Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano polyme chứa cao toàn phần nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris)

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

Nguyễn Thị Thanh Thảo

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO POLYME CHỨA CAO
TOÀN PHẦN NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
(Cordyceps militaris)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
--------------------

Nguyễn Thị Thanh Thảo

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO POLYME CHỨA CAO
TOÀN PHẦN NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO

(Cordyceps militaris)
Ngành: Cơng nghệ dược phẩm & bào chế thuốc
Mã số: 8720202

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. TRẦN VĂN THÀNH

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

.


.

iii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hồn tồn
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào.

Tác giả

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

.


.

iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dƣợc học – Năm học 2018-2020
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO POLYME CHỨA CAO TỒN PHẦN NẤM
ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)
Nguyễn Thị Thanh Thảo
Người hướng dẫn khoa học: Pgs. Ts. Trần văn thành
Đặt vấn đề
Nấm đông trùng hạ thảo (ĐTHT) (Cordyceps militaris) là một lồi nấm ký sinh có giá trị dược lý
cao. Hoạt chất có dược tính cao trong ĐTHT được kể đến là cordycepin và adenosin. Trong đó,
cordycepin đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như điều hòa miễn dịch, kháng ung
thư, kháng nấm, kháng virus... và đặc biệt là hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi
ở người. Tuy nhiên, theo nhóm nghiên cứu về nấm ĐTHT của Trường Đại học Thủ Dầu Một, đã có
một vài báo cáo chưa được công bố về sự không ổn định và kém bền của cordycepin. Vì vậy, việc
bào chế tiểu phân nano polyme chứa cao ĐTHT nhằm mục đích tăng độ bền và độ ổn định của
cordycepin là cần thiết. Các nghiên cứu về bào chế tiểu phân nano bằng phương pháp đông tụ phức
đã được thực hiện rất nhiều, nhưng chưa có một nghiên cứu về bào chế tiểu phân nano chứa cao
đông trùng hạ thảo được công bố. Vì lý do đó, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano polyme
chứa cao tồn phần nấm đơng trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)” đã được thực hiện.
Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Cao ĐTHT (Cordyceps militaris) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu
ĐTHT Trường Đại học Thủ Dầu Một
Phương pháp nghiên cứu: Cao toàn phần ĐTHT được kiểm tra, đánh giá chất lượng thông qua các
chỉ tiêu: cảm quan, mất khồi lượng do làm khô, định tính, định lượng, tro tồn phần, chất rắn khơng
tan trong nước; đồng thời được khảo sát tương kỵ với một số tá dược (gelatin, gôm arabic, span 80,
tween 80, dầu parafin). Quy trình định lượng được xây dựng và thẩm định bằng phương pháp
HPLC. Xây dựng công thức và quy trình bào chế vi nhũ tương với dầu parafin và hỗn hợp chất
diện hoạt. C-NPs được bào chế bằng phương pháp đông tụ phức từ vi nhũ tương dựa theo quy trình

của Yinyan Zhu và cs. C-NPs được khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và đánh giá lại bằng các thơng
số: kích thước tiểu phân, hiệu suất nang hố, hình thể học, độ ổn định, tính trơn chảy.
Kết quả
Kết quả đánh giá chất lượng của cao toàn phần ĐTHT: các chỉ số đều đạt chuẩn yêu cầu. Khảo sát
tương kỵ giữa cao ĐTHT và một số tá dược bào chế C-NPs: không tương kỵ; cao ĐTHT không bị
biến đổi thể chất, màu sắc, mùi. Quy trình định lượng cordycepin trong C-NPs được xác định với
bước sóng phát hiện cordycepin là 258 nm. Sau các thí nghiệm đã được thực hiện, công thức bào
chế C-NPs được chọn là: Cao ĐTHT (1,93 g); dung dịch gelatin 10%(16,6 g); dung dịch gôm
arabic 10% (5,5 g); dầu parafin (112 g); span 80 (56 g); tween 80 (48 g).
Kết luận
Kết quả nghiên cứu đã bào chế ra được các tiểu phân polyme chứa cao ĐTHT đạt yêu cầu về hình
thể học; nồng độ cordycepin; tính trơn chảy.

.


.

v

Final essay for the degree of MS Pharm. Academic year 2018-2020
PREPARATION OF POLYMERIC NANOPARTICLES CONTAINING EXTRACTION OF
Cordyceps militaris
Nguyen Thi Thanh Thao
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Tran Van Thanh

Introduction
Cordyceps militaris is a parasitic fungus with high pharmacological activity. Active ingredients
with high pharmacological properties are identified as cordycepin và adenosin. In which,
cordycepin has been shown to have many biological activities such as immunomodulatory,

anticancer, antifungal, antiviral ... and especially inhibitory activity on the growth of lung cancer
cells in humans. However, according to the research team of Thu Dau Mot University, there have
been some initial reports on the instability of cordycepin extraction. Therefore, the preparation of
polymeric nanoparticles containing Cordyceps militaris extract to increase the stability of
cordycepin is necessary. Researches on the preparation of nanoparticles with complex coagulation
method have been publised elsewhere, but none of nanoparticles containing cordyceps has been
published. For that reason, this is the first time the research about " Preparation of polymeric
nanoparticles containing extraction of cordyceps militaris" was carried out.
Material and Methods
Material: Cordyceps militaris provided by the research team of Thu Dau Mot University
Methods: Extraction was assessed following these criterias: sensory, loss of quantity due to drying,
active substance qualitative, quantitative, total ash, water insoluble solids. In preformulation step,
compatibility of extraction with some excipients (gelatin, arabic gum, span 80, tween 80, paraffin
oil) was investigated. Quantitative procedures are developped and validated using HPLC method.
Formulation and preparation process for making micro-emulsions with paraffin oil and active
substance mixture were investigated. C-NPs are prepared by complex coagulation method from
micro-emulsion with modifying influencing factors were evaluated by: particle size, encapsulation
efficiency, morphology, flowability and stability.
Results
The results of extract's quality assessment: all indicators meet the required standards. Investigation
of incompatibility between crude extract and some excipients: there is not changes about
physically, color, or smell. Quantitative procedure for cordycepin in C-NPs was determined with
wavelength at 258 nm. After experiments were performed, the formulation of C-NPs was selected:
Cordyceps militaris extract (1,93 g); GE 10% (16,6 g); GA10% (5,5 g); parafin (112 g); span 80
(56 g); tween 80 (48 g).
Conclusion
We have created the polymeric nanocapsules with extract of Cordyceps militaris, which have a
meet-demand in physical shape, the cordycepin concentration, morphology, flowability.

.

.

vi

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. xi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ xiii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) ................................ 3
1.1.1. Mô tả thực vật ......................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố và sinh thái ................................................................................ 3
1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................ 4
1.1.4. Tác dụng dược lý..................................................................................... 6
1.2. Cao toàn phần Cordyceps militaris ................................................................ 6
1.3. Vi nhũ tương ................................................................................................. 7
1.3.1. So sánh các tính chất giữa nhũ tương và vi nhũ tương ............................ 7
1.3.2. Thành phần của vi nhũ tương .................................................................. 7
1.3.3. Phương pháp bào chế vi nhũ tương ......................................................... 9
1.3.4. Giản đồ pha .......................................................................................... 10
1.4. Tổng quan về tiểu phân nano ....................................................................... 10
1.5. Tổng quan về polyme sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 12
1.5.1. Gôm arabic ........................................................................................... 12
1.5.2. Gelatin .................................................................................................. 13
1.6. Phương pháp bào chế NPs ........................................................................... 14
1.6.1. Phương pháp đông tụ ............................................................................ 14
1.6.2. Phương pháp nhũ hóa – bay hơi dung mơi ............................................ 16

1.6.3. Phương pháp nhũ hóa – phân tán.......................................................... 17
1.6.4. Kết tủa bằng muối ................................................................................. 18
1.7. Đánh giá tiểu phân nano polyme.................................................................. 18
1.7.1. Cảm quan .............................................................................................. 18

.


.

vii

1.7.2. Kích thước tiểu phân và phân bố kích cỡ hạt ......................................... 18
1.7.3. Hình thể học .......................................................................................... 19
1.7.4. Đánh giá thế zeta của hệ nano .............................................................. 19
1.7.5. Hiệu suất nang hố ............................................................................... 19
1.7.6. Giải phóng hoạt chất in vitro ................................................................ 19
1.8. Một số nghiên cứu bào chế tiểu phân nano polyme chứa hoạt chất chiết xuất
từ dược liệu ........................................................................................................ 20
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 22
2.1.1. Nguyên liệu và chất đối chiếu................................................................ 22
2.1.2. Dung mơi, hóa chất ............................................................................... 22
2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị .......................................................................... 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 23
2.2.1. Kiểm tra, đánh giá chất lượng cao toàn phần ĐTHT ............................. 23
2.2.2. Khảo sát tương kỵ giữa cao ĐTHT với các tá dược dùng trong nghiên
cứu .................................................................................................................. 25
2.2.3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng cordycepin trong C-NPs .. 25
2.2.4. Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương với dầu parafin và hỗn hợp

chất diện hoạt ................................................................................................. 29
2.2.5. Phương pháp bào chế C-NPs ................................................................ 30
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến công thức bào chế C-NPs .... 32
2.2.7. Phương pháp đánh giá các tính chất của C-NPs ................................... 33
2.2.8. Phương pháp đơng khô C-NPs .............................................................. 36
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ................................ 37
3.1. Kiểm tra, đánh giá chất lượng cao tồn phần đơng trùng hạ thảo ................. 37
3.1.1. Cảm quan .............................................................................................. 37
3.1.2. Mất khối lượng do làm khô.................................................................... 37
3.1.3. Định tính ............................................................................................... 37
3.1.4. Định lượng ............................................................................................ 38

.


.

viii

3.1.5. Tro tồn phần........................................................................................ 38
3.1.6. Cắn khơng tan trong nước ..................................................................... 38
3.2. Khảo sát tương kỵ cao ĐTHT với các tá dược trong nghiên cứu .................. 39
3.3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng cordycepin trong C-NPs ........ 39
3.3.1. Xây dựng quy trình định lượng cordycepin C-NPs ................................ 39
3.3.2. Thẩm định quy trình định lượng cordycepin trong trong tiểu phân
nanopolyme chứa cao đông trùng hạ thảo....................................................... 42
3.4. Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương dầu parafin và hỗn hợp chất diện
hoạt tween 80 và span 80 ................................................................................... 47
3.4.1. Khảo sát giản đồ pha của dầu parafin với hỗn hợp chất diện hoạt span
80, tween 80 .................................................................................................... 47

3.4.2. Khảo sát độ bền của các công thức được chọn trong thử nghiệm pha
lỗng............................................................................................................... 51
3.5. Xây dựng cơng thức và quy trình bào chế C-NPs......................................... 51
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH .................................................................. 51
3.5.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ gelatin/gôm arabic ................................................ 52
3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ cao ĐTHT/polyme ................................................. 53
3.5.4. Ảnh hưởng của phần trăm của tổng lượng polyme trong pha nước ....... 54
3.5.5. Ảnh hưởng của các yếu tố đến kích thước tiểu phân .............................. 55
3.5.6. Cơng thức và quy trình bào chế C-NPs ................................................. 56
3.6. Đánh giá tiểu phân nano polyme chứa cao ĐTHT........................................ 58
3.6.1. Hình thể học của C-NPs ........................................................................ 58
3.6.2. Độ ổn định của C-NPs .......................................................................... 58
3.6.3. Đánh giá sơ bộ tính trơn chảy của C-NPs ............................................. 60
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................... 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 66

.


.

ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ nguyên – Tiếng việt

As

Asymmetrical factor – Hệ số bất đối xứng

C-NPs

Hệ tiểu phân nano chứa cao ĐTHT

Cộng sự

cs

dd

Dung dịch

DĐVN

Dược điển Việt Nam

ĐTHT

Đông trùng hạ thảo

%EE

Encapsulation efficiency – Hiệu suất bắt giữ

GA

Gôm arabic

GE

Gelatin

HLB

Hydrophilic Lipophilic Balance – Hệ số cân bằng nước dầu

HPLC

High performance liquid chromatography – Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

ICH

International Conference on Harmonization - Hội nghị quốc tế về hịa
hợp hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người

IEP

pH đẳng điện

KHV

Kính hiển vi

kl/kl

Khối lượng/khối lượng

KTTP

Kích thước tiểu phân

%LC

Khả năng tải thuốc

LLS

Laser light scattering - Phương pháp đo nhiễu xạ tia laser

NCBI

National Center for Biotechnology Information - Trung tâm Thông tin
Công nghệ sinh học Quốc gia

N/D

Nước/Dầu

NPs

Tiểu phân nano polyme

PCS

Photon correlation spectroscopy – Đo kích thước hạt dựa trên sự
khuếch tán ánh sáng

PolyDispersity Index - Hệ số đa phân tán

PDI

.


.

x

RSD

Relative Standard Deviation – Độ lệch chuẩn tương đối

S

Diện tích pic

SD

Standard deviation – Độ lệch chuẩn

SEM

Scanning Electron Microscope – Kính hiển vi điện tử quét

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

STT

Số thứ tự

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

TEM

Transmission Electron Microscopy – Kính hiển vi điện tử truyền qua

TQ

Trung Quốc

tR

Retention Time – Thời gian lưu

UV-Vis

Ultraviolet visible – Tử ngoại - khả kiến

.


.

xi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh các tính chất giữa nhũ tương và vi nhũ tương ............................. 7
Bảng 1.2. Phần trăm các loại đường của gôm từ Acacia senegal và Acacia seyal .. 12
Bảng 1.3. Một số phức hợp đông tụ polysaccharid và gelatin ................................ 14
Bảng 1.4. Một số tiểu phân nano polyme chứa hoạt chất chiết xuất từ dược liệu ... 21
Bảng 2.1. Các trang thiết bị, dụng cụ sử dụng ....................................................... 22
Bảng 2.2. Điều kiện HPLC định lượng cordycepin trong C-NPs ........................... 26
Bảng 2.3. Chương trình pha động được khảo sát để định lượng cordycepin trong C-NPs. 26
Bảng 2.4. Nồng độ cordycepin chuẩn khảo sát tính tuyến tính............................... 28
Bảng 2.5. Yêu cầu độ phục hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau ..................... 29
Bảng 3.1. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cao ĐTHT ................ 37
Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng cordycepin trong cao ĐTHT ................................... 38
Bảng 3.3. Kết quả tro toàn phần của cao ĐTHT .................................................... 38
Bảng 3.4. Kết quả xác định cắn không tan trong nước của cao ĐTHT ................... 39
Bảng 3.5. Tính tương kỵ của cao ĐTHT và các tá dược trong nghiên cứu ............. 39
Bảng 3.6. Chương trình pha động để định lượng cordycepin trong C-NPs ............ 41
Bảng 3.7. Tính tương thích hệ thống của phương pháp định lượng cordycepin trong C-NPs .42
Bảng 3.8. Tính tuyến tính phương pháp định lượng cordycepin trong C-NPs ........ 44
Bảng 3.9. Độ lặp lại của phương pháp định lượng cordycepin trong C-NPs .......... 45
Bảng 3.10. Độ đúng của phương pháp định lượng cordycepin trong C-NPs .......... 46
Bảng 3.11. Tỷ lệ các thành phần của các mẫu khảo sát với tỷ lệ dầu và span 80 là 1:1 ..... 47
Bảng 3.12. Tỷ lệ các thành phần của các mẫu khảo sát với tỷ lệ dầu và span 80 là 2:1 ..... 48
Bảng 3.13. Tỷ lệ các thành phần của mẫu khảo sát với tỷ lệ dầu và span 80 là 3:1 49
Bảng 3.14. Độ bền các cơng thức khi pha lỗng với dầu parafin ........................... 50
Bảng 3.15. Thành phần các công thức C-NPs để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ GE/GA . 52
Bảng 3.16. Thành phần các công thức bào chế C-NPs để khảo sát ảnh hưởng của tỷ
lệ cao ĐTHT/polyme ............................................................................................. 53
Bảng 3.17. Thành phần các công thức bào chế C-NPs để khảo sát ảnh hưởng phần

.


.

xii

trăm của polyme ................................................................................................................................. 54
Bảng 3.18. Kích thước tiểu phân của các C-NPs được bào chế .............................. 54
Bảng 3.19. Kết quả xác định nồng độ cordycepin .................................................. 57
Bảng 3.20. Kết quả xác định độ ẩm ....................................................................... 58
Bảng 3.21. Kết quả xác định kích thước tiểu phân ................................................. 58
Bảng 3.22. Kết quả xác định tỷ số Hausner ........................................................... 58
Bảng 3.23. Kết quả xác định chỉ số nén ................................................................. 59
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát sơ bộ tính trơn chảy của C-NPs ................................ 59

.


.

xiii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. (a) Cordyceps militaris thể sâu, (b) Quả thể Cordyceps militaris ............. 3
Hình 1.2. Cấu trúc cordycepin và adenosin ............................................................. 4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của cordycepic acid ...................................................... 5
Hình 1.4. Sản phẩm Cordy-x ................................................................................... 7
Hình 1.5. Vi nang và vi cầu................................................................................... 11

Hình 1.6. Mơ tả quy trình bào chế vi nang bằng phương pháp đơng tụ phức ......... 16
Hình 2.1. Giản đồ ba pha ...................................................................................... 30
Hình 2.2. Quy trình tổng quát bào chế tiểu phân nano chứa cao ĐTHT ................. 32
Hình 3.1. Sắc ký đồ định tính cordycepin.............................................................. 37
Hình 3.2. Phổ đồ UV-Vis của cordycepin ............................................................. 40
Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu với tỷ lệ nước : methanol trong hệ dung
môi pha động là: (I) 92:8, (III) 85:15 (II) 80:20 ..................................................... 41
Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của (a) mẫu trắng; (b) mẫu chuẩn; (c) mẫu thử; (d) mẫu
thử thêm chuẩn ...................................................................................................... 43
Hình 3.5. Tương quan diện tích pic và nồng độ cordycepin................................... 44
Hình 3.6. Giản đồ pha của vi nhũ tương với tỷ lệ dầu parafin và span 80 1:1 ........ 47
Hình 3.7. Giản đồ pha của vi nhũ tương với tỷ lệ dầu parafin và span 80 2:1 ........ 48
Hình 3.8. Giản đồ pha của vi nhũ tương với tỷ lệ dầu parafin và span 80 3:1 ........ 49
Hình 3.9. Giản đồ pha của vi nhũ tương với tỷ lệ dầu parafin và span là 80 4:1; 5:150
Hình 3.10. Độ đục của hỗn hợp GE/GA tỷ lệ 3:1 ở các pH ................................... 51
Hình 3.11. Quy trình bào chế C-NPs ..................................................................... 56
Hình 3.12. Ảnh SEM của mẫu C-NPs ................................................................... 57

.


.

1

MỞ ĐẦU
Thuốc có nguồn gốc từ thực vật được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền và trong
dân gian. Ngày nay, việc sử dụng thảo dược tăng lên vì khả năng điều trị hiệu quả
với ít tác dụng phụ hơn.
Nấm đơng trùng hạ thảo (ĐTHT) có tên khoa học Cordyceps militaris là một lồi

nấm ký sinh có giá trị dược lý cao. Kết quả nghiên cứu từ các công bố khoa học
chứng minh ĐTHT có hiệu quả trong điều trị ung thư, điều hòa miễn dịch điều trị
rối loạn chức năng thận và cải thiện chức năng gan [2]. Hoạt chất có dược tính cao
trong ĐTHT được kể đến là cordycepin và adenosine. Trong đó, cordycepin đã
được chứng minh có chứa nhiều hoạt tính sinh học như điều hịa miễn dịch, kháng
ung thư [21], kháng nấm, kháng virus [32]. Đặc biệt là hoạt tính ức chế sự phát triển
của tế bào nhờ tác động vào chu trình chết của tế bào và hệ thống phân hủy nội bào
trong các tế bào ung thư phổi ở người [46]. Tuy nhiên, theo nhóm nghiên cứu về
nấm ĐTHT của Trường Đại học Thủ Dầu Một, đã có một vài báo cáo chưa được
công bố về sự không ổn định và kém bền của cordycepin. Và cordycepin ở dạng tự
do hiệu quả trên tế bào kém hơn khi được bào chế ở dạng tiểu phân nano [25]. Vì
vậy, để tăng sinh khả dụng việc bào chế tiểu phân nano polyme chức cao ĐTHT
làm nguyên liệu sản xuất các sản phẩm chứa ĐTHT là một nhu cầu cấp thiết.
Tiểu phân nano polyme là dạng bào chế có nhiều ưu điểm như tăng thời gian lưu
thuốc trong hệ tuần hoàn, cải thiện sinh khả dụng của thuốc, bảo vệ cấu trúc của
hoạt chất không bị biến đổi… [16]. Hạn chế của các phương pháp bào chế tiểu phân
nano là khó nâng cấp cỡ lơ do trong q trình nâng cấp cỡ lơ cần kiểm sốt các
thơng số của thiết bị như đồng nhất hóa, siêu âm... Phương pháp đông tụ phức từ vi
nhũ tương thể hiện ưu điểm như dễ nâng cấp cỡ lô, hiệu quả nang hóa cao, khả năng
tải thuốc cao, chi phí bào chế thấp, vật liệu bao gói được sử dụng có thể từ tự nhiên
như gelatin, gơm arabic, chitosan…[39], [52]. Các nghiên cứu về bào chế tiểu phân
nano bằng phương pháp đông tụ phức đã được thực hiện rất nhiều nhưng chưa có
một nghiên cứu về bào chế tiểu phân nano chứa cao đơng trùng hạ thảo được cơng
bố. Chính vì lý do đó, đề tài “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano polyme chứa cao

.


.

2

tồn phần nấm đơng trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)” được thực hiện với những
mục tiêu cụ thể sau:
1. Đánh giá cao tồn phần đơng trùng hạ thảo.
2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng cordycepin trong tiểu phân nano
polyme chứa cao đông trùng hạ thảo.
3. Xây dựng quy trình bào chế vi nhũ tương và tiểu phân nano polyme chứa cao
đông trùng hạ thảo từ vi nhũ tương.
4. Đánh giá một số chỉ tiêu tiểu phân nano polyme chứa cao đông trùng hạ thảo.

.


.

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)
Codyceps militaris (Hình 1.1 (a) và (b)), thuộc giới Nấm, chi Ascomycota, lớp
Sordarionycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps. Tên khoa
học là Cordyceps militaris (L.) Fr. (1818). Các lồi Cordyceps sp. được gọi là đơng
trùng hạ thảo [2], [49].

Hình 1.1. (a) Cordyceps militaris thể sâu, (b) Quả thể Cordyceps militaris
1.1.1. Mô tả thực vật
Cordyceps militaris là loài nấm chuyên sống ký sinh trên ấu trùng bướm, quả thể
nấm có màu vàng nhạt hoặc màu da cam, chiều dài 8 – 10 cm. Thường ấu trùng bị
nhiễm nấm vào mùa hè, nấm sinh trưởng và phát triển trên ấu trùng vào mùa thu.

Qua mùa đông nấm sẽ giết chết vật chủ và chiếm hoàn toàn cơ chất của vật chủ,
hình thành cấu trúc bào tử sinh sản gọi là stroma, sẽ phát triển nhô lên từ xác ấu
trùng ra ngoài để phát tán bào tử vào mùa hè [2].
1.1.2. Phân bố và sinh thái
Cordyceps militaris thường được tìm thấy ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Châu Á. Hiện
nay, khoảng hơn 400 lồi Cordyceps đã được tìm thấy và mơ tả, có khoảng 36 lồi
được ni trồng trong điều kiện nhân tạo. Tuy nhiên, chỉ có Cordyceps militaris
được trồng ở quy mơ lớn do nó có nhiều dược tính và thời gian sản xuất ngắn [2].

.


.

4

1.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hố học của Cordyceps militaris được xác định bao gồm các
nucleoside, vitamin A, vitamin B1, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3,
cordycepin, acid cordycepic, polysaccharide và các nguyên tố vi lượng [2].
1.1.3.1. Cordycepin
Cordycepin (3’-deoxyadenosine) (Hình 1.2) là một purine alkaloid bị mất oxy ở vị
trí 3’ phần đường ribose, công thức phân tử của cordycepin là C10H13N5O3, phân tử
lượng 251, nhiệt độ nóng chảy là 230 – 231 °C, độ hấp thụ cao nhất ở bước sóng
259 nm, có thể hịa tan trong dung dịch đệm phosphat, methanol hay ethanol, nhưng
khơng hịa tan trong benzene, ether hay chloroform [51]. Cordycepin là một loại
đồng phân của một nucleoside có cấu trúc tương tự như adenosine (Hình 1.2) [41].
Năm 2010, theo nghiên cứu của Wong và cộng sự, cordycepin có hai tác dụng chính
trên tế bào. Với hàm lượng cordycepin thấp, có tác dụng ức chế sự phát triển khơng
kiểm sốt sự phân chia của các tế bào. Ngược lại, với hàm lượng cao ngăn cản tế

bào dính kết với nhau và ức chế sự phát triển. Cả hai tác động này có các cơ chế về
cơ bản giống nhau đó là cordycepin ức chế sự chuyển hóa protein. Do ở liều lượng
thấp, cordycepin ức chế việc tạo ra mRNA và hình thành các protein, trong khi ở
liều lượng cordycepin cao gây ảnh hưởng trực tiếp trong việc tạo ra các protein [44].

Adenosin

Cordycepin

Hình 1.2. Cấu trúc cordycepin và adenosin [50]

.


.

5

1.1.3.2. Acid cordycepic
Acid cordycepic (Hình 1.3) là một isomer của acid quinic, được nghiên cứu đầu tiên
trên C. sinensis năm 1957. Acid cordycepic là hợp chất sinh học chính có nhiều
hoạt tính quan trọng như kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho. Hàm lượng acid
cordycepic trong Cordyceps khoảng 7-29% [51].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của cordycepic acid
1.1.3.3. Polysaccharid
ĐTHT chứa một lượng lớn polysaccharid, khoảng 3-8% khối lượng, đây là một
trong những hợp chất sinh học chính. Từ năm 1977, nhiều nghiên cứu khoa học tại
Trung Quốc và Nhật Bản đã chứng minh được những ích lợi từ polysaccharid trong
việc kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm cũng như tác động điều hòa miễn

dịch.
Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là một cấu trúc phân nhánh gồm các liên
kết (1 – 6) và (1 – 2) liên kết các gốc α – D – mannopyranosyl ở mạch chính, có các
liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng
nhỏ. Tuy nhiên, polysaccharid với trọng lượng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol được
phân tách gần đây chỉ chứa các đơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9. Các phân
tích cho thấy nó có một khung sườn α – D – glucan với các liên kết (1 – 4) và
(1 – 3); và các mạch nhánh của α – D – (1 – 6) – mannopyranose (Manp) được gắn
vào khung sườn qua vị trí O – 6 của gốc α – (1 – 3) – glucopyranosyl (Glcp).
Nghiên cứu này cũng cho thấy dược tính của polysaccharid phụ thuộc các đặc tính
của nó như trọng lượng phân tử, ví dụ như các polyglucan có trọng lượng phân tử
lớn hơn (10 – 1000 kDa) vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu quả hơn. Hoạt tính

.


.

6

kháng ung thư là do sự tăng cường miễn dịch cho cơ thể hơn là hiệu ứng gây chết tế
bào trực tiếp [51].
1.1.4. Tác dụng dược lý
Cordyceps militaris chứa nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý cao có tác dụng trong
điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe như [2]:
Kháng oxy hóa: Dịch chiết nấm có tính kháng oxy hóa, hoạt tính khử và tạo phức ở
nồng độ (8 mg/ml).
Hệ thống steroid và nội tiết: Kích thích sản xuất corticosteroid.
Hoạt tính kháng ung thư: Sterol và các glucosid của chúng, các chất biến dưỡng có
trọng lượng phân tử thấp hơn cordycepin, các nucleosid bị biến đổi, tăng cường

miễn dịch và sản xuất cytokin.
Điều hòa miễn dịch: Tăng cường và ức chế miễn dịch.
Kháng viêm
Kháng khuẩn và kháng nấm
1.2. Cao tồn phần Cordyceps militaris
Cao ĐTHT dung mơi chiết là nước cất, được kiểm tra, đánh giá các tiêu chuẩn theo
tiêu chuẩn cơ sở, bao gồm:
- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất, màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mơ tả
trong chun luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng.
- Mất khối lượng do làm khơ: Cao đặc khơng q 20%.
- Định tính: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu và cùng giá trị
Rf với vết chuẩn trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
- Định lượng: Không dưới 3,500 mg cordycepin trong 1 gam cao ĐTHT.
- Tro tồn phần: Khơng q 10%.
- Chất rắn khơng tan trong nước: Không quá 30%.
Cao đặc ĐTHT từ Trường Đại học Thủ Dầu Một đã được ứng dụng làm nguyên liệu
bào chế sản phẩm Cordy-x (Hình 1.4).

.


.

7

Hình 1.4. Sản phẩm Cordy-x
1.3. Vi nhũ tƣơng
Vi nhũ tương được tìm ra đầu tiên bởi Hoar và Schulman vào năm 1943. Kích
thước pha phân tán thơng thường nhỏ hơn 150 nm, nhỏ hơn bước sóng của ánh sáng
khả kiến nên vi nhũ tương gần như trong suốt và không thể quan sát cấu trúc của

chúng bằng kính hiển vi quang học [20].
1.3.1. So sánh các tính chất giữa nhũ tương và vi nhũ tương
Sự khác nhau giữa nhũ tương và vi nhũ tương được thể hiện ở Bảng 1.1 [38].
Bảng 1.1. So sánh các tính chất giữa nhũ tương và vi nhũ tương
STT

Tính chất

Vi nhũ tƣơng

1

Hình thức

2

Đẳng hướng quang học

Đẳng hướng

Bất đẳng hướng

3

Sức căng bề mặt

Rất thấp

Cao

4

Kích thước hạt

20 – 200 nm

> 500 nm

5

Nhiệt động lực học

Ổn định

Không ổn định

6

Bào chế

Cần cung cấp lực phân

Năng lượng cần cung

tán thấp

cấp cao

7

Độ nhớt

Thấp

Cao

Trong suốt (hoặc trong
mờ)

Nhũ tƣơng
Đục

1.3.2. Thành phần của vi nhũ tương
1.3.2.1. Pha dầu
Pha dầu là những chất lỏng không phân cực được dùng làm mơi trường hịa tan hoạt
chất đồng thời giúp tăng khả năng hấp thu thuốc qua hệ tiêu hóa [38]. Các chất

.


.

8

thường được sử dụng làm pha dầu là: dầu parafin, dầu đậu nành, dầu jojoba, dầu ô–liu,
acid oleic, isopropyl myristate ...
Dầu parafin:
Mô tả: Dầu parafin là một chất lỏng trong suốt, không màu, nhớt, không phát quang
dưới ánh sáng mặt trời, khơng mùi.
Tính chất vật lý: Nhiệt độ sơi > 360 oC, không tan trong ethanol (95%), glycerin và

nước. Tan trong acetone, benzene, chloroform, ether.
Phương pháp sản xuất: Dầu parafin thu được bằng cách tinh chế dầu khoáng. Hydro
chuỗi nhẹ được loại bỏ trong quá trình tinh chế và phần cịn lại được tinh chế thêm
lần lại. sau đó hỗn hợp được làm lạnh và phần rắn được loại bỏ bằng lọc. Dịch lọc
được tinh khiết hóa và khử màu bằng phương pháp hydrogel hóa dưới áp suất cao
hoặc bằng acid sulfuric, dịch lọc sau đó được lọc qua chất hấp phụ. Những chất có
nhiệt độ sơi dưới 360 sẽ được loại bỏ.
Độ an toàn: Dầu parafin là tá dược phổ biến trong công nghiệp dược phẩm cũng
như trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm. Liều dùng tối đa cho một người bình
thường đường uống có thể lên đến 45 mL. Liều gây chết ở chuột đường uống là
22 g/kg [17].
1.3.2.2. Chất diện hoạt
Là các hoạt chất mà trong công thức bao gồm 2 phần: Đầu thân nước và đuôi thân
dầu, có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt tại mặt phân cách giữa 2 chất lỏng
không thể trộn lẫn với nhau và qua đó tạo thành hệ phân tán đồng nhất [38].
Chất diện hoạt được chia thành 4 nhóm chính: anion, cation, khơng phân cực và
lưỡng cực. Các loại chất hoạt động bề mặt khác nhau có những đóng góp khác nhau
trong q trình nghiên cứu phát triển vi nhũ tương.
- Chất diện hoạt cation: Các chất hoạt động bề mặt cation khi tiếp xúc với nước
chúng chuyển sang dạng cation lưỡng tính và anion, các chất thuộc nhóm này
thường là halogen. Một bộ phận rất lớn của nhóm này tương ứng với các hợp chất
nitơ như amoni bậc bốn và muối amin béo, với một hoặc một vài chuỗi dài của loại

.


.

9

alkyl, thường đến từ các acid béo tự nhiên. Ví dụ như hexadecyltrimethyl
ammonium bromid và didodcecyl ammonium bromid.
- Chất diện hoạt anion: Khi các chất hoạt động bề mặt anion được phân ly trong
nước trong một anion lưỡng tính và một cation, thường là dạng muối kim loại kiềm
(Na, K) hoặc amoni. Ba nhóm anion quan trọng nhất trong nhóm này là carboxylat,
sulfonat và nhóm sulfat.
- Chất diện hoạt khơng ion hóa: Chất hoạt động bề mặt khơng ion được ổn định
bằng các tương tác lưỡng cực và liên kết hydro với lớp hydrat hóa của nước trên bề
mặt ưa nước của nó. Chúng khơng ion hóa trong dung dịch nước, bởi vì nhóm ưa
nước của chúng thuộc loại khơng phân ly, chẳng hạn như phenol, rượu, este hoặc
amide [31]. Thường dùng là tween 80 (HLB = 15), span 80 (HLB = 4,3).
1.3.3. Phương pháp bào chế vi nhũ tương
1.3.3.1. Phương pháp chuẩn độ pha
Vi nhũ tương được bào chế bằng phương pháp chuẩn độ pha và được thể hiện bằng
giản đồ pha. Giản đồ pha được xây dựng bằng cách trộn đều pha dầu, chất diện
hoạt/đồng diện hoạt với lượng xác định vào lọ thủy tinh sau đó được chuẩn độ với
nước và khuấy ở nhiệt độ phòng. Sự hình thành hệ đơn pha hoặc lưỡng pha được
xác định bằng cảm quan. Nếu có hiện tượng đục kèm theo sự tách pha, mẫu được
xác định là lưỡng pha. Đơn pha hệ sẽ trong suốt và đồng nhất. Tập hợp những điểm
đơn pha tạo thành vùng vi nhũ tương [38].
1.3.3.2. Phương pháp đảo pha
Sự đảo pha của vi nhũ tương xảy ra khi bổ sung lượng dư của pha phân tán hoặc
phản ứng với nhiệt độ. Trong quá trình đảo pha, những thay đổi vật lý nhanh chóng
xảy ra bao gồm những thay đổi về kích thước hạt.
Đối với các chất hoạt động bề mặt khơng ion, điều này có thể đạt được bằng cách
thay đổi nhiệt độ của hệ thống, buộc chuyển đổi từ vi nhũ tương dầu trong nước ở
nhiệt độ thấp sang vi nhũ tương nước trong dầu ở nhiệt độ cao hơn (đảo pha chuyển
tiếp).

.

.

10

Trong quá trình làm mát, hệ thống đi qua điểm có độ cong tự phát bằng khơng và
sức căng bề mặt tối thiểu, thúc đẩy sự hình thành các giọt dầu phân tán mịn. Phương
pháp này được gọi là phương pháp nhiệt đảo pha. Thay vì nhiệt độ, các thơng số
khác như nồng độ muối hoặc giá trị pH cũng có thể được xem xét [38].
1.3.4. Giản đồ pha
Giản đồ pha là phương tiện thường dùng để xác định các vùng có cấu trúc khác
nhau như vùng tạo vi nhũ tương, vùng tạo nhũ tương,... Giản đồ ba pha có hình tam
giác, mỗi cạnh tương ứng với một thành phần (trong trường hợp cơng thức có nhiều
hơn 3 thành phần thì một cạnh của hình tam giác sẽ gồm 2 thành phần như chất diện
hoạt/chất đồng diện hoạt, pha dầu/chất đồng hòa tan,... với các tỷ lệ xác định).
Giản đồ pha gồm có 3 thành phần: dầu, chất diện hoạt và đồng diện hoạt. Hỗn hợp
chất diện hoạt và đồng diện hoạt được chuẩn bị với các tỷ lệ khác nhau (3:1, 2:1,
1:1, 1:2). Pha dầu được phối hợp với các hỗn hợp theo các tỷ lệ 1:9, 2:8, 3:7,..., 8:2,
9:1 lắc xoáy kỹ. Tập hợp những điểm trong giản đồ tạo được nhũ tương trong được
xem là vùng vi nhũ tương, vùng vi nhũ tương càng lớn thì khả năng nhũ hóa của hệ
đó càng tốt [38], [42].
Đánh giá độ bền vi nhũ tương thu được:
- Sau khi hệ đạt trạng thái cân bằng, đánh giá khả năng phân tán và cảm quan (hệ
phải trong suốt và đồng nhất).
- Khi pha loãng 50 – 200 lần phải tạo được hệ vi nhũ tương trong suốt hoặc trong
mờ, đồng nhất và khơng có tủa [28].
1.4. Tổng quan về tiểu phân nano
Tiểu phân nano polyme (NPs) là các tiểu phân cấu tạo đa phân tử thành phần cấu
tạo chủ yếu là polyme, có kích thước từ 10 – 1.000 nm, có cấu trúc và thiết kế thích

hợp với vai trị như một phương tiện vận chuyển chuyên biệt, đảm bảo chuyển giao
hoạt chất đến đích sinh học [1].
Cấu trúc đặc trưng của nano polyme thường có 2 dạng (Hình 1.5):

.


.

11

Hình 1.5. Vi nang và vi cầu [7]
Tiểu phân nano polyme cấu trúc dạng màng bao, thường gọi là vi nang: Cấu tạo
gồm một màng polyme bao quanh một lõi chứa hoạt chất, lõi có thể dạng lỏng thân
nước hoặc thân dầu.
NPs cấu trúc dạng khung xốp thường gọi là vi cầu: Khung xốp polyme phân bố đều
bên trong tiểu phân hình cầu. Hoạt chất nang hố thường thân dầu phân bố đều
trong các mắc xích hoặc lỗ xốp bên trong khung polyme.
Ứng dụng công nghệ nano trong dược phẩm phát triển các hệ thống phân phối thuốc
mới như [16]:
- Nâng cao hiệu quả phân phối thuốc, đưa thuốc đến đích tác động, giải phóng thuốc
có kiểm sốt.
- Giảm liều điều trị đến mức tối thiểu giúp sử dụng thuốc an toàn hơn.
- Tăng sinh khả dụng của thuốc
- Kéo dài thời gian tác động
- Giảm độc tính và tác dụng phụ của thuốc.
- Tăng khả năng hòa tan.
- Cải thiện tính ổn định của thuốc tránh tác động của hệ enzyme trong cơ thể, phân
hủy sinh học trước khi thuốc đến vị trí tác động
- Tăng diện tích bề mặt, tăng độ tan và dược động học.

Thành phần cấu tạo các NPs chủ yếu là các polyme tự phân hủy sinh học và tương
thích sinh học, tổng hợp hoặc tự nhiên. Polyme có khả năng phân hủy sinh học tổng
hợp như: polylactide, polylactide-polyglycolide, polycaprolactone. Polyme có khả
năng phân hủy sinh học tự nhiên như: gelatin, chitosan,… [30].

.


.

12

1.5. Tổng quan về polyme sử dụng trong nghiên cứu
1.5.1. Gôm arabic
1.5.1.1. Giới thiệu chung
Tên khác là gôm acacia. Gôm arabic có dạng mảnh màu trắng hoặc trắng vàng dạng
hạt, bột hay bột phun sấy, khơng mùi và có vị nhạt [17].
Gôm arabic (GA) là một loại gôm tiết ra từ cây Acacia senegal và cây Acacia seyal.
Gôm chảy ra từ thân và cành của cây (thường ở những cây từ năm tuổi trở lên) khi
cây gặp điều kiện khắc nghiệt như khô hạn hoặc vết nứt ở vỏ cây. Khai thác GA
bằng cách dùng rìu rạch vỏ cây từ các chỗ rạch cây sẽ tiết ra chất dẻo dính sau đó
khơ lại tạo thành các nốt sần được thu hoạch bằng tay [43].
1.5.1.2. Cấu tạo
GA là hỗn hợp các polysaccharid acid hoặc trung tính, thường được tìm thấy ở dạng
muối của acid charidic, magie, kali. Mạch chính của polysaccharid được tạo thành
từ các đơn vị D-galactopyranose liên kết bởi các liên kết 1,4-β-D-galactopyranosyl
và liên kết 1,6-β-D-galactopyranosyl, các mạch bên thường được gắn bởi liên kết
1,3-β-D-galactopyranosyl [9].
1.5.1.3. Thành phần
Cả hai loại gôm chứa thành phần đường giống nhau nhưng gôm Acacia seyal gơm

có lượng đường rhamnose và acid glucuronic thấp hơn gôm Acacia senegal như
Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Phần trăm các loại đường của gôm từ Acacia senegal và Acacia seyal
% đƣờng

Acacia senegal

Acacia seyal

% galactose

44

38

% arabinose

27

46

% rhamnose

13

4

% glucuronic acid

14.5

6.5

4-O-methyl glucuronic acid

1.5

5.5

% nitrogen

0.36

0.15

.