
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................... 14
2.1.

Vật liệu – Thiết bị .................................................................................................... 15

2.2.2.
2.2.

Thiết bị - dụng cụ .......................................................................................... 15

Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 17

2.2.1.

Sơ đồ tổng quát.............................................................................................. 17

2.2.2.

Thuyết minh quy trình ................................................................................... 18

2.2.3.

Thiết kế thí nghiệm ....................................................................................... 19

A.

Tái kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thể PP01ccp ................................................ 19

i.

Tái kiểm tra gen ccp ......................................................................................... 19

ii. Tái kiểm tra hoạt tính enzyme CCP được tổng hợp từ bộ gen thực khuẩn thể
PP01ccp .................................................................................................................... 21
B.

Lựa chọn kháng sinh ......................................................................................... 22

i.

Lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI ...................................................... 22

Trang v


ii.

Lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau ................................................................... 23

C.

Xác định độ nhạy của phương pháp ................................................................. 24

i.

Xác định nồng độ E. coli O157:H7 sau khi tăng sinh ...................................... 24

ii.

Thử nghiệm hoạt tính phage trên mẫu rau. ...................................................... 26

D.

Xác định thời gian thử nghiệm ......................................................................... 28

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN........................................................................... 30
3.1.

Kết quả kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thể PP01ccp ............................................... 31

3.1.1.

Kiểm tra gen ccp ........................................................................................... 31

3.1.2.
Kiểm tra hoạt tính enzyme CCP được tổng hợp từ bộ gen thực khuẩn thể
PP01ccp ....................................................................................................................... 32
3.2.

Kết quả lựa chọn kháng sinh ................................................................................... 33

3.2.1.

Kết quả lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI ....................................... 33

3.2.2.

Kết quả lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau .................................................... 35

3.3.

Kết quả xác định độ nhạy ........................................................................................ 36

3.3.1.

Xác định nồng độ E.coli O157:H7 sau giai đoạn tăng sinh .......................... 36

3.3.2.

Thử nghiệm hoạt tính phage trên mẫu rau.................................................... 37

3.4.

Kết quả xác định thời gian thử nghiệm ................................................................... 42

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ........................................................................ 44
4.1.

Kết luận ................................................................................................................... 45

4.2.

Kiến nghị ................................................................................................................. 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 46
PHỤ LỤC ..............................................................................................................................

Trang vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BHI

:Brain Heart Infusin Broth (Môi trường BHI)

CDC

: Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm sốt và
phịng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ)

DAEC

:Diffusely adherent E. coli

EAEC

:Enteroaggregative E. coli

EHEC

:Enterohaemorrhagic E. coli

EIEC

:Enteroinvasive E. coli

ELISA

:Enzyme Linked Imunosortben Asssay (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch
gắn enzyme)

EPEC

:Enteropathogenic E. coli

ETEC

:Enterotoxigenic E. coli

HC

:Hemorrhagic Colitis (Bệnh viêm đại tràng xuất huyết)

HUS

:Hemolytic Uremic Syndrome (Hội chứng tan huyết urê)

IMS

: Immunomagnetic separation (phân tách miễn dịch)

IPEC

:Intestinal pathogenic E. coli

LB

:Luria Bertani (Môi trường LB)

MAEC

:Meningitidis-associated E. coli

UPEC

:Uropathogenic E. coli

PCR

:Polymerase chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi nhờ
polymerase)

SMAC

:Mac Conkey Sorbitol agar (Môi trường SMAC agar)

Trang vii


DANH MỤC HÌNH
NỘI DUNG

STT
Hình 1.1

Escherichia coli O157:H7 qua kính hiển vi điện tử

TRANG
2

(CDC.gov)
Hình 1.2

E. coli O157:H7 trên mơi trường Mac Conkey Sorbitol agar.

5

Hình 1.3

Nguyên tắc phát hiện E. coli O157:H7 bằng IMS (Bacbara và

7

cộng sự, 2015)
Hình 1.4

Thực khuẩn thể T4 và thực khuẩn thể T4 đang xâm nhiễm E.

8

coli (fineartamerica.com)
Hình 1.5

Chu trình ta và tiềm tan của thực khuẩn thể (Wikipedia).

9

Hình 1.6

Nguyên tắc phát hiện E. coli O157:H7 bằng thực khuẩn thể

11

tái tổ hợp PP01-luxI (Steven và cộng sự, 2008).
Hình 1.7

Nguyên tắc phát hiện E. coli trong nước bằng thực khuẩn thể

12

phage T7 liên kết với hạt tử tính.

Hình 1.8

Ngun tắc phát hiện E. coli O157:H7 bằng thực khuẩn thể

13

tái tổ hợp PP01ccp
Hình 3.1

Gel agarose điện di của các đoạn khuếch đại từ bộ gen

31

PP01ccp hoặc PP01wt.
Hình 3.2

Sơ đồ gen thực khuẩn thể PP01ccp và PP01wt

31

Hình 3.3

Sự thay đổi ABS550 trong quá trình thử nghiệm enzyme với

33

dịch ly giải thu được từ nhiễm PP01ccp hoặc PP01wt.
Hình 3.4

Ảnh hưởng của kháng sinh lên sự phát triển của E. coli

34

O157:H7 trong môi trường.
Hình 3.5

Sự thay đổi ABS550 trong quá trình thử nghiệm enzyme với

39

dịch ly giải thu được sau quá trình xâm nhiễm của PP01ccp
hoặc PP01wt ở mẫu rau xà lách.
Hình 3.6

Sự thay đổi ABS550 trong quá trình thử nghiệm enzyme với
dịch ly giải thu được sau quá trình xâm nhiễm của PP01ccp

Trang viii

39


hoặc PP01wt ở mẫu rau cải xanh.
Hình 3.7

Sự thay đổi ABS550 trong quá trình thử nghiệm enzyme với

40

dịch ly giải thu được sau quá trình xâm nhiễm của PP01ccp

hoặc PP01wt ở mẫu rau giá.
Hình 3.8

Sự thay đổi ABS550 trong quá trình thử nghiệm enzyme với

41

dịch ly giải thu được sau quá trình xâm nhiễm của PP01ccp
hoặc PP01wt ở mẫu rau ngị.
Hình 3.9

Sự thay đổi nồng độ E. coli O157:H7 theo thời gian.

Trang ix

43


DANH MỤC BẢNG
NỘI DUNG

STT

TRANG

Bảng 2.1

Các cặp mồi oligonucleotide sử dụng PCR

20

Bảng 3.1

Phát hiện E. coli O157:H7 tại nồng độ ban đầu là 103 CFU/5

35

gram rau
Bảng 3.2

Nồng độ E. coli O157:H7 sau quá trình tăng sinh với nồng độ

36

ban đầu là 102 CFU/5g rau và 101 CFU/5g rau.

DANH MỤC SƠ ĐỒ
NỘI DUNG

STT

TRANG

Sơ đồ 2.1

Sơ đồ tổng quát phương pháp nghiên cứu

17

Sơ đồ 2.2

Phương pháp tái kiểm tra hoạt tính enzyme CCP được tổng

21

hợp từ bộ gen thực khuẩn thể PP01ccp
Sơ đồ 2.3

Phương pháp lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI

22

Sơ đồ 2.4

Phương pháp lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau

23

Sơ đồ 2.5

Phương pháp xác định nồng độ E. coli O157:H7 sau giai đoạn

24

tăng sinh
Sơ đồ 2.6

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính thực khuẩn thể PP01ccp

26

trên mẫu rau.
Sơ đồ 2.7

Phương pháp xác định thời gian thử nghiệm

Trang x

28


LỜI MỞ ĐẦU
Escherichia coli (E. coli) tồn tại một cách tự nhiên và hầu hết không gây hại trong
đường tiêu hóa, Tuy nhiên, một số chủng E. coli có thể gây bệnh cho người và một số
loài động vật. Điển hình là chủng E. coli 0157: H7 có khả năng sản xuất độc tố Shiga,
chúng là nguyên nhân chính gây hội chứng tan huyết urê với tỉ lệ tử vong 3-5% và tỉ lệ
biến chứng là 25% trường hợp nhiễm.
E. coli O157:H7 có ở động vật nhai lại đặc biệt là bò, cừu, một số động vật khác
như thỏ, heo. Chúng lây truyền sang người chủ yếu qua việc tiêu thụ thực phẫm bị ô
nhiễm như thịt, sữa, chưa nấu chín. Sự nhiễm E. coli O157:H7 cũng liên quan đến việc
tiêu thụ trái cây và rau quả (bao gồm giá, rau bina, rau xà lách, salad…) bị ô nhiễm do
tiếp xúc với phân từ động vật hoang dã hoặc gia súc trong giai đoạn nào đó trong q
trình trồng trọt hoặc xử lý (Hugh Pennington, 2010).
Theo Trung tâm kiểm soát và phịng ngừa bệnh tật (CDC) ước tính rằng E. coli
O157:H7 gây ra 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện, và 60
trường hợp tử vong hàng năm ở Hoa Kỳ. E. coli O157:H7 cũng gây ra nhiều vụ ngộ độc
tại nhiều nơi trên thế giới.
Tại Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm đã xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thể,
rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể khơng đảm bảo vệ
sinh, an tồn chất lượng thực phẩm). Bộ Y tế cho biết năm 2016 cả nước xảy ra 129 vụ

ngộ độc thực phẩm với 4.139 người mắc, và 12 trường hợp tử vong, trong đó, 80% số ca
ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật.
Trước tình hình an tồn vệ sinh thực phẩm trên thế giới và Việt Nam đang diễn ra
hết sức phức tạp, yêu cầu kiếm soát mầm bệnh này ngày càng lớn. Do đó, việc xây dựng
một kỹ thuật có thể phát hiện E. coli O157:H7 nhanh chóng, đơn giản với có độ nhạy cao
đang được tập trung nghiên cứu. Bên cạnh các kỹ thuật truyền thống, kỹ thuật sử dụng
thực khuẩn thể (bacteriophage) đang hứa hẹn là một kỹ thuật tối ưu trong phát hiện vi
khuẩn gây bệnh.


Thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp do TS. Hoàng Anh Hồng và cơng sự xây
dựng năm 2015, có khả năng phát hiện E. coli O157:H7 trên môi trường chuẩn với độ
nhanh và độ nhạy cao. Tuy nhiên, để có ứng dụng thực tế trong các mẫu thực phẩm cần
phải tiến hành nhiều thử nghiệm. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên
cứu đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện E. coli O157:H7 trên mẫu rau ăn sống
bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp.
Mục tiêu của đề tài:
Xây dựng quy trình phát hiện E. coli O157:H7 trên bốn mẫu rau ăn sống là rau xà
lách, rau cải xanh, rau giá và rau ngò bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
 Xây dựng phương pháp giúp phát hiện E. coli O157:H7 với độ nhạy cao trong
thời gian ngắn.
 Đề tài góp phần bảo đảm an tồn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng,
phòng tránh tác nhân gây bệnh.
Nội dung nghiên cứu:
 Kiểm tra hoạt tính của thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp;
 Lựa chọn kháng sinh phù hợp cho giai đoạn tăng sinh E. coli O157:H7 trên các
mẫu rau xà lách, rau cải xanh, rau giá và rau ngò;
 Xác định độ nhạy của phương pháp;
 Xác định độ nhanh của phương pháp.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 1


1.1.

Escherichia coli (E. coli)
E. coli là vi khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3µm x 0,5µm; E. coli

thường có hình que, khơng tạo bào tử, có khả năng di động, có thể phát triển ở nhiệt độ từ
5-40oC, nhiệt độ thích hợp nhất là 37oC. Chúng được mơ tả lần đầu tiên bởi Theodor
Escherich vào năm 1885 (Trần Linh Thước, 2003).

Hình 1.1: Escherichia coli O157:H7 qua kính hiển vi điện tử (sciencedaily.com)
Hầu hết các chủng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường
tiêu hóa, chúng cịn đóng vai trị quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường tiêu hóa.
Tuy nhiên, một số chủng E. coli có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật.
Những chủng E. coli gây bệnh được phân loại dựa trên nhóm huyết thanh, cơ chế gây
bệnh, các triệu chứng lâm sàng, hoặc các yếu tố động lực (James và cộng sự, 2004).
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli được chia thành các kiểu huyết thanh.Với
sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều kiểu huyết thanh khác
nhau. Mỗi kiểu huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu
tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B).
Dựa vào vị trí gây bệnh các E. coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành
2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E. coli) hay
E. coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E. coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngồi
đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E. coli).

Trang 2


Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:
EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột
EIEC (Enteroinvasive E. coli): E. coli xâm nhập ruột
EAEC (Enteroaggregative E. coli): E. coli ngưng tập ruột
DAEC (Diffusely adherent E. coli): E. coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây xuất huyết ruột
Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
MAEC (Meningitidis-associated E. coli): E. coli gây viêm màng não
UPEC (Uropathogenic E. coli): E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu
Trong số đó, Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) gồm hơn 100 serotype có khả
năng sản xuất độc tố Shiga và độc tố giống Shiga (Shiga toxin-producing E. coli) hay cịn
gọi E. coli có khả năng sản xuất độc tố Vero[VTEC]), chúng gây bệnh viêm đại tràng
xuất huyết (Hemorrhagic Colitis_HC) và hội chứng tan huyết urê (Hemolytic Uremic
Syndrome_HUS) ở người. Một số type huyết thanh EHEC thường gây bệnh ở người như
O26:H11, O91:H21, O111:H8, O157:NM, và O157:H7 (Angela và cộng sự, 1996).
Trong đó, E. coli O157:H7 là serotype thường xuyên gây bệnh ở người nhất, việc
nhiễm E. coli O157:H7 có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, và phổ biến nhất là ở trẻ em và
người già. Vì vậy E. coli O157:H7 sẽ được tập trung nghiên cứu trong đề tài này.
1.2.

Hiện trạng nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm.
E. coli O157:H7 có ở động vật nhai lại, đặc biệt là bò, cừu, một số động vật khác

như thỏ, heo. Con người có thể bị nhiễm E. coli O157:H7 do việc sử dụng các thực phẩm,
nước bị bị ô nhiễm hay khi tiếp xúc với động vật, phân, đất bị nhiễm E. coli O157:H7.

E. coli O157:H7 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1982 như là một tác nhân
gây bệnh ở người liên quan đến vụ bùng phát tiêu chảy xuất huyết ở Oregon và
Michigan, Hoa Kỳ (Riley và cộng sự, 1983) và cũng liên quan đến những trường hợp
HUS vào năm 1983 (Karmali và cộng sự, 2005). Kể từ đó, nhiều vụ bùng phát bệnh liên
quan đến EHEC đã được báo cáo ở Hoa Kỳ và E. coli O157:H7 là một trong những mầm
bệnh chính trong thực phẩm. Sự bùng phát bệnh do nhiễm E. coli O157:H7 lớn nhất ở

Trang 3


Mỹ được báo cáo váo tháng 1 năm 1993 với hơn 700 trường hợp nhiễm bệnh và 4 trẻ em
tử vong (Rangel et al., 2005). Tại Anh trong tháng 8 và tháng 9 năm 2009 có 96 ca nhiễm
bệnh. 78 bệnh nhân có các triệu chứng và 17 trường hợp HUS. Sự bùng phát dịch lớn
nhất đã xảy ra ở thành phố Sakai, Nhật Bản vào năm 1996, với 7966 trường hợp nhiễm
khuẫn (2764 đã được xác minh bằng vi sinh học, 106 trường hợp HUS) do sự dụng củ cải
trắng nhiễm E. coli O157:H7 trong các bữa ăn của trường. Các trường hợp nhiễm E. coli
O157:H7 cũng được ghi nhận tại Châu Phi (tại Swaziland và Nam Phi vào năm 1990), 5
ổ dịch đã được ghi nhận tại Walkerton, ON, Canada, năm 2000 (Hugh Pennington, 2010).
Trung tâm kiểm soát và phịng ngừa bệnh tật (CDC) ước tính rằng E. coli
O157:H7 gây ra 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện, và 60
trường hợp tử vong hàng năm ở Hoa Kỳ (Mead và cộng sự, 1999). Số liệu giám sát dịch
bệnh từ CDC cho thấy, nhiễm E. coli O157:H7 đang giảm sau đỉnh điểm vào năm 1999.
Tuy nhiên, các vụ dịch bùng phát và các trường hợp nhiễm bệnh vẫn tiếp tục xảy ra. Chi
phí bệnh tật hàng năm do nhiễm E. coli O157:H7 khỗng 405 triệu đơ la, bao gồm chi phí
do mất năng suất lao động, chăm sóc y tế, và tử vong sớm (Frenzen và cộng sự, 1983).
Tại Việt Nam, từ ngày 8/7/2014 đến ngày 23/7/2014, xảy ra ổ dịch tiêu chảy tại xã
Lê Minh Xn, huyện Bình Chánh, TP. Hồ Chí Minh. Kết quả xét nghiệm 21 mẫu bệnh
phẫm trong đó có 4 mẫu dương tính với E. coli. Ổ dịch tiêu chảy tại ấp 5, xã Vĩnh Lộc A,
huyện Bình Chánh vào tháng 7/2014 ghi nhận 05 trường hợp tiêu chảy, trong đó có 1
trường hợp tử vong. Kết quả phân tích của viện Pasteur TP. HCM cho thấy nguyên nhân

gây bệnh là do nhiễm E. coli.
Theo thống kê của bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có khỗng 250 – 500 vụ ngộ độc
thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 – 200 ca tử vong. Trong đó, nguyên nhân
ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm 34 - 49%. Theo số liệu thống kê đến năm 2012
của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với 247 vụ với 7.239
trường hợp ngộ độc, số nhập viện là 5.584 ca trong đó có 55 ca tử vong. Năm 2008, có
205 vụ ngộ độc với số trường hợp nhập viện là 7.829 và 62 trường hợp tử vong, cao nhất
trong cả giai đoạn. Nhà nước đã chi trả rất nhiều tiền cho việc điều trị, xét nghiệm và điều
tra nguyên nhân.

Trang 4


Chi phí bệnh tật cao địi hỏi những nỗ lực bổ sung để kiểm soát mầm bệnh này.
Phát hiện nhanh và nhạy E. coli O157:H7 là điều cần thiết để giảm thiểu sự bùng phát
của các trường hợp bệnh, và hỗ trợ cho quá trình giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm.
1.3.

Các phương pháp phát hiện Escherichia coli O157:H7

1.3.1.

Phát hiện E. coli O157:H7 bằng môi trường đặc hiệu

Khác với hầu hết các chủng E.coli khác E. coli O157:H7 chỉ sử dụng nguồn dinh
dưỡng là peptone, không lên men sorbitol, do đó, bằng cách sử dụng mơi trường Mac
Conkey Sorbitol agar (SMAC) có thể phát hiện E. coli O157:H7. E. coli O157:H7 sẽ tạo
khuẩn lạc tròn trong suốt khác với các vi khuẩn khác. Phát hiện E. coli O157: H7 bằng
mơi trường SMAC có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 85% và độ chính xác 86% (Sandra và
Samuel, 1986).

Để tăng tính chọn lọc agar SMAC đã được cải thiện với việc bổ sung cefixime và
tellurite (CT-SMAC). Sự kết hợp của các phương pháp cefixime-tellurite sorbitol
MacConkey (CT-SMAC), xét nghiệm miễn dịch enzyme E.coli (EHEC) và PCR đã được
Fey và cộng sự sử dụng để kiểm tra sự có mặt của của Escherichia coli sản xuất độc tố
Shiga trong các mẫu phân tiêu chảy từ Nebraska (Paul và cộng sự, 2000).
Một phiên bản cải tiến của môi trường CT-SMAC medium được sản xuất bằng
cách thêm salicin và 4-methylumbelliferyl-β-d-galactopyranoside vào môi trường CTSMAC; môi trường này được gọi là môi trường CT-SSMAC và được sử dụng để phân
lập Escherichia coli O157:H7 từ củ cải củ cải (Fujisawa và cộng sự, 2000).

E. coli O157:H7

Hình 1.2. E. coli O157:H7 trên môi trường Mac Conkey Sorbitol agar

Trang 5


Ưu và nhược điểm của phương pháp:
Ưu điểm: phân biệt được vi sinh vật sống và vi sinh vật chết, đơn giản, ít tốn kém,
có thể phát hiện E. coli O157:H7 ở nồng độ thấp.
Nhược điểm: phương pháp này tốn nhiều thời gian vì phải mất hơn một ngày để
tiền nuôi cấy .
1.3.2.

Phương pháp PCR

Dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp PCR, áp dụng riêng cho đối tượng
nghiên cứu là E. coli O157:H7. E. coli O157:H7 là vi khuẩn thuộc dòng EHEC với những
gen đặc trưng là stx1, stx2, eaeA, hlyA. Tiến hành PCR để xác định sự hiện diện của E.
coli O157:H7 bằng cách sử dụng bốn cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện sự hiện diện của
gen stx1, stx2, eaeA và hlyA. Một cách tiếp cận phổ biến khác là sử dụng phương pháp

multiplex real-time PCR.
Trong nghiên cứu của Patricia và Rosa năm 2008, multiplex single-tube real-time
PCR đã được dùng để phát hiện đồng thời E. coli O157:H7, Salmonella spp. và
Staphylococcus aureus. Điều kiện phản ứng đã được điều chỉnh cho sự khuếch đại và
phát hiện đồng thời các đoạn cụ thể là gen β-glucuronidase (uidA, E. coli), gen
Thermonulease (nuc, aureus Sta.), và trình tự oriC (oriC, Salmonella spp.)
Trong nghiên cứu của Markus và cộng sự năm 2011, phản ứng real-time PCR với
các gen stx1, stx2, eaeA, ehx A, O-antigen đã được nghiên cứu để phát hiện các chủng
EHEC ở nồng độ 1-10 CFU/25g rau.
Ngoài ra, khung đọc mở (ORF), Z3276, được xác định là một marker di truyền đặc
hiệu cho việc phát hiện E. coli O157:H7. Năm 2012, Baoquang và chen, đã phát triển thử
nghiệm real-time PCR với mồi và mẫu dò ORF Z3276 và xác nhận rằng thử nghiệm này
rất nhạy cảm và đặc hiệu đối với chủng E. coli O157:H7 (n = 298).
Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR
Ưu điểm: Thời gian cho kết quả nhanh, cho phép phát hiện trong 4-16 giờ, tùy
thuộc nồng độ vi khuẩn trong mẫu ban đầu cao hay thấp.
Nhược điểm: Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết,
do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết, đồng thời

Trang 6


phương pháp này bị hạn chế khi kiểm tra các mẫu môi trường do sự hiện diện rộng rãi
của các gen này trong các vi khuẩn không gây bệnh (Oda và cộng sự, 2004).
1.3.3.

Phương pháp phân tách miễn dịch (Immunomagnetic separation_IMS)

IMS cho phép bắt và tập trung nhanh các vi khuẩn mục tiêu từ các mẫu nghi ngờ
nhiễm khuẩn. Các hạt từ tính thường là các hạt cầu 2-3μm chứa Fe2O4 và Fe3O4. Chúng

chỉ có từ tính khi có từ trường và dễ dàng tách rời nhau khi ra khỏi vùng từ trường. Các
hạt từ tính được phủ với các kháng thể hoặc liên hợp kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn
mục tiêu. Bằng cách đặt một từ trường mạnh lên bên ngoài của ống phản ứng, các hạt và
vi khuẩn có thể được cố định trên thành ống. Điều này cho phép loại bỏ có chọn lọc phần
cịn lại của các mẫu bao gồm vi khuẩn không phải là mục tiêu và các hạt hữu cơ khác.
Các hạt sau đó được giải phóng bằng cách thu hồi nam châm. Bước đơn giản này của thủ
tục IMS có thể giúp chúng tôi tách STEC khỏi các mẫu một cách dễ dàng (Jinwoo và
cộng sự, 2005).

Hình 1.3: Nguyên tắc phát hiện E. coli O157:H7 bằng IMS (Bacbara và cộng sự,
2015)
Trong nghiên cứu của Bacbara và cộng sự năm 2015, IMS đã được phát triển để
phát hiện E.coli O157:H7, họ sử dụng các hạt nano từ hoạt động điện tử (EAMNPs) và
được cải tiến bằng cách bổ sung natri clorua trong suốt quá trình liên hợp các kháng thể
vào MNPs. Độ nhạy của phương pháp IMS là lớn nhất khi có nồng độ kháng thể cao (1,0
mg/mL) trong suốt quá trình liên hợp. Nồng độ EAMNP 1,0 và 0,5 mg/mL sẽ cho độ
nhạy phân tích và độ đặc hiệu phân tích tối ưu.

Trang 7


Sự kết hợp IMS với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, được gọi là phương
pháp miễn dịch từ huỳnh quang (IMFA), có thể phát hiện E. coli O157:H7. Đầu tiên, Tế
bào E. coli O157:H7 được bắt giữ bởi hạt từ tính mang kháng thể kháng O157, sau đó
được nhận diện bởi một kháng thể phát huỳnh quang, tạo thành một phức hợp miễn dịchimmunosandwich (Peixuan và cộng sự, 2011).
Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp IMS
Ưu diểm: phương pháp này cho kết quả nhanh, đơn giản
Nhược điểm: vật liệu và thiết bị phát hiện đắt tiền.
1.3.4.

Phương pháp sử dụng thực khuẩn thể

Hình 1.4. Thực khuẩn thể T4 và thực khuẩn thể T4 đang xâm nhiễm E. coli
(fineartamerica.com)
Thực khuẩn thể là cơng cụ lý tưởng có thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn.
Những phage này phát triển đồng thời với vi khuẩn chủ và chúng có thể nhận diệnthị bò
và xâm nhiễm đặc hiệu với các vi khuẩn chủ. Chu kỳ xâm nhiễm hoàn toàn của một thực
khuẩn thể độc thường chỉ mất 1-2 giờ, ngoài ra, thực khuẩn thể dễ dàng nuôi cấy và sản
xuất đơn giản, khả năng phát triển mạnh (ví dụ, chúng có độ nhạy thấp với sự thay đổi
của nhiệt độ và pH, dung mơi hữu cơ, và proteases) và có thể phân biệt giữa tế bào sống
và tế bào chết (do thực khuẩn thể chỉ nhân lên trong tế bào sống) (Schmelcher và
Loessner, 2014).

Trang 8


Hình 1.5. Chu trình ta và tiềm tan của thực khuẩn thể (Wikipedia)
Ưu điểm của phương pháp sử dụng thực khuẩn thể
Ưu diểm: phương pháp này cho kết quả nhanh, chinh xác đến cấp độ chủng, phân
biệt được tế bào sống và tế bào chết.
1.4.

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp thực khuẩn thể trong phát hiện vi khuẩn

gây bệnh
Bằng kỹ thuật IMS–bacteriophage, Favrin và cộng sử (2003) đã phát hiện E. coli
O157:H7 trong mẫu thịt bò ở nồng độ 2 CFU/g thịt bị trong khỗng thời gian bao gồm
thời gian tăng sinh là 20 giờ. Trong phương pháp này, các hạt từ sẽ được liên kết vơi
kháng thể anti-E. coli Dynabeads sẽ được bắt giữ E. coli O157:H7, thực khuẩn thể LG1
sau khi bổ sung sẽ tăng sinh trong tế bào chủ. Cuối cùng các tế bào E. coli O157:H7 mới

được bổ sung, được gọi là các tế bào khuếch đại tín hiệu-SACe. Sự thay đổi của mật độ
quang sẽ phản anh nên sự xuất hiện của E. coli O157:H7 trong mẫu thực phẩm.
Năm 2004, Masahito và cộng sự đã tạo thực khuẩn thể PP01 tái tổ hợp mang gen
phát phát huỳnh quang GFP bằng cách đưa gen GFP vùng C và N của SOC để tạo ra các
thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01-GFP/SOC và PP01-SOC/GFP, tương ứng, thực khuẩn thể
tái tổ hợp này giúp phát hiện E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng với độ nhạy cao.
Cũng vào năm 2004, Tanji và cộng sự đã tạo thực khuẩn thể T4 tái tổ hợp mang
gen huỳnh quang GFP (T4e−/GFP) cho phép nhận biết E. coli K12 với các tế bào khác
chỉ trong vòng 1 giờ. Trên vỏ của T4e−/GFP sẽ trình diện protein phát huỳnh quang màu

Trang 9


xanh (GFP). Đồng thời phage tái tổ hợp này sẽ không sản xuất lysozyme chịu trách
nhiệm cho sự ly giải tế bào chủ. Tế bào E. coli K12 bị xâm nhiễm bởi T4e−/GFP sẽ tạo
tín hiệu huỳnh quang khác biệt với các tế bào vi khuẩn không bị xâm nhiễm.
Một thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01-luxI đặc hiệu với E. coli O157:H7 đã được
xây dựng, khi xâm nhiễm vào E. coli O157:H7 sẽ tổng hợp N-(3-oxohexanoyl)-Lhomoserine lactone (OHHL). Phage PP01 này mang gen lux từ Vibrio fischeri được kiểm
soát bởi phage promoter PL. OHHL được tổng hợp bởi E. coli O157:H7 bị xâm nhiễm tạo
ra sự phát quang sinh học ở các tế bào mang operon V. fischeri lux. Phage tạo ra phát
quang sinh học trong các tế bào trong vòng 1 giờ khi tiếp xúc với E. coli O157: H7 nồng
độ 104 CFU/mL và có thể phát hiện được E. coli O157: H7 nồng độ 10 CFU/ml trong
nuôi cấy tinh khiết sau bước tăng sinh (tổng thời gian phát hiện, 4 giờ). Phương pháp này
được áp dụng cho nước ép táo bị ơ nhiễm và có thể phát hiện được 104 CFU/ml E. coli
O157:H7 trong 2 giờ sau khi tăng sinh 6 giờ (Jennifer và cộng sự, 2007).
Steven và cộng sự (2008) đã tạo thành công thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01-luxI
mang gen phát quang sinh học (luxI/ luxR) kết hợp với hệ thống real-time Xenogen IVIS
(hình 1.7 ), họ đã phát hiện E. coli O157:H7 ở nồng độ ban đầu của 1 CFU mL-1 trong
mẫu nước ép táo trong khoảng 16 giờ sau 6 giờ nuôi cấy tăng sinh, phát hiện 1 CFU mL -1
trong mẫu nước máy trong khoảng 6,5 giờ sau 6 giờ nuôi cấy tăng sinh và phát hiện E.

coli O157: H7 trong lá rau bina với nồng độ 1 CFU/mL trong khoảng 4 giờ sau 2 giờ nuôi
cấy tăng sinh. Tuy nhiên, phát hiện E. coli O157:H7 trong thịt bị đã khơng thành cơng,
có thể là do sự xuất hiện tự nhiên của chất tự đông đặc hiệu nhận dạng túc số (N-3(oxohexanoyl)-L-homoserine lactone, OHHL), tạo ra tín hiệu bioreporter dương tính giả
trong các mẫu thịt bò.

Trang 10