Tỷ lệ nhiễm human papilloma virus và mối tương quan với phết tế bào cổ tử cung bất thường

.

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

TỶ LỆ NHIỄM HUMAN PAPILLOMA VIRUS VÀ
MỐI TƯƠNG QUAN VỚI PHẾT TẾ BÀO
CỔ TỬ CUNG BẤT THƯỜNG
Mã số: 27/2016/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Ngọc Lâm
PGS.TS.BS. Nguyễn Văn Thắng

Tp. Hồ Chí Minh, 07/2018

.


.

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

TỶ LỆ NHIỄM HUMAN PAPILLOMA VIRUS VÀ
MỐI TƯƠNG QUAN VỚI PHẾT TẾ BÀO
CỔ TỬ CUNG BẤT THƯỜNG
Mã số: 27/2016/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài

ThS. Nguyễn Ngọc Lâm

PGS.TS.BS. Nguyễn Văn Thắng

Tp. Hồ Chí Minh, 07/2018

.


.

THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Ngọc Lâm
PGS.TS.BS. Nguyễn Văn Thắng

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP

Thực hiện xét nghiệm PCR với sự hỗ trợ và giám sát Trung tâm Y sinh học phân tử.
Kết quả xét nghiệm được phê duyệt bởi Phó giáo sư, Tiến sĩ, Bác sĩ, Hà Thị Anh Trưởng Phịng Xét nghiệm hoặc Phó giáo sư, Tiến sĩ, Bác sĩ, Cao Minh Nga –
Trưởng Trung tâm Y sinh học phân tử.

Khoa Phụ sản - Bệnh viện Đại học Y dược cơ sở 2 thực hiện tư vấn vào ngày tái
khám sau khi có kết quả tế bào học cổ tử cung bất thường và được Bác sỹ điều trị
trực tiếp lấy mẫu.

.


.

i

MỤC LỤC

Trang
TRANG PHỤ BÌA ....................................................................................................... i
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................ix
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................. 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4
1.1 Tổng quan về Human papilloma virus............................................................... 4
1.1.1 Cấu trúc và phân loại................................................................................... 4
1.1.2 Chức năng một số gen đặc biệt ................................................................... 4
1.1.3 Quá trình phát triển ..................................................................................... 5
1.2 Phương pháp phát hiện và xác định kiểu gen HPV ........................................... 7
1.3 Xét nghiệm tế bào học ........................................................................................ 8
1.3.1 Lược sử ........................................................................................................ 8
1.3.2 Chỉ định ....................................................................................................... 9
1.3.3 Hệ thống Bethesda 2014 ............................................................................. 9
1.3.4 Một số nghiên cứu ..................................................................................... 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................12

.


.

v

2.1 Thiết kế nghiên cứu .......................................................................................... 12
2.2 Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 12
2.2.1 Dân số mục tiêu ......................................................................................... 12
2.2.2 Dân số chọn mẫu ....................................................................................... 12
2.3 Cỡ mẫu.............................................................................................................. 12
2.4 Phương pháp chọn mẫu .................................................................................... 13
2.5 Tiêu chuẩn chọn mẫu ....................................................................................... 13
2.5.1 Tiêu chuẩn lựa chọn .................................................................................. 13
2.5.2 Tiêu chuẩn loại trừ .................................................................................... 13
2.6 Thu thập dữ kiện và các chỉ tiêu đánh giá ....................................................... 13
2.6.1 Địa điểm thu thập dữ kiện ......................................................................... 13
2.6.2 Thời gian thu thập dữ kiện ........................................................................ 13
2.6.3 Quy trình và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 13
2.7 Xử lý dữ kiện .................................................................................................... 19
2.8 Các biện pháp khống chế sai số ....................................................................... 19
2.9 Đạo đức trong nghiên cứu:............................................................................... 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 21
3.1 Tỷ lệ các bất thường tế bào học cổ tử cung ..................................................... 21
3.1.1 Tuổi và phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi ............................................. 21
3.1.2 Tỷ lệ các bất thường TBH CTC trong nghiên cứu ................................... 22

.


.

3.1.3 Mối liên quan giữa các bất thường TBH CTC và yếu tố tuổi ..................22
3.2 Tỷ lệ nhiễm HPV và sự phân bố kiểu gen ....................................................... 23
3.2.1 Tỷ lệ nhiễm HPV và tình trạng đơn, đa nhiễm......................................... 23
3.2.2 Tuổi và mối liên quan với tỷ lệ nhiễm HPV ............................................. 24
3.2.3 Mối liên quan giữa tỷ lệ đơn nhiễm, đa nhiễm HPV và yếu tố tuổi ........25
3.2.4 Sự phân bố kiểu gen HPV ......................................................................... 25
3.2.5 Mối liên quan giữa kiểu gen HPV và tình trạng đơn nhiễm, đa nhiễm ...26
3.3 Mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với các bất thường TBH CTC .....27
3.3.1 Mối liên quan giữa các bất thường CTC với tỷ lệ nhiễm HPV ................27
3.3.2 Mối liên quan giữa các bất thường CTC với tình trạng đơn nhiễm, đa
nhiễm HPV ......................................................................................................... 29
3.3.3 Mối liên quan giữa các bất thường CTC với sự phân bố kiểu gen HPV
trong nghiên cứu ................................................................................................. 31
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................... 34
4.1 Tỷ lệ các bất thường tế bào học cổ tử cung ..................................................... 34
4.1.1 Độ tuổi trong nghiên cứu .......................................................................... 34
4.1.2 Tỷ lệ các bất thường TBH CTC trong nghiên cứu ................................... 34
4.1.3 Mối liên quan giữa các bất thường TBH CTC và yếu tố tuổi ..................35
4.2 Tỷ lệ nhiễm HPV và sự phân bố kiểu gen ....................................................... 36
4.2.1 Tỷ lệ nhiễm HPV và tình trạng đơn đa nhiễm.......................................... 36
4.2.2 Mối liên quan giữa tỷ lệ nhiễm HPV và yếu tố tuổi................................. 37

.

.

i

4.2.3 Mối liên quan giữa tỷ lệ đơn nhiễm, đa nhiễm HPV và yếu tố tuổi ........38
4.2.4 Sự phân bố kiểu gen HPV ......................................................................... 39
4.2.5 Mối liên quan giữa kiểu gen HPV và tình trạng đơn nhiễm, đa nhiễm ...42
4.3 Mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với các bất thường TBH CTC .....42
4.3.1 Mối liên quan giữa các bất thường CTC với tỷ lệ nhiễm HPV ................42
4.3.2 Mối liên quan giữa các bất thường CTC với tình trạng đơn nhiễm, đa
nhiễm HPV ......................................................................................................... 44
4.3.3 Mối liên quan giữa các bất thường CTC với sự phân bố kiểu gen HPV
trong nghiên cứu ................................................................................................. 45
Tính ứng dụng của nghiên cứu................................................................................... 48
KẾT LUẬN ................................................................................................................ 49
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................................
PHỤ LỤC .......................................................................................................................

.


.

i

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Phân tích mẫu chứng và mẫu xét nghiệm Multiplex PCR........................16
Bảng 2.2: Phân tích mẫu chứng và mẫu xét nghiệm Realtime PCR ......................... 18
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi ........................................................... 21

Bảng 3.2: Phân bố bệnh nhân theo các bất thường TBH CTC.................................. 22
Bảng 3.3: Phân bố tình trạng đơn, đa nhiễm HPV .................................................... 23
Bảng 3.4: Phân bố kiểu gen HPV theo tình trạng đơn nhiễm, đa nhiễm ..................26
Bảng 3.5: Phân bố các bất thường TBH CTC theo tình trạng nhiễm HPV ..............27
Bảng 3.6: Mối liên quan giữa các loại bất thường TBH CTC với nhiễm HPV ........28
Bảng 3.7: Mối liên quan giữa bất thường TBH CTC và nhiễm HPV có hiệu chỉnh 29
Bảng 3.8: Phân bố các bất thường TBH CTC theo tình trạng đơn và đa nhiễm HPV
..................................................................................................................................... 29
Bảng 3.9: Mối liên quan giữa các loại bất thường TBH CTC với tình trạng đơn và
đa nhiễm HPV ............................................................................................................ 30
Bảng 3.10: Mối liên quan giữa HPV 16 với các loại bất thường TBH CTC .........35
Bảng 4.1: Sự phân bố kiểu gen HPV theo một số tác giả.......................................... 40

.


.

ii

DANH MUC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Phân bố bất thường TBH CTC theo nhóm tuổi .................................... 23
Biểu đồ 3.2: Phân bố tình trạng nhiễm HPV theo nhóm tuổi .................................... 24
Biểu đồ 3.3: Phân bố tình trạng đơn và đa nhiễm HPV theo nhóm tuổi ...................25
Biểu đồ 3.4: Sự phân bố kiểu gen HPV ..................................................................... 26
Biểu đồ 3.5: Phân bố các bất thường TBH CTC theo kiểu gen HPV .......................31
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Q trình phát triển HPV trên mơ học ........................................................ 6
Hình 2.1: Kết quả điện di của xét nghiệm PCR định tính ......................................... 15
Hình 2.2: Kết quả điện di được phát hiện bởi hỗn hợp phản ứng A ......................... 16

Hình 2.3: Kết quả điện di được phát hiện bởi hỗn hợp phản ứng B ......................... 17
Hình 3.1: Kết quả PCR định tính của mẫu dương tính và âm tính với HPV

.


.

x

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASC-US

: Atypical Squamous Cell of Undetermined Significance

BTCTC

: Bất thường cổ tử cung

CIN

: Cervical Intraepithelial Neoplasia

CTC

: Cổ tử cung

DNA

: Deoxyribonucleic acid

HPV

: Human Papilloma Virus (Virút gây u nhú ở người)

HSIL

: High-grade squamous intraepithelial lesions

LSIL

: Low-grade squamous intraepithelial lesions

PCR

: Polymerase Chain Reaction

TBH

: Tế bào học

UT CTC

: Ung thư cổ tử cung

.


.

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: “Kỹ thuật PCR trong xác định kiểu gen Human Papilloma Virus và
mối tương quan với phết cổ tử cung bất thường”
- Mã số: 27/2016/HĐ-NCKH
- Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Ngọc Lâm và PGS.TS.BS. Nguyễn Văn Thắng
Điện thoại: 0937359357

Email:

- Đơn vị quản lý về chuyên môn: Khoa ĐD-KTYH, Bộ môn Xét Nghiệm
- Thời gian thực hiện: 06/2016 – 06/2018
2. Mục tiêu: Xác định tỷ lệ nhiễm HPV và mối liên quan giữa tình trạng nhiễm
HPV với các loại bất thường tế bào học ở cổ tử cung
3. Nội dung chính:
1. Xác định tỷ lệ các loại bất thường tế bào học cổ tử cung theo Bethesda
2014.
2. Xác định tỷ lệ nhiễm và phân bố các kiểu gen HPV ở bệnh nhân có kết
quả bất thường tế bào học ở cổ tử cung bằng kỹ thuật Multiplex PCR.
3. Xác định mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với các bất thường tế
bào học ở cổ tử cung
4. Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...):
1. Tỷ lệ các loại bất thường TBH CTC

.


.

i

- Nhóm ASCUS chiếm tỷ lệ đa số 63,2%, LSIL 26,4% và nhóm HSIL
16,4%.
- Độ tuổi của các đối tượng nằm trong khoảng 22 – 65 tuổi, trung vị là 43 và
nhóm chiếm đa số là 30 – 49 tuổi.
2. Tỷ lệ nhiễm HPV và sự phân bố kiểu gen:
- Tỷ lệ nhiễm HPV trong nghiên cứu là 62,3%. Trong đó, đơn nhiễm chiếm
50 %, đa nhiễm 48,5% và có 1 trường hợp không xác định được kiểu gen.
- Tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất ở nhóm 20 – 29 tuổi và có xu hướng giảm dần ở
nhóm 30 – 39, 40 - 49 tuổi rồi tăng lên ở nhóm ≥50 tuổi.
- Trong các trường hợp dương tính, các kiểu gen chiếm tỷ lệ cao lần lượt là
HPV 52 (22,7%), tiếp đến là HPV 58 (21,2%), HPV 16 (19,7%) và HPV
56 (16,7%).
3. Mối liên quan giữa các bất thường CTC và HPV
- Mức độ bất thường TBH CTC ở các đối tượng càng cao thì tỷ lệ nhiễm
HPV càng tăng.
- Nhiễm HPV 16 làm tăng mức độ bất TBH CTC. Trong khi đó, nhiễm HPV
52, 56, 58 khơng có sự khác biệt về tỷ lệ các bất thường tế bào học
5. Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại:
- Đóng góp vào nền khoa học kỹ thuật nước nhà, tạo tiền đề cho các nghiên
cứu sau này
- Thông qua nghiên cứu này biết được tỷ lệ nhiễm HPV, xác định kiểu gen
và mối liên quan với các tổn thương tế bào học. Qua đó đánh giá khả năng
bao phủ của vắc xin thế hệ mới nhất Gardasil® 9 để đưa vào chủng ngừa.

.

.

i

.


.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư cổ tử cung (UT CTC) là loại ung thư phổ biến, đứng thứ ba trong số
các ung thư ở phụ nữ trên thế giới sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng, với
khoảng 528.000 trường hợp mới mắc vào năm 2012. Tỷ lệ tử vong do ung thư cổ
tử cung ở các nước Châu Phi và Đơng Nam Á vẫn cịn rất cao so với các nước
đang phát triển [21]. Mặc dù thực tế thì đây là bệnh kiểm sốt thơng qua các
chương trình tầm soát hiệu quả.
Trong thập niên 70, Vi rút gây u nhú ở người (HPV – Human Papilloma
Virus) được mô tả như là một trong những tác nhân gây biến đổi tế bào cổ tử
cung. Khoảng 80% các trường hợp ung thư có liên quan đến HPV trên thế giới
xảy ra ở các nước đang phát triển. Các tỷ lệ mắc ước tính cao nhất là ở châu Phi,
Mỹ Latin, Trung Nam Á và Đông Nam Á. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã
khẳng định sự liên quan mật thiết giữa HPV và ung thư cổ tử cung. Ngoài ra,
HPV cịn có vai trị trong ung thư vùng hậu mơn, âm hộ, âm đạo và dương vật và
ung thư vùng hầu họng [3],[5],[49].
Việc tầm soát ung thư cổ tử cung hiện nay thường được thực hiện bằng xét
nghiệm phết tế bào cổ tử cung. Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (Pap smear) ra
đời năm 1943 do Papanicolaou khởi xướng. Ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào học
cổ tử cung đã góp phần giảm tình trạng ung thư cổ tử cung một cách ngoạn mục
từ 29.2/100.000 người năm 1998 xuống cịn 16/100.000 người trong năm 2003
tại TP. Hồ Chí Minh [47]. Nhiễm HPV giai đoạn sớm có thể đi kèm với những

thay đổi nhẹ trong biểu mơ và có thể được phát hiện bằng xét nghiệm tế bào học
cổ tử cung với hình ảnh tế bào rỗng (Koilocyte). Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện HPV
thường không cao và đánh giá được nhóm nguy cơ.
HPV gồm hơn 100 kiểu gen và được chia làm 2 nhóm: nhóm nguy cơ cao và
nhóm nguy cơ thấp. Khi nhiễm bệnh, HPV sẽ tác động thông qua gắn kết HPV
DNA vào gen tế bào, phá hủy chu trình sinh lý gây ra các rối loạn về gen. Các

.


.

kiểu gen nguy cơ cao được tìm thấy đến 50-80% các trường hợp tổn thương tiền
ung thư và 80%- 90% các trường hợp ung thư cổ tử cung [1],[2]. Hầu hết nhiễm
HPV ở cổ tử cung khơng có triệu chứng và có thể tự biến mất trong vịng hai năm
[14]. Các trường hợp nhiễm HPV kéo dài có xu hướng phát triển thành các tổn
thương tiền ung thư và tiến triển sang ung thư cổ tử cung nếu không được điều trị
kịp thời. Do đó việc phát hiện sớm tình trạng nhiễm HPV nhất là nhóm nguy cơ
cao có ý nghĩa quan trọng. HPV 16 và HPV18 được phát hiện trong khoảng 70%
các ca UT CTC [12],[25]. Tuy nhiên, sự phân bố các kiểu gen là khác nhau giữa
các vùng địa lý [34]. Ở khu vực châu Á, nhiều nghiên cứu trong những năm gần
đây ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Trung Quốc,... cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV
52 và 58 cao hơn so với các khu vực khác của thế giới [18],[39],[29],[31],[44].
Tuy nhiên, kết quả HPV chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi kỹ thuật và các mặt hạn
chế của phương pháp sinh học phân tử. Do đó, các nghiên cứu ở Việt Nam có sự
khác biệt về tỷ lệ nhiễm HPV và đặc biệt là sự phân bố kiểu gen so với các nước
trong khu vực [6],[7].
Vì vậy, với sự phát triển mạnh mẽ của xét nghiệm sinh học phân tử ở Việt
Nam hiện nay nên nghiên cứu “Kỹ thuật PCR trong xác định kiểu gen Human
Papilloma Virus và mối tương quan với phết cổ tử cung bất thường” được tiến

hành nhằm xác định tỷ lệ nhiễm HPV, sự phân bố các kiểu gen và mối liên quan
với các bất thường TBH CTC.

.


.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
♦ Câu hỏi nghiên cứu
Có hay khơng mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với các loại bất
thường tế bào học ở cổ tử cung?
♦ Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu tổng quát
Xác định tỷ lệ nhiễm HPV và mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với
các loại bất thường tế bào học ở cổ tử cung.
- Mục tiêu cụ thể
1. Xác định tỷ lệ các loại bất thường tế bào học ở cổ tử cung theo Bethesda
2014.
2. Xác định tỷ lệ nhiễm và phân bố các kiểu gen HPV ở bệnh nhân có kết quả
bất thường tế bào học ở cổ tử cung bằng kỹ thuật Multiplex PCR.
3. Xác định mối liên quan giữa tình trạng nhiễm HPV với các bất thường tế bào
học ở cổ tử cung.

.


.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Human papilloma virus
1.1.1 Cấu trúc và phân loại
•

Cấu trúc

Vi rút gây u nhú ở người (HPV – Human Papilloma Virus) là những vi rút nhỏ,
khơng có màng bọc ngồi, DNA sợi đơi dạng vịng và nucleocapsid đối xứng xoắn
ốc, viron có đường kính 52 - 55nm, capsid gồm 72 tiểu đơn vị capsomer.
Bộ gen của HPV chứa khoảng 8.000 cặp base, phân thành 3 vùng:
Vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region): chiếm 10% chiều dài bộ gen, là
vùng biến động nhất trong bộ gen HPV.
Vùng gen sớm: gồm 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7.
Vùng gen muộn: gồm 2 gen, ký hiệu là L1, L2.
•

Phân loại

Nhóm kiểu gen HPV “nguy cơ thấp”: những kiểu gen HPV thuộc nhóm này gây u
nhú hoặc khối u lành tính. DNA của HPV nằm ngồi nhiễm sắc thể ký chủ: HPV 6,
11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89.
Nhóm kiểu gen HPV “nguy cơ cao”: gồm những kiểu gen HPV có khả năng gắn kết
DNA vào gen người, làm rối loạn quá trình sinh lý tế bào: HPV 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82.
Nhóm kiểu gen HPV “chưa xác định nguy cơ”: HPV 2a, 3, 7, 10, 13, 27, 28,
29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, ...[19].
1.1.2 Chức năng một số gen đặc biệt
Một số vùng gen của HPV mã hóa cho các protein quan trọng:
Protein E4: có thể thúc đẩy quá trình sao chép DNA của HPV và điều hòa

.


.

hoạt động ở giai đoạn trễ trong chu trình xâm nhiễm của HPV.
Protein E5 quan trọng trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm, có vai trị ngăn
chặn q trình chết theo chu trình của tế bào có DNA hư hỏng.
Protein E6: có khả năng gắn với protein ức chế khối u p53 - protein
gắn DNA được biểu hiện để đáp ứng lại với sự hư hỏng của DNA dẫn tới
việc ngừng chu trình phân bào hoặc quá trình chết theo chu trình.
Protein E7: cũng là một oncoprotein của HPV có tác động làm tăng bất
thường sự sao chép DNA của HPV. Protein E7 đóng vai trị quan trọng đối
với tiến trình dẫn tới ung thư cổ tử cung và q trình sinh bệnh.
Protein L1và L2: protein L1 có khả năng tự hình thành vỏ capsid cịn protein
L2 liên quan đến sự gắn DNA và ảnh hưởng đến hiệu quả của q trình đóng
gói thành các hạt vi rút (virion). Đây là gen rất quan trọng giúp chẩn đoán
HPV [25],[28],[46],[50].
1.1.3 Quá trình phát triển
Quá trình phát triển của HPV liên quan chặt chẽ với tế bào biểu mô, được
chia làm 4 giai đoạn:
Giai đoạn xâm nhập: đầu tiên HPV xâm nhập vào lớp tế bào đáy ở những vị trí dễ
tổn thương. Ở lớp tế bào này, số lượng vi rút thấp và tồn tại ở dạng episomal tách
rời với gen của tế bào vật chủ.
Giai đoạn tiềm tàng: DNA HPV có thể tồn tại rất lâu với số lượng ít và không sao
chép, không tạo các hạt vi rút. Các gen E1, E2 rất cần thiết cho sự nhân lên của vi
rút ở giai đoạn này.
Giai đoạn nhân bản mạnh: cùng với q trình nhân lên và biệt hóa từ lớp tế bào đáy
lên các tế bào ở lớp trên, các tế bào bị nhiễm HPV mới hình thành cũng di chuyển
theo, các gen muộn HPV được bộc lộ và khởi động giai đoạn tăng sinh của vi rút,

.


.

DNA HPV được nhân lên. Chu kỳ nhân lên của vi rút không kèm theo hiện tượng
chết hoặc phân hủy tế bào do vậy không gây hiện tượng viêm và sản xuất các
cytokine tiền viêm. Các gen E5, E6, E7 tác động hỗ trợ cho hoạt động nhân lên của
vi rút đồng thời tăng hoạt động tổng hợp DNA của tế bào chủ và ngăn quá trình chết
theo chu trình.
Giai đoạn giải phóng: Ở lớp tế bào sừng ngồi cùng, gen L1 và L2 có vai trị hình
thành vỏ capsid cho DNA của vi rút. Các hạt vi rút mới được hình thành giải phóng
ra bề mặt tế bào sừng.

Hình 1.1: Q trình phát triển HPV trên mơ học [20]
Có nhiều cơ chế giải thích sự “lẩn trốn” của HPV khỏi đáp ứng miễn dịch
của cơ thể, gây nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến sự biến đổi tế bào. E6 và E7
của HPV nhóm “nguy cơ cao” làm cơ thể suy giảm khả năng sản xuất
interferon, cytokine, ức chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tiêu diệt vi rút và
điều hịa miễn dịch. Gen E6 có khả năng gắn vào yếu tố 3 điều hòa interferon
(IRF-3) gây ức chế chức năng hoạt hóa của yếu tố này. Đồng thời, gen E7
phản ứng với IRF-1 gây ức chế sự sao chép đối với yếu tố thúc đẩy IFN-1.

.


.

Mặc dù, HPV có khả năng tránh khỏi cơ chế đáp ứng bảo vệ của cơ thể

nhưng hầu hết các trường hợp nhiễm HPV diễn ra ngắn và tổn thương có thể
tự hết trong vịng 1 năm hoặc dưới tác động của đáp ứng của hệ miễn dịch cơ
thể. Khoảng 91% HPV bị biến mất trong năm đầu sau nhiễm và 70% trong
năm thứ hai. Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ HPV có thể tồn tại dai dẳng ở lớp tế
bào đáy và là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi tế bào dẫn đến ung thư
[28],[25],[46].
1.2 Phương pháp phát hiện và xác định kiểu gen HPV
Phương pháp sinh học phân tử phát hiện sự hiện diện của HPV
- Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Phương pháp PCR Các
mồi sử dụng trong phản ứng PCR thường để khuếch đại vùng gen L1 dùng
phát hiện sự hiện diện của HPV.
- Real-time PCR: Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuyếch đại
DNA đích hiển thị ngay mỗi chu kì nhiệt của phản ứng. Trái ngược với
PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời
điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại. Real-Time PCR cho phép phát
hiện tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm tại mỗi chu kỳ của phản ứng.
Phân tích kết quả phản ứng PCR mà không cần bước điện di trên gel mà
thông qua tín hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản
ứng PCR bằng máy tính.
Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen HPV:
- Phương pháp Reverse line blot: dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng mồi
PGMY09/11 khuếch đại vùng gen L1 HPV. Sản phẩm PCR được lai với
các mẫu dò đặc hiệu đa kiểu gen HPV gắn trên màng. Phức hợp gắn được
phát hiện bằng mắt thường.
- Phương pháp PCR đặc hiệu theo kiểu gen: là phương pháp PCR phát hiện

.


.

các kiểu gen HPV dựa vào sự khác biệt ở vùng gen E6 và E7. Phát hiện đa
nhiễm các kiểu gen HPV trong cùng một mẫu cũng phải được thực hiện
riêng biệt cho từng kiểu gen.
- Phương pháp giải trình tự gen: hiện nay phương pháp giải trình tự gen chưa
được sử dụng rộng rãi vì giá thành cao..
- Phương pháp Multiplex PCR:
Multiplex – PCR: là phản ứng PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại
nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR.
Nguyên tắc: là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu. Mỗi
bộ gồm 24 mẫu dò tương ứng 24 kiểu gen HPV. Sau khi sản phẩm PCR được lai
với các mẫu dò sẽ được gắn R- phycoerythrin đã đánh dấu streptavidin và được
đọc trên máy phân tích..
Bộ thử nghiệm (Kit) nhân bản vùng gen đặc trưng của từng kiểu gen HPV, phát
hiện đồng thời 15 kiểu gen (6,11,16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 và
66). Các cặp mồi này được thiết kế để nhân bản đặc hiệu các trình tự mục tiêu trong
vùng gen L1, L2, L6, E1, E2/E4 hoặc E6 của bộ gen HPV có kích thước khác nhau
tùy theo kiểu gen HPV.
1.3 Xét nghiệm tế bào học
1.3.1 Lược sử
Năm 1928, George Nicolas Papanicolaou- một bác sĩ người Hi Lạp giới thiệu
những phát hiện mới của mình về một phương pháp chẩn đốn ung thư mới
với tựa đề bài báo là "New Cancer Diagnosis" (Phương pháp chẩn đoán ung
thư mới). Cho đến nay, phương pháp làm xét nghiệm này đã có nhiều cải tiến
để tăng tính chính xác và hiệu quả, và hiện được dùng rất rộng rãi để tầm
soát ung thư cổ tử cung.

.

.

Tại Việt Nam, từ khi được đưa vào sử dụng, xét nghiệm tế bào học cổ tử
cung đã góp phần quan trọng trong việc giảm tỷ lệ ung thư cổ tử cung.
1.3.2 Chỉ định
Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung được chỉ định cho những bệnh nhân sau:
- Kiểm tra định kỳ cho tất cả các phụ nữ đã có quan hệ tình dục..
- Khi khám phụ khoa phát hiện thấy những tổn thương ở cổ tử cung.
- Khi có nghi ngờ ung thư cổ tử cung như: xuất huyết bất thường...
1.3.3 Hệ thống Bethesda 2014
Bảng phân loại Bethesda 2014 là hệ thống do Viện Ung thư Quốc gia Hoa
Kỳ đề nghị và được nhiều nước áp dụng.
Phân loại theo hệ thống này thì trước tiên cần phải xác định:
Mẫu có đạt tiêu chuẩn khơng. Mẫu đạt tiêu chuẩn thì phải có cả tế bào cổ ngồi và
tế bào cổ trong tử cung. Bởi vì vùng cần xem xét nhất là vùng chuyển tiếp giữa 2
loại tế bào này và khi thấy được tế bào cổ trong hoặc tế bào dạng chuyển tiếp thì
chứng tỏ đã lấy được tế bào ở vùng chuyển tiếp.
Những tổn thương kèm theo như tổn thương viêm nhiễm.
Những tiền sử tổn thương ác tính.
Bảng phân loại Bethesda 2014 [36]:
- Tế bào biểu mơ bình thường
- Tế bào biểu mơ biến đổi lành tính: viêm nhiễm: có thể do các tác nhân
Chlamydia, Trichomonas, Actinomyces, Candida, Herpes Simplex Virus;
biến đổi tế bào do phản ứng: viêm teo (do giảm lượng estrogen trong cơ
thể ở phụ nữ mãn kinh), tia xạ, đặt vòng tránh thai
- Những thay đổi bất thường của tế bào biểu mô:

.

.

0

Tế bào biểu mơ gai:
•

Tế bào gai khơng điển hình (ASC): dùng để chỉ những thay đổi nhỏ về
hình thái ở tế bào gai nhưng không đủ số lượng hoặc khơng đủ điển hình để
xếp vào loại tổn thương nào, gồm 2 nhóm:

Tế bào biểu mơ gai khơng điển hình có ý nghĩa khơng xác định (ASC-US).
Tế bào biểu mơ gai khơng điển hình chưa loại trừ được đó là tổn thương trong biểu
mơ gai mức grade cao (ASC- H).
•

Tổn thương trong biểu mô gai độ thấp (LSIL): dùng để chỉ những tổn
thương trong biểu mô gai được gọi là loạn sản nhẹ hay tân sinh trong biểu
mô độ 1 (CIN I).

•

Tổn thương trong biểu mơ gai độ cao (HSIL): dùng để những tổn thương
có khả năng tiến triển thành ung thư: loạn sản trung bình - CIN II, loạn sản
nặng - CIN III, ung thư tại chỗ và nghi ngờ xâm lấn.

•

Ung thư tế bào biểu mơ gai xâm lấn.

Tế bào biểu mơ tuyến:
•

Tế bào biểu mơ tuyến khơng điển hình (AGC:): dùng để chỉ những thay
đổi về hình thái ở tế bào tuyến

•

Tế bào biểu mơ tuyến khơng điển hình hướng đến U: dùng để chỉ những
thay đổi chưa loại trừ được đó là tổn thương do bướu.

•

Tế bào nội mạc tử cung: tìm thấy trên phết tế bào có thể do phụ nữ trong
lúc đang hành kinh hoặc tăng sinh của nội mạc tử cung.

•

Ung thư tại chỗ tuyến cổ tử cung trong.

•

Ung thư tế bào tuyến xâm lấn.

Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung là công cụ hữu hiệu để sàng lọc và phát hiện bất

.


.

1

thường tế bào, có vai trị quan trọng góp phần làm giảm tỷ lệ ung thư CTC [33],[43]
1.3.4 Một số nghiên cứu
Trên thế giới:
- Nghiên cứu của tác giả Leslie R. Rowe và cộng sự năm 2004 tỷ lệ HPV
(thực hiện bằng kỹ thuật Hybrid Capture II) là 53,6 % trên bệnh nhân có
kết quả ThinPrep Pap bất thường [42].
- Nghiên cứu của tác giả Barbara và cộng sự năm 2009 có kết quả tỷ lệ
nhiễm HPV là 73,3%. Kiểu gen chủ yếu là HPV 16, 31; 52; 51 [11].
- Ở khu vực châu Á, nghiên cứu của tác giả Khunamornpong ở Thái Lan có
tỷ lệ nhiễm HPV là 73,5% và các kiểu gen chiếm tỷ lệ cao lần lượt là HPV
52, 16, 51, 56. Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của tác giả Chansaenroj
cũng ở Thái Lan có kết quả tỷ lệ HPV là với các kiểu gen chủ yếu là HPV
16, 52, 58, 18 [18],[30].
- Nghiên cứu tại Nhật Bản của tác giả Nishiwaki và cộng sự năm 2008 có tỷ
lệ là 74,1%. Kiểu gen chủ yếu là 58, 16, 52, 56 [38].
Ở Việt Nam:
- Nghiên cứu của tác giả Vũ Thị Nhung năm 2007 thực hiện tại Bệnh viện
Hùng Vương báo cáo tỷ lệ nhiễm HPV là 73.6%. Kiểu gen chủ chiếm tỷ lệ
cao là HPV 16, 11, 18, 35. [6]
- Nghiên cứu tác giả Phạm Việt Thanh năm 2011 thực hiện tại Bệnh viện Từ
Dũ trên cùng đối tượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV thấp hơn là 63.1% và
kiểu gen chủ yếu là HPV 16, 18, 6 và 11, 58 [7].
- Kết quả nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và kiểu gen HPV ở Việt Nam so với các
nước trong khu vực có sự khác biệt có thể do kỹ thuật sinh học phân tử.
Do đó, cần có nhiều nghiên cứu về các xét nghiệm để xây dựng hệ thống
xét nghiệm hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi điều trị

.


.

2

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu cắt ngang.
- Thời gian: Từ tháng 06 năm 2016 đến tháng 06 năm 2018.
- Địa điểm: Bệnh viện Đại học Y dược cơ sở 2, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Đối tượng nghiên cứu
2.2.1 Dân số mục tiêu
Bệnh nhân từ 18 tuổi trở lên đến khám tại Phân khoa Phụ sản - Bệnh viện Đại học
Y dược cơ sở 2 có kết quả phết tế bào cổ tử cung bất thường.
2.2.2 Dân số chọn mẫu
Bệnh nhân từ 18 tuổi trở lên đến khám tại Khoa Phụ sản - Bệnh viện Đại học Y
dược cơ sở 2 có kết quả phết tế bào cổ tử cung bất thường trong thời gian nghiên
cứu.
2.3 Cỡ mẫu
Z2 (1-α/2) . p. (1-p)
n=
d2
A

E

E

Trong đó:
-n

: cỡ mẫu

-Z

: hệ số tin cậy Z(1-α/2) : Z 0,95 = 1,96

-p

: tỷ lệ nhiễm HPV trên bệnh nhân có phết tế bào cổ tử cung bất

thường trong nhiều nghiên cứu đã được cơng bố.
-d

: độ chính xác mong muốn

Nhiều nghiên cứu trên thế giới có sự khác biệt về tỷ lệ (55% - 75%). Ở Việt Nam,
nghiên cứu mới nhất là của tác giả Phạm Việt Thanh năm 2011 thực hiện tại Bệnh

.